يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

خلايا شبيهة بالجزر المشتقة من زرع الخلايا الأقنية في الفئران

465 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68066

⸱

أغسطس 1, 2025

 , 
1Department of Physiology, Ankara Medipol University Faculty of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

تظهر الخلايا الشبيهة بالجزر المشتقة من الخلايا الأقنية إمكانية علاج مرض السكري عن طريق خفض مستويات الجلوكوز في الدم وتعزيز إنتاج الأنسولين في الفئران المصابة بالسكري. ومع ذلك ، لا تزال هناك تحديات في ضمان وظيفة الخلية الكافية والدفاع المناعي والسلامة. ويلزم إجراء مزيد من التحقيقات لتعزيز القدرة العلاجية لهذه المواد.

الملخص

ظهر استخدام الخلايا الشبيهة بالجزر المشتقة من الخلايا الأقنية كنهج محتمل لعلاج مرض السكري من النوع 1. مرضى السكري لديهم تخليق الأنسولين غير كاف في أجسامهم بسبب تدمير المناعة الذاتية لخلايا بيتا البنكرياس المسؤولة عن صنع الأنسولين. في هذا الإطار ، الهدف من زرع الخلايا الجزرية هو إعادة قدرة المرضى على إنتاج الأنسولين. ومع ذلك ، فإن العقبات مثل عدم كفاية اكتساب خلايا الجزر من البنكرياس المتبرع وردود الفعل المناعية تعيق التطبيق الواسع لطريقة العلاج هذه. في ظل ظروف معينة ، تمتلك خلايا الأقنية البنكرياس القدرة على التحول إلى خلايا تنتج الأنسولين. يمكن زراعة هذه الخلايا في بيئة خاضعة للرقابة وتحويلها إلى خلايا شبيهة بالجزر الصغيرة لديها القدرة على إفراز الأنسولين ، مما يجعلها مناسبة للزراعة. توفر هذه الاستراتيجية المبتكرة إمكانية وقف تطور مرض السكري من النوع 1 وتقليل الاعتماد على حقن الأنسولين. في هذه الدراسة ، تم زرع خلايا شبيهة بالجزر المشتقة من الخلايا القنوية في الكبد من خلال الوريد البابي للكبد في الفئران المصابة بالسكري التي يسببها الستربتوتوسين. بعد الزرع ، لاحظنا انخفاضا كبيرا في مستويات الجلوكوز في دم الفئران بدءا من اليوم الخامس ، والذي استمر لمدة 15 يوما. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر اختبار تحمل الجلوكوز داخل الصفاق (IPGTT) أن الفئران المصابة بالسكري التي تتلقى عمليات زرع الخلايا الشبيهة بالجزر أنتجت أنسولين أكثر بكثير من المجموعة الضابطة. تشير هذه النتائج إلى أن الخلايا الشبيهة بالجزر المشتقة من الخلايا الأقنية قد تكون نهجا علاجيا واعدا لمرض السكري. تشمل العقبات الأساسية في هذا المجال من الدراسة تحقيق قدرة وظيفية كافية للخلايا ، وحمايتها من جهاز المناعة ، وضمان سلامتها للتطبيق العلاجي. يمكن أن تؤدي مساعي الدراسات المستقبلية إلى تحقيق رؤى حاسمة لتحسين استخدام هذه الخلايا في البيئات العلاجية ، مع التركيز على تعزيز الفعالية والسلامة.

المقدمة

مرض السكري من النوع 1 هو اضطراب مناعي ذاتي مستمر يتميز بتدمير خلايا بيتا في البنكرياس التي تنتج الأنسولين. تشمل العلاجات الحالية في الغالب العلاج بالأنسولين على المدى الطويل ، والذي ، على الرغم من نجاحه في التحكم في مستويات الجلوكوز في الدم ، إلا أنه لا يوفر علاجا للحالة أو يوقفتقدمها 1. إن الدافع وراء التحقيق في العلاجات البديلة لمرض السكري من النوع 1 هو ضرورة وجود بدائل أكثر فعالية من التركيز الحالي على علاج الأنسولين. وقد كان الدافع وراء البحث الجاري من خلال هذا ، مع التركيز على العلاجات البديلة مثل زرع الخلايا الجزرية ، والتي تسعى إلى إعادة قدرة الجسم المتأصلة على إنتاج الأنسولين. ومع ذلك ، فإن حقيقة أن الخلايا الجزرية المانحة يصعب الحصول عليها وهناك فرصة للرفض المناعي جعلت من الصعب استخدام هذا العلاج على نطاق واسع. نتيجة لذلك ، أصبح المجتمع العلمي مهتما بشكل متزايد بإيجاد مصادر بديلة للخلايا التي تنتج الأنسولين1،2،3.

تسعى هذه الطريقة إلى الاستفادة من إمكانات التجديد لهذه الخلايا لإنشاء إمدادات مستدامة من الخلايا التي تفرز الأنسولين4. أظهرت التحقيقات في المختبر قدرة هذه الخلايا الأقنية على التحول إلى خلايا وظيفية شبيهة ببيتا قادرة على إفراز الأنسولين استجابة لتحفيز الجلوكوز5. يعد هذا الخط من الاستفسار أمرا حيويا بشكل خاص ، مع الأخذ في الاعتبار النتائج غير المواتية المرتبطة بزرع الجزر التقليدية بسبب الاستجابات المناعية المعقدة المعنية. تشير العديد من الدراسات إلى أن الخلايا المشتقة من الأقنية لا تتمتع فقط بالقدرة الجوهرية على إنتاج الأنسولين ولكنها قد تظهر أيضا خصائص يمكن أن تعزز تحمل المناعة ، وبالتالي التخفيف من بعض التحديات المرتبطة بتقنيات الزرع التقليدية5،6،7،8. يمكن زراعة هذه الخلايا خارج الجسم ، وتحويلها إلى خلايا تشبه الجزر الصغيرة التي يمكن أن تطلق الأنسولين ، ثم يتم زرعها لاحقا في الأفراد المصابين بداء السكري. أظهرت التحقيقات قبل السريرية ، التي شملت تجارب على الفئران المصابة بالسكري التي يسببها الستربتوتوتوسين ، أن زرع هذه الخلايا يمكن أن يقلل بشكل فعال من مستويات الجلوكوز في الدم ويعزز إفرازالأنسولين 9.

ركز نهجنا على تسريع عملية التمايز وتحسين وظائف الخلايا المنتجة للأنسولين من خلال زيادة وسط زراعة الخلايا القياسي باستخدام الأنسولين - ترانسفيرين - السيلينيوم (ITS) 10،11،12 ، والإيزوكسازول 9 (ISX-9) 13،14 ، و GLP-115. يقال إن هذه العوامل ضرورية في تسهيل تمايز البنكرياس وتعزيز إفراز الأنسولين. يهدف تكامل هذه المكونات إلى تحقيق خلايا وظيفية شبيهة بالجزر بشكل أكثر كفاءة ، مما يضمن قدرتها على إنتاج وإطلاق الأنسولين استجابة لتحفيز الجلوكوز9،10،11،12،13،14.

في زراعة الجزر ، يشكل الرفض المناعي عقبة كبيرة أمام تحقيق نتائج ناجحة. الجزر المزروعة الخيفية معرضة للهجوم المناعي ، وتتطلب علاجات مثبطة للمناعة لتجنب الرفض16،17. تمثل مشاركة خلايا الأقنية البنكرياس في الرفض المناعي أثناء زرع الجزر مجالا متطورا للدراسة. يعتقد أن الخلايا الأقنية قد يكون لها خصائص يمكن أن تقلل من الرفض المناعي ، مما يجعل الجزر المزروعة أكثر عرضة للبقاء على قيد الحياة والعمل بشكل صحيح. أظهر إليفا وآخرون أن الجزر المزروعة مع الخلايا الأقنية أظهرت انخفاضا في النخر المركزي وموت الخلايا المبرمج ، مما يشير إلى تأثير وقائي ضد الضرر المناعي. يمكن أن يتوسط هذا التأثير بعوامل مثل عامل النمو الشبيه بالأنسولين 2 (IGF-2) الذي تفرزه الخلايا القنوية ، كما لاحظ Marín-Cañas et al. (2019) 18. التأثير الوقائي ضروري ، حيث يشكل الرفض المناعي تحديا كبيرا لنجاح زرع الجزر ، خاصة في مرض السكري من النوع 1. ارتبطت الخلايا الأقنية في الطعوم الجزرية بوظيفة الكسب غير المشروع المحسنة والبقاء على قيد الحياة ، ويعزى ذلك على الأرجح إلى قدرتها على إفراز العوامل المناعية التي تخفف من الاستجابة المناعية19.

