مقالة منهجية

تحليل الجينات التفاضلية والتحقق من صحة داء ثاني كبريتيد في نموذج إصابة نقص تروية عضلة القلب في الفئران

630 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68019

⸱

أبريل 18, 2025

 , 
1Department of Cardiovascular Medicine, The Affiliated Hospital of Guizhou Medical University

في هذه المقالة

ملخص

يصف البروتوكول تحديد العديد من الجينات التفاضلية الجديدة المرتبطة بداء ثاني كبريتيد الصدر المرتبطة بإصابة نقص تروية عضلة القلب وإعادة تروية القلب عن طريق تحليل المعلوماتية الحيوية والتحقق من الصحة التجريبية.

الملخص

إصابة نقص تروية عضلة القلب (MIRI) هي إصابة إضافية تحدث أثناء عملية استعادة تدفق الدم في أنسجة القلب بعد الإصابة الناجمة عن نقص التروية. يؤثر MIRI بشكل خطير على فعالية وتشخيص إعادة التروية على المدى القصير والطويل بعد احتشاء عضلة القلب. وفي الوقت الحاضر، آلية المبادرة ليست واضحة تماما. داء ثاني كبريتيدس هو طريقة جديدة لموت الخلايا ، ولا تزال العلاقة بين MIRI والتعبير عن الجينات المرتبطة بداء ثاني كبريتيد (DRGs) غير واضحة. أولا ، تستكشف هذه الدراسة الجينات المعبر عنها تفاضليا المرتبطة بداء ثاني كبريتيد في MIRI من خلال تحليل المعلوماتية الحيوية. ثانيا ، من خلال بناء نموذج فئران من MIRI ، تم اكتشاف DRGs بشكل أكبر. حددت هذه الدراسة 12 جينا ذا صلة ، بما في ذلك Myh9 و SLC7A11 و SLC3A2 و Myh7b و ACTB و FLNB و Actn1 و Actn4 و Flnc و Dbn1 و Pdlim1. يظهر نسيج عضلة القلب للفئران المصابة ب MIRI أضرارا مرضية واضحة وأحداث موت الخلايا المبرمج. أشارت نتائج الكيمياء المناعية إلى أن تحفيز MIRI زاد من التعبير عن بروتين GLUT1 في أنسجة عضلة القلب ولكنه قيد التعبير عن بروتين F-actin. بالإضافة إلى ذلك ، تم التحقق من صحة الاختلافات ذات الدلالة الكبيرة في التعبير عن ثلاثة بروتينات باستخدام مجموعات البيانات الخارجية ونماذج الفئران MIRI. أظهرت هذه الدراسة أن DRGs لها قيمة تنبؤية كبيرة في MIRI ، مما يوفر آفاقا جديدة لاستكشاف المؤشرات الحيوية والأهداف العلاجية المحتملة ل MIRI.

المقدمة

احتشاء عضلة القلب الحاد (AMI) هو حالة قلبية وعائية حادة ولا يزال سببا عالميا رئيسيا للوفاة. أدى التدخل التاجي عن طريق الجلد إلى تقليل معدلات الوفيات بشكل كبير لدى مرضى AMI1. ومع ذلك ، فإن علاج إعادة التروية الذي يهدف إلى استعادة إمدادات الدم في عضلة القلب مصحوب بسلسلة من الاستجابات المرضية والفسيولوجية الضارة. يمكن أن تؤدي هذه العمليات إلى زيادة حجم الاحتشاء ، وموت خلايا عضلة القلب ، وعدم انتظام ضربات القلب البطيني المستمر ، والموت المفاجئ2. إصابة نقص تروية عضلة القلب (MIRI) هي حالة قلبية وعائية معقدة تتأثر بعوامل مثل السيتوكينات والكيموكينات وعوامل النمو والإجهاد التأكسدي والحمل الزائد للكالسيوم3. ولا يزال التخفيف من حدة العدوى والوقاية من العدوى تحديا كبيرا.

