Method Article

سير عمل حاسوبي ثنائي اللغة لتحديد مثبطات محتملة ل PLK1 في لغة الإشارة الأمريكية والإنجليزية

DOI:

10.3791/67979

⸱

April 3rd, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Drug Discovery Lab, School of Science, Technology, Accessibility, Mathematics, and Public Health (STAMP), Gallaudet University, 2University of Connecticut

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا البروتوكول ثنائي اللغة سير عمل حاسوبي لاكتشاف الأدوية يقيم تفاعلات البروتين والليغاند بين الكينازات الشبيهة بالبولو من 1 إلى 3 (PLK1–3) وخصائص الامتصاص، والتوزيع، والتمثيل الغذائي، والإخراج، والسمية، والاستقرار (ADMET-S) للجزيئات الطبيعية المستمدة من قواعد البيانات.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يلعب كيناز 1 الشبيه بالبولو (PLK1) أدوارا أساسية في مراحل S وG2 وM من دورة الخلية، وغالبا ما يلاحظ التعبير الزائد في عدة أنواع سرطان، بما في ذلك سرطان الثدي، حيث يساهم في عدم الاستقرار الجيني واضطراب الموت المبرمج. على عكس المثبطات التقليدية المنافسة ل ATP التي تستهدف مجال الكيناز، يقدم التثبيط الانتقائي لمجال صندوق البولو-بوكس (PBD) الخاص ب PLK1 استراتيجية واعدة لتعطيل التفاعلات البروتينية مع الليغاند الحيوية لتقدم الانقسام، مما يؤدي إلى حدوث موت المبرمج في خلايا السرطان. ومع ذلك، فإن التشابه الهيكلي العالي بين PLK1 ونظيره (PLK2 وPLK3)، اللذين هما حيويان للوظيفة العصبية والاستجابة للإجهاد على التوالي، يتطلب انتقائية استثنائية لتجنب التأثيرات خارج الهدف. لمواجهة هذا التحدي، يتضمن البروتوكول سير عمل حسابي ثنائي اللغة (لغة الإشارة الأمريكية والإنجليزية) يدمج الفحص الافتراضي، والتجميع الهيكلي، وربط البروتين والليجند، والتنبؤ بألفة الربط، وتحليل التوصيف بنظام ADMET-S، وتحليل استقرار ميكانيكا الكمومية (QM). بدءا من قاعدة بيانات المنتجات الطبيعية Supernatural 3.0، تم تصفية المركبات باستخدام معايير الصلة بسرطان الثدي ومعايير الشبه الدوائي، وجمعت لضمان التنوع الكيميائي، وقيمت تفاعلاتها مع هياكل PLK1 وPLK2 وPLK3-PBD. بينما لا يمكن لتقييمات الالتحام الافتراضي وعلى شكل سيلكو ADMET-S تأكيد الانتقائية أو آلية العمل بشكل قاطع، فإن هذه الدراسة تولد فرضيات قابلة للاختبار وتعطي الأولوية لمجموعة مركزة من المرشحين المستخلصين من المنتجات الطبيعية لمحاكاة الديناميكا الجزيئية المستقبلية، أو التحقق الكيميائي الحيوي، أو الفحص التجريبي.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كينازات شبيهة بالبولو (PLKs) هي عائلة من الكينازات البروتينية تتكون هيكليا من مجال N-طرفي وطرف C يتكون من مجال أو اثنين من مجالات صندوق البولو (PBD)1,2.  يختلف عدد وتنوع وظيفي هذه النطاقات بين أفراد عائلة PLK المختلفة. يشارك PLK1 في مراحل S وG2 وM من انقسام الخلية. في دورة الخلية، يعمل PLK1 كنقطة تحقق لتلف الحمض النووي في المرحلة S وكمنظم لتكثف الكروموسومات ونضج الجري في المرحلة G2. كما يعزز PLK1 الدخول الانقسامي إلى طور M، يليه تجميع المغزل، ودخول الطور الخارجي، والتحريك الخلوي 3,4. يؤدي التعبير الزائد عن PLK1 إلى عدم استقرار جيني بسبب تكوين غير طبيعي للمركز المركزي، مما يؤدي إلى دورات خلوية غير مرتبة تجعل الخلايا غير قادرة على تنظيم الاستماتة المبرمجة.  يلاحظ هذا التعبير الزائد في سرطانات الرئة والرأس والرقبة، وسرطان المريء، والمعدة والقولون والمستقيم، وسرطان الثدي4. لذلك، فإن تثبيط PLK1 من خلال عوامل تستهدف PBD قد يؤدي إلى تحفيز الاستماتةالمبرمجة 5,6. يهدف هذا السير إلى تحقيق انتقائية عالية لتجنب تثبيط PLK2 وPLK3، اللذين هما ضروريان للوظيفة العصبية وإدارة الإجهاد الجينيالسام 3.

يعمل PLK2 كمثبط للورم في سياقات معينة، حيث ينظم انتقال G1/S ويعزز تحلل السيكلين E لمنع تكاثر الخلايا غير المنضبط. يظهر PLK3 دورا معقدا في تنظيم دورة الخلية والاستجابة للإجهاد الجيني السمي، ويساهم في الحفاظ على سلامة الجينوم من خلال مشاركته في تنشيط نقاط التحقق من تلف الحمض النووي وتحفيز الاستماتةالمبرمج. ومن المهم أن تثبيط PLK1 برز كاستراتيجية علاجية واعدة لعلاج السرطان، فإن الأدوار الأساسية ل PLK2 وPLK3 في الوظائف العصبية والاستجابة للإجهاد تتطلب تطوير مثبطات انتقائية للغاية لتقليل التأثيرات غير المستهدفة على هذه الكينازات الحيوية3. يؤكد هذا السياق البيولوجي والتشابهات الهيكلية فوق 38٪3 أهمية تحديد المركبات التي تستهدف تحديدا مجال صندوق البولو (PBD) الخاص ب PLK1 دون التدخل في وظائف الحماية ل PLK2 وPLK3 في الفسيولوجيا الخلوية الطبيعية.

تم دراسة مثبطات كيناز شبيه بالبولو (PLK) المعروفة، خاصة تلك التي تستهدف PLK1، بشكل موسع بسبب تطبيقاتها العلاجية المحتملة في علاج السرطان. تم تطوير عدة مركبات، منها BI 2536، volasertib (BI 6727)، onvansertib (NMS-1286937)، و GSK461364، وتطويرها إلى تجارب سريرية، غالبا كمثبطات تنافسية ل ATP 8,9,10. أنواع أخرى من المثبطات تستهدف PBD، بما في ذلك ثيموكينون (TQ)11,12، البولوكسين13,14، وألوبول-A15. على الرغم من أن التوقعات واعدة بذلك، إلا أنه لا توجد حاليا مثبطات خاصة ب PBD معتمدة أو تجارب سريرية في مراحلها المتأخرة بسبب التحديات، بما في ذلك خصائص ADMET-S غير المثاليةوتأثيرات غير مستهدفة. على سبيل المثال، يقال إن عدة مثبطات PLK1-PBD هي ألكيلاتورات بروتينية غير محددة16، مما يحد من قابليتها السريرية. لذلك، يظل تحسين الانتقائية وملفات ADMET-S لمثبطات PLK1-PBD المحتملة هدفا حاسما في اكتشاف الأدوية.

هدف هذه الدراسة هو استكشاف مثبطات PLK1-PBD المحتملة ذات خصائص ADMET-S باستخدام الفحص الافتراضي، وترشيح التشابه الهيكلي، والالتحم، وحسابات طاقة الربط، وتقييم ADMET-S. تم إخضاع PLK2 وPLK3 لنفس البروتوكولات لتقييم الانتقائية المحتملة. بينما توجد العديد من خطوط الأنابيب الحسابية لاكتشاف مثبطات الكيناز، فإن القليل منها يدمج الفحص الانتقائي المتزامن عبر PBDs PLK1–3 مع تحليلات شاملة ل ADMET-S واستقرار ميكانيكي كموي، خاصة باستخدام مكتبات المنتجات الطبيعية. يبني سير العمل على نماذج الفرز الافتراضي الراسخة، لكنه مصمم لتوفير الوصول التعليمي وتوليد الفرضيات في المراحل المبكرة. يتطلب البروتوكول فقط لابتوب قياسي (8 جيجابايت رام)، وبرامج أكاديمية مجانية، ولا خبرة برمجية سابقة، مما يجعله مناسبا لبيئات المدارس الثانوية والبكالوريوس والدراسات العليا، بما في ذلك تجارب البحث الجامعية القائمة على الدورات (CUREs).

يبدأ خط العمليات الحسابية لهذا العمل بتحضير البروتين، حيث يتم استرجاع هياكل PLK1-PBD وPLK2-PBD وPLK3-PBD من بنك بيانات البروتين (PDB) أو نمذجتها ومعالجتها لحل التناقضات الهيكلية. بعد ذلك، تم إجراء فحص في قاعدة بيانات المنتجات الطبيعية، حيث تم تصفية المركبات بناء على إمكانية استخدامها كمضادة لسرطان الثدي والامتثال لقاعدة ليبينسكي الخمسة. الخطوات التالية هي التجميع في 50 هيكلا تمثيليا بناء على البصمة الجزيئية والتشابه. خضع هؤلاء الممثلون لحسابات الترابط والارتباط بين البروتين والرابط، مما أنتج بيانات تفاعل ل PLK الثلاثة. بعد ذلك، يتم تقييم خصائص ADMET-S باستخدام ثلاثة خوادم ويب مختلفة للتنبؤ بالديناميكيات الدوائية، وتشبيهه مع الدواء، والسمية، واستقرار الأيض. تم استخدام حسابات الميكانيكا الكم لتقييم الاستقرار الجزيئي من خلال تحليل المدارات الجزيئية الأعلى (HOMO) وأدنى مدار جزيئي غير مشغول (LUMO) لفجوة HOMO–LUMO. وأخيرا، تم تحليل بيانات ADMET-S لتصفية وتصنيف المركبات بناء على معايير الفيزيائيوكيميائيا، والامتصاص، والتوزيع، والتمثيل الغذائي، والإخراج، والسمية، والاستقرار كمثبطات محتملة وانتقائية ل PLK1-PBD.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

معرفات موارد البحث (RRIDs) وأرقام إصدارات جميع أدوات البرمجيات المستخدمة متوفرة في جدول المواد.

1. تحضير البروتين المستهدف

  1. أنشئ دليلا عمليا لهذا المشروع حيث يمكن تخزين الملفات الهيكلية والنتائج الحسابية.
  2. قم بزيارة بنك بيانات البروتين لاسترجاع معرف البروتين المستهدف PLK1-PBD (4HCO11) ومتابعة مع كيمياء في ميكانيكا الجزيئات بجامعة هارفارد - واجهة المستخدم الرسومية (CHARMM-GUI 17,18) لحل أي تناقضات هيكلية.
    1. قم بزيارة CHARMM-GUI وسجل حسابا أكاديمي. عند تسجيل حساب أكاديمي، اضغط على مولد الإدخال، ثم قارئ PDB، أدخل معرف PDB 4HCO، ثم اضغط على الخطوة التالية.
    2. في الصفحة التالية، تأكد من اختيار PROA فقط – سلسلة البروتين A وانقر على الخطوة التالية للصفحتين التاليتين.
    3. قم بتنزيل step1_pdbreader.pdb إلى دليل، ثم أعد تسمية الملف إلى 4hco أو المفضل، واستخدم محرر نصوص أو رمز لإعادة تسمية حالات الهيستيدين (HSD) إلى (HIS).
  3. كرر الإجراء لجهاز PLK2-PBD (معرف PDB: 4XB019) باستخدام واجهة المستخدم الرسومية CHARMM.
    ملاحظة: بالنسبة للهياكل التي لا تحتوي على معرفات PDB، مثل PLK3-PBD، استخدم هياكل نمذجة التجانس أو Alphafold20. تأكد من دقة التسلسل من Uniprot21.

