يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

توليد العضيات المعوية القمية وتقييم معدل التكاثر العضلي باستخدام وضع العلامات على EdU

2.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68039

⸱

مارس 28, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Small Animal Internal Medicine, Department for Small Animals and Horses, University of Veterinary Medicine, 2Cluster of Excellence Physics of Life, TU Dresden, 3Unit for Microbiology, Center for Pathobiology, Department for Biological Sciences and Pathobiology, University of Veterinary Medicine

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نصف بروتوكولا لتوليد عضيات معوية قمية من الثقافات العضوية القياسية المضمنة في المصفوفة. كما يحدد الدمج اللاحق ل EdU في الخلايا التي تتكاثر بنشاط والقياس الكمي شبه التلقائي للخلايا الإيجابية ل EdU.

الملخص

هنا ، نصف توليد الثقافات العائمة للعضيات المعوية القمية من الثقافات العضوية المعوية المضمنة في الهيدروجيل. في الوقت نفسه ، يتم إنشاء الثقافات العضوية القاعدية العائمة للمقارنة المباشرة بين العضيات القمية للخارج والقاعدية. تخضع العضيات القمية والقاعدية لاحقا لنظير الثايميدين 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ، والذي يتم دمجه في الحمض النووي المركب حديثا خلال المرحلة S من انقسام الخلية. يمكن تصور هذا الدمج في الحمض النووي في العضيات السليمة شكليا باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر بالمسح بالليزر. ثم يتم قياس الخلايا المسماة ب Hoechst33342 و EdU بطريقة شبه تلقائية باستخدام برنامج تحليل الصور. يسمح حساب النسبة المئوية للخلايا الإيجابية ل EdU من إجمالي عدد الخلايا بتحليل تكاثر الخلايا في العضيات ثلاثية الأبعاد (3D). على الرغم من استخدامه هنا لتحليل التكاثر في العضيات المعوية ، إلا أن البروتوكول قابل للتطبيق على تحليل البقع الخاصة بالنواة من أنواع مختلفة في العضيات الأخرى أو مزارع الخلايا ثنائية الأبعاد أيضا.

المقدمة

العضيات المعوية هي نماذج ثلاثية الأبعاد في المختبر تلخص ظهارة الأمعاء التي تشتمل على أنواع مختلفة من الخلايا. يمكن إنشاء هذه العضيات بسهولة من الخلايا الجذعية البالغة المعزولة من الخبايا المعوية1. نظرا لأن العضيات أقرب بكثير إلى ظهارة الجسم الحي ، فقد أصبحت ذات أهمية متزايدة في البحوث الطبية الحيوية. لا تستخدم عضيات الأمعاء فقط لتحليل الآليات الفسيولوجية (على سبيل المثال ، إشارات المعويةالمتخصصة 2،3 وتمايز الخلايا4،5) ولكن أيضا للبحث عن الأمراض المعدية6،7. ومع ذلك ، فإن زراعة الخلايا المستقطبة في 3D التي تحيط بالتجويف المركزي يمثل تحديا ، حيث ينتهي الأمر بسطح الخلية القمية بحيث لا يمكن الوصول إليه داخل التجويف العضوي. يمكن أن يكون فحص الاختلافات بين أسطح الخلايا القمية والقاعدية الجانبية مهما في دراسات التمثيل الغذائي ، كما يتضح من الاختلافات في امتصاص الأحماضالدهنية 8 وأبحاث الأمراض المعدية9،10،11،12.

يعد توليد ما يسمى بالعضيات القمية خيارا سهلا للتغلب على هذه المشكلة. عن طريق إزالة المصفوفة خارج الخلية من الثقافات العضوية القياسية (أي العضيات القاعدية المضمنة في المصفوفة) وبذر هذه العضيات في وسط خال من المصفوفة ، يمكن إحداث مفتاح قطبية9.