في الآونة الأخيرة ، ظهر داء ثاني كبريتس كبريتس كشكل جديد من أشكال موت الخلايا يتميز بالانهيار السريع لشبكة الأكتين الهيكلية الخلوية بسبب التراكم المفرط لثاني كبريتيدات ، بما في ذلك السيستين ، داخل الخلايا ، الناتج عن استنفاد NADPH + . يؤدي التراكم المفرط لثاني كبريتيد إلى تعطيل روابط ثاني كبريتيد بين بروتينات الهيكل الخلوي ، مما يؤدي إلى هجرة الأكتين وموت الخلايا4،5. على عكس الأشكال التي تم الإبلاغ عنها سابقا من موت الخلايا مثل موت الخلايا المبرمج ، والنخر ، وداء الحمى ، والتهاب الحديد ، يبدأ داء ثاني كبريتس عن طريق التجميع المفرط لثاني كبريتيد داخل الخلايا ولا يعارضه مثبطات محددة لمسارات موت الخلايا الأخرى. كموت خلوي مميز ، أشارت الأدلة إلى أن نقص الجلوكوز الخلوي الذي يثيره SLC7A11 الإفراط في التعبير يمكن أن يؤدي إلى داء ثاني كفيديبتوس4. بعد MIRI ، يمكن أن يؤدي إفراز الأنسولين غير الكافي إلى نقص السكر في الدم وداء ثاني كبريتدبتوس اللاحق ، مما قد يسبب مزيدا من الضرر لخلايا عضلة القلب وقد يكون أحد الآليات الجديدة ل MIRI5.

في هذه الدراسة ، كان الهدف الأساسي هو استخدام قواعد بيانات التعبير الجيني الشاملة ، مثل Gene Expression Omnibus (GEO) ، لتحليل التعبير الجيني التفاضلي بين العينات العادية و MIRI. أجرينا تحليلا مرجعيا بين الجينات والجينات المعبر عنها تفاضليا المرتبطة بداء ثاني كبريتيد ، بهدف تحديد الجينات المرتبطة بداء ثاني كبريتيد (DRGs) التي تظهر تعبيرا تفاضليا في MIRI. تم استخدام خوارزميات التعلم الآلي لتحديد الجينات الرئيسية ، وقمنا بالتحقق من صحة أنماط التعبير عن الجينات التفاضلية المختارة ذات الأهمية باستخدام نموذج حيواني. يوفر هذا النهج منظورا جديدا نحو اكتساب فهم أعمق للآليات المحتملة الكامنة وراء ظهور وتطور الهرجان. كان التركيز الأساسي لهذا البحث هو التحقيق في آلية موت الخلايا الجديدة داخل MIRI ، والكشف عن الجينات التفاضلية المرتبطة بها ، وإجراء تجارب أولية للتحقق من صحة هذه النتائج. كان الهدف النهائي هو تحديد أهداف علاجية جديدة للتخفيف من MIRI بناء على آلية موت الخلايا الناشئة هذه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

في هذه الدراسة ، تم اختيار تسعة فئران ذكور من Sprague-Dawley (SD) ، تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع ووزنها 180-220 جراما ، من مركز أبحاث التجريبية في هوبي [SCXK (Hubei) 20200018]. تم الاحتفاظ بالفئران في بيوت محددة خالية من مسببات الأمراض للتأقلم لمدة أسبوع واحد ، مع دورة إضاءة وظلام لمدة 12 ساعة / 12 ساعة ، والشرب والأكل مجانا. أجريت الدراسة الحالية بموافقة لجنة أخلاقيات في المستشفى الثالث التابع لجامعة زوني الطبية (رقم الموافقة: (2016)-1-56). تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للتوصيات الموضحة في دليل رعاية واستخدام المختبر الذي نشرته المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة. تم تنفيذ تدابير صارمة لتقليل عدد المستخدمة والتخفيف من معاناتها.

1. تحليل التعبير التفاضلي للجينات المتعلقة ب MIRI و dissulfifideptosis

ملاحظة: تم اختيار بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي من MIRI المسمى GSE214122 لفحص الجينات المرتبطة بداء الكريات الكبريتي وفقا لتقرير الأدبيات6.