2. فحص قاعدة بيانات المنتجات الطبيعية

  1. قم بزيارة قاعدة بيانات مكتبة Supernatural 3.0 للمنتجات الطبيعية واختر الصفحة الفرعية22 للأمراض المتخصصة.
    1. اختر سرطان الثدي مع أي حدود ثقة أو بدون ثقة، حيث يجب تصفية النتائج بالكامل برمجيا، واضغط على البحث. انقر على تحميل ملف النتائج الكامل لحفظ النتائج في دليل مفضل ك .csv. بعد ذلك، استخدم الكود لتصفية لأولئك الذين لديهم حدود ثقة بين 0.900–1.000 (n = 1,193 من 73,406).
      ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن إدخال معرف موسوعة كيوتو للجينات والجينوم (KEGG) لسرطان الثدي في الصفحةالفرعية 23 من المسارات.
    2. اذهب إلى صفحة الأسئلة الشائعة في الأسفل، وابحث عن مجموعة البيانات الكاملة المتاحة للتحميل كملف .csv. قم بتنزيل هذا واستخدم سكريبت لمطابقة سلاسل نظام إدخال خط الإدخال الجزيئي المبسط (SMILES) من مجموعة البيانات مع معرفات Super Natural ل 1,193 جزيء وتحضير قائمة بسلاسل SMILES الخاصة بها (smiles.csv).

3. أخذ عينات العنقود

  1. قم بتنزيل توزيعة أناكوندا (https://www.anaconda.com/download) التي تحتوي على معظم الحزم مفتوحة المصدر تقريبا، أو قم بتحميل بيئة تطوير متكاملة (IDE) بشكل فردي مثل RStudio (RStudio Desktop - Posit) أو Jupyter (Jupyter Notebook). قم بتثبيت RDKit24، وهو حزمة مفتوحة المصدر في المعلوماتية الكيميائية وتعلم الآلة باستخدام Conda.
    ملاحظة: يمكن العثور على تعليمات تثبيت كوندا وإنشاء بيئة كوندا في وثائق كوندا 25.9.2.dev31. لتثبيت RDKit وإعداد الوحدات في البيئة، انظر التثبيت — وثائق RDKit 2025.03.6.
  2. ضع السكريبت "Lipinski.py" في الملف التكميلي 1 في نفس المجلد الذي فيه "smiles.csv" وشغله. يفتح السكربت بيئة Conda، ويقوم بتحميل الوحدات، ويقرأ ملف سلاسل SMILES، ويطبق مرشحا بناء على قاعدة ليبينسكي رقم 5 لتقدير التوافر الحيوي والامتصاص (n = 999 من 1,193)، ويحفظ قائمة سلاسل SMILES ك "all.csv".
    ملاحظة: تأكد من أن "all.csv" قد تم توليدها وتحتوي على ~999 مركبا (مجموعة فرعية مفلترة). افتح الملف للتحقق من أن كل إدخال يحتوي على سلسلة SMILES صالحة. تعمل بايثون في RStudio بعد تنفيذ ما يلي في وحدة التحكم: مكتبة (reticulate); الشفاف::use_condaenv(اسم كونداينف)
  3. ضع السكريبت "Clustering.py" (الملف التكميلي 1) في نفس المجلد مع "all.csv" وشغله في بيئة تطوير التطوير المفضلة. تقوم السكربتات بتحميل وحدات التجميع، وقراءة ملف سلاسل SMILES، وتجميع المركبات في 50 مجموعة بناء على البصمة الجزيئية وتشابه التانيموت.
    ملاحظة: يتم حفظ 50 هيكلا تمثيليا (rep_struct.csv، في الملف التكميلي 1) في الدليل كقائمة بسلاسل SMILES. تشابه تانيموتو (المعروف أيضا بمؤشر جاكارد في الكيميالية) هو مقياس يستخدم لقياس التشابه البنيوي بين جزيئين بناء على بصماتهما الجزيئية، حيث يتراوح معامل تانيموتو من 0 (بدون تشابه) إلى 1 (بصمات متطابقة). تأكد من أن "rep_struct.csv" يحتوي على 50 إدخالا فريدا في SMILES يمثل كل عنقود.

4. حساب الألفة بين البروتين والليجاند

  1. قم بزيارة خادم الويب الموجه لاكتشاف التجويف باستخدام جهاز AutoDock Vina (CB-Dock2)26.
    1. اذهب إلى تبويب الإرساء وارفع بروتين 4HCO.
    2. لرفع الليجند، انقر على سحب الليغاند والصق ليغاند من قائمة سلاسل SMILES (rep_struct.csv، الملف التكميلي 1). أدخل عنوان بريد إلكتروني في الحقل التالي لتسهيل جمع البيانات المضغوط، ثم اضغط على الالتحام التلقائي الأعمى. كرر ذلك لممثل العنقود الجزيئي الصغير البالغ عددها 49، مع تصنيفها ب lig1، lig2، ...، lig50.
  2. اذهب إلى النتيجة المرسلة عبر البريد الإلكتروني وحمل مجلدات zip إلى مجلد فرعي بعنوان 4HCO، مع تسميتها بشكل عادي (4hco_lig1، 4hco_lig2، ...، 4hco_lig50).
    1. قم بفك ضغط المجلدات وإزالة جميع الملفات باستثناء ملفات معقدة بتقنية البروتين التي تنتهي ب ".complex.pdb".
      ملاحظة: تحقق من أن كل مجلد ليغاند (4hco_lig1 إلى 4hco_lig50) يحتوي على ملف ".complex.pdb" المقابل.
    2. افتح ملف .complex.pdb نموذجي مع محرر نصوص لتدوين معرف سلسلة البروتين: P ومعرف الليغاند A:UNL وأعد ضغط المجلدات باستخدام أداة ضغط الملفات.
    3. قم بزيارة خادم الويب الخاص ب PROtein binDing enerGY (PRODIGY) لتقييم الانتقائية وارتباط البروتين والليغاند27.
      1. انقر على تبويب PRODIGY-lig (جزيء صغير للبروتين) لتحميل مجلد مضغوط يحتوي على عدة مركبات بروتين-ليغاند في نفس الوقت (مثل 4hco_lig1). أدخل معرفات سلسلة البروتين والليجناد، أكمل التحقق من الكابتشا، ثم تابع للنقر على إرسال برودجي ليغاند.
      2. بعد معالجة البيانات، انقر على ملف الأرشيف لجميع المخرجات (.zip) لتحميل النتائج. كرر الخطوة السابقة وجمع النتائج لجميع الأدلة الفرعية حتى 4hco_lig50.
    4. كرر جميع الخطوات للبروتينات 4XB0 وPLK3 مع انتباه دقيق لتسمية الملف (مثل 4xb0_lig1 أو plk2_lig1).
      ملاحظة: تأكد من أن CSVs المخرجات لجميع مركبات البروتين-الليجند تم تحميلها وتحتوي على أعمدة بيانات ΔG وبقايا الواجهة.

5. تقييم ADMET-S

  1. قم بزيارة منصة ADMETlab3 3.0رقم 28.
    1. انقر على "ابدأ تحت "فحص ADMET" وأدخل قائمة ب SMILES.
      1. افتح rep_struct.csv في مجلد للصق قائمة سلاسل SMILES كاملة في حقل النص وتقديمها.
      2. قيم خصائص الحراكيات الدوائية وخصائص الشبه الدوائي باستخدام نظام التقييم الملون على المنصة وتحميل نتائج التقييم كملف .csv لمزيد من التحليل.
      3. انتقل إلى أداة SwissADMEرقم 29.
  2. قم بلصق قائمة سلاسل SMILES لجميع الجزيئات الخمسين في حقل الإدخال.
    1. انقر على Run لحساب خصائص التوافر الحيوي والنفاذية، بما في ذلك اختراق BBB.
    2. قم بتنزيل المخرج كملف .csv للتكامل مع نتائج ADMET الأخرى.
  3. قم بتنزيل وتثبيت ToxTree30 (تقدير المخاطر السامة بنظام شجرة القرار) المتوافق مع نظام تشغيل المستخدم.
    1. افتح البرنامج عبر الطرفية باستخدام الأمر: sh Toxtree.sh
    2. أدخل سلاسل SMILES بشكل فردي في ToxTree لتصنيف السمية بناء على قواعد كريمر.
    3. تصدير النتائج كملف .csv للتكامل مع بيانات ADMET الأخرى.
      ملاحظة: تحقق من أن CSV الناتج من ADMETLab3 وSwissADME يتطابق مع عدد الروابط (n = 50) وأن نتائج Toxtree تصنف كل مركب وفقا لقواعد كرامر (I–III).
  4. بعد تثبيت ORCA31، أنشئ مجلدا باسم stability في دليل العمل والمجلدات الفرعية لكل جزيء (مثل plk1_lig1، plk1_lig2، ...، plk1_lig50).
    1. استخدم أفوغادرو (أفوغادرو) لبناء كل جزيء من سلسلة SMILES الخاصة به: اذهب إلى تبويب الامتدادات واضغط على تحسين الهندسة لتحسين الجزيء. إنشاء ملفات إدخال ORCA عبر امتدادات > ORCA > توليد مدخلات ORCA وتطبيق الإعدادات التالية:
      ! تردد B3LYP OPT DEF2-TZVP
      ٪maxcore 4000
      ٪pal
      NPROCS 1
      النهاية
    2. عدل ملف الوظيفة .sh المحمل لكل ليغاند ليشمل أسماء وظائف فريدة وعنوان بريد إلكتروني. بعد ذلك، نقل دليل "الاستقرار" إلى نظام حوسبة عالي الأداء (HPC) باستخدام الأوامر التالية:
      SSH xsedeu0000@darwin.hpc.udel.edu
      mkdir ~/4hco
      SCP -r /local/path/to/stability xsedeu0000@darwin.hpc.udel.edu:~/4hco
    3. نفذ المهام عبر أداة لينكس البسيطة لإدارة الموارد (مدير عبء العمل SLURM لتجمعات HPC) باستخدام سكريبت حلقي:
      ل i في {1..50}; قم
      CD ~/4HCO/stability/plk1_lig${i}
      chmod +x job_lig${i}.sh
      sbatch job_lig${i}.sh
      تم
    4. بعد استلام رسائل إنجاز المهمة، انتقل إلى مجلدات الليجاند وافتح ملفات الإخراج لمراجعة البيانات وتدوين قيم HOMO و LUMO:
      CD ~/4HCO/Stability/plk1_lig1
      nano lig1.out

