نقدم بروتوكولا محسنا لمعالجة الكلى البشرية الكاملة لعزل وزراعة الخلايا الظهارية للنبيبات الكلوية القريبة الأولية وتطبيق هذه الخلايا في منصة ثلاثية الأبعاد ، ميكروفلويديك ، فيزيولوجية دقيقة لتلخيص النبيبات الكلوية القريبة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل الخلايا الظهارية الأنبوبية البشرية القريبة الأولية واستخدامها في إنشاء نموذج فيزيولوجي مجهري للأنبوب الكلوي القريب
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يصيب مرض الكلى أكثر من 850 مليون شخص على مستوى العالم ، بما في ذلك 37 مليون أمريكي. تشمل عوامل الخطر لأمراض الكلى المزمنة التأثيرات البيئية ، والاستعدادات الوراثية ، والحالات الطبية المصاحبة ، وتاريخ إصابة الكلى الحادة. غالبا ما تستغرق هذه العوامل شهورا أو سنوات لتطويرها ، مما يعقد الدراسات الطولية لمسببات المرض والفيزيولوجيا المرضية. هناك حاجة إلى نماذج الكلى المتقدمة لتحسين فهمنا لآليات المرض وتعزيز التنبؤ بالسمية الكلوية في تطوير الأدوية. تلعب الخلايا الظهارية النبيبية القريبة (PTECs) في الكلى دورا مهما في إزالة الكائنات الحيوية والسموم بالإضافة إلى إعادة امتصاص العناصر الغذائية الأساسية. لقد أثبتنا سابقا أن منصات نظام الفيزيولوجيا الدقيقة ثلاثية الأبعاد (3D) (MPS) ، المأهولة ب PTECs الأولية المعزولة ، يمكن استخدامها للتحقيق في التفاعلات الدوائية الكلوية ، وتقييم السمية الكلوية للمركبات ، والتنبؤ بإزالة الأدوية. هنا ، نقدم بروتوكولات لعزل واستزراع PTECs الأولية من الكلى البشرية الكاملة ولبذرها في منصة MPS ثلاثية الأبعاد تحاكي فسيولوجيا الكلى في الجسم الحي . يتيح هذا البروتوكول إجراء دراسات طويلة الأجل تدعم جدوى PTEC ، والتشكل الفسيولوجي ، والاستقطاب الوظيفي لبروتينات النقل الرئيسية في أجهزة MPS لمدة تصل إلى 6 أشهر.
المقدمة
تلعب الكلى دورا مهما في إزالة وإزالة مجموعة واسعة من الكائنات الغريبة الحيوية والسموم والمركبات الذاتية من الجسم. يتم تحقيق ذلك عن طريق تصفية الدم لإزالة الفضلات وتنظيم توازن الإلكتروليت ومستويات السوائل ودرجة الحموضة. تحتوي كل كلية بشرية على حوالي مليون نفرون ، الوحدات الهيكلية والوظيفية للكلية1. داخل هذه النيفرون ، تكون الخلايا الظهارية المتخصصة في الأنابيب القريبة ، والمعروفة باسم الخلايا الظهارية للأنابيب القريبة (PTECs) ، مسؤولة عن إعادة امتصاص الجزيئات الأساسية مثل الجلوكوز والأحماض الأمينية والأيونات ، وكذلك عن إفراز ركائز الدواء والمواد السامة المحتملة في البول2،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم إجراء جميع الأعمال وفقا لإرشادات جامعة واشنطن للتعامل مع الأنسجة البشرية. يستوفي المتبرعون المناسبون المتطلبات التالية: أقل من 36 ساعة من وقت الإقفار البارد (CIT) ، ولا يوجد تاريخ معروف لأمراض الكلى ، أو غسيل الكلى ، أو أي حالات طبية أخرى (على سبيل المثال ، داء السكري من النوع 1 أو 2 ، أو التهاب الكبد B ، أو التهاب الكبد C ، أو فيروسات نقص المناعة البشرية (HIV) ، أو التهاب السحايا الفيروسي / الجرثومي ، أو عدوى المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين ، أو مرض الزهري ، أو الإنتان ، أو Covid-19). تم الحصول على الكلى البشرية بأكملها المستخدمة في هذه الدراسة من خلال OPO المعتمد من UNOS.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
مورفولوجيا وتقاء PTECs الأولية المعزولة بمرور الوقت في ثقافة ثنائية الأبعاد
بعد العزلة عن قشرة الكلى ، سمح ل PTECs بالنمو دون إزعاج لمدة 48 ساعة على الأقل قبل أول تغيير للوسائط. بعد أسبوع تقريبا من زراعة الخلايا ، يجب أن تظهر دفعات صغيرة من PTECs في جميع أنحاء قارورة الاستزراع مع مورفولوجيا ظهارية موحدة تشبه الحصى (الشكل 1 أ ، ب). اعتمادا على معدلات نمو PTECs من مانحين مختلفين ، يجب أن يصل التقاء الخلايا إلى حوالي 50٪ -60.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
توفر MPS ، أو تقنيات الأعضاء على الرقاقة ، منصة مختبرية ذات صلة كبيرة لتلخيص الجوانب الرئيسية لعلم وظائف الأعضاء البشري ، وبالتالي تقليل الاعتماد على النماذج الحيوانية في تطوير الأدوية والتقييمات السمية. في الآونة الأخيرة ، سمح قانون تحديث إدارة الغذاء والدواء 2.0 (2022) بإدراج MPS ، من بين بدائل أخرى ، في تطبيقات الأدوية الجديدةالتجريبية 29. يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل إجراء تشغيل قياسي لتفكك PTECs عن الأنسجة القشرية للمتبرع البشري واستخدامها اللاحق في .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح أو إفصاحات مالية ذات صلة بهذه الدراسة.
شكر وتقدير
تم دعم أجزاء من هذا العمل من خلال عقد ناسا 80ARC023CA001 ، والمركز الوطني للنهوض بالعلوم الانتقالية (NCATS) (U2CTR004867 ، UH3TR000504 ، UG3TR002158) ، بالاشتراك مع NCATS ومركز تقدم العلوم في الفضاء (CASIS) (UG3TR002178) ، والمعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية (NIEHS) (P30ES00703) ، والمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (T32GM007750) ، وهدية غير مقيدة من مراكز الكلى الشمالية الغربية لأبحاث الكلى معهد وكلية الصيدلة بجامعة واشنطن (جائزة جي بينغ وانغ وزمالة برادلي).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| حقن لوير-لوك تيب بسعة 1 مل | بيكتون، ديكنسون | 309628 | |
| أنابيب الطرد المركزي الدقيق بسعة 1.5 مل | منتجات سيلتريت العلمية | 229442 | |
| أنبوب بولي بروبيلين مخروطي معقم بحجم 15 مل | فيشر ساينتيفك | 14-959-53A | |
| جهاز ميكروفسيولوجي ثلاثي الأبعاد | نورتيس | TCC-001 | |
| حقن لوير-لوك تيب سعة 5 مل | بيكتون، ديكنسون | 309646 | |
| أنبوب بولي بروبيلين مخروطي معقم بحجم 50 مل | فيشر ساينتيفك | 12-565-271 | |
| مضاد حيوي-مضاد للفطريات (100x) | ثيرموفيشر ساينتيفيك | 15240062 | |
| الكولاجيناز، النوع الرابع، مسحوق | ثيرموفيشر ساينتيفيك | 17104019 | |
| D-(+)-جلوكوز | ميليبورسيغما | G8270 | |
| مثبط التربسين المحدد | ثيرموفيشر ساينتيفيك | R007100 | |
| ثنائي ميثيل كبريتوكسيد، الكاشف الحيوي، الكيماويات العلمية الحرارية | ثيرموفيشر ساينتيفيك | J66650-AK | |
| ديسباسي II، مسحوق | ثيرموفيشر ساينتيفيك | 17105041 | |