على الرغم من التطورات الواعدة ، يجب حل بعض العقبات لضمان الفعالية التشغيلية والسلامة لهذه العلاجات القائمة على الخلايا للاستخدام السريري. من الضروري التحقق من أن الخلايا المستحثة تظهر خصائص وظيفية مماثلة لخلايا بيتا الأصلية وإنشاء تقنيات فعالة لحماية هذه الخلايا من اعتداءات الجهاز المناعي لضمان بقائها ووظائفها لفترةطويلة 20،21. مع تقدم هذا المجال البحثي ، ستكون المعرفة الشاملة وحل هذه العقبات ضرورية للاستفادة من وعد الخلايا المنتجة للأنسولين المشتقة من الخلايا الأقنية في علاج مرض السكري من النوع 122،23،24.

تهدف هذه الدراسة إلى تقييم الكفاءة في الجسم الحي للخلايا الشبيهة بالجزر المشتقة من الخلايا الأقنية ، والتي تم تطويرها في ظل الظروف المثلى ، لاستعادة التحكم في نسبة السكر في الدم في نموذج الفئران السكري الناجم عن الستربتوزوتوسين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

التزمت هذه الدراسة بتوصيات ARRIVE ، مما يضمن أن تصميم البحث وتنفيذه والإبلاغ عنه يفي بالمعايير العالية لرعاية والسلامة التجريبية (https://arriveguidelines.org). حصلت جامعة أنقرة ميديبول على موافقة لجنة الأخلاقيات (AMUHADYEK-12- 09.05.2025) وتفويض مؤسسي. تم تنفيذ جميع الطرق وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح المعمول بها. تم سن جميع التدابير لتقليل معاناة وتوظيف الحد الأدنى من اللازمة لتحقيق الأهداف العلمية.

1. إعداد الحلول

  1. محلول الإنزيم: تحضير محلول كولاجيناز يحتوي على 50 مجم من مسحوق كلوستريديوم هيستوليتيكوم كولاجيناز من النوع V. قم بإعداد محلول سعة 50 مل عن طريق الجمع بين الكولاجيناز و HBSS (يحتوي على Ca-Mg) لتحقيق تركيز 1 مجم / مل. استخدم 7 مل من المحلول لكل عينة وضع الباقي في الفريزر عند -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: التركيز الموصى به للكولاجيناز هو 1 مجم / 1 مل. قبل سحبه إلى المحاقن ، يجب خلط الكولاجيناز مع محلول HBSS المعد مسبقا بتركيز 1 مجم / مل.
  2. محلول الغسيل 1: اسحب 62.5 مل من 500 مل من HBSS الخالي من الفينول باللون الأحمر. أضف 50 مل من FBS إلى HBSS المتبقي بعناية فائقة. أضف 5 مل من البنسلين / الستربتومايسين (P / S) ، و 5 مل من L-glutamine (L-Gln) ، و 2.5 مل من 1 M HEPES. ارفع الحجم إلى 500 مل.
    ملاحظة: مع إضافة الفينول الأحمر ، يتكون الحجم النهائي من 88٪ HBSS و 10٪ FBS و 1٪ P / S و 1٪ l-Gln. لمنع الرغوة وضمان الدقة ، قم بدمج مصل الأبقار الجنيني بعناية خطوة بخطوة.
  3. وسط الاستزراع للخلايا ومحلول الغسيل 2: اسحب 62.5 مل من 500 مل من معهد روزويل بارك التذكاري المتوسط (RPMI w / L-Gln). توخي الحذر لمنع FBS من الرغوة أثناء الإضافة التدريجية ل 50 مل إلى RPMI المتبقي. أضف 2.5 مل من 1 M HEPES و 5 مل من P / S و 5 مل من L-Gln. تأكد من أن الحجم الإجمالي 500 مل. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  4. محاليل تدرج الكثافة: تحضير محاليل الكثافة النهائية عن طريق تخفيف محلول الكثافة 1100 مجم / مل بمحلول HBSS للحصول على نطاق كثافة متوسط يتراوح بين 1062-1096 مجم / مل. لضمان الدقة ، تحقق باستخدام مقياس الكثافة من كثافة كل محلول معد. استخدم محلول التركيز 1077 كمرجع. بمجرد الحصول على التركيزات المطلوبة (1062-1096 مجم / مل) ، انقل المحاليل إلى حاويات محكمة الإغلاق وخزنها في مكان مظلم عند 4 درجات مئوية للحفاظ على ثباتها.
  5. تحضير محلول تريبان أزرق بنسبة 0.4٪. يتم تعزيز نمو الخلايا عن طريق المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) ، والذي يحتوي على درجة حموضة 7.4.
  6. وسط نمو زراعة الخلايا: اجمع بين 43.4 مل لكل من معهد روزويل بارك التذكاري المتوسط (RPMI) ووسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM-low glucose). أضف 10٪ مصل ربلة الساق الجنينية (FCS) ، و 1٪ أنسولين - ترانسفيرين - سيلينيوم (ITS) ، و 1٪ L-glutamine (L-Gln) ، و 1٪ بنسلين - ستربتومايسين (P / S) ، و 0.2 مل من 1 M HEPES. اصنع الحجم النهائي إلى 100 مل. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  7. وسط تمايز مزرعة الخلايا: أضف 43.4 مل من RPMI مع 43.4 مل من الجلوكوز المنخفض DMEM. أضف 10٪ FCS ، و 1٪ أنسولين ترانسفيرين - سيلينيوم (ITS) ، و 1٪ L-Gln ، و 1٪ P / S ، و 0.2 مل من 1 M HEPES في الخليط. علاوة على ذلك ، أضف 1 ميكرولتر من إيزوكسازول 9 (ISX-9) المخفف في 4 مل من الإيثانول إلى وسط التمايز. أخيرا ، أضف 24 ميكرولتر من محلول الببتيد 1 الشبيه بالجلوكاجون (GLP-1) بتركيز 50 نانومتر في وسط زراعة الخلية.
    ملاحظة: يتم إضافة ISX-9 و GLP-1 فقط أثناء تغييرات الثقافة. هم مستعدون مسبقا. مطلوب تحضير طازج لأي مادة ثقافية.
  8. محلول ديثيزون (DTZ): قم بإذابة 100 مجم من الديثيزون في 20 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) واخلطه جيدا. أضف 30 مل من HBSS إلى المحلول الناتج وحركه حتى يتم الحصول على خليط متجانس. قم بتصفية المحلول 0.2 أو 0.4 ميكرومتر. أضف 50 مل من HBSS إلى المحلول المصفى. قم بتسمية المحلول بتاريخ التحضير. بمجرد تكسير المواد الصلبة تماما ، قم بتشغيل المحلول من خلال جهاز تصفية 0.4 ميكرومتر. ضع المحلول المصفى في أنابيب سعة 2 مل واستخدمها على الفور بعد إذابتها. احتفظ بالمحلول الذي تم تصنيعه عند -20 درجة مئوية.
  9. محلول كريبس: في وعاء سعة 250 مل ، أضف 1.68 جم من كلوريد الصوديوم (ل 115 مل) ، و 0.50 جم من بيكربونات الصوديوم (ل 24 مل) ، و 0.09 جم من كلوريد البوتاسيوم (لجعلها 5 ملم) ، و 0.05 جم من كلوريد المغنيسيوم (ل 1 ملم) ، و 0.09 جم من كلوريد الكالسيوم (ل 2.5 مل) ، و 0.25 جم من ألبومين مصل الأبقار (بنسبة 0.1٪). أضف 6.25 مل من 1 م HEPES. اضبط مستوى الصوت على 250 مل عن طريق إضافة الماء منزوع الأيونات والتقليب حتى يتجانس كل شيء. اضبط الأس الهيدروجيني على نطاق من 7.3 إلى 7.5 ، باستخدام إما 1 M NaOH أو 1 M HCl. قم بالتصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. قم بتخزين المحاليل في درجة حرارة الغرفة. في حمام مائي عند 37 درجة مئوية ، أضف المحاليل عندما تكون جاهزة للاستخدام.
  10. محلول تركيز عالي الجلوكوز: قم بقياس وإضافة 149.1 مجم من D- (+) - جلوكوز إلى الأنبوب. أضف 50 مل من محلول كريبس إلى الأنبوب واخلطه جيدا عن طريق الرج. قم بالتصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر.
  11. محلول تركيز منخفض الجلوكوز: امزج 1 مل من محلول تركيز الجلوكوز العالي 16.7 ملي مولار مع 9 مل من محلول كريبس.