6. تحليل بيانات ADMET-S

  1. اجمع بيانات الخصائص الفيزيائية والكيميائية المستمدة من مخططات رادار التوافر الحيوي والنفاذية في SwissADME في ملف .csv.
    1. احفظ ملف .csv من SwissADME واسمه "Physiochemical.csv".
    2. ضع السكريبت "Physiochemical.py" (الملف التكميلي 1) في نفس المجلد مع "Physiochemical.csv" وشغله.
    3. تطبيق المعايير التالية: nHD: 0–7، nHA: 0–12، nStereo: <2، LogP: 0–3، LogD: 1–3، LogS: –4 إلى 0.5، Fsp3: >0.41، وnHet: 1–15.
  2. استند بيانات الامتصاص والتوزيع من SwissADME.
    1. لقطة وحفظ مخطط BOILINGEgg 32 في SwissADME.
    2. تطبيق المعايير التالية: يجب أن تقع الجزيئات في منطقة "البيضة" وتعمل كمثبطات لبروتين p، حيث يفضل النقاط الحمراء.
  3. استند بيانات الأيض من ADMETlab3.0 لركيزة ومثبطات السيتوكروم (CYP).
    1. احفظ .csv الملف من ADMETlab3.0 واسمه "Metabolism.csv".
    2. عدل ملف .csv واحتفظ فقط بأعمدة CYP-inh و CYP-sub.
    3. ضع سكريبت "Metabolism.R" (الملف التكميلي 1) في نفس المجلد مع "Metabolism.csv" وشغله.
    4. تطبيق المعايير التالية: يفضل مثبط CYP p450 وغير الركيزة كفئة 0.
  4. استند بيانات الإخراج من ADMETlab3.0 لإزالة البلازما ونصف العمر.
    1. احفظ .csv الملف من ADMETlab3.0 واسمه "Excretion.csv".
    2. قم بتعديل ملف .csv واحتفظ فقط بأعمدة cl-plasma و t0.5.
    3. ضع السكربت "Excretion.py" (الملف الإضافي 1) في نفس المجلد مع "Excretion.csv" وشغله.
    4. تطبيق المعايير التالية: إزالة البلازما: 0.01–5 مل/دقيقة/كجم.
    5. nبيانات السمية من توكستري لفئة السمية وADMETlab3.0 لعدد السموم.
      1. احفظ .csv من ADMETlab3.0 واسمه "Toxicity.csv".
      2. عدل ملف .csv، مع الاحتفاظ فقط بعمود توكسيكوفور، وإضافة عمود جديد يسجل كل فئة سمية في كل ليغاند من Toxtree.
      3. ضع السكريبت "Toxicity.py" (الملف التكميلي 1) في نفس المجلد مع "Toxicity.csv" وشغله.
      4. طبق المعيار التالي: عدد السموم ليكون 0–2.
    6. اشتقاق بيانات الاستقرار من ملفات إخراج ORCA. ("طاقة المدار"، وتحديدا قيم طاقة HUMO وLUMO).
      1. أنشئ مخطط Excel يسجل طاقات HUMO وLUMO لكل ليغاند كأعمدة منفصلة.
      2. أضف عمودا جديدا لحساب فجوة النطاق (HUMO–LUMO = فجوة النطاق).
      3. احفظ مخطط Excel ك "Stability.csv".
      4. ضع السكريبت "Stability.py" (الملف التكميلي 1) في نفس المجلد مع "Stability.csv" وشغله.
      5. طبق المعايير التالية: فرق فجوة النطاق بين 3.6–5 إلكترون فولت.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يضمن بروتوكول ملف بنية البروتين المستهدف تحسين ملف البروتين المستهدف للتحليل والالتحام القائم على الهيكل. ملف البنية الناتج، بصيغة PDB، خال من البقايا والهيدروجين المفقودة، وأنواع الذرات المفقودة، والمكونات غير الضرورية مثل جزيئات الماء والروابط المتبلورة معا. توضح الأشكال 1A,B الفروقات البصرية (موضحة بواسطة Mol* Viewer33) في الهياكل قبل وبعد التحضير. إذا بقيت أي مشاكل في التنسيق المتبقية (مثل أسماء ذرات غير معروفة أو بقايا غير مكتملة)، عادة ما يصدر CB-Dock2 خطأ عند الرفع. عندها، يمكن تطبيق تصحيحات يدوية بسيطة، مثل إعادة تسمية HSD إلى HIS أو إزالة البقايا غير القياسية قبل إعادة محاولة خطوة الإرساء.

يوضح الشكل 2 نتائج التجميع من خلال تحليل المكونات الرئيسية (PCA) بناء على البصمة الجزيئية وتشابه التانيموتو. في الشكل، كل عنقود مجمع بواسطة بيضاوي رمادي يحتوي على نقاط متشابهة اللون، تمثل الجزيئات في تلك العناصر.  توفر مكونات PCA 1 و2 على المحاور تمثيلا خطيا ثنائي الأبعاد للاختزال من العناصر عالية الأبعاد في مصفوفات تانيموتو. في هذه الدراسة، يستخدم تشابه التانيموتو خلال خطوة أخذ العينة العنقودية لتقليل التكرار وتعزيز التنوع الكيميائي بين 999 منتجا طبيعيا متوافقا مع ليبينسكي. من خلال حساب تشابهات التانيموتو الزوجية باستخدام بصمات الجزيئات، يتم تقسيم مجموعة البيانات إلى 50 مجموعة من المركبات المرتبطة بنيويها. يتم بعد ذلك اختيار جزيء تمثيلي واحد من كل عناقود، مما يضمن أن المجموعة النهائية من 50 رابطا تلتقط مساحة كيميائية واسعة مع تقليل التكرار الحسابي في تحليلات الالتحام اللاحق وADMET-S. تعزز هذه الاستراتيجية كفاءة وتمثيلية الفحص الافتراضي، خاصة عند العمل مع مكتبات المنتجات الطبيعية الكبيرة مثل Supernatural 3.0. (انظر الشكل 2).

يتم محاكاة الوضعيات المثلى لكل مركب بروتين ورابط، مصحوبة بتوقعات متوقعة على شكل درجات فينا بين أوضاع CurPocket الخمسة لبروتين PLK1 في CB-Dock2، مع الأخذ في الاعتبار قوى فان دير فالس والروابط الهيدروجينية.  مثال محاكاة لليغاند 1 في الشكل 3 تظهر أفضل ارتباط بوضعية CurPocket الثانية (C2)، مع أقل درجة فينا هي –7.5 كيلو كالوري/مول، مقارنة بالوضعيات الأربع العليا الأخرى. يتم الالتحام الجزيئي مع CB-Dock2 من خلال دالة تسجيل تعتمد على معلمات تجريبية وخوارزمية تحسين عالمي عشوائي. تم التحقق بدقة من CB-Dock2 وأظهر أداء متفوق مقارنة بأدوات الالتحام العمياء المتطورة الأخرى، مما يجعله خيارا ممتازا لدراسات الالتحام26,34. يحقق الخادم معدل نجاح يقارب 85٪ في توقع وضعية الربط (RMSD <2 Å)، متفوقا على الأدوات الشهيرة، بما في ذلك الإصدار الأول من CB-Dock، وSwissDock، وCOACH-D، وMTiAutoDock34. تعزى هذه الدقة العالية إلى دمج CB-Dock2 المبتكر لنظامين تكميليين للالتحرس: النهج القائم على البنية والقالب المعتمد.

يوضح الشكل 4 خريطة حرارية لمتوسط الألفة المتوقعة لكل تركيبة بروتين-ليجاند باستخدام التقاربات المتوقعة من قبل خادم الويب PRODIGY.  التوافقات الأعلى، التي تمثل بطاقة مولية منخفضة (kcal/mol) وتلوين خريطة الحرارة الأخضر، هي متعلقات ارتباط مفضلة. في المقابل، فإن التوافقات المنخفضة، التي تمثل الطاقات الضاربية الأعلى وتظليل خريطة الحرارة الأكثر احمرارا، أقل ملاءمة. من منظور الانتقائية، من المثالي وجود مركبات ذات تقارب إيجابي للبروتين المستهدف (PLK1) مقارنة بالنظائر (PLK2–3). على سبيل المثال، ليغاند 27 هو ليغند انتقائي PLK1-PBD بالنسبة للليغاند 45، ويظهر تشابه في التشابه بين البروتينات الثلاثة. على الرغم من أن الضربات 3، 5، 6، 7، 27، 28، 34، 35 و49 تظهر ألفة أعلى ل PLK1-PBD مقارنة بPLK2/3، إلا أنها متنوعة كيميائيا في فضاء البصمات ثنائية الأبعاد (متوسط ECFP4 Tanimoto ≈ 0.135، لا زوج ≥ 0.50)، مما يشير إلى أن أي خصوصية أوسع على الأرجح مدفوعة بهندسة جيوب PBD المحفوظة وأنماط الدواء/التفاعل ثلاثية الأبعاد المشتركة بدلا من هوية السقالات. تشمل التوصيات مقارنة التفاعل مع البصمة ورسم خرائط الأدوية لتحديد المحددات الهيكلية للتعرف على PLK1-PBD.

تظهر نتائج تقييم الخصائص الفيزيائية الكيميائية في مخطط رادار (الشكل 5). تشمل الخصائص التي تم تقييمها التفاعلات الذرية، والذوبانية، والتوافر الحيوي. تتميز بعض المركبات بخصائصها الفيزيائية-الكيميائية الأكثر رغبة مع النطاقات المقبولة: nHD = 0–7، nHA = 0–12، nStereo < 2، LogP = 0–3، LogD = 1–3، LogS = –4 إلى 0.5، Fsp3 > 0.41، وnHet = 1–15. يوفر هذا المخطط الراداري تصورا شاملا ومتعدد الأبعاد للخصائص الفيزيائية والكيميائية ل 50 ليغاند ممثلة تم تحديدها في سير عمل الفحص الحاسوبي. تم تصميمه لتقييم مدى التزام كل مركب بمعايير "شبيهة بالأدوية" المحددة مسبقا من خلال رسم خصائصه مقابل الحدود الدنيا والعليا المحددة. يعرض المخطط عشرة أوصاف جزيئية رئيسية مرتبة حول المحور القطبي، بما في ذلك pKa الحمضي وpKa الأساسي. المساحة المظللة بين المضلع الأخضر (الحد الأدنى) والمضلع الأزرق (الحد الأعلى) كانت تحدد النطاق المثالي أو المقبول لكل خاصية، بناء على العتبات المقدمة في البروتوكول. تم تحديد الحدود العليا والدنيا لحمض pKa (2–12) وقاعدة pKa (3–10) بناء على مراجعات الأدبيات 35,36,37، حيث لا يوجد حد أعلى وسفلي واحد ل pKa في اكتشاف الأدوية. كل خط ملون يمثل أحد الليغاندات الخمسين. الشكل المتكون من ربط نقاط البيانات للرابطة الواحدة يظهر ملفه عبر الخصائص العشر المختارة في نفس الوقت. الغالبية العظمى من الروابط الخمسين تقع ضمن أو قريبة جدا من المنطقة المقبولة التي تحددها المضلعات الخضراء والزرقاء. يشير هذا إلى أن خطوات التصفية الأولية، وخاصة تطبيق قاعدة ليبينسكي الخمسة والتجميع القائم على تشابه تانيموتو، كانت فعالة للغاية في إثراء مجموعة البيانات بجزيئات ذات خصائص دوائية مفضلة. يوصى بعرض النطاق الكامل للقيم الموثقة لجميع المعلمات.