  1. افتح قاعدة بيانات GEO، واكتب GSE214122 في مربع البحث، ثم انقر فوق Enter. قم بتنزيل ملف (ملفات) مصفوفة السلسلة التي تم إنشاؤها بتنسيق TXT ضمن قسم التنزيل.
    ملاحظة: قبل إجراء تحليل البيانات ، من الضروري عادة معالجة البيانات التي تم تنزيلها مسبقا. يتضمن ذلك التحقق من القيم المفقودة ، وإزالة العينات والجينات منخفضة الجودة ، وإجراء التطبيع أو التوحيد القياسي للبيانات. احتوت مجموعة البيانات GSE214122 المسترجعة على عينات من مجموعات MIRI التي يتم تشغيلها بشكل وهم.
  2. قم بإجراء تحليل التعبير الجيني التفاضلي للعينات باستخدام حزمة DESeq27. ضع في اعتبارك الجينات التي تحتوي على |log2FC|>1 (تغيير الطية أكبر من 2) و FDR<0.05 على أنها ذات دلالة إحصائية ، مما يؤدي إلى تحديد الجينات المعبر عنها تفاضليا المرتبطة ب MIRI. قم بإنشاء خريطة تمثيلية للتعبير الجيني التفاضلي في الخطوة 1.2 باستخدام حزمة خريطة الرسمالتصويري 7 الخاصة ب R.
  3. قم بإنشاء مخطط Venn باستخدام حزمة VennDiagram7 الخاصة ب R (انظر جدول المواد). قم بإنشاء مخططات بركان لتصور الجينات المرتبطة بداء ثاني كبريتيد باستخدام حزمة EnhancedVolcano في R7.
  4. قم ببناء شبكة PPI تربط الجينات المعبر عنها تفاضليا MIRI مع جينات داء ثاني الكبريت باستخدام قاعدة بيانات STRING7 (انظر جدول المواد).

2. بناء نموذج MIRI للفئران

  1. قم بصيام الفئران طوال الليل قبل إجراء التخدير. تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من 2٪ بنتوباربيتال الصوديوم (40 مجم / كجم) وتأمين الأطراف في لوح الفئران في وضع ضعيف. تأكد من عمق التخدير من خلال عدم الاستجابة لقرص إصبع القدم ، وفقدان منعكس التصحيح ، وانعكاس غمزة العين. استخدم مرهما بيطري لمنع الجفاف أثناء التخدير.
  2. تطهير جلد الرقبة والصدر باليودوفور وإزالة اليود بالكحول بنسبة 75٪. احلق فرو الرقبة والصدر الأيسر بشفرة حلاقة كهربائية وقم بعمل شق متوسط في الرقبة بطول 2.5 سم تقريبا باستخدام مشرط (انظر جدول المواد).
  3. افصل القصبة الهوائية بالملقط وقم بإجراء التنبيب الرغامي مع توصيل جهاز التنفس الصناعي الحيوانيالصغير 3 (انظر جدول المواد).
  4. اقطع طوليا 4 سم على طول الجانب الأيسر من القص بمقص للعيون وافصل العضلات تحت الجلد بصراحة باستخدام ملقط لفضح غشاء الجنب بين الأضلاع الثالثة والرابعة.
  5. قم بعمل شق 4-5 سم من عملية الخنجري إلى منتصف المساحة الوربية الثانية اليسرى مع إمساك المشرط بزاوية 45 درجة. افصل بلطف وببطء بين عضلات الصدرية الكبرى والعضلات المنشارية الأمامية باستخدام ملقط العين للوصول إلى الفضاء الوربي.
  6. قم بعمل شق عرضي بطول 1.5 سم بين الضلعين الأيسر والثالث والرابع باستخدام مقص العيون. بعد تشريح التامور باستخدام ملقط العين ، ارفع زائدة الأذين اليسرى بالملقط لتحديد العبء التاجي في جذر الأبهر.
  7. ربط الشريان التاجي الأمامي الأيسر الهابط بين المخروط الرئوي والزائدة الأذينية اليسرى باستخدام خياطة 6-0 (انظر جدول المواد).
  8. بعد 30 دقيقة ، قم بفك الخيط للسماح بإعادة التروية لمدة 120 دقيقة ، متبوعا بإغلاق طبقات العضلات والجلد باستخدام خياطة 6-0. ضع البنسلين (انظر جدول المواد) عن طريق الحقن داخل الصفاق ب 80,000-100,000 وحدة.
  9. في المجموعة الوهمية ، قم بإجراء جميع الإجراءات كما تم إجراؤها للمجموعة النموذجية ، ولكن قم فقط بخيط الشريان التاجي الأمامي الأيسر الهابط دون ربط أو إعادة تروية.
  10. بمجرد أن تستعيد الفئران وعيها ، قم بإزالة الأنابيب الرغامية. أعد الفئران إلى منشأة للتعافي ، حيث سيكون لديهم حرية الوصول إلى الطعام والماء. ضع الفئران الخاضعة لعملية جراحية في قفص واحد بنظام تهوية مستقل في مختبر معقم.
  11. خلال 30 دقيقة من نقص التروية و 120 دقيقة من إعادة التروية ، قم بإجراء تخطيط صدى القلب. اعتبرت النمذجة ناجحة إذا تم قياس جزء طرد البطين الأيسر أقل من 50٪ 1،6.