2. عزل البنكرياس عن الفئران

  1. ابدأ بمجموعة من ثلاثة فئران مختبر Wistar Albino (3 أشهر / ذكر) يتراوح وزنها بين 220 جم و 280 جراما. تخدير باستخدام مزيج من الكيتامين (35-50 مجم / كجم) والزيلازين (5-10 مجم / كغ). تحقق من عمق التخدير من خلال عدم وجود استجابة لسحب الدواسة. ضع مرهما بيطري على العينين لمنعهما من الجفاف.
  2. ابدأ العملية الجراحية بشق بطني خط الوسط 3-4 سم على طول الخط المتوسط بالمقص. (الشكل 1 أ). قم بإجراء معالجة دقيقة للكبد عن طريق ممارسة ضغط بدني لطيف بالأصابع على القفص الصدري لرفع الحجاب الحاجز. قم بإخراج الكبد من الخارج وضعه على شاش معقم لتحقيق الثبات.
  3. قم بإعداد محلول كولاجيناز موحد بجرعة 28 مجم / جم من وزن الجسم واسحب 7 مل (حوالي 7 جم) في المحقنة للفئران التي يتراوح وزنها بين 250 و 300 جم. قم بتعديل حجم المحلول بناء على وزن جسم كل.
  4. شق قناة البنكرياس. باستخدام مقص الأوعية الدموية الناعم ، اقطع القناة بالقرب من الكبد. استخدم المواضع التشريحية بالنسبة للبنكرياس والأوعية الدموية المحيطة لتحديد القناة. استخدم إشارات الموقع مثل الأوعية الدموية القريبة وميزات الأنسجة لضمان الدقة. قم بعمل قطع واحد مثالي في هذا المكان للانسداد.
    ملاحظة: كان الشق صغيرا جدا بحيث لا يمكن قياسه بدقة - ولكنه واسع بما يكفي للسماح بإدخال القسطرة. يسمح الشق بوضع القسطرة بسلاسة وفعالة، مما يضمن الحد الأدنى من الصدمات للأنسجة المحيطة.
  5. أدخل قسطرة مع intracket مدمج داخل فتحة القناة التي تم إنشاؤها (الشكل 1 ب). عند الموضع الصحيح ، اربط القسطرة باستخدام مشبك جراحي (على سبيل المثال ، ملقط صغير) لتجنب الإزاحة.
  6. قم بإدارة المحلول الأنزيمي الكولاجيناز عن طريق التسريب الخاضع للرقابة من خلال اكتئاب المكبس التدريجي المتعمد.
  7. بعد النفخ ، استخدم أدوات جراحية دقيقة لفصل أنسجة البنكرياس بعناية عن الهياكل المحيطة. قم بإجراء الاستئصال بسرعة وبمناورات دقيقة ولطيفة لتقليل تلف الأنسجة. مباشرة بعد الإزالة ، ضع البنكرياس في أنبوب سعة 50 مل على الجليد لإيقاف أي نشاط إنزيمي.
  8. يجب أن تستغرق العملية برمتها حوالي 60 ثانية لبنكرياسواحد 25. بالإضافة إلى ذلك ، حتى تحتقان كل البنكرياس ، احتفظ بالكولاجيناز والبنكرياس الذي تمت إزالته على الجليد.

figure-protocol-1
الشكل 1: معالجة البنكرياس. (أ) لقط فتحة قناة البنكرياس في الاثني عشر و (ب) ينتج عن تضخم الكولاجيناز من النوع 5 صورة للبنكرياس. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3 عزل الخلايا الأقنية من أنسجة البنكرياس

  1. بعد القلع الجراحي ، احتضان البنكرياس في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة.
  2. أضف 25 مل من محلول الغسيل 1 إلى الأنبوب لتحييد نشاط الكولاجيناز. رج الأنبوب يدويا لتعزيز انهيار أنسجة البنكرياس. قم بتنفيذ جميع الإجراءات اللاحقة تحت حقل معقم مع تدفق رقائقي.
  3. احتفظ بجميع الوسائط على الجليد. عينات أجهزة الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية ، عند 100 × جم لمدة دقيقة واحدة ، واضبط الفرامل على الحد الأقصى للإعداد. تخلص من المادة الطافية. إلى بيليه الخلية ، أضف 25 مل من محلول الغسيل 1 وأعد تعليق الخليط.
  4. قم بإجراء الطرد المركزي مرة أخرى وتخلص من المادة الطافية. إلى الحبيبات ، أضف 25 مل من محلول الغسيل 1 وأعد تعليقه. قم بتصفية أنسجة البنكرياس المعالجة من خلال شبكة فولاذية 425 ميكرومتر للتخلص من أي شظايا بقايا من الأوعية الدموية أو الأنسجة غير المهضومة.
  5. بعد الترشيح ، اجعل الحجم يصل إلى 25 مل بمحلول الغسيل 1. قم بإجراء الطرد المركزي 1x عند 100 × جم لمدة 1 دقيقة عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية.
  6. انقل الحبيبات إلى أنبوب جديد باستخدام ماصة بلاستيكية معقمة بعد إضافة 50 مل من وسط RPMI. الطرد المركزي العينة مرة أخرى عند 100 × جم لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وقم بتخزين الحبيبات لمزيد من التحليل.
    ملاحظة: تم تنفيذ جميع الخطوات المتبقية داخل خزانات التدفق الصفحي في ظل ظروف معقمة مناسبة لتجارب زراعة الخلايا.
  7. أضف 10 مل من محلول الكثافة 1.077 إلى الحبيبات المكتسبة بعد الأخير, متبوعا بتعطيل لطيف وتجانس للحبيبات عن طريق النقر على حافة الأنبوب بإصبع.
    ملاحظة: يبلغ نطاق الكثافة لعزل خلايا الجزر من أنسجة البنكرياس المحيطة حوالي 1.077 ، على عكس كثافة الوسط ، والتي تبلغ حوالي 1.00126. وبالتالي ، استخدمنا حل الكثافة 1.077 لهذا الهدف.
  8. أضف 10 مل من RPM وجهاز الطرد المركزي عند 600 × جم لمدة 12 دقيقة عند 4 درجات مئوية مع إيقاف تشغيل الفرامل. أنشأ هذا الإجراء انقساما قائما على الكثافة داخل الأنابيب ، مما أدى إلى تراكم خلايا الجزر في طبقة أسفل طبقة RPMI مباشرة ، موضوعة مباشرة تحت طبقة RPMI.
  9. إزالة كل من خلايا الجزيرة و RPMI. كان الهدف من هذه الخطوة هو تنقية خلايا الجزر لتعزيز إزالتها من أنسجة البنكرياس ، مما يؤدي إلى عملية عزل خلايا الأقنية النقاء.
  10. قم بإزالة أي أنسجة بنكرياس إضافية في أنبوب جديد سعة 50 مل باستخدام ماصة. أضف 10 مل من محلول كثافة 1.096 إلى حبيبات الأنسجة.
  11. بعد ذلك ، أضف ببطء 10 مل من تدرج محلول الكثافة 1.062 باستخدام حقنة. انتبه للحفاظ على توزيع متجانس للمكونات. قم بعمل تدرج عن طريق تكديس المحاليل بالترتيب من الأكثر كثافة إلى الأقل كثافة.
  12. أضف 10 مل من RPMI في الأعلى. أنابيب الطرد المركزي عند 600 × جم لمدة 12 دقيقة عند 4 درجات مئوية بدون الفرامل. بعد الغزل ، تظهر طبقات مختلفة من الكثافة. توجد الخلايا القنوية في الطبقة الوسطى ، أسفل طبقة RPMI.
  13. قم بإزالة الخلايا القنوية بعناية باستخدام ماصة باستور التي يتم التخلص منها وضعها في أنبوب منفصل سعة 50 مل. أضف 25 مل من محلول الغسيل 2 واخلط التعليق برفق عن طريق النقر على الأنبوب بإصبع.
  14. قم بتدوير الأنبوب عند 100 × جم لمدة 1 دقيقة وتخلص من المادة الطافية. قم بإجراء جولتين أخريين من الطرد المركزي باستخدام الحبيبات. بعد الغسيل الأخير ، أضف 2 مل من محلول الغسيل 2 إلى الحبيبات27.