| دولبيكو' s MEM (DMEM)/F-12 بدون جلوكوز | علوم الحياة البيولوجية الأمريكية | D9807-02 | |
| محلول ملحي مخزن الفوسفات من دولبيكو (DPBS)، الكالسيوم، المغنيسيوم | ثيرموفيشر ساينتيفيك | 14040117 | |
| مصل البقر الجنيني (FBS)، بريميوم | ثيرموفيشر ساينتيفيك | A5670701 | |
| مجموعات فينبيبت F2 جيدة للعمل في المختبر (GLP) | ثيرموفيشر ساينتيفيك | 05-719-511 | الميكروبايبتات |
| نصائح مائية SureOne Micropoint من Fisherbrand، تناسب شامل، غير مفلترة | فيشر ساينتيفك | 02707407, 02707410, 02707438 | |
| كلية إنسانية كاملة طازجة | نوفابيوز | https://www.novabiosis.com/research-organ-allocation-services/ | تم الحصول على الكلى البشرية من خلال نوفابيوسيس، وهو مكتب أوبوي معتمد من UNOS |
| الحاضنة المرطبة (37 & درجة؛ C و5٪ CO2) | فيشر ساينتيفك | 51033556 | |
| الهيدروكورتيزون | ميليبورسيغما | H0888 | |
| الهزاز المداري الحاضن | أفانتور | 12620-946 | |
| الإنسولين-ترانسفيرين-سيلينيوم (100X) (ITS -G) | ثيرموفيشر ساينتيفيك | 41400045 | |
| القوارير المبردة ذات الخيط الداخلي | كورنينغ | 430487 | |
| كيمتيك ساينس كيموائيب | كيمبرلي-كلارك بروفيشنال | 34120 | |
| لوير سبيبس (إبرة غير حادة)، 22 جرام × 0.5 بوصة | مختبرات إنستك، إنك. | LS22 | |
| متوسط 199، ملح إيرلز (10 مرات) | ثيرموفيشر ساينتيفيك | 21180021 | |
| ميغافوج 8 جهاز الطرد المركزي الصغير ذو الطاولة | ثيرموفيشر ساينتيفيك | 75007210 | |
| موصل معدني (غير حاد) | مختبرات إنستك، إنك. | SC 20/15 | |
| حاوية تجميد السيد فروستي | ثيرموفيشر ساينتيفيك | 5100-0036 | |
| مجهر نيكون إكليبس Ti-S | نيكون إنسترومنتس | https://www.thelabworldgroup.com/product/nikon-eclipse-ti-fluorescent-microscope/ | تم إيقاف النموذج الأصلي |
| قوارير Nunc غير المعالجة، T-25 | ثيرموفيشر ساينتيفيك | 169900 | |
| قوارير Nunc غير المعالجة، T-75 | ثيرموفيشر ساينتيفيك | 156800 | |
| بيبيت، 10 مل، خريجة، 1/10 مل، معقمة | غرينر بيو-ون | 607180 | |
| أنابيب السيليكون، أنابيب C-flex، (معرف: 0.020"، قطر العرض: 0.083") | كول-بارمر | 06422-00 | |
| شفرة حلاقة بحافة واحدة (معقمة) | الختم البيولوجي | KI-205/50 | |
| بيكربونات الصوديوم | ميليبورسيغما | S6297 | |
| هيدروكسيد الصوديوم | ميليبورسيغما | S8045 | |
| وحدات المرشح المعقمة ذات التخلص مرة واحدة مع أغشية PES | ثيرموفيشر ساينتيفيك | 567-0020 | |
| أطباق معالجة بمزرعة الأنسجة، 150 مم & nbsp; × 20 مم مهوى | جينيسي ساينتيفك | 25-203 | |
| تريبسين-إيدتا (0.05٪)، فينول أحمر | ثيرموفيشر ساينتيفيك | 25300054 | |
| الكولاجين من النوع الأول، ذيل الجرذ | كورنينغ | 354236 | |
| كولاغن النوع الرابع، فأر | كورنينغ | 354233 |
المراجع
- Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. Human nephron number: implications for health and disease. Pediatr Nephrol. 26 (9), 1529-1533 (2011).
- Zhang, X., et al. Tubular secretion of creatinine and kidney function: an observational stu....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