كما نشرنا سابقا ، فإن معظم العضيات تعكس قطبيتها في غضون 12 ساعة. ومع ذلك ، يستغرق الأمر 48-72 ساعة للحصول على ثقافة تحتوي على أكثر من 90٪ من العضوية القمية. على الرغم من ميزتها المتمثلة في تمكين الوصول إلى سطح الخلية القمية ، إلا أن العضيات القمية تظهر انخفاضا كبيرا في الانتشار بعد انعكاس القطبية بينما تزداد معدلات موت الخلايابمقدار 13. يمكن أن يمثل عامل النشاط التكاثري متغيرا مربكا في التحليلات المختلفة ويجب أن يؤخذ في الاعتبار عند تصميم التجربة.

هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لإنشاء الثقافات العضوية القمية المعوية وعضويات التحكم القاعدية العائمة لتحليلات المصب. علاوة على ذلك ، نصف وضع العلامات باستخدام 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ، المدمج في الحمض النووي المركب حديثا وبالتالي يشير إلى الخلايا المتكاثرة بنشاط. نصف أيضا تحليل الصور شبه التلقائي لمعدل تكاثر العضيات باستخدام برنامج arivis Pro (Zeiss) عن طريق القياس الكمي لخلايا EdU + . تم توضيح مخطط العملية في الشكل 1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم استخدام العضيات المعوية المشتقة من الخلايا الجذعية البالغة من ، والتي تم إنشاؤها وفقا ل Kramer et al. ، 202014 . بناء على إرشادات لجنة الأخلاقيات المؤسسية ، يتم تضمين استخدام مواد الأنسجة التي تم جمعها أثناء الاستئصال العلاجي أو ما بعد الوفاة في "موافقة المالك على العلاج" للجامعة ، والتي تم توقيعها من قبل جميع مالكي المرضى.

1. الثقافة العضوية

  1. استزراع العضيات المعوية المشتقة من الخلايا الجذعية البالغة المضمنة في مصفوفة مستخلص الغشاء القاعدي (BME) المفضلة في ألواح مكونة من 24 بئرا وتقسيمها ميكانيكيا باستخدام ماصات زجاجية كما هو موضح بالتفصيل في Pleguezuelos et al. ، 202015.
    ملاحظة: بالنسبة للبروتوكول الموضح هنا ، تم استخدام Geltrex كBME.
  2. قم بإزالة الوسط المكرر بعناية (الجدول 1) من العضيات المضمنة في BME.
  3. أضف 500 ميكرولتر من 0.05٪ تريبسين-EDTA لكل بئر وافصل جميع قباب المصفوفة عن البئر عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل بشكل متكرر. انقل العضيات إلى أنبوب سعة 15 مل وأعد تعليقها جيدا لفصل مصفوفة الهيدروجيل تماما.
  4. احتضان العضيات بنسبة 0.05٪ تريبسين-EDTA عند 37 درجة مئوية في حمام مائي حتى يتم تفكك جميع العضيات إلى خلايا مفردة أو مجموعات صغيرة من الخلايا.
  5. تمييع معلق التربسين / الخلية بالوسط القاعدي (الجدول 1). استخدم ما لا يقل عن ضعف الوسط القاعدي من التربسين.
  6. خلايا الطرد المركزي عند 8 درجات مئوية عند 420 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المواد الطافية.
  7. خلايا البذور المضمنة في BME في العديد من الآبار التي تم استخدامها في التربسين في الخطوة 1.3. وتزويدهم بوسط مكرر (الجدول 1).
  8. احتضان الخلايا لمدة 3 أيام في حاضنة زراعة الخلايا والمضي قدما في الخطوة 2.1.