4. عزل واستزراع الخلايا القنوية

  1. قم بتلقيح الخلايا المحصودة في قارورة T25 وأضف 5 مل من سوائل زراعة الخلايا الدافئة مسبقا. حافظ على الحاضنة عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون2و 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يعد الحفاظ على استقرار درجات الحرارة الفسيولوجية أمرا مهما لعمل زراعة الخلايا ، لذلك تم تسخين جميع المحاليل إلى حوالي 37 درجة مئوية قبل استخدامها.
  2. بعد 24 ساعة ، استنشق الوسط بعناية. شطف الخلايا مرتين بمحلول الغسيل 2. أضف وسط زراعة الخلايا الطازجة وأعد القارورة إلى الحاضنة. تلك الخلايا التي التصقت بسطح القارورة كانت تسمى الخلايا الأقنية.
  3. استبدل وسط النمو كل 3 أيام. إذا تغير لون الوسط بسرعة كبيرة ، فهذا يعني أنه يفقد العناصر الغذائية ويصبح أكثر حمضية ، مما يشير إلى أنه يجب تغيير الوسط بشكل متكرر.
  4. خلايا المرور بمجرد أن تصل الخلايا الموجودة في القوارير إلى 80٪ من التقاء. اغسل ب 1-2 مل من PBS 2x وتخلص من أي وسائط إضافية.
  5. أضف 2 مل من محلول التفكك الأنزيمي (بدون الفينول الأحمر) لبدء عملية الانهيار الأنزيمي وفصل الخلايا عن سطح القارورة.
  6. احتضن لمدة 2-3 دقائق وقم بتقييم انفصال الخلية تحت مجهر 10x. إذا ظلت الخلايا متصلة جزئيا ، فأعد احتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين إضافيتين.
  7. بعد فصل الخلايا تماما عن سطح القارورة ، أوقف هضم الإنزيم عن طريق إضافة حوالي 8 مل من وسط نمو الخلية ، وهو ما يعادل 4 أضعاف حجم محلول التفكك الأنزيمي. اضغط برفق على جدران القارورة.
    ملاحظة: التنصت ، الذي يمكن أن يساعد الخلايا على الانفصال ، يقلل من وقت الحضانة الكلي ويمنع الإنزيمات من إتلاف غشاء الخلية ، مما يضمن حدوث ذلك بعد ملامسة طويلة الأمد لمحلول التفكك الأنزيمي.
  8. بعد إضافة وسائط زراعة الخلايا ، انقل تعليق الخلية إلى أنابيب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي عند 150 × جم لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية مع إعداد تباطؤ خفيف (سرعة 9 فاصل) لحبيبات الخلايا.
  9. تخلص من المادة الطافية. أعد تعليق حبيبات الخلية في محلول غسيل 6-8 مل 2. كرر الطرد المركزي على النحو الوارد أعلاه. تخلص من المادة الطافية. وتكرر هذا الإجراء لضمان القضاء الشامل على محلول التفكك الأنزيمي.
  10. باستخدام سحب العينات اللطيف ، أعد تعليق الحبيبات في وسط زراعة الخلايا الطازجة سعة 5 مل لعمل تعليق خلوي موحد. في هذه المرحلة ، قم بإجراء عد الخلايا.
  11. امزج 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 10 ميكرولتر تريبان بلو وعد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم.
  12. البذور 1 × 106 خلايا لكل قارورة T25 باستخدام المعلق المحسوب.
    ملاحظة: بحلول هذا الوقت ، تم تحديد معظم الخلايا على أنها خلايا قنوية. تم زرع عدد كبير من الخلايا في كل طبق بناء على عدد الخلايا الذي تم إجراؤه. بناء على ما رأيناه في التجارب ، انتشرت الخلايا في قارورتين مختلفتين من T25 بمجرد وصولها إلى أفضل مستوى من التقاء في قارورة واحدة. تم ذلك للحفاظ على كفاءة الانتشار عالية. تمكنا من فصل الخلايا القنوية بنجاح عن أنسجة البنكرياس في الفئران باستخدام هذه الطريقة. بعد فصلها بنجاح ، تم تجهيز الخلايا لمزيد من التجارب وفقا لخطة الدراسة.
  13. استمر في الزراعة حتى المقطع 4. خلايا المرور عند الحاجة للحفاظ على ظروف النمو المثلى.
    ملاحظة: من المقطع 4 فصاعدا ، كان هناك ارتفاع ملحوظ في عدد الخلايا بين الأيام 3 و 9. نظرا لأن الخلايا تميل إلى أن تكون أقل قدرة على الانقسام بعد المزيد من الدورات ، فقد تأكدت هذه الطريقة من وجود خلايا كافية قابلة للحياة. بمجرد أن نمت الخلايا الأقنية بدرجة كافية ، بدأت في التحول إلى خلايا تشبه الجزر. بناء على ما وجدناه ، فإن الخلايا بين المرحلتين 3 و 6 لديها أسرع معدلات الانتشار. يظهر المقطع 4 ارتفاعا ملحوظا بشكل خاص في عدد الخلايا القنوية. ومع ذلك ، بعد المقطع 6 ، كان هناك انخفاض في القدرة على التكاثر. تم تعديل البروتوكول بناء على هذه النتائج للحصول على العدد الصحيح من الخلايا مع الحفاظ على قابليتها للحياة وفائدتها28.

5. تمايز الخلايا الأقنية إلى مجموعات تشبه الجزر

  1. حصاد ممر 4 خلايا قنوية باستخدام إجراء المرور القياسي. اغسل مرتين باستخدام 1-2 مل PBS لإزالة الخلايا المتوسطة المتبقية وغير المتصلة.
  2. أضف 2 مل من محلول التفكك الأنزيمي (بدون الفينول الأحمر) إلى القارورة. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 2-3 دقائق وراقبه تحت مجهر 10x.
  3. إذا ظلت الخلايا متصلة ، احتضنها لمدة دقيقتين أخريين. أوقف التفاعل الأنزيمي عن طريق إضافة 8 مل من وسط نمو الخلايا.
  4. انقل التعليق إلى أنبوب سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 150 × جم لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية ، مع الضبط 9 للتسريع والإبطاء.
  5. تخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات في محلول غسيل 6-8 مل 2. جهاز الطرد المركزي والتخلص من المادة الطافية.
  6. أعد تعليق الحبيبات النهائية في 5 مل وسط طازج. عد الخلايا كما هو موضح سابقا.
  7. البذور 1 × 105 خلايا لكل بئر في طبق من ستة آبار ، مع إضافة 3 مل متوسط لكل بئر. احتضان عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
  8. استبدل الوسيط كل 3 أيام خلال أول 7 أيام. اضبط التردد إذا تغير اللون المتوسط بسرعة.
  9. قم بالتبديل تدريجيا إلى وسط التمايز بعد 7 أيام. استمر في الاستزراع لمدة 15 يوما إجمالا (نمو 7 أيام + تمايز 8 أيام). قم بتغيير الوسط كل يومين أثناء التمايز.
  10. في اليوم 8 ، ابدأ مرحلة التمايز. بعد 4 أيام ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS وأضف 500 ميكرولتر من محلول التفكك الأنزيمي.
  11. احتضن 2-3 دقائق ، وأوقف التفاعل بإضافة 2 مل من وسط النمو. جهاز طرد مركزي عند 150 × جم لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية. أعد تعليق وإعادة زرع 1 × 105 خلايا لكل بئر في أطباق من ستة آبار.
  12. في اليوم الخامس عشر ، قم بإجراء تحليل مجهري كامل لتوصيف وتأكيد تكوين مجاميع خلوية تشبه الجزيرةبوضوح 24.

6. القياس الكمي لتركيز الزنك في الخلايا القنوية المتمايزة بواسطة Dithizone

  1. قم بإذابة محلول DTZ وموازنته من التخزين -20 درجة مئوية. أضف 3-4 قطرات من محلول DTZ إلى كل بئر من الخلايا المتمايزة لمدة 15 يوما. راقب تحت المجهر. تحديد الخلايا المنتجة للأنسولين عن طريق تلطيخ اللونالأحمر 28 (الشكل 2).

figure-protocol-2
الشكل 2: صور مجهرية للخلايا القنوية الشبيهة بالجزر. الصور في (أ) اليوم 11 للثقافة (20x) ، (B) اليوم 13 من الثقافة (20x) ، (C ، D) اليوم 15 من الثقافة (20x). تم تصور الخلايا بعد تلطيخ الديثيزون. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

7. اختبار تحفيز الجلوكوز

  1. بذرة 1 × 104 مجموعات تشبه الجزر لكل بئر في صفيحة 24 بئرا مع 1 مل من وسط التمايز لكل بئر.
  2. في اليوم 15 ، قم بتحفيز الخلايا بالجلوكوز. قم بإزالة الوسط الموجود وأضف 1 مل من محلول الجلوكوز المنخفض (1.67 مل). احتضان 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  3. اجمع الوسط وانقله إلى أنابيب 2 مل. أضف 1 مل من محلول عالي الجلوكوز (16.7 مل). احتضان 1 ساعة. جمع وسيط للتحليل. اجمع وسط زراعة الخلية في كل 1 ساعة فاصلة بين إضافة محاليل الجلوكوز المختلفة.
  4. قم بإجراء الأنسولين ELISA باتباع تعليمات الشركة المصنعة. بمجرد إزالتها من كيس القصدير ، اسمح للصفيحة الدقيقة بالتوازن مع درجة حرارة الغرفة قبل بدء إجراء ELISA.
  5. أضف 10 ميكرولتر من الكاشف إلى العينة والتحكم والآبار القياسية. أضف 75 ميكرولتر من محلول مترافق العمل. قم بتسخين اللوحة واحتضانها لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة مع الرج (700-900 دورة في الدقيقة).
  6. اغسل الآبار 6x مع 350 ميكرولتر من محلول الغسيل. أضف 100 ميكرولتر من ركيزة 3،3 ′ ، 5،5،5،5-Tetramethylbenzidine (TMB) لكل بئر. أغلق الألواح واحتضن لمدة 15 دقيقة في الظلام مع الاهتزاز (700-900 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة.
  7. أضف 100 ميكرولتر من محلول التوقف لكل بئر واخلطه عن طريق تحريك اللوحة برفق لإيقاف العملية. قم بإزالة الفقاعات وقراءة الامتصاص عند 450 نانومتر. قم بالقياس لمدة 30 دقيقة بعد إضافة محلول التوقف27.