الشكل 6A–C يصور مكونات بيانات ADME من ADMETlab3.0 وSwissADME. بدءا من الامتصاص والتوزيع، يمثل نموذج CELED-Eggرقم 38 في الشكل 6A من SwissADME امتصاص وتوزيع الأدوية عبر الجاذبية والنفاذية، كما هو موضح من القطع الناقص الأصفر والبيضاء في الرسم البياني. تشمل ركائز P-gp ومثبطات، ممثلة بنقاط زرقاء وحمراء على التوالي، حيث يكون تثبيط P-gp أمرا بالغ الأهمية لمعدلات امتصاص أعلى. في الشكل 6B، تظهر خريطة حرارة الأيض تثبيط وركيزة حوالي 7 أنواع من إنزيمات السيتوكروم p450 من CYP. النتيجة المرغوبة للروابط هي أن تعمل كمثبطات وغير مثبطات وغير ركائز CYP (خضراء)، مع النتائج المفضلة التي تؤكد ملف سلامة دوائي آمن مع عدم وجود تداخلات دوائية منخفضة أو منخفضة. يمثل الشكل 6C بيانات الإخراج الخاصة بإزالة الدواء ونصف عمره. يمكن تمييز الإفراز من خلال الإزالة المثلى للبلازما (<5 مل/دقيقة/كجم). يعتمد نصف عمر الدواء لجميع أدوية مكافحة السرطان على آلية عمل الدواء، وسميته، وهدفه. يوازن نصف العمر المثالي بين الحفاظ على تركيزات الأدوية ضمن نافذة علاجية مع تقليل السمية والسماح بجداول جرعات مريحة 39,40.

يتم تصوير مزيج من نوعين من تقييمات السمية. في الشكل 7A، يظهر عدد السموم التي تم تحديدها بواسطة ADMETlab3.0 لكل ليجند.  لا يوجد حد محدد أو معلومات حول النطاقات المقبولة للسموم السمية.  في الشكل 7B، يوفر تطبيق توكستري معلومات تتعلق بفئة السمية (I-III) بالإضافة إلى انتهاكات قواعد كرامر والالتزام بها. تظهر عينة الليغاند 1 نتائج السمية ورمز SMILES الخاص بها في الشريط العلوي، مع الهيكل في النافذة السفلية اليسرى. يشير تحديد السمية الفئة في نافذة أعلى اليمين إلى سمية عالية (الفئة الثالثة) بناء على قواعد كرامر للرابطة 1، بدلا من احتمالات أخرى مثل الفئة الثانية (السمية المتوسطة) أو الفئة الأولى (السمية المنخفضة).  تظهر النافذة السفلية اليمنى الاستدلال المكتوب لتحديد الفئة بناء على شجرة قرارات قاعدة كرامر.

حسابات ORCA QM لتردد الاهتزازات للهياكل المحسنة تحسب قيم طاقة المدارات لتحديد فجوة النطاق. يوضح الشكل 8 فجوة الشريط (eV) لكل ليجند مشتقة من الفرق بين HOMO و LUMO. يمثل نطاق العتبة في المنطقة المظللة بين 3.6 إلكترون فولت و5.0 إلكترون فولت، حيث تحقق كل نقطة في المنطقة المظللة مستويات الطاقة المرتبطة بالاستقرار والتفاعل الأكثر رغبة. يلخص الشكل 9 نظرة عامة على سير العمل الحسابي بأكمله، الذي يوضح المراحل المتسلسلة من تحضير البروتين المستهدف وفحص قاعدة بيانات المنتجات الطبيعية إلى تقييم ADMET-S، المصمم لتحديد مثبطات PLK1-PBD الانتقائية مع ضمان خصائص شبيهة بالأدوية واستقراره الكيميائي. تؤكد خارطة الطريق البصرية هذه على قابلية البروتوكول للنمطية، وسهولة الوصول، وملاءمته للتنفيذ التعليمي.

يقوم الجدول 1 بتشغيل البروتوكول من خلال تحويله من تسلسل خطي للتعليمات إلى خط أنابيب قوي وواع للأخطاء مناسب للاستخدام في الفصول الدراسية والبحثية المستقلة. يتناول صراحة قابلية التكرار، وهو تحد معروف في اكتشاف الأدوية الحاسوبية، من خلال تضمين معايير التحقق في نقاط انتقال رئيسية. على سبيل المثال، التأكد من أن بقايا الهيستيدين تصنف بشكل موحد ك "HIS" بعد معالجة CHARMM-GUI يمنع حدوث أعطال صامتة في الالتحام اللاحق، بينما يتجنب التحقق من سلامة SMILES قبل التجميع الأخطاء المتسلسلة في توقع ADMET. يبرز الجدول أيضا التصميم التربوي، حيث يمكن تنفيذ كل نصيحة لحل المشكلات مع خلفية حسابية بسيطة (على سبيل المثال، "افتح .complex.pdb في محرر نصوص للتحقق من معرفات السلسلة"), بما يتماشى مع هدف المخطوطة في الوصول إلى الصم وطلاب البكالوريوس والدراسات العليا وطلاب المدارس الثانوية. علاوة على ذلك، من خلال تحديد الخطوات التي تؤثر فيها النتائج بشكل غير متناسب، مثل تقييم الانتقائية عبر تقييم PRODIGY المقارن، يساعد الجدول المستخدمين على ترتيب أولويات الانتباه والموارد.

من نقاط القوة الرئيسية لهذا السير المتكامل قدرته على كشف التناقضات بين التنبؤات الحاسوبية التكميلية، كاشفا عن حالات حاسمة تبرز حدود أي طريقة واحدة. على سبيل المثال، أظهر الليجند 5 ل PLK1-PBD درجة Vina قوية في CB-Dock2 (−7.9 كيلو كالوري/مول) وألفة PRODIGY مفضلة (ΔG = −9 كيلو كالوري/مول، الشكل 4) لكنها فشلت في عدة مرشحات ADMET. لم يكن يتوافق مع نموذج امتصاص وتوزيع البيض المسلوق، حيث أظهر قيمة إزالة بلازما أقل رغبة (9.3 مل/دقيقة/كجم، الشكل 6)، مما يشير إلى التخلص السريع، وتم تصنيفه كتصنيف كرامر الفئة الثالثة (سمية عالية) من قبل توكستري الذي يحتوي على خمسة سموم (الشكل 7A). وعلى العكس، أظهر ليغاند 33 ألفة PLK1 متوقعة ب PRODIGY (−5.4 كيلو كالوري/مول) لكنها استوفيت جميع معايير ADMET، مما أظهر سمية منخفضة (الفئة الأولى)، وLogP الأمثل (0.7)، وتوزيع امتصاص وتنظيف بلازما ملائم. على الرغم من ضعف تقاربه، فإن ليغاند 33 مرشح يشبه المخدرات أكثر. هذا التباين يوضح مبدأ أساسيا في اكتشاف الأدوية في مراحلها المبكرة: أن الألفة العالية للارتباط وحدها غير كافية بدون حركيات دوائية وسلامة مناسبة. وفي الوقت نفسه، قد توفر مركبات مثل الليغاند 5، رغم ضعف أداء ADMET، أفكارا قيمة للتحسين المستقبلي لتحسين السلامة أو الاستقرار الأيضي دون المساس بفعاليتها.

على الرغم من أن المرشحات المبكرة في هذا السير تهدف إلى الفرز وتحديد الأولويات، وليس الاستبعاد الدائم، فإن تبسيط المرشحين الخمسين يصنف بعضهم ك "أفضل النتائج" من خلال تطبيق حدود مرغوبة متاحة من أدوات ADMET والأدبيات. من بين 50 ليغاند تم تقييمها عبر 114 وصفا إلكترونيا ومرتبطا ب ADMET، استوفى 13 منها ما لا يقل عن 95 من معايير الخصائص المرغوبة. من بين هذه المركبات، أظهرت ستة مركبات (10، 13، 14، 32، 43، و47) ملفات تعريف ADMET-S مواتية وارتباط أعلى ل PLK1-PBD مقارنة ب PLK2/3، وبالتالي تم تصنيفها كأفضل مثبطات مرشحة (الشكل 10). كشفت تحليلات التشابه البنيوي الوظيفي والكمية المقارنة أن الضربات المحددة تشترك في خصائص دوائية رئيسية مع مثبطات PLK1-PBD المعروفة، مما يشير إلى احتمال تقارب في سلوك الارتباط. جميع الضربات احتوت على سقالات عطرية أو غير متجانسة تعكس أنظمة الحلقات الكارهة للماء مثل TQ وPoloxin وAllopole-A، مما يتيح تفاعلات π–π وكارهة للماء داخل جيب PBD. كان التداخل الوظيفي واضحا من خلال رموز الروابط الهيدروجينية المحفوظة (مجموعات الكربوكسيل والأميد والكربونيل) المشابهة لتلك التي تتوسط الاتصالات القطبية الرئيسية في مثبطات المرجع. الروابط المرنة في الأليفاتي والدورية الموجودة في عدة ضربات تتوازى مع التكيف التشكيلي لنظائر البولوكسين، مما يسهل التوجه نحو بقايا الارتباط الأساسية. كميا، أكدت درجات التشابه في تانيموتو (0.36–0.54) تشابها هيكليا متوسطا بين الضربات والمثبطات المعروفة، حيث كانت الضربات 10 و13 و14 أكثر تشابها مع البولوكسين، والضربة 32 مع TQ، والضربات 43 و47 مع Allopole-A. تسلط هذه النتائج مجتمعة الضوء على تداخل واضح في البنية والوظيفة، مما يشير إلى أن الضربات من المحتمل أن تحاكي طوبولوجيا الارتباط وأنماط التفاعل لمثبطات PLK1-PBD المثبتة مع الاحتفاظ بالجدة الكافية لمزيد من التحسين (الشكل 10).