2. تحريض انعكاس القطبية ووضع العلامات على EdU

  1. قم بإزالة الوسيط بعناية من العضيات المضمنة في BME.
  2. أضف 500 ميكرولتر من محلول الحصاد العضوي إلى كل بئر وافصل جميع قباب المصفوفة عن البئر عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل بشكل متكرر. انقل العضيات إلى أنبوب سعة 15 مل وأعد تعليقها جيدا لفصل مصفوفة الهيدروجيل تماما.
  3. احتضان الأنبوب سعة 15 مل على الجليد لمدة 1.5 ساعة. رج الأنبوب جيدا كل 10 دقائق لمنع تكتل العضيات وضمان تفكك متساو لمكونات الهيدروجيل المتبقية.
  4. أثناء الحضانة ، قم بتغطية لوح 96 بئرا بمحلول مضاد للالتصاق. لكل بئر من صفيحة 24 بئرا مدرجة في الخطوة 1.3 ، قم بتغطية 8 آبار من صفيحة 96 بئرا. احتضان لمدة 1 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة (RT).
  5. أضف ما لا يقل عن ضعف كمية PBS التي تم استخدامها في محلول الحصاد العضوي إلى أنبوب 15 مل وجهاز الطرد المركزي عند 8 درجات مئوية عند 150 × جم لمدة 5 دقائق.
  6. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق العضيات في 1 مل من PBS.
  7. انقل 500 ميكرولتر من التعليق العضوي / PBS في أنبوب منفصل سعة 15 مل وقم بالطرد المركزي كلا الأنبوبين مرة أخرى عند 8 درجات مئوية عند 150 × جم لمدة 5 دقائق.
  8. قم بإزالة جميع المحلول المضاد للالتصاق من اللوحة المكونة من 96 بئرا.
  9. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المواد الطاففية بعد الطرد المركزي.
  10. استخدم أحد الأنابيب لتوليد العضيات القاعدية العائمة (BO) والأنبوب الآخر للعضيات القمية (AO).
  11. بالنسبة للعضيات BO ، أضف 100 ميكرولتر من الوسط المكرر الذي يحتوي على 7.5٪ BME لكل بئر من اللوحة المكونة من 96 بئرا إلى أنبوب واحد. تخلط جيدا وتفريق العضيات بالتساوي عبر العدد المطلوب من الآبار في الصفيحة المطلية مسبقا 96 بئرا.
  12. بالنسبة للعضيات AO ، أضف 100 ميكرولتر من الوسط المكرر العادي (دون إضافة أي BME) لكل بئر من اللوحة المكونة من 96 بئرا إلى الأنبوب الآخر. تخلط جيدا وتفريق العضيات بالتساوي عبر العدد المطلوب من الآبار في الصفيحة المطلية مسبقا 96 بئرا.
  13. احتضان العضيات عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 3 أيام.
    ملاحظة: ستبدأ الاختلافات المورفولوجية في الظهور بعد اليوم الأول. ومع ذلك ، تظهر النتائج المنشورة سابقا أن الغالبية العظمى من العضيات تستغرق حوالي 3 أيام لتقديم قطبية قمية13.
  14. في نقاط زمنية محددة ، على سبيل المثال ، 24 ساعة / 48 ساعة / 72 ساعة بعد تحريض انعكاس القطبية ، أضف 50 ميكرولتر من 3 ميكرومتر EdU مخفف في وسط مكرر إلى جميع آبار العضيات المراد تصنيفها ، لتلقي تركيز نهائي قدره 1 ميكرومتر EdU في كل بئر.
  15. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 1.5 ساعة.
  16. اجمع العضيات التي تحمل علامة EdU باستخدام أطراف واسعة التجويف وانقلها إلى أنبوب سعة 15 مل.
  17. أضف كمية متساوية من 4٪ PFA إلى كل أنبوب (عضيات BO و AO ؛ التركيز النهائي ل PFA = 2٪) واخلطها بعناية.
  18. احتضن في RT لمدة 15 دقيقة.
  19. أضف ما لا يقل عن ضعف كمية PBS حيث يوجد حجم في أنبوب 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 8 درجات مئوية عند 80 × جم لمدة 5 دقائق.
  20. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق العضيات في 1 مل من PBS.
  21. جهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 8 درجات مئوية عند 80 × جم لمدة 5 دقائق.
  22. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق العضيات في 1 مل من PBS ، وانقلها إلى أنبوب سعة 1.5 مل. قم بتخزين العضيات في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى إجراء تفاعل تلطيخ EdU (انظر القسم 3).
  23. كرر الخطوات 2.14-2.22 لكل نقطة زمنية ليتم تحليلها.