8. الجزر وزرع الخلايا الأقنية الشبيهة بالجزر

  1. تخدير الفئران باستخدام الكيتامين (100 مجم / كغ) والزيلازين (10 مجم / كغ). تعقيم ولف موقع الجراحة. قم بعمل شق خط الوسط 2-3 سم.
  2. قم بإزاحة الأمعاء وكشف الوريد البابي باستخدام الضاعات. قم بإجراء بضع الوريد وأدخل قسطرة مملوءة مسبقا بالمحلول الملحي (الشكل 3 أ).
  3. قم بغرس 100-500 ميكرولتر من تعليق الخلية في الوريد البابي. قم بإزالة القسطرة وأغلق بضع الوريد بالخيوط أو المادة اللاصقة. أغلق البطن وراقب الشفاء ، وتوفير التسكين حسب الحاجة (الشكل 3 ب).

figure-protocol-3
الشكل 3: زرع الجزر الصغيرة والخلايا الشبيهة بالجزر. (أ) القسطرة المعقمة في الوريد تستخدم لزرع الجزر الصغيرة والخلايا الشبيهة بالجزر. (ب) زرع الجزر الصغيرة والخلايا الشبيهة بالجزر في حقنة معقمة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

9. الستربتوزوتوسين (STZ) يسبب في الفئران المصابة بالسكري

  1. الفئران السريعة 12 ساعة. يتم تطبيق 45 ملغ/كغ STZ داخل الصفاق، مذاب في مخزن السترات البارد (الرقم الهيدروجيني 4.5).
    ملاحظة: الصيام لمدة 12 ساعة قبل حقن STZ يعزز تعبير GLUT2 ، مما يسهل نقل الجلوكوز في خلايا بيتا البنكرياس. تزيد هذه العملية من امتصاص STZ في الخلايا ، مما يؤدي إلى تلف أكبر لخلايا بيتا. تسهل هذه الآلية تطور ارتفاع السكر في الدم بشكل أكبر وتعزز فعالية نموذج مرض السكري.
  2. تأكيد مرض السكري بعد 48-72 ساعة بعد الحقن مع جلوكوز الدم >250 مجم / ديسيلتر. صنف الفئران التي تصل عادة إلى قيم جلوكوز الدم التي تزيد عن 250 مجم / ديسيلتر على أنها مصابة بالسكري ودمجها في التجربة29.

10. تحضير الجزر الصغيرة والخلايا الشبيهة بالجزر للزرع

  1. حصاد الخلايا بعد المعالجة بمحلول التفكك الأنزيمي لمدة 1 دقيقة. كشط الخلايا التي تلتصق بالسطح. استبدل بوسط جديد واجمع الخلايا.
  2. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. أعد تعليق الحبيبات في 100-150 ميكرولتر من المحلول الملحي. قم بإجراء عد الخلايا واضبط عدد الخلايا على 1000 IEQ أو 800 جزيرة لكل فأر أو 1 × 105 خلايا تشبه الجزيرة لكل فأر.

11. زرع الوريد البابي

  1. تخدير عن طريق الحقن داخل الصفاق للكيتامين (100 مجم / كغ) والزيلازين (10 مجم / كغ).
  2. قم بتعقيم منطقة بطن بمحلول معقم (بيتادين أو 70٪ إيثانول). غلف منطقة الجراحة بسترى معقمة.
  3. قم بعمل شق خط الوسط ، بطول 2-3 سم تقريبا ، للوصول إلى تجويف البطن.
  4. قم بإزاحة الأمعاء للكشف عن الكبد. قم بتأمين الفص الأيسر والأيمن من الكبد باستخدام ضاغطات معقمة. كشف السطح البطني للكبد لتحديد موقع الوريد البابي.
  5. شطف قسطرة البولي إيثيلين مسبقا (PE-10 أو PE-50) بمحلول ملحي واملأها بالكامل. استخدم ملقط جراحي مجهري لتثبيت فرع من الوريد البابي - عادة الفرع الجانبي الأيسر أو الأيمن.
  6. إجراء بضع الوريد البسيط (حوالي 1-2 مم). أدخل القسطرة بعناية في موقع بضع الوريد. لمنع الإزاحة ، استخدم مادة الخياطة أو الملقط لتثبيت القسطرة ، عادة باستخدام خيط خياطة 6-0.
  7. تحقق من تحديد موضع القسطرة بدقة عن طريق إعطاء المحاليل الملحية المعقمة تدريجيا. قامت القسطرة تدريجيا بتسليم خلية الجزيرة المحضرة وتعليق الخلية الشبيهة بالجزيرة في الوريد البابي. الحجم الإجمالي 100-500 ميكرولتر.
  8. عند الانتهاء من التسريب ، قم بإزالة القسطرة واستخدم لاصقا معقما للأنسجة أو خيوطا قابلة للامتصاص لإغلاق موقع بضع الأوردة.
  9. قم بإدارة النزيف. أعد وضع جميع الأنسجة المحيطة بالكبد وخياطة عضلات البطن باستخدام خيط قابل للامتصاص. ثبت الجلد بالخيوط أو المشابك.
  10. أبق تحت المراقبة في بيئة دافئة. توفير مسكنات مناسبة للتحكم في الألم أثناء الخروج من التخدير (على سبيل المثال ، بوبرينورفين 0.1 مجم / كجم). راقب لمدة 48 ساعة. افحص بحثا عن مؤشرات العدوى أو الوذمة في موقع الجراحة أو النزيف30.

12. مراقبة نسبة الجلوكوز في الدم

  1. تقييم مستويات الجلوكوز الأولية في الدم. أمسك الجرذ بعناية واستخدم إبرة وخز لإنشاء قطع صغير عند طرف الذيل. قم بإزالة قطرة الدم الأولية برفق باستخدام قطعة قطن معقمة.
  2. ضع قطرة الدم الثانية على شريط اختبار الجلوكوز وقم بتوثيق مستوى الجلوكوز الأساسي31.

13. اختبار تحمل الجلوكوز داخل الصفاق

ملاحظة: تخضع الفئران لاختبار تحمل الجلوكوز داخل الصفاق (IPGTT) لتقييم كفاءة تصفية الجلوكوز في مجرى الدم. يقدم هذا الاختبار رؤى حول استقلاب الجلوكوز وحساسية الأنسولين وحالات السكري المحتملة. تم إجراء اختبار تحمل الجلوكوز داخل الصفاق في اليوم 15 في اليوم 15 بعد الزرع. الأساس المنطقي الأساسي لتنفيذ مدة صيام محددة قبل IPGTT هو تثبيت مستويات الجلوكوز القاعدية وضمان حالة استقلابية متسقة. تسهل فترة الصيام استنفاد مخازن الجليكوجين في الكبد ، مما يتيح تقييما أكثر موثوقية لاستجابة تحمل الجلوكوز. يقلل الصيام لمدة 6 ساعات من آثار ما بعد الأكل ، بينما قد يكون للصيام طوال الليل (حوالي 12-16 ساعة) آثار واضحة ، مما قد يؤثر على حساسية الأنسولين واستقلاب الجلوكوز.