لتقييم متانة سير العمل الحسابي، تم تحليل مثبطات PLK1-PBD المعروفة (Poloxinpan14 و Allopole-A15) كعوامل ضابطة إيجابية، مع وجود ميتفورمين وإميغليمين (وهما دواءان مضادان للسكري غير مرتبطين بهيكليا ولم يتم الإبلاغ عن نشاط PLK1-PBD) كعوامل ضيبية في الضوابط عبر تحليلات ADMET-S، والالتحاط، والارتباط. أظهرت الضوابط الإيجابية تقاربات ارتباط –5.8 و–5.6 كيلو كالوري/مول على التوالي، بينما أظهرت الضابطات السلبية ألفة أضعف بين –5.1 كيلو كالوري/مول (ميتفورمين) و–4.8 كيلو كالوري/مول (إيميغليمين)، مما يتوافق مع نقص نشاط ارتباطهم ب PBD. ومن المثير للاهتمام أن تقييم ADMET-S كشف أن الضوابط السلبية استوفت أوصاف أكثر رغبة (88 من أصل 114 خاصية) مقارنة بالعوامل الإيجابية (80 من 114)، مما أكد قدرة سير العمل على التمييز بين تفضيل الحراكية الدوائية وإمكانات الارتباط الخاصة بالهدف. تعزز هذه الروابط أهمية الحفاظ على منظور متوازن: فلا ينبغي التخلص من المركبات مبكرا فقط بناء على توقعات ADMET غير المثالية إذا أظهرت تقارب أهداف قوي، حيث قد توفر مثل هذه السقالات نقاط انطلاق قيمة للتحسين. وعلى العكس، قد تكون الجزيئات ذات الخصائص الدوائية الممتازة ولكن الارتباط الضعيف نماذج منخفضة المخاطر لتطوير التناظر. هناك حاجة لمزيد من التحقق الكيميائي الحيوي والخلوي لتأكيد هذه الملاحظات الحسابية وتحسين معايير تحديد الأولويات.

figure-results-1
الشكل 1: مقارنات هيكلية بين هيكل رباعي الهيكل غير الجاهز وهيكل 4HCO المجهز بواجهة CHARMM-GUI. (أ) هيكل 4HCO يرفع مباشرة من PDB، مع تسليط الضوء على البقايا المفقودة. (ب) هيكل 4HCO بعد بروتوكول تحضير CHARMM-GUI. تم اختيار 4HCO (مرتبط PLK1-PBD ب TQ) لأنه من بين البلورات القليلة PLK1-PBD المرتبطة بالرابطة العضوية، مما يجعله قابلا للتطبيق المباشر على اكتشاف مثبط جزيئات صغيرة قائم على البنية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: تحليل المكونات الرئيسية (PCA) ل 999 منتجا طبيعيا متوافقا مع ليبينسكي بعد تجميع المتوسطات K بناء على البصمة الجزيئية وتشابه التانيموتو. كل نقطة تمثل مركبا، ملونة حسب العنقود المخصص لها (1–50)، مع تجمع المجموعات بواسطة قطع ناقص رمادي لتأكيد التشابه الكيميائي. يشير التجميع الضيق داخل المجموعات والفصل بينها إلى أن التجميع القائم على التانيموتو نجح في تقليل التكرار الهيكلي مع الحفاظ على التنوع الكيميائي عبر مجموعة البيانات. يضمن هذا التنوع أن الروابط التمثيلية الخمسين المختارة للالتحام أسفل النهر تمتد عبر منطقة واسعة من الفضاء الكيميائي، مما يعزز متانة وقابلية تعميم نتائج الفحص الافتراضي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: يحدد الالتحام الأعمى في CB-Dock2 وضعية ارتباط عالية الألفة لليغاند 1 ضمن نطاق صندوق البولو-بوكس PLK1 (PBD). يمثل الشكل المعروض ل CurPocket C2 (درجة فينا = −7.5 كيلو كالوري/مول) الوضعية المثلى بين خمسة مواقع ارتباط متوقعة، تتميز باتصالات فان دير فالس المواتية والروابط الهيدروجينية مع بقايا PBD الرئيسية (Trp414، His538، و Lys540). تؤكد هذه النتيجة استخدام الالتحام الأعمى القائم على البنية لتحديد جيوب الربط البيولوجية ذات الصلة في غياب رابطة متبلورة، مما يوضح كيف يعطي سير العمل الأولوية للوضعيات ذات أقوى طاقة ارتباط متوقعة لتحليل الانتقائية في مرحلة لاحقة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: خريطة الحرارة لخادم الويب PRODIGY تنبأت بالألفة بواسطة تركيبات البروتين والليجند. تعالج خريطة الحرارة مباشرة التداخل بين الروابط عند ربطها ب PLK1 وPLK2 وPLK3. بينما تظهر بعض الليغاندات (بما في ذلك الليغاند 45) تقاربات ارتباط مماثلة بين جميع أشكال PLK الثلاثة، مما يشير إلى ضعف الانتقائية، تظهر أخرى (لا سيما الليجندات 3، 5، 6، 7، 27، 28، 34، 35، و49) تفضيلا قويا ل PLK1 (ΔΔG ≥ 3.0 كيلو كالوري/مول مقابل PLK2/PLK3)، وهو ما يتماشى مع هدف التثبيط الانتقائي ل PBD. كميا، يظهر 20 من أصل 50 رابطا انتقائية تقارب الضعف الثنائي ل PLK1 مقارنة بكل من PLK2 وPLK3 بناء على قيم ΔG المتوقعة من PRODIGY. يعزى هذا الارتباط التفاضلي إلى التغيرات الطفيفة في جيوب ربط PBD، والتي يلتقطها بروتوكول الالتحام الأعمى. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5: تمثيل الخصائص الفيزيائية الكيميائية المجمعة من ADMETlab3.0 وSwissADME. المعلمات هي: nHD = عدد مانحي الهيدروجين، nHA = عدد مستقبلات الهيدروجين، pKa الأساسي، pKa الحمضي، nStereo = عدد مراكز المجسم، LogP = n-أوكتانول/معامل توزيع الماء، LogD = n-أوكتانول/معامل توزيع الماء عند pH=7.4، LogS = قيمة الذوبان المائي، Fsp3 = عدد الكربون المهجين sp3/إجمالي عدد الكربون، وnHet = عدد الذرات غير المتجانسة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-6
الشكل 6: مزيج من نتائج ADME من ADMETlab3.0 و SwissADME. (أ) مخطط البيض المسلوق بين وايلدمان-كريبين لوج بي (WLOGP) ضد المساحة السطحية القطبية الطوبولوجية (TPSA) من SwissADME تمثل نفاذية الحاجز الدموي-الدماغي (BBB) للامتصاص والتوزيع في منطقة الصفار الصفر، والامتصاص عبر الجهاز الهضمي (HIA) في القطع الناقصة البيضاء، وركائز بروتين P الجليكوبروتين وغير الركائز في النقاط الزرقاء والحمراء على التوالي. تعتبر الجزيئات التي تقع خارج "البيضة" ذات امتصاص وتوزيع ضعيفين. (ب) خريطة حرارية لعملية الأيض مع معرفات مختلفة من السيتوكروم P450 (CYPs) التي تتعلق باستقرار أيض الكبد البشري (HLM)، حيث يعمل الأحمر كمثبطات/ركائز واللون الأخضر كغير مثبط/غير ركائز، مما يترك اللون الأخضر هو المرغوب فيه. (ج) الإخراج يشمل المعاملات، وإزالة البلازما، ونصف العمر. يشير الخط الأحمر المنقط إلى خلوص البلازما المرغوب فيه (<5 مل/دقيقة/كجم)، بينما يشير 5-15 مل/دقيقة/كجم و>15 مل/دقيقة/كجم إلى الارتفاع المتوسط والعالي على التوالي.  يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-7
الشكل 7: يكشف التنميط المتكامل للسمية عن مسؤوليات أمنية حرجة بين الليغاندات التي تم فحصها. (أ) توزيع أعداد السموم عبر 50 منتجا طبيعيا ممثلا، كما تنبأ بها ADMETlab3.0. (ب) نتائج عينة من السمية للرابطة 1، تشير إلى سمية الفئة الثالثة المميزة باللون الأحمر، مع شرح مطول لقواعد كرامر ذات الصلة مذكور في مربع النص أدناه. يتيح هذا النهج المزدوج للتقييم (فئة السموم + فئة كريمر) الفرز المبكر للمركبات عالية الخطورة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-8
الشكل 8: طاقات فجوة النطاق HOMO–LUMO (بوحدة eV) ل 50 ليغاند طبيعي مشتق من النوت، محسوبة باستخدام ORCA على مستوى النظرية B3LYP/def2-TZVP. تشير المنطقة المظللة (3.6 إلى 5.0 إلكترون فولت) إلى نافذة الاستقرار المثلى: فجوات الشريط تحت 3.6 إلكترون فولت تشير إلى تفاعل كيميائي عالي أو احتمال التحلل الضوئي، بينما قد تشير القيم فوق 5.0 إلكترون فولت إلى ضعف الاستقطاب الإلكتروني وانخفاض القدرة على التكيف مع الربط. تظهر الليغاندات التي تقع ضمن هذا النطاق توازنا إيجابيا بين الاستقرار الحركي والاستجابة الجزيئية، مما يدعم أولويتها كمرشحين محتملين لمثبطات PLK1-PBD. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-9
الشكل 9: مخطط تدفق لسير عمل اكتشاف الأدوية الحسابي ثنائي اللغة. يبدأ خط الأنابيب بتحضير هياكل PBD PLK1-PLK3، تليها فحص مركز بيانات Supernatural 3.0 على أساس الأمراض والترشيح عبر قاعدة ليبينسكي الخمسة (الوزن الجزيئي ≤ 500 دالتون، متبرعون بروابط الهيدروجين ≤ 5، المستقبلات ≤ 10، LogP ≤ 5). يتم اختيار المركبات التمثيلية بعد التجميع ثم تقييمها من خلال التصاق البروتيني-الرابط، والتنبؤ بالألفة المرتبطة بالارتباط، والتحليل الشامل ل ADMET-S، بما في ذلك الامتصاص، والتوزيع، والتمثيل الغذائي، والإخراج، والسمية، وتقييم استقرار الكم. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-10
الشكل 10: التداخل البنيوي والوظيفي المقارن بين الروابط المرشحة العليا ومثبطات PLK1-PBD المعروفة. يسلط الشكل الضوء على أفضل ستة مركبات مرشحة (10، 13، 14، 32، 43، و47) تم تحديدها من خلال تحليلات الفحص الافتراضي، والتجميع، والتقارب، وتحليل ADMET-S. وقد استوفت هذه الروابط ما لا يقل عن 95 من أصل 114 وصفا فيزيائيوكيميائيا ودوائيا مرغوبا، وأظهرت تقارير ارتباط أعلى ل PLK1-PBD مقارنة ب PLK2/3. لتقييم التقارب البنيوي والوظيفي المحتمل، تمت مقارنة كل ليغاند مع مثبطات PLK1-PBD المعروفة TQ وPoloxin وAllopole-A، استنادا إلى الزخارف الدوائية الأساسية المشتركة ومعاملات تشابه تانيموتو الزوجية (بصمات ECFP4). تشير درجات التشابه المتوسطة (0.36–0.54) والمجموعات الوظيفية الشائعة مثل الحلقات العطرية أو غير العطرية، أزواج المتبرع/المستقبل للرابطة الهيدروجينية، والروابط الكارهة للماء إلى وجود تداخل جزئي في خصائص الربط. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مرحلة سير العملنقطة تفتيش وسيطة (كيفية تأكيد النجاح)الخطوة الحرجة (لماذا تحدد النجاح/الفشل)المشاكل الشائعة وإرشادات استكشاف الأخطاء
1. تحضير البروتين المستهدف• تحميل ملف PDB بدون أخطاء في عرض Mol*.
• لا توجد بقايا مفقودة في جيب الربط (فحص بصري).
• بقايا الهيستيدين الموسومة ب "HIS" (وليس HSD/HSE)		تركيب البروتين غير الدقيق → جيوب ربط زائفة → أوضاع التحام مضللة. يضمن CHARMM-GUI التشكيل الأولي الصحيح، ووضع الهيدروجين، وإزالة المياه/الليجند.المشكلة: CB-Dock2 يرفض ملف PDB. الحل: إزالة البقايا غير القياسية، والتأكد من وجود سلسلة البروتين فقط، وتوحيد أسماء الذرات/البقايا باستخدام محرر نصوص.
2. تصفية المنتجات الطبيعية (قاعدة ليبينسكي الخامسة)• "all.csv" يحتوي فقط على SMILES الصالحة (غير فارغة، قابلة للتحليل كيميائيا).
• عدد المباريات المتوقع (مثلا، 999/1,193).		SMILES غير الصالح يتسبب في تعطل RDKit، خوادم الإرساء، وأدوات ADMET. يجب أن يحافظ الترشيح على صلاحيته الكيميائية.المشكلة: يفشل السكريبت أثناء التجميع. تصحيح: إضافة التحقق من صحة SMILES باستخدام Chem.MolFromSmiles(smiles, sanitize=True) بلغة بايثون؛ سجل وقم بإزالة الإدخالات غير الصحيحة قبل المتابعة.
3. أخذ عينات عنقودية• 50 ابتسامة فريدة في "rep_struct.txt".
• مخطط PCA (الشكل 2) يظهر فصلا واضحا للعناقود.		التجميع الضعيف → الممثلين الزائدين أو غير المتنوعين → الفحص غير الفعال.المشكلة: جميع الجزيئات تتجمع في مجموعة واحدة.
الحل: تحقق من نوع البصمة (مثل Morgan/ECFP4)، عتبة Tanimoto، وتوحيد SMILES. فكر في زيادة عدد المجموعات إذا كان التنوع منخفضا.
4. الالتحام بين البروتين والليجاند (CB-Dock2)• كل ليغاند يعيد ≥1 ملف ".complex.pdb".
• درجات فينا سالبة (مثلا، ≤ −5 كيلو كالوري/مول).
• الليجند يوضع في CurPocket (وليس على السطح).		الالتحام يحدد وضعية الربط والتوافق. وضعية خاطئة → توقعات PRODIGY الخاطئة.المشكلة: فشل الوظيفة، أو أن الليجاند لم يتم توصيله. الإصلاح: إعادة سحب الليجند في CB-Dock2 باستخدام SMILES؛ ضمان عدم وجود أحرف خاصة في اسم الملف؛ تحقق من البريد الإلكتروني لمعرفة حالة الوظيفة. إذا كنت مستمرا، جرب SwissDock كنسخة احتياطية.
5. الألفة الملتصقة (العبقري)• PRODIGY يعيد قيم ΔG لجميع المجمعات.
• التوافقات تتوافق مع درجات CB-Dock (فينا) (اتساق الاتجاه).		يعتمد تقييم الانتقائية على دقة ΔG ل PLK1 مقابل PLK2/PLK3. التعريفات الخاطئة للسلسلة/الليجند → توقعات خاطئة.المشكلة: خطأ في "السلسلة غير موجودة". الإصلاح: فتح .complex.pdb في محرر نصوص؛ تأكيد معرف سلسلة البروتين (مثل "P") واسم بقايا الليغاند (مثل "UNL"); إدخال الإدخال بشكل صحيح في PRODIGY.
6. تقييم ADMET-S• جميع نتائج SMILES الخمسين تظهر في SwissADME وADMETlab3.0 وToxTree.
• لا توجد صفوف "N/A" أو "خطأ" في CSV المخرج.		بيانات ADMET غير المتسقة → ترتيب المرشحين غير الصحيح. قد تفشل المنصات في سقالات المنتجات الطبيعية الغريبة.المشكلة: ADMETlab3.0 يرفض SMILES. الحل: تحويل SMILES إلى النسخة الأصلية باستخدام RDKit (MolToSmiles(MolFromSmiles(...))). بالنسبة ل ToxTree، أدخل جزيء واحد في كل مرة وتحقق من عملية عرض البنية.
7. الاستقرار الكمومي (ORCA)• تكتمل كل مهمة ORCA دون "SCF غير متقارب" أو "خطأ هندسي".
• قيم HOMO/LUMO موجودة في ملف الإخراج (.out).		الفجوة بين الشريط تحدد الاستقرار/التفاعل الكيميائي. المهام الفاشلة = بيانات مفقودة لمرشح المفاتيح.المشكلة: تعطل وظيفة ORCA. الإصلاح: إعادة تحسين الهندسة في أفوغادرو؛ ضمان عدم تكرار الذرات؛ زيادة نسبة Maxcore أو التحول إلى أساس def2-SVP للجزيئات الكبيرة.
8. الترشيح المتكامل ل ADMET-S• القائمة النهائية للروابط تستوفي جميع المعايير (مثل، LogP 0–3، فجوة النطاق 3.6–5 eV، فئة Cramer I/II).
• يظهر الرابط ≥1 الانتقائية PLK1 (ΔΔG ≥ 2 كيلو كالوري/مول مقابل PLK2/3).		العتبات الصارمة أو غير المتسقة تقضي على العملاء المحتملين المحتملين؛ العتبات المعتدلة جدا تدفع مركبات سامة وغير مستقرة.المشكلة: لا توجد روابط تمر بجميع الفلاتر.
الحل: خفف من معيار واحد في كل مرة (مثلا، السماح بتسجيل السجل ≤ 4 أو 3 سموم السموم) ووثق المقايضات. قارن مع الأدوية المعروفة للقياس المرجعي.