3. انقر فوق تفاعل تلطيخ EdU وتلوين Hoechst 33342

  1. الطرد المركزي للعضيات الثابتة (من الخطوة 2.22.) في أنبوب 1.5 مل عند 4 درجات مئوية عند 50 × جم لمدة 5 دقائق.
  2. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق العضيات في 1 مل من ألبومين مصل الأبقار 3٪ (BSA) المخفف في PBS باستخدام أطراف التجويف العريض.
  3. كرر الخطوات 3.1. و 3.2 (خطوات الغسيل).
  4. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق العضيات في 1 مل من 0.5٪ Triton X-100 المخفف في PBS.
  5. احتضن في RT لمدة 20 دقيقة.
  6. عضيات الطرد المركزي عند RT عند 50 × جم لمدة 5 دقائق.
  7. في أنبوب جديد ، قم بإعداد 1x Buffer Addition عن طريق خلط 45 ميكرولتر من H2O مع 5 ميكرولتر من 10x Buffer Additive.
  8. في أنبوب آخر ، قم بإعداد كوكتيل التفاعل عن طريق خلط المكونات التالية: 385.8 ميكرولتر من H2O ، 43 ميكرولتر من 10x Reaction Buffer ، 20 ميكرولتر من CuSO4،1.2 ميكرولتر من Alexa Fluor 647 azide ، و 50 ميكرولتر o 1x Buffer Additive (من الخطوة 3.7.).
    ملاحظة: هذا المزيج كاف لخمسة تفاعلات ويمكن توسيع نطاقه لأعلى ولأسفل وفقا للعدد المطلوب من تفاعلات التلوين.
  9. كرر الخطوات 3.1. و 3.2. مرتين (خطوات الغسيل).
  10. قم بإزالة المادة الطافية وأضف 100 ميكرولتر من كوكتيل التفاعل (الخطوة 3.8.) في كل أنبوب به عضويات.
  11. احتضن في RT لمدة 30 دقيقة في الظلام.
  12. كرر الخطوات 3.1. و 3.2 (خطوات الغسيل).
  13. عضويات الطرد المركزي عند 50 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
  14. أعد تعليق العضيات في 1 مل من 10 ميكروغرام / مل Hoechst33342 المخفف في PBS.
  15. احتضن في RT لمدة 45 دقيقة في الظلام.
  16. كرر الخطوات 3.1. و 3.2 (خطوات الغسيل).
  17. عضيات الطرد المركزي عند 50 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  18. عضيات البذور في مصفوفة BME المختارة في شريحة متوافقة مع الفحص المجهري متحد البؤر (على سبيل المثال ، μ-Slide 18 جيدا)
  19. صورة العضيات تحت المجهر متحد البؤر.

4. تحليل الصور شبه التلقائي

ملاحظة: في هذا التحليل ، تم استخدام الإصدار 4.2.2 من arivis Pro (برنامج تحليل الصور).