  1. أخضع الفئران لفترة صيام مدتها 6 ساعات ، مع السماح فقط بالوصول إلى المياه بين عشية وضحاها ، مما يضمن ألا تتجاوز مدة الصيام 12 ساعة. ضمان فترة صيام موحدة لجميع الأشخاص لتقليل التباين في قياسات الجلوكوز.
  2. قبل إعطاء الجلوكوز ، قم بوزن الفئران. لتحضير محلول معقم ، قم بإذابة 20 جم من الجلوكوز في 100 مل من محلول ملحي معقم.
    ملاحظة: الجرعة القياسية هي بشكل عام 2 جم من الجلوكوز / كجم من وزن الجسم (2 جم / كجم). يتم تحديد الحجم الإجمالي المعطى من خلال وزن جسم.
  3. تقييم مستويات الجلوكوز في الدم الأساسية. أمسك الجرذ واستخدم إبرة وخز لعمل شق صغير في طرف الذيل. قم بإزالة قطرة الدم الأولى برفق باستخدام قطعة قطن معقمة.
  4. ضع قطرة الدم الثانية على شريط اختبار الجلوكوز وسجل مستوى الجلوكوز الأساسي.
  5. بناء على وزن جسم الفئران ، قم بإعطاء الكمية المناسبة من محلول الجلوكوز بمعدل 2 جم / كجم.
  6. قبل إعطاء محلول الجلوكوز داخل الصفاق (IP) ، تعامل مع الفئران برفق. حقن الجلوكوز في التجويف البريتوني ، وليس في الأنسجة تحت الجلد أو أي عضو ، وتأكد من إدارته بشكل صحيح.
  7. بعد حقن الجلوكوز ، اجمع عينات الدم على فترات محددة لمراقبة مستويات الجلوكوز. الفترات الزمنية النموذجية هي 15 و 30 و 60 و 90 و 120 دقيقة بعد الحقن.
  8. في كل نقطة ، اجمع الدم عن طريق قطع الوريد الذيلي. قبل كل جمع دم ، تأكد من مسح الذيل بمسحة كحولية.
  9. في كل نقطة زمنية محددة ، قم بقياس مستويات الجلوكوز وقم بتوثيقه باستخدام مقياس الجلوكوز.
  10. أثناء الاختبار ، راقب الفئران بحثا عن أي علامات على الانزعاج أو ردود الفعل السلبية. لتقليل الضغط على بين القياسات ، حافظ على بيئة دافئة وهادئة.
  11. بعد آخر قياس لنسبة الجلوكوز في الدم ، قم بتنظيف جروح الذيل ، وتهدئة29.

14. تحليل الأنسولين من خلال ELISA بعد جمع الدم

ملاحظة: تتمثل الخطوات الواردة في هذا البروتوكول في أخذ الدم من الشريان الأورطي البطني للفئران ثم استخدام طريقة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) لاختبار الأنسولين.

  1. تخدير الجرذ قبل جمع الدم كما هو موضح سابقا. ضع الجرذ المخدر في وضع ضعيف على منصة جراحية معقمة.
  2. حلق منطقة البطن وتطهير المنطقة باستخدام 70٪ من الإيثانول أو محلول اليود لضمان العقم.
  3. قم بعمل شق خط الوسط بمشرط لاختراق طبقات الجلد والعضلات وفضح تجويف البطن.
  4. اسحب الأمعاء للوصول إلى الشريان الأورطي البطني الموجود بجوار العمود الفقري. استخدم حقنة هيبارينية لإدخال الإبرة في الشريان الأورطي البطني بزاوية طفيفة.
  5. اجمع الدم (عادة 1-3 مل ، حسب حجم الفئران) في المحقنة. قم بتطبيق الشفط التدريجي والمتسق لتجنب انهيار الأوعية الدموية أو انحلال الدم.
  6. ضع الدم الذي تم جمعه في أنبوب طرد مركزي واحتفظ به على الجليد.
  7. إذا كان سيقتل رحيما بعد العملية ، فقم بإجراء القتل الرحيم وفقا للإرشادات الأخلاقية المؤسسية.
  8. قم بالطرد المركزي للدم الذي تم جمعه عند 300 × جم لمدة 10-15 دقيقة عند 4 درجات مئوية لضمان فصل البلازما أو المصل. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وخزنها عند -80 درجة مئوية لتحليل الأنسولين اللاحق.
    ملاحظة: من المهم تجنب انحلال الدم أثناء جمع الدم لأن ذلك يمكن أن يؤثر على دقة نتائج ELISA (الشكل 4) 29.

figure-protocol-4
الشكل 4: تم الحصول على عينات دم من وريد ذيل الفئران في أنابيب الدم لتحليل الأنسولين في ختام التجربة في اليوم 15 بعد الزرع. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

15. قياس الأنسولين بواسطة ELISA

  1. قم بإعداد مجموعة الأنسولين ELISA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. اسمح لجميع الكواشف والمعايير والعينات بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة قبل بدء الفحص.
  2. تحديد العدد المطلوب من الآبار على لوحة ELISA للمعايير والضوابط وعينات مصل الفئران.
  3. قم بإعداد عينات مصل الفئران للتحليل عن طريق تخفيفها كما هو موضح في بروتوكول مجموعة ELISA ، على سبيل المثال ، تخفيف 1:10 في PBS.
  4. قم بإعداد معايير الأنسولين عن طريق التخفيف التسلسلي لتوليد منحنى قياسي ، على سبيل المثال ، يتراوح من 0 إلى 10 نانوغرام / مل.
  5. قم بتوزيع المعايير والضوابط وعينات مصل الفئران المخففة (عادة 50-100 ميكرولتر لكل بئر) في الآبار المشار إليها للوحة ELISA. قم بتوزيع محلول الأجسام المضادة للكشف المزود مع المجموعة في كل بئر لضمان التوزيع المتساوي.
  6. احتضان اللوحة للوقت المحدد (عادة 1-2 ساعة) في درجة حرارة الغرفة أو وفقا للتعليمات المقدمة.
  7. بعد الحضانة ، تأكد من غسل الآبار باستخدام مخزن الغسيل المخصص ، وعادة ما يحتوي PBS على 0.05٪ Tween-20 ، لإزالة المواد غير المرتبطة. قم بتنفيذ خطوة الغسيل من 3 إلى 5 مرات وفقا لتعليمات المجموعة ، مع التأكد من إزالة أي سائل متبقي تماما بعد كل غسلة.
  8. ضع محلول الركيزة في كل بئر. سوف تتفاعل الركيزة مع الجسم المضاد المرتبط بالإنزيم ، مما يتسبب في تغيير اللون. ترتبط شدة اللون بكمية الأنسولين الموجودة في العينة. احتضن اللوحة في الظلام للمدة التي تحددها المجموعة ، والتي تتراوح عادة من 15 إلى 30 دقيقة.
  9. أضف محلول التوقف إلى كل بئر لإنهاء التفاعل اللوني. سوف يستقر تغير اللون بعد إضافة محلول التوقف ، والذي عادة ما يكون أصفر.
  10. قم بقياس الكثافة البصرية (OD) على الفور لكل بئر باستخدام قارئ لوحة مضبوطة على 450 نانومتر (أو كما هو محدد في المجموعة).
  11. قم بإنشاء منحنى قياسي عن طريق رسم التركيزات المعروفة لمعايير الأنسولين مقابل قيم الكثافة الضوئية (OD) المقابلة.
  12. احسب تركيز الأنسولين في عينات مصل الفئران باستخدام المنحنى القياسي وقيم OD المقابلة. يجب الإبلاغ عن مستويات الأنسولين في نانوغرام / مل أو الوحدات المناسبةالأخرى 29.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تحليل المجهر الضوئي

خلال فحوصاتاليوم الرابع عشر للخلايا الأقنية ، كشف تحليل المجهر الضوئي أن الخلايا تجمعت وشكلت بنية تشبه الجزيرة. يشير هذا التغيير الهيكلي إلى أنه بعد فترة معينة ، تغير الخلايا الأقنية خصائصها المورفولوجية عن طريق الدخول في ترتيب تنظيمي واكتساب مظهر يشبه الجزيرة. ربما يرجع ميل الخلايا إلى التجمع إلى تأثيرات الاتصال بين الخلايا والبيئة المكروية ، ويوفر اكتشافا مهما قد يلقي الضوء على عمليات الانتقال المحتملة بين الخلايا الجزرية والخلايا القنوية (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

جذبت دراسة القدرة الوظيفية للخلايا الشبيهة بالجزر من مصادر مختلفة اهتماما كبيرا بأبحاث مرض السكري. تظهر الأبحاث الأولية أن هذه الخلايا يمكن أن تطلق الأنسولين عند رفع مستويات الجلوكوز ، مما يشير إلى أنها قد تكون قادرة على تقليد وظائف جزر البنكرياس الطبيعية. استخدم الباحثون تلطيخ ديثيزون للتحقق من التشابه الظاهري للخلايا الشبيهة بالجزر الجزرية مع جزر البنكرياس ، كما يتضح من التلوين الأحمر المميز الموجود في هذهالخلايا 32. أظهر استخدام الفئران المصابة بالسكري كنماذج للزرع أن الخلايا الشبيهة بالجزر يمك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ولم يبلغ المؤلف (المؤلفون) عن أي تضارب محتمل في المصالح.