الجدول 1: نقاط التحقق الحرجة لمراقبة الجودة، ونقاط اتخاذ القرار عالية التأثير، واستراتيجيات استكشاف الأخطاء عبر سير العمل الحاسوبي ثنائي اللغة المكون من ثماني مراحل لتحديد مثبطات PLK1-PBD الانتقائية. كل صف يتوافق مع مرحلة بروتوكول رئيسية من تحضير البروتين إلى الترشيح المتكامل ل ADMET-S ويحدد (1) كيفية التحقق من الإنجاز الناجح (نقطة تفتيش وسيطة)، (2) لماذا تكون الخطوة محورية للنجاح أو الفشل الكلي (مبررات الخطوة الحرجة)، و(3) الحلول العملية للأعطال التقنية الشائعة (إرشادات استكشاف الأخطاء). يعمل هذا الجدول كخارطة طريق للتحقق ومساعدا تعليميا للطلاب والباحثين الذين يطبقون البروتوكول في بيئات أكاديمية أو محدودة الموارد.

الملف الإضافي 1: سكريبتات بايثون. يحتوي على سكريبت بايثون لتطبيق قواعد ليبينسكي؛ سكريبت بايثون المستخدم في تحليل التجميع؛ سكريبت بايثون لحسابات الخصائص الفيزيائية الكيميائية؛ سكريبت R لتحليل الأيض؛ سكريبت بايثون لتحليل الإخراج؛ سكريبت بايثون للتنبؤ بالسمية؛ سكريبت بايثون لتقييم الاستقرار؛ وسلاسل SMILES من 50 مركبا تم تحليلها. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تركز هذه الدراسة على سير عمل حسابي استكشافي لتحديد وتقييم مثبطات PLK1-PBD المحتملة من خلال الفحص الافتراضي، والالتحاط، وتحليل ADMET-S. يعطي خط الأنابيب الأولوية بفعالية للمركبات بناء على اتجاهات الارتباط المتوقعة والخصائص الحركية الدوائية. في هذا البروتوكول، يتم تحديد مجموعة من مثبطات PLK1 المحتملة، ويتم تقييم خصائصها في ADMET ومواجهات الارتباط الخاصة بها لبروتينات PLK1–3. يستخدم البروتوكول نهجا يركز على الأمراض لتحديد 50 جزيئا من قاعدة بيانات تضم حوالي 73,400 جزيء (الشكل 9). ثم خضعت هذه الجزيئات الخمسين لتقييم ADMET-S، حيث تم حساب خصائصها الدوائية والديناميكية الدوائية، وشبهها الدوائي، واستقرارها. بالإضافة إلى ذلك، تم حساب تقاربها ببروتينات PLK1–3 لتقييم فعاليتها المثبطة ضد PLK1 وانتقائتها. استنادا إلى النتائج، أظهرت عدة جزيئات خصائص أكثر رغبة. قد تختار الدراسات اللاحقة لاكتشاف الأدوية القضاء على بعض الجزيئات والتركيز على بعضها من خلال هذا الاستكشاف، أو قد تمتنع عن الإزالة المبكرة وتستخدم هذه النتائج لاحقا في عملية تصميم الدواء لتحسين خصائص ADMET.

المنطق البيولوجي للتركيز على PLK1 وPLK2 وPLK3 مع استبعاد PLK4 وPLK5 يستند إلى اعتبارات هيكلية ووظيفية على حد سواء. تم استبعاد PLK4 وPLK5 من هذا العمل بسبب اختلافهما الهيكلي والوظيفي الواضح عن PLK1 وعلاقتهما المحدودة بعلاج السرطان. يتميز PLK1 بمجال الكينازي ونطاق صندوق البولو (PBD)، ويلعب دورا حيويا في تنظيم الأحداث الانقسامية، مما يجعله هدفا رئيسيا لعلاج السرطان41. على النقيض من ذلك، فإن PLK4 وPLK5 متباعدان هيكليا: يحتوي PLK4 على صندوق مرموز (CPB) بدلا من PBD كانوني ويعمل بشكل أساسي في تكرار الجزر. وفي الوقت نفسه، يفتقر PLK5 إلى مجال كيناز وظيفي ويعبر عنه تقريبا حصريا في الدماغ3. نظرا لتداخلها البنيوي المحدود مع PLK1-PBD وعلاقتها المحدودة باضطراب الانقسام في السرطان، فإن إدراجها لن يؤثر بشكل كبير على الانتقائية لمثبطات PLK1-PBD. لذا، تقدم استراتيجية الفحص إطارا بيولوجيا ذا صلة وحسابية لتقييم الانتقائية. ومن المهم أن الروابط الستة المرشحة العليا (10، 13، 14، 32، 43، و47) أظهرت طاقات ارتباط وملفات ADMET-S أكثر ملاءمة من المثبطات المعروفة TQ وAllopole-A، مما أبرز إياها كمعدلات محتملة ل PLK1-PBD.

لدعم التنفيذ القوي، خاصة من قبل الطلاب أو الباحثين الجدد على أدوات اكتشاف الأدوية الحاسوبية، يتم توفير ملخص لنقاط التفتيش الرئيسية (أيضا في قسم البروتوكول)، والخطوات الحرجة، وإرشادات استكشاف الأخطاء لسير العمل في الجدول 1. يدعم الجدول التكيف؛ على سبيل المثال، إذا كان المستخدم يفتقر إلى وصول HPC، يمكنه ملاحظة أن تحليل استقرار ORCA قابل للتأجيل، وإذا كان خادم الويب معطلا، تقترح بدائل مثل SwissDock. تضمن هذه المرونة بقاء سير العمل قابلا للتطبيق عبر سياقات مؤسسية متنوعة مع الحفاظ على الصرامة العلمية وتعزيز حداثة الدراسة كمساهمة شاملة وثنائية اللغة وموجهة نحو التعليم في اكتشاف الأدوية في مراحلها المبكرة. على الرغم من أن سير العمل بأكمله مصمم كخط أنابيب متكامل، إلا أن عدة خطوات حاسمة تحدد بشكل أساسي نجاحه أو فشله (انظر الجدول 1). كما يتضمن الفيديو المرافق تعليقات إنجليزية متزامنة وإشارة بلغة الإشارة الأمريكية (ASL)، مصممة لتوفير وصول عادل دون تشتيت. تعليمات الموقع متوافقة زمنيا مع الإجراءات على الشاشة، مثل الإشارة "التالي"، ثم التوقف عند النقر على زر "التالي". خلال خطوة تحضير 4HCO، يستخدم الموقعة وضع العلامات بالأصابع ("A" و"B") لتوجيه اختيار السلسلة، والتي تنعكس بدقة في تسجيل الشاشة. في فقرة عرض Supernatural 3.0، تتغير نافذة الموقع وتتحرك إلى الأعلى يمين مع توجيه الانتباه إلى أيقونة "المسار"، وتتوقف أثناء متابعة المؤشر. تضمن هذه الخيارات التصميمية حصول المشاهدين الصم وضعاف السمع على نفس الإرشاد المتكامل والفوري الذي يحصل عليه مستخدمو السمع، مما يحاكي تجربة مختبرية حضورية يقودها المدرب.