3. حصاد أنسجة القلب3

  1. بعد 120 دقيقة من إعادة التروية ، ضع الفئران في حاوية القتل الرحيم لتنفيذ القتل الرحيم عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون. اجمع أنسجة قلب الفئران على الفور.
  2. قم بإزالة شعر بطن الفئران بجهاز حلاقة وتعقيم منطقة الصدر الأمامية باليود و 75٪ كحول. تشريح تجويف البطن للفأر على طول خط الوسط للبطن بمشرط.
  3. اقطع الجلد من عملية الخنجري لأعلى إلى الفضاء تحت الفك السفلي باستخدام مقص جراحي وقم بتقشير الجلد والأنسجة تحت الجلد بصراحة باستخدام ملقط على كلا الجانبين لفضح القفص الصدري وطبقة عضلات عنق الرحم السطحية (انظر جدول المواد).
  4. افتح الصدر وغشاء الجنب على طول خط الوسط بمقص جراحي لكشف القلب ، وقم بتثبيت الشريان الأورطي بمشبك وعائي ، وقطع الشريان بمقص العيون. أخرج القلب وقم بتشريحه إلى كتلة من الأنسجة مقاس 1 مم3 في محلول ملحي بارد في حمام جليدي وثبته بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 48 ساعة (انظر جدول المواد).

4. تلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين (H & E)

  1. التجفيف والتضمين: قم بتجفيف كتلة أنسجة القلب عن طريق النقع بالتسلسل في 75٪ كحول ، و 85٪ كحول (I) ، و 95٪ كحول (II) ، و 100٪ كحول (I) ، و 100٪ كحول (II) لمدة ساعة واحدة في كل محلول. قم بشفافية الزيلين (I) والزيلين (II) عن طريق الغمس لمدة 15 دقيقة في كل محلول. ضع كتلة أنسجة القلب في البارافين السائل (I) والبارافين (II) والبارافين (III) لمدة 20-30 دقيقة بالتسلسل. اترك كتلة البارافين لتبرد بشكل طبيعي حتى تصلب.
  2. قم بتقطيع كتلة أنسجة القلب المضمنة في البارافين إلى أقسام بحجم 4 ميكرومتر باستخدام آلة تقطيع البارافين (انظر جدول المواد). ضع الأقسام بشكل مسطح بفرشاة ناعمة في حمام مائي 45 درجة مئوية ثم التقط الأقسام الموسعة بالكامل بشريحة.
  3. إزالة الشمع: تخبز الشرائح في فرن لمدة 30-60 دقيقة عند 55 درجة مئوية ، وقم بإزالة الشمع بالزيلين (I) لمدة 5-10 دقائق والزيلين (II) لمدة 5-10 دقائق. بعد ذلك ، اغسل الزيلين بالإيثانول المطلق لمدة 1-5 دقائق ، و 95٪ إيثانول لمدة 1-5 دقائق ، و 75٪ إيثانول لمدة 1-5 دقائق ، واشطفه بماء الصنبور لمدة 1-5 دقائق.
  4. تلطيخ: تلطيخ بمحلول الهيماتوكسيلين لمدة 5-20 دقيقة ، اشطفه بماء الصنبور لمدة 5-10 ثوان ، وصمة عار بمحلول اليوزين لمدة 15-30 ثانية ، واغسلها بمحلول 75٪ - 85٪ من الإيثانول لمدة 30 ثانية.
  5. التجفيف والشفافية والختم: يجفف بنسبة 95٪ من الإيثانول (I) لمدة 0.5-2 دقيقة ، و 95٪ إيثانول (II) لمدة 2-5 دقائق ، يليه الإيثانول المطلق (I) لمدة 2-5 دقائق ، والإيثانول المطلق (II) لمدة 2-5 دقائق. قم بشفافية الزيلين (I) لمدة 1 دقيقة والزيلين (II) لمدة دقيقة واحدة ، ثم أغلق الشريحة بإضافة قطرتين من الراتنج المحايد على الشريحة ووضع غطاء زجاجي. اضغط على زجاج الغطاء برفق لملء الشريحة بالراتنج المحايد (انظر جدول المواد).
  6. راقب كل شريحة تحت مجهر بصري بتكبير 200x بطريقة مزدوجة التعمية بواسطة فنيين مستقلين.
    1. حدد ثلاثة مجالات بصرية عشوائية لتقييم احتقان عضلة القلب والنزيف والتليف والنخر والتنكس. استخدم معايير التسجيل التالية: 0 أشار إلى عدم وجود آفة. 0-1 الآفات المشار إليها كانت أقل من 1/4 من المنطقة المحددة. تراوحت 1-2 آفات موضحة من حوالي 1/4-1/2 من المنطقة المحددة. تراوحت 2-3 آفات مشار إليها من حوالي 1/2-3/4 من المنطقة المحددة. و 3-4 الآفات المشار إليها كانت أكبر من 3/4 من المنطقة المحددة.