  1. قم باستيراد صور المجهر متحد البؤر إلى برنامج تحليل الصور وحدد مجلدا سيتم حفظ ملف التحليل فيه. استخدم الخيار الصور كنقاط زمنية لاستيراد صور متعددة (نسخ الصور ، ونقاط زمنية مختلفة ، ومعالجات مختلفة ، وما إلى ذلك). سيتم بعد ذلك التعامل مع كل صورة كنقطة زمنية واحدة ، مما يتيح سهولة التبديل بين الصور الفردية.
  2. افتح لوحة التحليل واستورد مسار التحليل المتوفر كملف تكميلي 1 (arivis_EdU_pipeline).
  3. استخدم أداة Place New Objects وSphere مع العلامة Organoid لتطويق جميع العضويات المنفصلة جيدا بسهولة.
  4. قم بالتبديل إلى الصورة التالية ، أي النقطة الزمنية التالية ، وتابع وضع علامة على العضيات لجميع الصور.
  5. بالنسبة للعضيات القريبة جدا من بعضها البعض وبالتالي لا يمكن فصلها باستخدام وضع Sphere ، افتح قائمة الكائنات وقم بتنشيط العلامة Organoid.
  6. استمر في استخدام أداة رسم الكائنات في وضع المضلع لتمييز المخططات العضوية يدويا.
    ملاحظة: في قائمة الكائنات، يتم الآن تمييز جميع العضويات وتعيينها إلى نقطة زمنية محددة. تتوافق هذه النقطة الزمنية مع ترتيب الصور المستوردة في الخطوة 4.1. يمكن الآن إعادة تسمية هذه النقاط الزمنية لمطابقة اسم الصورة الأصلي إذا كنت تفضل ذلك.
  7. في قائمة الكائنات، ضع علامة على كل الكائنات (=العضيات) وانقر بزر الماوس الأيمن، ثم انقر على إزالة العلامات لإزالة العلامة يدوية من جميع الكائنات.
  8. قم بإلغاء تنشيط علامة Organoid في قائمة الكائنات وقم بتمييز جميع المناطق داخل الكائنات المحددة مسبقا والتي يجب استبعادها من التحليل باستخدام أداة رسم الكائنات في وضع المضلع . قد تشمل هذه المناطق خلايا ميتة داخل التجويف العضوي أو المناطق الضبابية ، مما قد يؤدي إلى انحراف التحليل.
  9. عند فتح قائمة الكائنات، تأكد من إدراج جميع المواد العضوية بعلامة Organoid وأن جميع المناطق التي يجب استبعادها تحتوي على العلامة Manual.
  10. ابدأ مسار التحليل بالنقر فوق السهم الموجود في اللوحة العلوية اليمنى.
    ملاحظة: يقوم البرنامج الآن بتقسيم جميع النوى في قنوات Hoechst33342 و EdU. يأخذ خط أنابيب التحليل هذا في الاعتبار فقط نوى Hoechst33342+ و EdU + المجزأة التي يزيد حجمها عن 15 ميكرومترمربع (أي المساحة الموجودة في جزء النواة) لضمان استبعاد النوى الصغيرة ، التي تنشأ على الأرجح من الخلايا الميتة ، من التحليل.
  11. ابحث عن نتائج التحليل في قائمة الكائنات بالنقر فوق علامة أعمدة المعالم .
  12. قم بالتبديل إلى طريقة عرض التفاصيل الرئيسية وحدد علامة Organoids في اللوحة العلوية والميزة النقطة الزمنية الأولى.
  13. في اللوحة السفلية، حدد الميزات المراد عرضها لكل مادة عضوية. استخدم منطقة الإسقاط (x / y / z) (voxel) ، ومتوسط الكثافة # 1 (قناة EdU) ، وشدة SD # 1.
  14. تصدير النتائج (تقرير التفاصيل الرئيسية) باستخدام وظيفة Excel Export .
  15. احفظ ملف التحليل وأغلق البرنامج.

5. تحديد معدلات الانتشار العضوي

  1. افتح ملف تقرير التفاصيل الرئيسية الذي تم تصديره في الخطوة 4.14.
  2. هناك علامة تبويب واحدة منفصلة لكل صورة تم تحليلها. احسب مجموع المساحة / فوكسل للنوى وصمة عار EdU لكل صورة. بعد ذلك ، انسخ جميع البيانات الناتجة في علامة تبويب جماعية جديدة وقم بتجميع جميع البيانات التي تشير إلى نفس النقطة الزمنية.
  3. بعد ذلك ، احسب المساحة الإجمالية لنوى الخلية (أي مجموع منطقة Hoechst33342+ ومنطقة EdU + ) لكل صورة.
  4. بعد ذلك ، قسم المساحة الإجمالية على نفسها (= 100٪) ومتوسط مساحة EdU + على المساحة الإجمالية (= النسبة المئوية ل EdU + DNA).
  5. ارسم النسبة المئوية للحمض النووي التكاثري للعضيات BO و AO على المحور y والنقاط الزمنية المختلفة على المحور x.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يجب أن تكون العضيات المزروعة لمدة 3 أيام بعد التربسين بين 50-250 ميكرومتر ، كما هو موضح في الشكل 2أ. قد لا تعكس العضيات الأكبر بكثير من ذلك قطبيتها بكفاءة. قد تبدأ العضيات الأكبر حجما أيضا في التبرعم ، وقد لاحظنا أن هذه العضيات يمكن أن تواجه مشاكل في انعكاس القطبية الفعال أيضا. تقدم العضيات القاعدية والقمية اختلافات مورفولوجية واضحة بالفعل في تصوير المجال الساطع. بينما تحتفظ العضيات القاعدية بالتجويف الكبير (الشكل 2ب) بع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يصف هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية إحداث انعكاس القطبية في المزارع العضوية المعوية القياسية المشتقة من الخلايا الجذعية البالغة. تخدم العضيات القمية الغرض من الوصول إلى سطح الخلية القمية ، والتي عادة ما تكون موجهة نحو التجويف العضوي. يمكن أن تكون القدرة على فحص السطح القمي ذات أهمية كبيرة لتطبيقات معينة لأن هذا هو جزء غشاء الخلية الذي يتعرض لجميع محتويات الجهاز الهضمي في ظل الظروف الفسيولوجية في الجسم الحي. الطرق الأخرى لتحدي السطح القمي على وجه التحديد هي الحقنا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم هذا البحث باستخدام موارد مرفق VetImaging الأساسي (VetCore ، Vetmeduni ، النمسا). نود أن نشكر أورسولا ريشارت على دعمها في تحليل الصور شبه الكمي. حصلت GC على زمالة DOC (رقم المنحة 26349) من الأكاديمية النمساوية للعلوم (ÖAW) في قسم الطب الباطني للحيوانات الصغيرة في Vetmeduni.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
24 لوحة بئرBiologix07-6024
[Leu15] -Gastrin I human, ≥ 95٪ (HPLC)سيجما ألدريتشG-9145
µ ؛ -Slide 18 بئر زجاج قاعibidi81817
100X مكمل البنسلين الستربتومايسين لوسائطجيبكو / ثيرمو15140122
A 83-01   ؛توكريس بيوساینس2939/10 
محلول الشطف المضاد للالتصاقStemCell Technologies7010
arivis Pro  Zeissالإصدار 4.2.2
B27 ملحق مصل خال (50X) ، سائلجيبكو / ثيرمو17504044
بيسبنزيميد H 33342 (Hoechst 33342)Abcamab145597
مصل الأبقار الألبومينسيجما-ألدريتشA7906-100G
Click-iT EdU مجموعة تكاثر الخلايا للتصوير ، أليكسا فلور 647 صبغةثيرمو ساينتيفيةC10340
DMEM-F12جيبكو / ثيرمو11320033
جيلتريكسجيبكو / الملحق A1413202
الجلوتاماكس الحرارية   ؛Gibco / Thermo35050061
HEPES Buffer Solution 1 M ، سائلGibco / Thermo15630056
الإنسان FGF-الأساسيPeproTech100-18B-100 µ ؛ G
الإنسان HGF PeproTech100-39-100 µ ؛ ز  
منتدى إدارة الإنترنت-أنا البشري PeproTech100-11-100 & micro ؛ G
الإنسان NOGGIN (الثدييات) PeproTech120-10C-200 µ ؛ ز  
N-Acetyl-L-cysteine ، تم اختبار زراعة الخلايا ، BioReagent   ؛سيجما ألدريتشA9165-5G   ؛
محلول الحصاد العضويThermoC10340
Triton (TM) X-100 ، للبيولوجيا الجزيئيةSigma-AldrichT8787-250ML
Trypsin-EDTA (0.05٪) ، الفينول الأحمرGibco / Thermo25300054