بجانب الفوائد، هناك العديد من الطرق لتحسين سير العمل. أولا، يمكن تعديل التصفية الأولية؛ بدلا من طرق أخذ عينات تركز على الأمراض وطرق العينة العنقودية، يمكن البدء بمحاكاة الالتحام لجميع الجزيئات في قاعدة بيانات المنتجات الطبيعية لتحديد المركبات الأنسب للارتباط بالبروتين المستهدف مع الليجند. بالإضافة إلى ذلك، هناك حاجة إلى تقديرات أكثر تفصيلا للتنبؤ الدقيق بالألفة المرتبطة.  تشمل حسابات PRODIGY "لا كهروستاتيكية" لألفة البروتين-الليغاند مطابقة أعداد أنواع الاتصالات الذرية المصنفة المشاركة في التفاعل (كربون-كربون، نيتروجين-نيتروجين، أكسجين-أكسجين، وذرات أخرى) في نموذج انحدار خطي متعدد مدرب مع التحقق المتقاطع رباعي الأضعاف، وكانت هذه الطريقة مرتبطة بشكل كبير بالتقارير التجريبية في مناسبات مختلفة42,43.  يمكن استخدام طرق بديلة مثل FoldX44، fastDRH45، نماذج التعلم العميق46، وMD مع أخذ عينات متقدمة، ومن المتوقع درجات متفاوتة من التوافق في التنبؤات حسب دقة كل طريقة47.

جانب آخر هو أن الأدوات البرمجية المختلفة المستخدمة في تقييم ADMET-S تولد العديد من المقاييس، وفهم كل مقياس يستخدم لتقييم ترشيح الطبيب أمر حيوي. إحدى الطرق لضمان الدقة قد تكون إخضاع عدة أدوية في السوق للبروتوكول لتحديد كيفية تحقيقها للحدود.  في هذا السياق، تتطلب السمية المزيد من البحث، حيث لا يتم التخلص من الجزيئات فقط بناء على ملفات السمية من أشجار قرارات دقيقة مثل قواعد كريمر، حيث تحمل العديد من الأدوية المتاحة تصنيفات مماثلة.  عدد السموم ليس مفيدا تماما عن السمية، حتى مع ملفات السمية.  في هذا السياق، سيكون امتداد هذا سير العمل هو إجراء مراجعات مقارنة لعينات الجزيئات الصغيرة مع توفر الأدوية لتوجيه التفسيرات.  على سبيل المثال، استشار الباحثون إلى الأدبيات السابقة التي وثقت تطبيق وملاحظات حسابات DFT في أدوية سرطان الثدي الحالية مثل تاموكسيفين48، ليتروزول49، وسيسبلاتين50عند تفسير الاستقرار الذي يحدده حسابات QM لقيم فجوة النطاق HOMO–LUMO. سابقا، تم اعتماد سير عمل مماثل لتحديد المثبطات المحتملة لأهداف المرض/الاضطرابات المختلفة51. مؤخرا، قام ستافورد وآخرون بمراجعة استراتيجيات تصميم مثبطات PLK1-PBD وفرص العلاج في السرطان. حددت أحدث الدراسات مثبطات مزدوجة الاستهداف ضد PLK1-PBD وPLK4-PB3 باستخدام نمذجة الأدوية الموجهة بالبنية، والفحص الافتراضي، والالتحام الجزيئي، ومحاكاة الديناميكا الجزيئية (MD)، والتقييم البيولوجي52. كما حدد تشو وآخرون مثبطات PLK1-PBD من مكتبة المنتجات الطبيعية البحرية باستخدام فارماكوفور QSAR ثلاثي الأبعاد، ADMET، قفز السقالات، الالتحام الجزيئي، وMD53.

بشكل عام، فإن حداثة هذه الدراسة تتكون من أربعة أوجه. أولا، هو بروتوكول حاسوبي ثنائي اللغة، يقدم بلغة الإشارة الأمريكية والإنجليزية، مما يعزز سهولة الوصول والشمول في مجالات العلوم والتكنولوجيا والهندسة والرياضيات، خاصة للطلاب والباحثين الصم وضعاف السمع. هذا التقديم ثنائي اللغة نادر في اكتشاف الأدوية الحاسوبية ويتماشى مع مهمة جامعة جالوديت في ريادة التعليم العلمي العادل. ثانيا، بينما يظل PLK1 هدفا قويا لمكافحة السرطان، فإن الدراسات الحاسوبية الدقيقة التي تقيم الانتقائية عبر PLK1 وPLK2 وPLK3 باستخدام معايير هيكلية وطاقية وADMET-S متكاملة نادرة. تركز معظم الجهود السابقة فقط على تثبيط مجال الكينازي أو تفتقر إلى التنميط الانتقائي المقارن. يعالج هذا العمل هذه الفجوة من خلال توفير بروتوكول فحص متزامن استكشافي أولي ضد ثلاثة PLK-PBDs، مع مرشحات تعطي الأولوية للمركبات بناء على ألفة عالية ل PLK1 وربط خارج الهدف بشكل طفيف. ثالثا، تم تصميم سير العمل مع مراعاة الكفاءة وسهولة الاستخدام، خاصة في البيئات التعليمية ومحدودة الموارد. يمكن إكمال كامل خط الإنتاج من تصفية قواعد البيانات إلى تقييم ADMET-S خلال أسبوعين على أجهزة أكاديمية قياسية (لابتوب بذاكرة RAM بسعة 8 جيجابايت)، مستفيدا من البرمجيات المجانية القائمة على الويب (CB-Dock2، PRODIGY، SwissADME، ADMETlab). حسابات الالتحام والربط ليست خطوات تستغرق وقتا طويلا (~30 ثانية لكل ليجند). أكثر خطوة تستغرق وقتا طويلا هي تحليل استقرار ميكانيكا الكم باستخدام ORCA، والذي يمكن تأجيله إلى مراحل لاحقة أو تشغيله على موارد حوسبة عالية الأداء، كما هو موضح. السكربتات معيارية وتتطلب فقط تعديلات بسيطة في سطر الأوامر أو Jupyter Notebook، مما يتيح الدمج السلس مع المناهج الحالية. مدة التشغيل متواضعة مع استغرق الترشيح في قواعد البيانات والامتثال لليبينسكي دقائق؛ تكتمل تجميع ~1,000 جزيء في أقل من 30 دقيقة على سطح مكتب نموذجي. جميع أدوات البرمجيات متاحة مجانا للاستخدام الأكاديمي، عبر المنصات (ويندوز، ماك أو إس، لينكس)، ولا تتطلب تراخيص تجارية، مما يقلل بشكل كبير من حواجز الدخول. رابعا، تظهر الليغاندات المحددة ميول ارتباط واعدة تتوافق مع التفاعلات على نطاق النانو مولر، إلى جانب شبه دوائي إيجابي، واستقرار أيضي، وملفات سمية منخفضة. تظهر عدة مرشحات كروابط PLK1-PBD قوية وانتقائية بخصائص ADMET-S مرغوبة، مما يستدعي التحقق من الحقيقة من خلال محاكاة الديناميكا الجزيئية أو الاختبارات المختبرية .

لذلك، وبالإضافة إلى فائدتها المنهجية، توضح هذه الدراسة كيف يمكن الاستفادة من الأدوات الحاسوبية المتاحة والمفتوحة المصدر والفعالة كنقطة انطلاق لمعالجة تحد طبي حيوي عالي القيمة مع تعزيز التدريب العلمي الشامل. مع استمرار مثبطات PLK1-PBD في اكتساب الزخم في علم الأورام، يوفر هذا السير العمل مخططا قابلا للتكرار وصديقا للتعليم لاكتشاف الأدوية في مراحلها المبكرة. تنوعه يجعلها مناسبة للمدارس الثانوية والبكالوريوس والدراسات العليا، كما توفر أساسا ممتازا لبرامج CURE التي توفر للطلاب فرص بحث عملية وحقيقية. على عكس خطوط الأنابيب التي تعتمد فقط على الالتحام بمجال الكينازات أو الفحص ببروتين واحد، يقوم هذا النهج بتقييم انتقائية PBD عبر PLK1–3 في الوقت نفسه، وهو أمر ضروري نظرا لتجانسها الهيكلي بنسبة >38٪ وأدوارها البيولوجية المتباينة. علاوة على ذلك، من خلال دمج التجميع، وADMET-S، واستقرار ميكانيكا الكم في إطار الوصول المفتوح، تم تقليل خطر التكرار والفقدان مقارنة بالفحص الافتراضي بالقوة الغاشمة.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا البحث بتمويل من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة، والمعاهد الوطنية للصحة (1R15GM148942-01)، والمكتبة الوطنية للطب (R25LM014208)، ومنحة مومنتوم من جامعة بيتسبرغ. استخدم هذا العمل نظام داروين في أودل (darwin.hpc.udel.edu) من خلال تخصيص [MED230016] من برنامج تنسيق البنية التحتية السيبرانية المتقدمة: الخدمات والدعم (ACCESS) المدعوم من منح المؤسسة الوطنية للعلوم #2138259 و#2138286 و#2138307 و#2137603 و#2138296.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ADMETLab3سيموليشينز بلس. شركةV3.0خصائص أدميت
ألفافولدابحث في جوجل عن ديب مايند و مختبرات إيزومورفيك (شركات فرعية لألفابت)V3.0.1نمذجة البروتينات ثلاثية الأبعاد
أناكوندا/كونداشركة أناكوندا.V24.9.2نظام إدارة الحزم مفتوح المصدر 
CB-Dock2مختبر يانغ تساوV2.0الالتحام الأعمى بالبروتين والليجاند
تشارم-جويجامعة ليهايV3.8التلاعب والمحاكاة الجزيئية الحيوية
داروين على الوصولجامعة ديلاويرلا يوجدالحوسبة عالية الأداء
أوركاFAccTs GmbHV6.1.0حزمة الكيمياء الكمومية
بنك بيانات البروتينبنك بيانات البروتين العالميRRID:SCR_006555قاعدة بيانات البروتين
RDKitالمصدر المفتوحRRID:SCR_014274برمجة المعلوماتية الكيميائية
سوبرناتشورال 3.0معهد الفسيولوجيا والعلوم-تكنولوجيا المعلومات (برلين)V3.0مكتبة الجزيئات الطبيعية
SwissADMEالمعهد السويسري للمعلوماتية الحيويةRRID:SCR_017865خصائص ADME
توكستريشركة إيديا كونسلت المحدودةV3.1.0تصنيف السمية