5. اختبار TUNEL

  1. قم بتخفيف البروتيناز K بمحلول عازلة الفوسفات (PBS) إلى 40 ميكروغرام / مل وأضف 100 ميكرولتر من البروتيناز K إلى أقسام 4 ميكرومتر المحضرة في الخطوة 4.3 لتغطية مساحة العينة بأكملها واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يتم تضمين Proteinase K في مجموعة الكشف عن موت الخلايا المبرمج TUNEL (انظر جدول المواد).
  2. اغسل القسم 2x باستخدام PBS لمدة 5 دقائق لكل منهما ، وقم بإزالة السائل الزائد عن طريق الشفط بورق الترشيح ، وحافظ على رطوبة القسم في صندوق مبلل.
    ملاحظة: يجب غسل البروتيناز K نظيفا حتى لا يتداخل مع تفاعلات وضع العلامات اللاحقة.
  3. أضف بشكل موحد 50 ميكرولتر من محلول تفاعل TUNEL الذي يحتوي على 2 ميكرولتر من إنزيم TdT و 48 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتفاعل TUNEL وضع القسم في صندوق مبلل لاحتضانه عند 37 درجة مئوية في الظلام لمدة ساعتين.
    ملاحظة: يتم تضمين إنزيم TdT والمخزن المؤقت لتفاعل TUNEL في مجموعة الكشف عن موت الخلايا المبرمج TUNEL.
  4. تخلص من محلول تفاعل TUNEL واشطفه 2x باستخدام PBS لمدة 5 دقائق لكل منهما. اغسل القسم 3x لمدة 5 دقائق لكل منها باستخدام PBS يحتوي على 0.1٪ Triton X-100 و 5 مجم / مل BSA.
  5. أضف بشكل موحد 50 ميكرولتر من محلول تلطيخ DAPI واحتضنه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام. تخلص من محلول تلطيخ DAPI وانقع القسم في PBS ، 3x ، 5 دقائق في كل مرة.
  6. احصل على إشارات TUNEL الحمراء والأزرق DAPI عند أطوال موجية للإثارة والانبعاث تبلغ 593/614 نانومتر و 364/454 نانومتر على التوالي. التقط الصور تحت المجهر الفلوري بتكبير 200x (انظر جدول المواد).