المراجع

  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
  2. Li, Y., et al. BMP suppresses Wnt signaling via the Bcl11b-regulated NuRD complex to maintain intestinal stem cells. EMBO J. 43 (23), 6032-6051 (2024).
  3. Gaowa, A., Leangpanich, S., Park, E. J., Kawamoto, E., Shimaoka, M. Irisin promotes intestinal epithelial cell proliferation via Wnt/β-catenin and focal adhesion kinase signaling pathways. Sci Rep. 14, 25702(2024).
  4. Basak, O., et al. Induced quiescence of Lgr5+ stem cells in intestinal organoids enables differentiation of hormone-producing enteroendocrine cells. Cell Stem Cell. 20 (2), 177-190 (2017).
  5. Ludikhuize, M. C., et al. Mitochondria define intestinal stem cell differentiation downstream of a FOXO/Notch axis. Cell Metab. 32 (5), 889-900.e7 (2020).
  6. Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science (1979). 353 (6306), 1387-1393 (2016).
  7. Zhou, J., et al. Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2. Nat Med. 26 (7), 1077-1083 (2020).
  8. Joo, S. -S., et al. Porcine intestinal apical-out organoid model for gut function study. Animals. 12 (3), 372(2022).
  9. Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Rep. 26, 2509-2520.e4 (2019).
  10. Sasaki, N., et al. Development of a scalable coculture system for gut anaerobes and human colon epithelium. Gastroenterology. 159 (1), 388-390.e5 (2020).
  11. Mayorgas, A., et al. A novel strategy to study the invasive capability of adherent-invasive escherichia coli by using human primary organoid-derived epithelial monolayers. Front Immunol. 12, 646906(2021).
  12. Csukovich, G., et al. Neutralising effects of different antibodies on clostridioides difficile toxins TcdA and TcdB in a translational approach. Int J Mol Sci. 24 (4), 3867(2023).
  13. Csukovich, G., et al. Polarity reversal of canine intestinal organoids reduces proliferation and increases cell death. Cell Prolif. 57 (2), e13544(2023).
  14. Kramer, N., et al. Generation of differentiating and long-living intestinal organoids reflecting the cellular diversity of canine intestine. Cells. 9 (4), 822(2020).
  15. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Curr Protoc Immunol. 130 (1), e106(2020).
  16. Dutta, D., Heo, I., O'Connor, R. Studying infection in 3D tissue-derived human organoid culture systems by microinjection. J Vis Exp. (151), e59610(2019).
  17. Kumar, A., et al. Decreased SLC26A3 expression and function in intestinal epithelial cells in response to Cryptosporidium parvum infection. Am J Physiol Cell Physiol. 317 (6), C1205-C1212 (2019).
  18. Dutta, D., Clevers, H. Organoid culture systems to study host-pathogen interactions. Curr Opin Immunol. 48, 15-22 (2017).
  19. Csukovich, G., Pratscher, B., Burgener, I. A. The world of organoids: Gastrointestinal disease modelling in the age of 3R and one health with specific relevance to dogs and cats. Animals. 12 (18), 2461(2022).
  20. Han, X., et al. Creating a more perfect union: Modeling intestinal bacteria-epithelial interactions using organoids. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 12 (2), 769-782 (2021).
  21. Li, Y., et al. Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations. J Virol. 94 (21), e01006-e01020 (2020).
  22. Smith, D., et al. The development of ovine gastric and intestinal organoids for studying ruminant host-pathogen interactions. Front Cell Infect Microbiol. 11, 733811(2021).
  23. Nash, T. J., Morris, K. M., Mabbott, N. A., Vervelde, L. Inside-out chicken enteroids with leukocyte component as a model to study host-pathogen interactions. Commun Biol. 4 (1), 377(2021).
  24. Hanson, K. I., Weiss, A. A. Intestinal tissue response to Shiga toxin exposure. mBio. 15 (9), e0123224(2024).
  25. Hovhannisyan, P., et al. Infection of human organoids supports an intestinal niche for Chlamydia trachomatis. PLoS Pathog. 20 (8), e1012144(2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

عضويات ذات طرف قمي خارجيعضويات ذات طرف قاعدي خارجيالمجهر البؤريزراعة العضويات العائمةعكس قطبية الخليةصبغ النوىبرنامج تحليل الصور
توليد العضيات المعوية القمية وتقييم معدل التكاثر العضلي باستخدام وضع العلامات على EdU
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.