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eckerdt, F., Yuan, J., Strebhardt, K. Polo-like kinases and oncogenesis. Oncogene. 24 (2), 267-276 (2005).
  2. Dube, D. Polo-like kinases: An antimitotic drug target for cancer therapy. Protein Kinase Inhib. 2022, 457-477 (2022).
  3. de Cárcer, G., Manning, G., Malumbres, M. From PLK1 to PLK5: Functional evolution of polo-like kinases. Cell Cycle. 10 (14), 2255-2262 (2011).
  4. Lee, S. Y., Jang, C., Lee, K. A. Polo-like kinases (Plks), a key regulator of cell cycle and new potential target for cancer therapy. Dev Reprod. 18 (1), 65-71 (2014).
  5. Park, J. E., Hymel, D., Burke, T. R. Jr, Lee, K. S. Current progress and future perspectives in the development of anti-polo-like kinase 1 therapeutic agents. F1000Res. 6, 1024(2017).
  6. Stafford, J. M., Wyatt, M. D., McInnes, C. Inhibitors of the PLK1 polo-box domain: Drug design strategies and therapeutic opportunities in cancer. Expert Opin Drug Discov. 18 (1), 65-81 (2023).
  7. Feng, Y. B., et al. Overexpression of PLK1 is associated with poor survival by inhibiting apoptosis via enhancement of survivin level in esophageal squamous cell carcinoma. Int J Cancer. 124 (3), 578-588 (2009).
  8. Gutteridge, R. E. A., Ndiaye, M. A., Liu, X., Ahmad, N. PLK1 inhibitors in cancer therapy: From laboratory to clinics. Mol Cancer Ther. 15 (7), 1427-1435 (2016).
  9. Steegmaier, M., et al. BI 2536, a potent and selective inhibitor of polo-like kinase 1, inhibits tumor growth in vivo. Curr Biol. 17 (4), 316-322 (2007).
  10. Vanden Bossche, J., et al. Spotlight on volasertib: preclinical and clinical evaluation of a promising PLK1 inhibitor. Med Res Rev. 36 (4), 749-786 (2016).
  11. Yin, Z., Song, Y., Rehse, P. H. Thymoquinone blocks pSer/pThr recognition by PLK1 polo-box domain as a phosphate mimic. ACS Chem Biol. 8 (2), 303-308 (2013).
  12. Reindl, W., Yuan, J., Krämer, A., Strebhardt, K., Berg, T. Inhibition of polo-like kinase 1 by blocking polo-box domain-dependent protein-protein interactions. Chem Biol. 15 (5), 459-466 (2008).
  13. Scharow, A., et al. Optimized PLK1 PBD inhibitors based on poloxin induce mitotic arrest and apoptosis in tumor cells. ACS Chem Biol. 10 (11), 2570-2579 (2015).
  14. Reindl, W., Yuan, J., Krämer, A., Strebhardt, K., Berg, T. A pan-specific inhibitor of the polo-box domains of polo-like kinases arrests cancer cells in mitosis. ChemBioChem. 10 (7), 1145-1148 (2009).
  15. Park, J. E., et al. Specific inhibition of an anticancer target, polo-like kinase 1, by allosterically dismantling its mechanism of substrate recognition. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (35), e2305037120(2023).
  16. Archambault, V., Normandin, K. Several inhibitors of the PLK1 polo-box domain turn out to be non-specific protein alkylators. Cell Cycle. 16 (12), 1220-1224 (2017).
  17. Jo, S., Kim, T., Iyer, V. G., Im, W. CHARMM-GUI: A web-based graphical user interface for CHARMM. J Comput Chem. 29 (11), 1859-1865 (2008).
  18. Park, S. J., Kern, N., Brown, T., Lee, J., Im, W. CHARMM-GUI PDB manipulator: Various PDB structural modifications for biomolecular modeling and simulation. J Mol Biol. 435 (14), 167995(2023).
  19. Kim, J. H., Ku, B., Lee, K. S., Kim, S. J. Structural analysis of the polo-box domain of human polo-like kinase 2. Proteins. 83 (7), 1201-1208 (2015).
  20. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  21. UniProt Consortium. UniProt: The universal protein knowledgebase in 2023. Nucleic Acids Res. 51 (D1), D523-D531 (2023).
  22. Gallo, K., et al. SuperNatural 3.0—A database of natural products and natural product-based derivatives. Nucleic Acids Res. 51 (D1), D654-D659 (2023).
  23. Du, J., et al. KEGG-PATH: Kyoto encyclopedia of genes and genomes-based pathway analysis using a path analysis model. Mol Biosyst. 10 (9), 2441-2447 (2014).
  24. Bento, A. P., et al. An open source chemical structure curation pipeline using RDKit. J Cheminform. 12 (1), 51(2020).
  25. Chung, N. C., Miasojedow, B., Startek, M., Gambin, A. Jaccard/Tanimoto similarity test and estimation methods for biological presence-absence data. BMC Bioinformatics. 20 (Suppl 15), 644(2019).
  26. Liu, Y., et al. CB-Dock2: Improved protein–ligand blind docking by integrating cavity detection, docking and homologous template fitting. Nucleic Acids Res. 50 (W1), W159-W164 (2022).
  27. Vangone, A., et al. Large-scale prediction of binding affinity in protein–small ligand complexes: the PRODIGY-LIG web server. Bioinformatics. 35 (9), 1585-1587 (2019).
  28. Fu, L., et al. ADMETlab 3.0: An updated comprehensive online ADMET prediction platform enhanced with broader coverage, improved performance, API functionality and decision support. Nucleic Acids Res. 52 (W1), W422-W431 (2024).
  29. Daina, A., Michielin, O., Zoete, V. SwissADME: A free web tool to evaluate pharmacokinetics, drug-likeness and medicinal chemistry friendliness of small molecules. Sci Rep. 7 (1), 1-13 (2017).
  30. Patlewicz, G., Jeliazkova, N., Safford, R., Worth, A., Aleksiev, B. An evaluation of the implementation of the Cramer classification scheme in the Toxtree software. SAR QSAR Environ Res. 19 (5-6), 495-524 (2008).
  31. Neese, F. Software update: The ORCA program system—version 5.0. Wiley Interdiscip Rev Comput Mol Sci. 12 (5), e1606(2022).
  32. Daina, A., Zoete, V. A BOILED-Egg to predict gastrointestinal absorption and brain penetration of small molecules. ChemMedChem. 11 (11), 1117-1121 (2016).
  33. Sehnal, D., et al. Mol* Viewer: Modern web app for 3D visualization and analysis of large biomolecular structures. Nucleic Acids Res. 49 (W1), W431-W437 (2021).
  34. Liu, Y., Cao, Y. Protein–ligand blind docking using CB-Dock2. Comput Drug Discov Des. 2023, 113-125 (2023).
  35. Manallack, D. T. The pKa distribution of drugs: application to drug discovery. Perspect Med Chem. 1, 25-38 (2007).
  36. Manallack, D. T., Prankerd, R. J., Yuriev, E., Oprea, T. I., Chalmers, D. K. The significance of acid/base properties in drug discovery. Chem Soc Rev. 42 (2), 485-496 (2013).
  37. Charifson, P. S., Walters, W. P. Acidic and basic drugs in medicinal chemistry: A perspective. J Med Chem. 57 (23), 9701-9717 (2014).
  38. Wildman, S. A., Crippen, G. M. Prediction of physicochemical parameters by atomic contributions. J Chem Inf Comput Sci. 39 (5), 868-873 (1999).
  39. Pasha, T., et al. Therapeutic importance of biological half-life of antineoplastic agents – A review. Adv Pharmacol Pharm. 10, 265-272 (2022).
  40. Smith, D. A., Beaumont, K., Maurer, T. S., Di, L. Relevance of half-life in drug design. J Med Chem. 61 (10), 4273-4282 (2018).
  41. Sharma, P., et al. A cryptic hydrophobic pocket in the polo-box domain of the polo-like kinase PLK1 regulates substrate recognition and mitotic chromosome segregation. Sci Rep. 9 (1), 1-15 (2019).
  42. Kurkcuoglu, Z., et al. Performance of HADDOCK and a simple contact-based protein–ligand binding affinity predictor in the D3R Grand Challenge 2. J Comput Aided Mol Des. 32 (1), 175-185 (2018).
  43. Gaieb, Z., et al. D3R Grand Challenge 2: Blind prediction of protein–ligand poses, affinity rankings, and relative binding free energies. J Comput Aided Mol Des. 32 (1), 1-20 (2018).
  44. Delgado, J., Radusky, L. G., Cianferoni, D., Serrano, L. FoldX 5.0: Working with RNA, small molecules and a new graphical interface. Bioinformatics. 35 (20), 4168-4169 (2019).
  45. Wang, Z., et al. fastDRH: A webserver to predict and analyze protein–ligand complexes based on molecular docking and MM/PB (GB) SA computation. Brief Bioinform. 23 (5), bbac201(2022).
  46. Wang, H., Liu, H., Ning, S., Zeng, C., Zhao, Y. DLSSAffinity: Protein–ligand binding affinity prediction via a deep learning model. Phys Chem Chem Phys. 24 (17), 10124-10133 (2022).
  47. Schöning-Stierand, K., et al. Proteins Plus: A comprehensive collection of web-based molecular modeling tools. Nucleic Acids Res. 50 (W1), W611-W615 (2022).
  48. Flores-Holguín, N., Glossman-Mitnik, D. CDFT-based chemical reactivity properties analysis of the fluorine substitution in the selective estrogen receptor modulator (SERM) tamoxifen. Theor Chem Acc. 142 (8), 79(2023).
  49. Akçay, H. T., Bayrak, R. Computational studies on the anastrozole and letrozole, effective chemotherapy drugs against breast cancer. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. 122, 142-152 (2014).
  50. Georgieva, I., Trendafilova, N., Dodoff, N., Kovacheva, D. DFT study of the molecular and crystal structure and vibrational analysis of cisplatin. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. 176, 58-66 (2017).
  51. Lawal, M. M., Kucukkal, T. G. Evaluation of small molecule binding to the polo-box domain of PLK1 at the molecular level. J Comput Biophys Chem. 25 (5), 751-768 (2026).
  52. Zhao, C., et al. Discovery of novel dual-targeting inhibitors against PLK1-PBD and PLK4-PB3: structure-guided pharmacophore modelling, virtual screening, molecular docking, molecular dynamics simulation, and biological evaluation. J Enzyme Inhib Med Chem. 40 (1), 2522810(2025).
  53. Zhou, N., Zheng, C., Tan, H., Luo, L. Identification of PLK1-PBD inhibitors from the library of marine natural products: 3D QSAR pharmacophore, ADMET, scaffold hopping, molecular docking, and molecular dynamics study. Mar Drugs. 22 (2), 83(2024).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

PLK1 InhibitorsPolo Box DomainVirtual ScreeningProtein Ligand DockingBinding Affinity PredictionADMET EvaluationQuantum Mechanical AnalysisNatural Product DatabaseK Means ClusteringBreast Cancer

Related Articles