6. تلطيخ كيميائي مناعي

  1. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت المعزز لحجب البيروكسيديز الداخلي إلى القسم الوارد في الخطوة 4.3 واحتضنه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام. اغسل القسم 2x بالماء المقطر لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  2. أضف 1 مل من محلول استرجاع مستضد السترات المحسن و 49 مل من الماء المقطر المزدوج إلى صندوق حضانة الأجسام المضادة واخلطه برفق. اغمر القسم في محلول استرجاع المستضد وقم بتسخينه عند 95 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة قبل التبريد إلى درجة حرارة الغرفة (انظر جدول المواد).
  3. اغسل القسم 2x باستخدام PBS لمدة 5 دقائق لكل منهما. ضع القسم في صندوق حضانة الأجسام المضادة لتحتضانه ب 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية ضد F-actin (1: 100) و GLUT1 (1: 200) و Myh9 (1: 200) و SLC7A11 (1: 200) و SLC3A2 (1: 200) طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  4. اغسل القسم 2x باستخدام PBS لمدة 5 دقائق لكل منهما. أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي إلى القسم واحتضنه لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. اغسل القسم 2x باستخدام PBS لمدة 5 دقائق لكل منهما. قم بتلطيخ 100 ميكرولتر من محلول عمل DAB لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ووقف تفاعل اللون عن طريق التنظيف بالماء النقي.
    ملاحظة: تم إعداد حل عمل DAB عن طريق خلط محلول الكروموجينيك DAB A والمحلول الكروموجيني DAB B بنسبة 1: 1 ، والذي يتم تضمينه في مجموعة تطوير ألوان بيروكسيداز الفجل الحار DAB (انظر جدول المواد).
  6. قم بتلطيخ القسم ب 100 ميكرولتر من محلول تلطيخ الهيماتوكسيلين لمدة 3 دقائق واغسله بالماء الجاري لمدة 3 دقائق (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: تشتمل مجموعة تلطيخ الهيماتوكسيلين والأيوزين على محلول تلطيخ الهيماتوكسيلين.
  7. اغمر القسم في 75٪ إيثانول و 95٪ إيثانول و 100٪ إيثانول لمدة دقيقتين في كل منهما.
  8. أغلق القسم براتنج محايد ، وقم بتغطيته بقلة غطاء ، وافحص القسم تحت مجهر بصري بتكبير 200x (انظر جدول المواد). الأنسجة التي تظهر اللون البني هي ردود فعل إيجابية. احسب معدل التعبير الإيجابي كنسبة المساحة الملطخة إلى المساحة الإجمالية لمجال الرؤية. إجراء التحليل الكمي باستخدام برنامج Image J.

7. كشف اللطخة الغربية

ملاحظة: تم تضمين عازلة التحلل ومثبط الإنزيم البروتيني في مجموعة قياس بروتين BCA (انظر جدول المواد).

  1. تزن 0.1 جم من عينات عضلة القلب الطازجة من الخطوة 3.5 وتخلط مع 1 مل من محلول التحلل و 10 ميكرولتر من مثبط الإنزيم البروتيني ، متبوعا بالطحن في حاوية طحن زجاجية والطرد المركزي عند 10,304 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  2. اجمع المادة الطافية وقم بإجراء قياس كمية البروتين باستخدام طريقة BCA وفقا لتعليمات الشركةالمصنعة 8. اغلي المادة الطافية على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  3. افصل البروتينات ذات الأوزان الجزيئية المختلفة باستخدام هلام فصل بنسبة 10٪ عن طريق تحميل عينة 10 ميكرولتر للرحلان الكهربائي للبروتين عند 80/120 فولت.
  4. انقل البروتينات الموجودة على الجل إلى غشاء PVDF9. بعد ذلك ، قم بسد الغشاء بمسحوق الحليب الخالي من الدسم بنسبة 5٪ لمدة ساعة واحدة واحتضانه طوال الليل عند 4 درجات مئوية باستخدام الأجسام المضادة الأولية Myh9 و SLC7A11 و SLC3A2 و β-tubulin عند تخفيف 1: 1000 (انظر جدول المواد).
  5. بعد الغسيل باستخدام PBS 3x لمدة 5 دقائق لكل منهما ، احتضان الغشاء بجسم مضاد ثانوي (1: 5000 ؛ انظر جدول المواد) في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين ، متبوعا بالغسيل باستخدام PBS 3x لمدة 5 دقائق لكل منهما قبل التصور باستخدام أداة تصور البروتين (انظر جدول المواد).
  6. احسب نسبة التدرج الرمادي للنطاقات إلى β-tubulin باستخدام برنامج Image J8،9.

8. التحليل الإحصائي

  1. التعبير عن البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري. تحليل البيانات باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه متبوعا باختبار لاحق للفرق الأقل دلالة. إجراء التحليل الإحصائي باستخدام أداة التحليل الإحصائي التجاري (انظر جدول المواد) واعتبر p < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