شكر وتقدير

يود المؤلفون أن يشكروا فريق المختبر على مساهماتهم في الدراسة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.9٪ كلوريد الصوديومسحر فارمالإزالة البنكرياس وزرع الخلايا
10 مل ماصة مصلية معقمةكورنينج4488للعزل
24 لوحة بئركورنينج353047ل GSIS & nbsp ؛
25 مل ماصة مصلية - معقمةCorning4489للعزل
70٪ إيثانول   ؛ISOLAB64-17-5لتطهير الفئران
betadine باتيكونول  1186لتطهير الفئران
Biocholl 1077SigmaL6715-BCلتنقية البنكرياس
Biocoll ، الكثافة 1.10 جم / ملSigmaL6155-BCلتنقية البنكرياس
أجهزة قياس نسبة الجلوكوز في الدم وشرائط اختبار الجلوكوزOn Call Plusلقياس نسبة الجلوكوز في الدم
BSASigmaA9418لتحضير krebs
CaCl2سيجما57647902لتحضير
تكوين قسطرة كريبس: قسطرة البولي إيثيلين (داخل الوريد)  Bicakcilar24G  و 14Gللبنكرياس والكبد   ;
جهاز طردمركزي ThermoST1R Plusللعزل  
الكولاجيناز نوع V ، & 1 وحدات FALGPA / ملغ صلب ،
>125 CDU / mg solid   ؛		سيجماC9263- 1Gلهضم البنكرياس
D- (+) - الجلوكوز  Sigma50-99-7ل GSIS و IPGTT
Dithizone (DTZ)SigmaD5130لتقدير الجزيرة
DMSOSigmaD8779لحل DTZ
Dulbecco ' s النسر المعدل s متوسط (DMEM&[مدش] ؛ انخفاض الجلوكوز) جيبكو11885084لزراعة الخلايا
أنبوب إيبندورفإيسولابلغسل الخلايا
أنبوب الصقر (50 مل)ISOLABLB. IS.078.02.009لعزل
مصل الأبقار الجنينية (FBS)SigmaN4637لعزل البنكرياس وثقافته
إبرة دقيقة ومواد خياطة (مقاس 6-0 أو 7-0)PROLENE Blue 18 " إبرة P-1 | 8697Gلإزالة البنكرياس وزرع الخلايا
الببتيد الشبيه بالجلوكاجون 1 (GLP-1)  علاء الدينrp174144لزراعة الخلايا
محلول الملح المتوازن هانك (HBSS مع Ca-Mg)  الجديHBSS-1Aلتحضير الإنزيم
HBSS لا الكالسيوم ، لا المغنيسيوم ، لا الفينول الأحمرBIOCHROM  ؛ L2015لعزل البنكرياس
HEPESLonzaلزراعة الخلايا
الأنسولين إليساألبكو80-INSRT-E01للأنسولين إليسا
الأنسولين ترانسفيرين السيلينيوم (ITS)GibcoITS -Gلزراعة الخلايا
إيزوكسازول 9 (ISX-9)  علاء الدينI304735-10 مجملزراعة الخلايا
KClSigma329820207لتحضير الكراب
كيتامين هيدروكلوريد 200 مجم / ملNexGenللفئران التخدير
خزانات التدفق الصفحيالعمالة IldamBSC-1100IIA2-Xلفترة العزل والثقافة
لانسيتسAyset28 جملقياس نسبة الجلوكوز
في الدمL-الجلوتامين سيجما59202cلعزل البنكرياس وثقافته
MgCl2< / sub>Sigma329759772لتحضير
قارئ الصفيحة الدقيقةBioTek SynergyH1 Multimode Readerللأنسولين إليزا
شاكر صفيحة دقيقةVWR& nbsp ؛ 444-0270للأنسولين إليزا
المجهر المجهريEMZ-200TR 3.9X لإزالة البنكرياس وزرع الخلايا
مقص الجراحة المجهرية والملقطAesculapلإزالة البنكرياس وزرع الخلايا
إدراج ثقافة الخلايا المعلقة Millicell ، البولي إيثيلين تيريفثاليت 8.0 & micro ؛ m MILLIPOREPIEP30R48 ل GSIS 
كلوريد الصوديومسيجما7647-14-5لتحضير كريبس
NaHCO3Sigma144-55-8لتحضير
ماصة كربس باستور 3 ملBIOSIGMAلعزل
البنسلين / الستربتومايسين   ؛سيجمالعزل البنكرياس وثقافته
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)  BIOCHROM  L1815لمرور الخلايا
ضام (لتثبيت الكبد والأنسجة الضامة)Aesculapلإزالة البنكرياس وزرع الخلايا
معهد روزويل بارك التذكاري المتوسط (RPMI w / L-Gln)الجديRPMI-Aلعزل البنكرياس وثقافته
Dynarexالقطن المعقملإزالة البنكرياس وزرع
الخلاياحقنة معقمة (10 مل)Ayset32MM 22Gلتفاعل Collegenase
ساعة توقيتKenkoKK613Dل IPGTT
Streptozotocin (STZ) Sigma18883-66-4لحدوث الفئران المصابة بالسكري وحدة
تصفية سائق الحقنة (GP-0.22 & micro; م -3 مم)MillexSLGP033RSلتعقيم وسائط زراعة الخلايا
قارورة T25Thermo130189للثقافة
كواشف TrypLE ExpressGibcoلحمام مائي مرور
الخلية   ؛المخاض IldamALB128لتفاعل الكلية
Xylazine 2٪ w / v محلول للحقنRompunلتخدير الفئران
كريبس

