مقالة منهجية

بروتوكول قياس الخلوي الكهربائي للفحص المجهري للخلايا الحية والفلورية باستخدام زراعة الخلايا U2 OS

DOI:

10.3791/68005

⸱

يونيو 13, 2025

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biology, Toronto Metropolitan University, 2Institute for Biomedical Engineering, Science and Technology (iBEST), a partnership between St. Michael's Hospital, a site of Unity Health Toronto, and Toronto Metropolitan University, 3Keenan Research Centre for Biomedical Science at St. Michael's Hospital

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التثقيب الكهربائي هو استخدام المجالات الكهربائية النبضية (PEFs) لإنشاء مسام عابرة في مزارع الخلايا لإدخال البضائع الجزيئية. أصبحت هذه التقنية مؤخرا مستخدمة على نطاق واسع في الأبحاث والبيئات السريرية. هنا ، نصف تقنيات التثقيب الكهربائي باستخدام "نظام القياس الخلوي الكهربائي" الذي تم تطويره مؤخرا لإجراء الفحص المجهري للخلايا الحية والفلورية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المجالات الكهربائية النبضية (PEFs) لها مجموعة واسعة من التطبيقات في البحوث الطبية والتطبيقات السريرية. يركز مجال رئيسي من البحث على التثقيب الكهربائي (قابل للانعكاس أو لا رجعة فيه). تم استخدام التثقيب الكهربائي القابل للانعكاس لعدة عقود لنقل الجزيئات عبر أغشية الخلايا مثل الحمض النووي البلازميدي ، والذي يشار إليه عادة باسم النقل الكهربائي الجيني (GET). على العكس من ذلك ، أصبح التثقيب الكهربائي الذي لا رجعة فيه أسلوبا شائعا في علاج السرطان ، حيث يوفر بديلا غير سام عن طريق تمزيق الخلايا بشكل دائم باستخدام PEFs. يمكن دمج هذا مع أنواع مختلفة من الأدوية أو الكواشف لتعزيز التأثير الذي أصبح يعرف باسم العلاج الكيميائي الكهربائي (ECT). ومع ذلك، وعلى الرغم من النجاح الواسع النطاق في التطبيقات العملية، فإن هناك حاجة إلى مزيد من الدعم للتكنولوجيا والبحوث لتحسين التقنيات الحالية. لمعالجة هذا الأمر ، تم تطوير نظام القياس الخلوي الكهربائي لدعم تجربة PEF للخلايا الحية مع القدرة على إجراء الفحص المجهري الفلوري طويل الأمد. كان هذا بالاقتران مع خط خلية FUCCI (CA) 5 U2-OS يعبر بثبات لتقييم التغيرات في دورة الخلية استجابة للتعرض ل PEF. من خلال القيام بذلك ، تم تحقيق الفحص المجهري بفاصل زمني يصل إلى 30 ساعة ، مما يوفر تغييرات في الوقت الفعلي في نشاط الخلية بناء على مراسل FUCCI (CA) 5. ونتيجة لذلك، كانت التغييرات الخاصة بالطور قابلة للقياس الكمي لتحليل المصب.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نمت المجالات الكهربائية النبضية (PEFs) لتصبح أداة شائعة لمجموعة متنوعة من التطبيقات في علم الأحياء والتطبيقات السريرية1. يمكن تصنيفها على نطاق واسع حسب التثقيب الكهربائي (EP) والتحفيز الكهربائي (ES). يحتوي التثقيب الكهربائي على مجالين فرعيين يعرفان باسم التثقيب الكهربائي القابل للانعكاس وغير القابل للعكس. تم استخدام التثقيب الكهربائي القابل للانعكاس (RE) لعقود كأداة فعالة لنقل البضائع الجزيئية مثل الحمض النووي البلازميدي إلى خلايا من أنواع مختلفة مثل الثدييات والبكتيريا والخميرة2. في الآونة الأخيرة ، نما التثقيب الكهربائي الذي لا رجعة فيه (IRE) كبديل غير سام لعلاجات السرطان الحالية3. يشار إلى مجال فرعي ناشئ باسم استئصال المجال النبضي (PFA) ، والذي يركز على إزالة الأنسجة غير الحرارية ، ولا سيما لعلاج بعض الاختلالاتالقلبية 4. بالاقتران مع الأدوية والكواشف الأخرى ، أدى ذلك إلى تطوير العلاج الكيميائي الكهربائي (ECT). ومع ذلك ، فإن الفهم الحالي لعلاجات PEF يتجاوزه التطبيقات السريرية5. نقدم هنا نظام القياس الخلوي للتثقيب الكهربائي للتحقيق في العلاجات الكهروكيميائية. تمثل دورة الخلية مؤشرا رئيسيا لصلاحية الخلية ، ويمكن للتغييرات تحديد التأثيرات الخاصة بالمرحلة. من خلال تطوير هذه الأدوات ، يمكن تكييف البروتوكولات بشكل أسرع ، مما يوفر علاجات أكثر فعالية لمجموعة واسعة من السرطانات.

يتكون نظام القياس الكهربائي المخصص الخاص بنا (الشكل 1) من غرفة بها أقطاب كهربائية من الألومنيوم وغطاء زجاجي قاع بالإضافة إلى مولد نبض اضمحلال أسي بسيط. تم بناء الغرفة من غرفة مطبوعة ثلاثية الأبعاد ويتم لصق قاع زجاجي بغطاء # 1.5 بواسطة مادة لاصقة حساسة للضغط من الدرجة الطبية. تتكون الأقطاب الكهربائية من فيلم ألومنيوم لاصق يوضع فوق دعامات مدمجة في الغرفة ، مما يوفر قطبين متوازيين يفصل بينهما 0.4 سم. هذا تكوين شائع للأقطاب الكهربائية التجارية ويوفر تصميما قويا يمكنه تكييف البروتوكولات الحالية بسرعة. يمكن أن تتناسب الغرفة مع العبوات البيئية المصممة للشرائح مقاس 25 مم × 55 مم ، وهو أيضا تنسيق شرائح شائع يدعمه مزودي المجاهر التجاريون. يوفر مولد النبض ما يصل إلى 330 فولت نبضات اضمحلال أسية ، مما يسمح بتحقيق مجموعة واسعة من التجارب ، بما في ذلك التثقيب الكهربائي القابل للانعكاس ولا رجعة فيه.

لدراسة تأثيرات PEFs على دورة الخلية ، استخدمنا خط خلية الساركوما العظمية البشرية المعدلة وراثيا (U2 OS) يعبر عن مؤشر دورة الخلية الفلورية في كل مكان (CA) 5 (FUCCI (CA) 5) ، وهو عبارة عن بناء مراسل دورة الخلايا الحية الفلورية. يقدم النظام شكلين فلوريين مقطوعين من Geminin و Cdt1 ، يتم إنتاجهما وإعادة تدويرها بمعدلات محددة خلال دورة الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن مراقبة موت الخلايا المبرمج بشكل مباشر أثناء التجربة باستخدام خط FUCCI (CA) 5 يعبر بشكل ثابت عن خلايا U2-OS. خلال دورة الخلية ، يعمل المراسل بشكل متوقع مع كل مرحلة لأنه يتم إنتاجها وتدهورها بنفس معدلات الإصدارات الوظيفية التي يتم التعبير عنها بشكل طبيعي في الخلية. عندما يحدث موت الخلايا المبرمج ، تتعطل هذه الدورة مع إغلاق دورة الخلية بسرعة. عادة ، سيظهر هذا بصريا على أنه تأمل قديم داخل دورة الخلية ، متبوعا بتغيرات مورفولوجية جذرية في النواة ، والتي يمكن رؤيتها بوضوح بسبب توطين المراسلين إلى النواة6. يسمح هذا بالتعرف البصري على كل مرحلة في خلايا مفردة بمرور الوقت (الشكل 2). يتسبب التثقيب الكهربائي القابل للانعكاس في حدوث تغييرات في الظروف داخل الخلايا وتم اختيار نبضة اضمحلال أسية 180 فولت للتحقيق. تم اختيار هذا النبض للحد من موت الخلايا قدر الإمكان ، مع ضمان التثقيب الكهربائي في غالبية السكان. تم تحديد ذلك بناء على بحث سابق يبحث في معلمات نبض التثقيب الكهربائي المثلى لستة خطوط خلايا ثدييات. كانت كثافة الطاقة لنبضة 180 فولت أقل قليلا من معلمات التعداء المثلى ، مما يوفر بقاء أفضل للخلية مع ثقب عال7. تمت دراسة تأثير النبضة في الخلايا غير المتزامنة والخلايا المتزامنة في المرحلة S باستخدام كتلة الثايميدين المزدوجة مع وبدون تطبيق PEF (الشكل 3). أشارت النتائج إلى انخفاض في متوسط طول S و G2 مقارنة بالسيطرة. يشير هذا إلى أن المرحلة S كانت حساسة للتعرض ل PEF مما أدى إلى دورة خلية أسرع. أظهر هذا أن نظام القياس الخلوي للتثقيب الكهربائي كان قادرا على الجمع بين توصيل PEFs وتصوير الخلايا الحية على المدى الطويل لدراسة دورة الخلية. بينما استخدمنا هذه المنصة لمراقبة تقدم الخلية خلال دورة الخلية استجابة ل PEFs ، فهذه أداة مفيدة لدراسة مجموعة متنوعة من التطبيقات والشروط ل PEFs وزراعة الخلايا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير ثقافة الخلايا

  1. قم بإعداد الخط المستقر باستخدام التثقيب الكهربائي القابل للانعكاس مع المعلمات التالية: 100 ميكرولتر من خلايا U2 OS المعلقة (6 × 106 خلايا / مل) مع 5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد في كوفيت 0.4 سم ، ونبضة موجة مربعة 180 فولت لمدة 10 مللي ثانية.
  2. طباعة تصميم الغرفة المخصصة باستخدام أي طابعة ثلاثية الأبعاد مناسبة وبلاستيك متوافق حيويا مثل حمض البولي لاكتيك (PLA) (انظر الملف التكميلي 1). قم بتطهير الغرفة المكتملة باستخدام الإيثانول (70٪) ، وتخزينها في وعاء معقم قبل الاستخدام.
  3. زراعة U2-OS FUCCI (CA) 5 خلايا في صفيحة مقاس 10 سم مع 10 مل من Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM) - نسبة عالية من الجلوكوز تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ PenStrep وتحتضن عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  4. عندما تصل المزرعة إلى 80٪ من التقاء ، قم بشفط الوسائط ، واغسل مزرعة الخلية بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، وقم بفصل الخلايا باستخدام 1 مل من 0.25٪ تربسين لمدة 1.5 دقيقة.
  5. تحييد التربسين عن طريق تعليق زراعة الخلايا في 5 مل من DMEM-High Glucose (يحتوي على 10٪ FBS و 1٪ PenStrep).
  6. من ثقافة الخلايا المعلقة ، احصل على عينة 100 ميكرولتر وضعها في غرفة نظام القياس الخلوي للتثقيب الكهربائي على الغطاء الزجاجي السفلي. تأكد من أن الغرفة ملتقية بنسبة 30٪ بعد إدخال العينة. إذا بدت العينة مفرطة التقاء قبل الحضانة ، فقم بشفط العينة وخفض حجم العينة.
  7. ببطء ، أضف 4 مل من DMEM-High Glucose (يحتوي على 10٪ FBS و 1٪ PenStrep) إلى الطرف البعيد من الغرفة ، مما يمنع السائل من طرد العينة.
  8. ضع شريحة مجهر قياسية أعلى الغرفة واحتضان الغرفة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة ، مما يضمن التصاق المزرعة تماما بقاع الغرفة. اختياريا ، استخدم Hoechst 33342 (1 ميكروغرام / مل) لتلطيخ نوى الخلايا لتسهيل القياس الكمي للخلايا المصب وكذلك موت الخلايا المبرمج. قم بإجراء البقعة قبل 30 دقيقة من الفحص المجهري بفاصل زمني.

2. تحضير المجهر

  1. أولا ، قم بتشغيل مجهر الفلورسنت المقلوب مع أدوات التحكم البيئية والغرفة ، مما يسمح للظروف بالاستقرار قبل إجراء التثقيب الكهربائي.
    ملاحظة: أي مجهر مضان مقلوب مزود بنظام بيئي يمكنه قبول شريحة الغرفة مقاس 25 مم × 55 مم × 16 مم. تم تصميم التصميم في الأصل للعمل على المجهر المقلوب المشار إليه (انظر جدول المواد) والنظام البيئي المقابل.
    يمكن أن يتسبب تسخين المرحلة في حدوث انجراف في الصورة بسبب تمدد المعدن.
  2. أثناء وصول النظام البيئي إلى درجة الحرارة المثلى ، قم بتوصيل جهاز قياس رقمي متعدد بمكثف مولد النبض ومفتاح الجهد العالي باستخدام الكابلات الكهربائية المناسبة. لاتباع هذا البروتوكول ، استخدم كبلات مشبك "التمساح" للسماح بالتجميع والتفكيك السريع باستخدام غرفة التثقيب الكهربائي.
  3. بعد ذلك ، حدد التكبير بمقدار 20 ضعفا وباستخدام برنامج المجهر ، تأكد من تحديد قنوات FITC (GFP) و A594 (TexRed / mCherry) (اختياريا ، قناة DAPI ل Hoechst 33342) المقابلة لبروتيني الفلورسنت في نظام FUCCI (CA) 5. استخدم إعدادات التعريض الضوئي المنخفض (عادة <0.05 ثانية) لتجنب تلف الصورة على مدى فترات زمنية طويلة المدى.
  4. قم بتحسين تركيز الصورة وجودتها عن طريق التقاط صور تجريبية قبل بدء الفاصل الزمني.
    ملاحظة: يجب أن يكون التألق ساطعا فقط بقدر الضرورة لتصور الألوان.
  5. قم ببرمجة الفاصل الزمني لالتقاط 3-6 وجهات نظر كل 10 دقائق لمدة 24 ساعة للحصول على حجم كبير من بيانات دورة الخلية لكل فاصل زمني مع التخفيف من تلف الصورة.
    ملاحظة: قد يختلف طول الوقت اعتمادا على الجدول الزمني للنشاط الخلوي.
  6. تأكد من تمكين التركيز البؤري التلقائي لقناة A594 للحصول على أفضل النتائج لتتبع زراعة الخلايا أثناء الفاصل الزمني.
  7. اترك البرنامج في وضع الاستعداد حتى يتم إجراء التثقيب الكهربائي. بمجرد تسليم النبضة ، قم على الفور بتنشيط الفاصل الزمني لضمان أعلى دقة ممكنة للبيانات.

3. التثقيب الكهربائي

  1. ضع غرفة قياس التثقيب الكهربائي الخلوي في المجهر بغرفة بيئية مناسبة. قبل التثقيب الكهربائي ، اترك الغرفة مغلقة مع تشغيل النظام البيئي لضمان عدم تأثر دورة الخلية.
  2. قم بتوصيل مقياس رقمي متعدد بمولد النبض وقم بتوصيل مولد النبض بأقطاب الغرفة باستخدام كابلات مشبك التمساح عن طريق فتح الغرفة البيئية.
  3. اشحن المكثف الموجود في مولد النبض إلى 180 فولت وقم بتفريغ النبضة بسرعة في الغرفة حتى يقرأ جهاز القياس الرقمي المتعدد 0 فولت.
  4. قم بإزالة التوصيلات الكهربائية للغرفة واستبدل الغطاء في أسرع وقت ممكن لضمان ظروف الزراعة المناسبة.
  5. قم بتنشيط الفاصل الزمني على الفور بمجرد وضع النظام البيئي للمجهر في مكانه.

4. الحصول على بيانات بفاصل زمني

  1. بعد اكتمال الفاصل الزمني ، استخدم برنامج المجهر لحفظ الفاصل الزمني كفيديو واحد بناء على الصور الملتقطة على مدار فترة الفاصل الزمني. تحسين الجودة المرئية في هذه المرحلة للمساعدة في القياس الكمي اليدوي.
    ملاحظة: يمكن تحديد أي معدل إطارات. ومع ذلك ، توفر 6 إطارات / ثانية سرعة إعادة تشغيل معتدلة مع ثانية فيديو واحدة تؤدي إلى ساعة واحدة من الوقت الفعلي.
  2. بمجرد إعداد فيديو الفاصل الزمني ، تتبع مراحل الخلية بمرور الوقت من خلال مراقبة التغييرات في إشارات FITC و A594

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام نظام FUCCI (الشكل 2) ، تم الحصول على بيانات دورة الخلية المرئية عن طريق قياس طول الفترة الزمنية التي تم فيها التعبير عن كل لون بواسطة الخلية نتيجة للتعبير عن البروتين وإلغاء التدخين. بناء على نتائج التجارب غير المتزامنة والمتزامنة (الشكل 3) ، كان من الواضح أن التعرض ل PEF في المرحلة S ينظم دورة الخلية. وقد تجلى ذلك من خلال الانخفاض في متوسط طول الطور ، مما يشير إلى دورة خلية أسرع. علاوة على ذلك ، فقد أظهر أيضا التأثير طويل المدى للثيميدين على دورة الخلي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عند إجراؤها بشكل صحيح ، يمكن قياس بيانات مرحلة دورة الخلية لكميات كبيرة من الخلايا المفردة لفترات تصل إلى 24 ساعة. أسفر هذا البروتوكول عن بيانات دورة الخلية القابلة للمقارنة لطرق بديلة مثل FACs. هذه طريقة شائعة الاستخدام حيث يتم تصنيف الخلايا بالفلورسنت أثناء تقدمها خلال دورة الخلية. بعد الحضانة لمدة 24 ساعة على الأقل ، يتم فرزها حسب شدة الفلورسنت ، والتي ترتبط بعدد السكان في مرحلةمعينة 8. أظهرت الأبحاث السابقة باستخدام هذه الطريقة أن U2 OS تؤدي دورة خليتها في حوا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر كل من مختبر غوبتا وأعضاء مجموعة Rackus على دعمهم المستمر داخل وخارج المختبر. منح التمويل المقدم بسخاء من خلال الشراكة مع Mitacs.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
شريحة الغرفة (3D المطبوعة / Assesmbled)   ؛N / AN / A
لوحة الثقافة (10 سم)Sarstedt83.3902
Delta VisionOlympusN /A. تأكد من أن المرحلة والنظام البيئي يمكن أن يستوعب شريحة غرفة التثقيب الكهربائي (55 مم x & nbsp ؛
DMEM – ارتفاع الجلوكوزجيبكو11965092
مصل الأبقار الجنين ThermoFisherA5256701 
طابعة i3 MK3S ثلاثية الأبعادPrusaN / Aيمكن استخدام نماذج الطابعة البديلة التي يمكنها استخدام ملفات STL.
Pen StrepThermoFisher15070063
فوسفات مخزن محلول ملحيGibco10010031
tFUCCI (CA) 5Addgene153521
TrypsinSigma-Aldrich9002-07-07
U2-OS Cell LineATCCHTB-96
يمكن أيضا استخدام نماذج المجاهر البديلة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shi, J., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), 3044(2018).
  2. Kandušer, M., Miklavčič, D. Electroporation in biological cell and tissue: An overview. Electrotechnologies for extraction from food plants and biomaterials. Food Engineering Series. , Springer. New York. (2009).
  3. Cemazar, M., Sersa, G. Recent advances in electrochemotherapy. Bioelectricity. 1 (4), 204-213 (2019).
  4. Iyengar, S. K., Iyengar, S., Srivathsan, K. The promise of pulsed field ablation and the challenges ahead. Front Cardiovasc Med. 10, 1235317(2023).
  5. Miklavčič, D., Mali, B., Kos, B., Heller, H., Serša, H. Electrochemotherapy: From the drawing board into medical practice. Biomed Eng Online. 13 (1), 29(2014).
  6. Ando, R., Sakaue-Sawano, A., Shoda, K., Miyawaki, A. Two coral fluorescent proteins of distinct colors for sharp visualization of cell-cycle progression. Cell Struct Funct. 48 (2), 132-144 (2023).
  7. Nesmith, T., Vieira, C., Rackus, D., Gupta, G. An electroporation cytometry system for long-term, live cell cycle analysis. Biomicrofluidics. 18 (4), 044105(2024).
  8. Hulett, H. R., Bonner, W. A., Barrett, J., Herzenberg, L. A. Cell sorting: automated separation of mammalian cells as a function of intracellular fluorescence. Science. 166 (3906), 747-749 (1969).
  9. Chao, H. X., et al. Evidence that the human cell cycle is a series of uncoupled, memoryless phases. Mol Sys Bio. 15 (3), e8604(2019).
  10. Diehl, F. F., Sapp, K. M., Vander Heiden, M. G. The bidirectional relationship between metabolism and cell cycle control. Trends Cell Bio. 34 (2), 136-149 (2024).
  11. Rems, L., et al. Cell electrofusion using nanosecond electric pulses. Sci Rep. 3, 3382(2013).
  12. Klein, S. G., et al. Toward best practices for controlling mammalian cell culture environments. Front Cell Dev Bio. 10, 788808(2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

U2 OS FUCCI S

مقالات ذات صلة