فحص DRGs في MIRI
تضمنت مجموعة البيانات GSE214122 من Gene Expression Omnibus ثلاث بيانات عينات زائفة وثلاث عينات MIRI. باستخدام حزمة DESeq2 في R ، تم تحديد 1233 جينا معبر عنه تفاضليا (DEGs) بين عينات MIRI والزائفة. استنادا إلى |log2FC|>2 و FDR<0.05 ، تم اختيار 417 جينا مختلفا بشكل كبير باستخدام حزمة خريطة التصويرية الخاصة ب R (الشكل 1 أ). بعد ذلك ، تم تقديم 15 جينا متقاطعا بين 1233 DEGs و 106 DRGs في الشكل 1 ب. تم شرح DRGs ال 15 المعبر ع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يرتبط داء ثاني كبريتيدس ارتباطا وثيقا بالهيكل الخلوي للأكتين ، وهو هيكل خلوي مهم ضروري للحفاظ على شكل الخلية وقابليتها للحياة. يتكون الهيكل الخلوي من خيوط الأكتين ، ويضفي الشكل الخلوي العام للخلوية. يعمل F-actin كعلامة للهيكل الخلوي الخلوي ، وفي ظل ظروف تجويع الجلوكوز ، تزداد روابط ثاني كبريتيد بشكل كبير ، مما يؤدي إلى تقليل تنظيم F-actin. تؤثر هذه الظاهرة في المقام الأول على العمليات والمسارات المتعلقة بالهيكل الخلوي للأكتين والتصاق الخلية10،

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا البحث من قبل مكتب مقاطعة قويتشو للعلوم والتكنولوجيا (Qiankehe [2022] -583) وإدارة مقاطعة قويتشو للطب الصيني التقليدي (QZYY-2016-019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
75٪ كحولهونان Tongruijian Pharmaceutical Co. Ltd. ، Hunan ، الصين85026
6-0 خياطة نايلونشنغهاي بودونغ Jinhuan Medical Supplies Co. Ltd. ، شنغهاي ، الصينCS002
BCA مجموعة قياس البروتينBeyotime Biotechnology ، شنغهاي ، الصينP0011
ألبومين مصلالثور Beyotime Biotechnology ، شنغهاي ، الصينST2254
الطرد المركزيهونان كايدا العلمية للأدوات المحدودة ، هونان ، الصينKH19A
DAB الفجل الحار بيروكسيداز مجموعة تطوير لونBeyotime Biotechnology ، شنغهاي ، الصينP0203
حل تلطيخ DAPIBeyotime Biotechnology ، شنغهاي ، الصينC1006
حزمة DESeq2الإصدار 4.1
ماكينة حلاقة كهربائيةKelmerpp235376
عازلة حجب البيروكسيديز الذاتية المحسنةBeyotime Biotechnology ، شنغهاي ، الصينP0100B   ؛
ورق الترشيحنانجينغ Keruicai Equipment Co.، Ltd.، نانجينغ ، الصين1.00049E + 11
مجهر مضاننيكونECLIPSE Ci
GEO قاعدة بياناتhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
طاحونةزجاجية Shanghai Leigu Instrument Co. Ltd. ، شنغهاي ، الصينB-013002
GraphPad PrismGraphPad برنامجV8.0
طقم تلطيخ الهيماتوكسيلين والأيوزينBeyotime Biotechnology ، شنغهاي ، الصينC0105M
برنامج Image Jالمعاهد الوطنية للصحة ، بيثيسدا ، الولايات المتحدة الأمريكيةv1.8.0
حل محسن لاسترجاع مستضد السترات (50X)Beyotime Biotechnology ، شنغهاي ، الصينP0083
IodophorFolca ، شنتشن ، الصين1.00077E + 11
مجهر بصرينيكونECLIPSE Ci
محلول عازل للفوسفاتBeyotime Biotechnology ، شنغهاي ، الصينC0221A
الأجسام المضادة الأولية ضد GLUT1Proteintech Group، Inc ، ووهان ، الصين21829-1-AP
الأجسام المضادة الأولية ضد MYH9Proteintech Group، Inc ، ووهان ، الصين11128-1-AP
الأجسام المضادة الأولية ضد SLC3A2Wuhan Lingsi Biotechnology Co.، Ltd. ، ووهان ، الصينLJS-D-7468
الأجسام المضادة الأولية ضد SLC7A11Proteintech Group، Inc ، ووهان ، الصين26864-1-AP
أداة تصور البروتينThermo Fisher Scientific Inc.iBright CL750
Rat BoardZhengzhou Haopai Biotechnology Co. Ltd. ، Zhengzhou ، الصينJPB-E
ScalpelShanghai Lianhui Medical Supplies Co.، Ltd. ، شنغهاي ، الصين1.00471E + 13
الجسم المضاد الثانويWuhan Boster Biological Technology، Ltd. ، ووهان ، الصينBA1054
STRING قاعدة بياناتhttps://cn.string-db.org/ 12.0
Triton X-100Beyotime Biotechnology ، شنغهاي ، الصينST1722
TUNEL طقم الكشف عن موت الخلايا المبرمجProteintech Group، Inc. ، ووهان ، الصينPF00009
الإصدار