المراجع

  1. Nichols, G. A., Kimes, T. M., Harp, J. B., Kou, T. D., Brodovicz, K. G. Glycemic Response and Attainment of A1C Goals Following Newly Initiated Insulin Therapy for Type 2 Diabetes. Diabetes Care. 35 (3), 495-497 (2012).
  2. Shapiro, A. M. J., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. New Engl J Med. 343 (4), 230-238 (2000).
  3. Barton, F. B., et al. Improvement in Outcomes of Clinical Islet Transplantation: 1999-2010. Diabetes Care. 35 (7), 1436-1445 (2012).
  4. Jacobson, A., et al. Biomedical Risk Factors for Decreased Cognitive Functioning in Type 1 Diabetes: An 18-year Follow-Up of the Diabetes Control and Complications Trial (DCCT) Cohort. Diabetologia. 54 (2), 245-255 (2010).
  5. Rovner, A. J., et al. Development and Validation of the Type 1 Diabetes Nutrition Knowledge Survey. Diabetes Care. 35 (8), 1643-1647 (2012).
  6. Knopp, B., Perumareddi, P. An Atypical Presentation of Type 1 Diabetes. Arch Clin Cases. 8 (3), 46-49 (2021).
  7. Low, J. C., et al. Do Obese Children With Diabetic Ketoacidosis Have Type 1 or Type 2 Diabetes. Primary Care Diabetes. 6 (1), 61-65 (2012).
  8. Xu, X., et al. β cells can be generated from endogenous progenitors in injured adult mouse pancreas. Cell. 132 (2), 197-207 (2008).
  9. Dorrell, C., et al. Transcriptomes of the major human pancreatic cell types. Diabetologia. 54 (11), 2832(2011).
  10. Kim, B., et al. Differentiation of human labia minora dermis-derived fibroblasts into insulin-producing cells. Exp Mol Med. 44 (1), 26(2012).
  11. Campbell, S. C., et al. Selenium stimulates pancreatic beta-cell gene expression and enhances islet function. FEBS Lett. 582 (15), 2333-2337 (2008).
  12. Shaer, A., Azarpira, N., Vahdati, A., Karimi, M. H., Shariati, S. Differentiation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells Into Insulin-Producing Clusters. Exp Clin Transplantat. 13 (1), 68-75 (2015).
  13. Koh, S. H., et al. Differential Effects of Isoxazole-9 on Neural Stem/Progenitor Cells, Oligodendrocyte Precursor Cells, and Endothelial Progenitor Cells . PLoS One. 10 (9), e0138724(2015).
  14. Tsakmaki, A., Fonseca Pedro, P., Pavlidis, P., Hayee, B., Bewick, G. A. ISX-9 manipulates endocrine progenitor fate revealing conserved intestinal lineages in mouse and human organoids. Mol Metabol. 34, 157-173 (2020).
  15. Khan, S., Sur, S., Newcomb, C. J., Appelt, E. A., Stupp, S. I. Self-assembling glucagon-like peptide 1-mimetic peptide amphiphiles for enhanced activity and proliferation of insulin-secreting cells. Acta Biomaterialia. 8 (5), 1685-1692 (2012).
  16. White, A. M., et al. Engineering Strategies to Improve Islet Transplantation for Type 1 Diabetes Therapy. ACS Biomater Sci Eng. 6 (5), 2543-2562 (2020).
  17. Li, X., Meng, Q., Zhang, L. The Fate of Allogeneic Pancreatic Islets following Intraportal Transplantation: Challenges and Solutions. J Immunol Res. 2018, 1-13 (2018).
  18. Marín-Cañas, S., et al. Pancreatic ductal cells may have a negative effect on human islet transplantation. PLoS One. 14 (7), e0220064(2019).
  19. Webb, M. A., et al. The Impact of Potential Islet Precursor Cells on Islet Autotransplantation Outcomes. Cell Transplant. 22 (6), 1041-1051 (2013).
  20. Vendrame, F., et al. Recurrence of Type 1 Diabetes After Simultaneous Pancreas-Kidney Transplantation, Despite Immunosuppression, Is Associated With Autoantibodies and Pathogenic Autoreactive CD4 T-Cells. Diabetes. 59 (4), 947-957 (2010).
  21. Barron, E., et al. Associations of Type 1 and Type 2 Diabetes With COVID-19-related Mortality in England: A Whole-Population Study. Lancet Diabetes Endocrinol. 8 (10), 813-822 (2020).
  22. Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
  23. Blum, B., et al. Functional β-cells maturation is marked by an increase in the glucose threshold for insulin secretion and by expression of urocortin3. Nat Biotechnol. 30 (3), 261-264 (2012).
  24. Karimi, N., Ozcan, G. B. Rat Ductal Cell-Derived Differentiation into Islet-Like Cells. Methods Mol Biol. , 1-15 (2024).
  25. Dagli Gul, A. S., Fadillioglu, E., Karabulut, I., Yesilyurt, A., Delibasi, T. The effects of oral carvacrol treatment against H2O2-induced injury on isolated pancreas islet cells of rats. Islets. 5 (4), 149-155 (2013).
  26. Noguchi, H., et al. Evaluation of Osmolality of Density Gradient for Human Islet Purification. Cell Transplant. 21 (2-3), 493-500 (2012).
  27. Boyuk, G., Yigit, A. A., Aydogan, I. Co-culture of rat luteal cells with islet cells enhances islet viability and revascularization. In Vitro Cell Dev Biol Animal. 54, 640-647 (2018).
  28. Karimi, N., Boyuk Ozcan, G. Isolation Procedure for Rat Pancreatic Ductal Cells. Methods Mol Biol. , (2024).
  29. Karakose, M., et al. Comparison of the Ovary and Kidney as Sites for Islet Transplantation in Diabetic Rats. Transplant Proc. 48, 2216-2220 (2016).
  30. Gou, W., Cui, W., Cui, Y., Wang, H. Minimizing post-infusion portal vein bleeding during intrahepatic islet transplantation in mice. J Vis Exp. (171), e62530(2021).
  31. Geiger, M. C., et al. Evaluation of Metabolic Control Using a Continuous Subcutaneous Glucose Monitoring System in Patients with Type 1 Diabetes Mellitus who Achieved Insulin Independence after Islet Cell Transplantation. Cell Transplant. 14 (2-3), 77-84 (2005).
  32. Farina, M., et al. 3D Printed Vascularized Device for Subcutaneous Transplantation of Human Islets. Biotechnol J. 12 (9), 1700169(2017).
  33. Biancone, L., et al. Platelet-Activating Factor Synthesis and Response on Pancreatic Islet Endothelial Cells: Relevance for Islet Transplantation. Transplantation. 81 (4), 511-518 (2006).
  34. Lee, Y. S., Lee, C., Choung, J. S., Jung, H. S. Glucagon-Like Peptide 1 Increases Β-Cell Regeneration by Promoting Α- To Β-Cell Transdifferentiation. Diabetes. 67 (12), 2601-2614 (2018).
  35. Akinci, E., Banga, A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. Reprogramming of pancreatic exocrine cells towards a beta (β) cell character using Pdx1, Ngn3 and MafA. Biochem J. 442 (3), 539-550 (2012).
  36. Kalwat, M. A., et al. Isoxazole Alters Metabolites and Gene Expression, Decreasing Proliferation and Promoting a Neuroendocrine Phenotype in Β-Cells. Acs Chem Biol. 11 (4), 1128-1136 (2016).
  37. Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol. 26 (4), 443-452 (2008).
  38. García-Ocaña, A., et al. Transgenic Overexpression of Hepatocyte Growth Factor in the β-Cell Markedly Improves Islet Function and Islet Transplant Outcomes in Mice. Diabetes. 50 (12), 2752-2762 (2001).
  39. Vegas, A. J., et al. Long-term glycemic control using polymer-encapsulated human stem cell-derived beta cells in immune-competent mice. Nat Med. 22 (3), 306-311 (2016).
  40. Zhang, W. J., et al. Evaluation of islets derived from human fetal pancreatic progenitor cells in diabetes treatment. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 141(2013).
  41. El-Kersh, A. O. F. O., El-Akabawy, G., Al-Serwi, R. H. Transplantation of human dental pulp stem cells in streptozotocin-induced diabetic rats. Anat Sci Int. 95 (4), 523-539 (2020).
  42. Lee, D. Y., Park, S. J., Nam, J. H., Byun, Y. Optimal aggregation of dissociated islet cells for functional islet-like cluster. J Biomater Sci Pol Ed. 19 (4), 441-452 (2008).
  43. Brissova, M., et al. Intraislet Endothelial Cells Contribute to Revascularization of Transplanted Pancreatic Islets. Diabetes. 53 (5), 1318-1325 (2004).
  44. Maxwell, K. G., Kim, M. H., Gale, S. E., Millman, J. R. Differential function and maturation of human stem cell-derived islets after transplantation. Stem Cells Transl Med. 11 (3), 322-331 (2022).
  45. Brissova, M., et al. Pancreatic Islet Production of Vascular Endothelial Growth Factor-A Is Essential for Islet Vascularization, Revascularization, and Function. Diabetes. 55 (11), 2974-2985 (2006).
  46. Chow, L. W., Wang, L., Kaufman, D. B., Stupp, S. I. Self-assembling Nanostructures to Deliver Angiogenic Factors to Pancreatic Islets. Biomaterials. 31 (24), 6154-6161 (2010).
  47. Assady, S., et al. Insulin Production by Human Embryonic Stem Cells. Diabetes. 50 (8), 1691-1697 (2001).
  48. Homma, J., Sekine, H., Shimizu, T. Tricultured Cell Sheets Develop into Functional Pancreatic Islet Tissue with a Vascular Network. Tissue Engineering Part A. 29 (7-8), 211-224 (2023).
  49. Loganathan, G., et al. Culture of Impure Human Islet Fractions in the Presence of Alpha-1 Antitrypsin Prevents Insulin Cleavage and Improves Islet Recovery. Transplaxt Proc. 42 (6), 2055-2057 (2010).
  50. Hilderink, J., et al. Controlled aggregation of primary human pancreatic islet cells leads to glucose-responsive pseudoislets comparable to native islets. J Cell Mol Med. 19 (8), 1836-1846 (2015).
  51. Choi, H., Shinohara, M., Ibuki, M., Nishikawa, M., Sakai, Y. Differentiation of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Endocrine Progenitors to Islet-like Cells Using a Dialysis Suspension Culture System. Cells. 10 (8), 2017(2021).
  52. Ding, Y., Xia, S., Zhang, H., Chen, Q., Niu, B. Loureirin B Activates GLP-1R and Promotes Insulin Secretion in Ins-1 Cells. J Cell Mol Med. 25 (2), 855-866 (2020).
  53. O'Mara, B. A., Liehuaa, L., Ahrén, B. Stromal Derived Factor 1 Alpha (SDF-1a) in a Dual Therapy With the DPP-4 Inhibitor 1 Vildagliptin Does Not Enhance Beta Cell Function but Improves Glucose Clearance After Oral Glucose in Streptozotocin Diabetic Mice. J Chem Biol Ther. 1, 110(2016).
  54. Caporarello, N., Parrino, C., Trischitta, V., Frittitta, L. Insulin Receptor Signaling and Glucagon-Like Peptide 1 Effects on Pancreatic Beta Cells. Plos One. 12 (8), e0181190(2017).
  55. Schwenk, R. W., et al. GLP-1-oestrogen Attenuates Hyperphagia and Protects From Beta Cell Failure in Diabetes-Prone New Zealand Obese (NZO) Mice. Diabetologia. 58 (3), 604-614 (2014).
  56. He, Y., et al. Reversal of Early Diabetic Nephropathy by Islet Transplantation under the Kidney Capsule in a Rat Model. J Diabetes Res. 2016, 1-12 (2016).
  57. Yun, F., Zhaorigen, B., Han, X., Li, X., Yun, S. Islet-Like Cells Induced from Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells with Neonatal Bovine Pancreatic Mesenchymal Exosomes for Treatment of Diabetes Mellitus. Hormone Metabolic Res. 56 (06), 463-470 (2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

داء السكري من النوع الأولإنتاج الأنسولينخلايا بيتا البنكرياسيةزراعة خلايا الجزرخفض جلوكوز الدمتحمل الجلوكوز داخل الصفاقجرذان مصابة بالسكري بمادة الستربتوزوتوسينالحماية المناعية

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.