المراجع

  1. Lu, Z., et al. Tripartite motif 38 attenuates cardiac fibrosis after myocardial infarction by suppressing TAK1 activation via TAB2/3 degradation. iScience. 25 (8), 104780(2022).
  2. Tu, Q., et al. EGCG decreases myocardial infarction in both I/R and MIRI rats through reducing intracellular Ca2+ and increasing TnT levels in cardiomyocytes. Adv Clin Exp Med. 30 (6), 607-616 (2021).
  3. Li, Q., et al. Histone deacetylase HDAC4 participates in the pathological process of myocardial ischemia-reperfusion injury via MEKK1/JNK pathway by binding to miR-206. Cell Death Dis. 7 (1), 240(2021).
  4. Liu, X., et al. Actin cytoskeleton vulnerability to disulfide stress mediates disulfidptosis. Nat Cell Biol. 25 (3), 404-414 (2023).
  5. Yang, L., et al. Analysis of risk genes associated with disulfidptosis-related myocardial ischemia-reperfusion injury. J Chongqing Med Univ. 49 (4), 401-408 (2024).
  6. Xiao, G., et al. CXCR1 and its downstream NF-κB inflammation signaling pathway as a key target of Guanxinning injection for myocardial ischemia/reperfusion injury. Front Immunol. 13, 1007341(2022).
  7. Zhu, E. Y., et al. Screening of immune-related secretory proteins linking chronic kidney disease with calcific aortic valve disease based on comprehensive bioinformatics analysis and machine learning. J Transl Med. 21, 359(2023).
  8. Shi, D. C., et al. Potential of Dendrobium officinale oligosaccharides to alleviate chronic colitis by modulating inflammation and gut microbiota. FoodMedHomo. 2, 9420077(2025).
  9. Ning, E. J., et al. Artemisia argyi polysaccharide alleviates intestinal inflammation and intestinal flora dysbiosis in lipopolysaccharide-treated mice. FoodMedHomo. 1 (1), 9420008(2024).
  10. Zhou, H., Wang, J., Zhu, P., Hu, S., Ren, J. Ripk3 regulates cardiac microvascular reperfusion injury: The role of IP3R-dependent calcium overload, XO-mediated oxidative stress and F-action/filopodia based cellular migration. Cell Signal. 45, 12-22 (2018).
  11. Antonipillai, J., Rigby, S., Bassler, N., Peter, K., Bernard, O. Pharmacological inhibition of LIM kinase pathway impairs platelets functionality and facilitates thrombolysis. Exp Cell Res. 382 (2), 111458(2019).
  12. Kaumeyer, B. A., et al. GLUT1 immunohistochemistry is a highly sensitive and relatively specific marker for erythroid lineage in benign and malignant hematopoietic tissues. Am J Clin Pathol. 158 (2), 228-234 (2022).
  13. Patching, S. G. Glucose transporters at the blood-brain barrier: Function, regulation and gateways for drug delivery. Mol Neurobiol. 54 (2), 1046-1077 (2017).
  14. Zhou, H., et al. 3-iodothyronamine inhibits apoptosis induced by myocardial ischemia reperfusion via the Akt/FoxO1 signaling pathway. Ann Trans Med. 10 (4), 168(2022).
  15. Pecci, A., et al. MYH9: Structure, functions and role of non-muscle myosin IIA in human disease. Gene. 664, 152-167 (2018).
  16. Girolami, A., et al. Occurrence of thrombosis in congenital thrombocytopenic disorders: A critical annotation of the literature. Blood Coagulat Fibrino. 24 (1), 18-22 (2013).
  17. Li, P., et al. SLC7A11-associated ferroptosis in acute injury diseases: Mechanisms and strategies. Eur Rev Med Pharmaco Sci. 27 (10), 4386-4398 (2023).
  18. Wu, X., et al. Dihydrotanshinone I preconditions myocardium against ischemic injury via PKM2 glutathionylation sensitive to ROS. Acta Pharma Sinica B. 13 (1), 113-127 (2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة