هنا ، نقدم بروتوكولا لتحديد الديناميكيات الزمانية المكانية لتنشيط Akt والفسفرة في خلايا HepG2 الحية. يعد تصوير فورستر لنقل الطاقة بالرنين (FRET) أداة قوية توفر رؤى قيمة حول مسارات إشارات الأنسولين وتنظيم التمثيل الغذائي في الخلايا السرطانية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تصوير نقل طاقة رنين الخلية الحية لديناميكيات تنشيط Akt المنظمة الأيضية في خلايا HepG2
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يعد تنشيط Akt المنظم الأيض عقدة مهمة في سلسلة إشارات الأنسولين ويوفر رؤى قيمة حول العلاقة بين مرض السكري والسرطان. لتحديد نشاط Akt بدقة في خلايا HepG2 ، قمنا بتطوير بروتوكول قوي وقابل للتكرار باستخدام نقل طاقة الرنين Förster (FRET) مع أجهزة استشعار حيوية مشفرة وراثيا خاصة ب Akt. يحدد هذا البروتوكول خطوات مفصلة لزراعة الخلايا ، وإعداد طبق التصوير ، وتعداء خلايا HepG2 للتعبير عن أجهزة الاستشعار الحيوية القائمة على FRET ، جنبا إلى جنب مع إرشادات محددة لتكوين أجهزة وبرامج المجهر متحد البؤر للمسح بالليزر. أظهرت النتائج أنماطا فريدة من إشارات الأنسولين في خلايا HepG2 ، والتي تظهر مفتاحا لا رجعة فيه يتميز بتنشيط Akt التأسيسي مع عتبة تشغيل محددة ولكن بدون عتبة إيقاف التشغيل. في المقابل ، تعرض الأنابيب العضلية مفتاحا قابلا للعكس. يشير تنشيط Akt المستمر في خلايا HepG2 إلى آليات تكمن وراء مقاومة الأنسولين وخلل تنظيم التمثيل الغذائي في الخلايا الكبدية ، مع آثار أوسع لفهم تطور اضطرابات التمثيل الغذائي والسرطان. يوفر هذا البروتوكول إطارا قيما لاستكشاف مسارات الإشارات المتعلقة ب Akt والسلوكيات الخلوية عبر سياقات المرض المختلفة.
المقدمة
يشكل داء السكري تحديا صحيا عالميا كبيرا ، يتميز بمقاومة الأنسولين وضعف توازن الجلوكوز1. يعد الفهم الشامل لمسارات إشارات الأنسولين أمرا بالغ الأهمية لتوضيح الفيزيولوجيا المرضية لهذا المرض ، حيث يلعب الأنسولين دورا محوريا في استقلاب الجلوكوز ونمو الخلايا والبقاءعلى قيد الحياة 2. أظهرت العديد من الدراسات أن إشارات الأنسولين تؤثر بشكل كبير على أنواع السرطان المختلفة ، حيث تربط مقاومة الأنسولين بتطور الورم ونتائج المرضىالسيئة 3،4،5،6. تعمل خلايا HepG2 ، وهي خط خلايا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تظهر نظرة عامة على الخطوات التجريبية المتضمنة في تصوير الخلايا الحية FRET لمراقبة فسفرة Akt في خلايا HepG2 المفردة في الشكل 1.
1. اكتساب البلازميد وانتشاره وتنقيته
ملاحظة: يوضح هذا القسم الخطوات الأساسية للحصول على البلازميد المطلوب لتحليل FRET أحادي الخلية وتضخيمه وتنقيته.
- استخدم بلازميد pEevee-iAkt-NES-YPet (الشكل 2 أ).
ملاحظة: تم توفير البلازميد بسخاء من قبل البروفيسور كازوهيرو أوكي في المعهد الوطني لعلم الأحياء الأساسي (NIBB) ، اليابان ، حيث تم تصوير خرائط البلازميد لأجهزة الاستشعار الحيوية FRET المستخدمة لمراقبة Akt و....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
للتحقيق في تنشيط Akt في خلايا HepG2 ، تم زرع الخلايا في أطباق تصوير مغلفة مسبقا وتم نقلها باستخدام المستشعر الحيوي القائم على FRET pEevee-iAkt-NES (الشكل 2 أ) ، المصمم لتمكين المراقبة في الوقت الفعلي لفسفرة Akt. بعد التعدي ، خضعت الخلايا لتجويع المصل لمدة 4 ساعات في وسط خال من المصل لمزامنة حالتها الأيضية وتقليل إشارات الأنسولين القاعدية.
تعرضت الخلايا لاحقا لتركيزات مختلفة من الأنسولين (0 جزء في المليون ، 300 جزء في المليون ، 400 جزء في المليون ، 500 جزء في الملي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يتضمن بروتوكول تصوير الخلايا الحية FRET لمراقبة فسفرة Akt في خلايا HepG2 عدة خطوات رئيسية لضمان نتائج موثوقة وقابلة للتكرار. الخطوة الحاسمة الأولى هي زراعة الخلايا ، والتي تشمل الصيانة الروتينية للخلايا ، وطلاء أطباق التصوير ، وبذر الخلايا. يعد الطلاء المناسب ضروريا لربط الخلية أثناء تجارب التصوير بفاصل زمني ، لأنه يضمن التصاق خلوي مستقر ، ويمنع الانفصال ، ويقلل من الانجراف ، مما قد يؤدي إلى بيانات غير متسقة9،32. قد تؤدي الاختلاف.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح متضاربة.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية في Shenzhen (JCYJ20240813113606009) ، ومنطقة التعاون بين Shenzhen و Hong Kong للتكنولوجيا والابتكار (HZQB-KCZYB-2020056) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32070681) ، والبرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2019YFA0906002) ، وخطة Shenzhen Peacock (KQTD2016053117035204).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.25٪ التربسين EDTA | جيبكو | القط # 25200-056 | استخدم PBS مثلج لغسل الخلايا |
| طبق زراعة الخلايا القاع الزجاجي 15 مم | عش | القط # 801001 | |
| 2 مل قوارير Nalgene المبردة | ثيرمو ساينتفيك | القط # 5012-0020 | |
| 5 مل مخطط مصلية | كورنينج | القط # 4487 | |
| 95٪ إيثانول | كرمل | قط # C028005 | |
| A1 HD25 / A1R HD25 مجهر متحد البؤر | نيكون | https://www.nikon.com/ | التكبير: 40 مرة ؛ ، الفتحة العددية (NA): 1.30 ، وقت مكوث البكسل: 2.4 مللي ثانية ، حجم البكسل: 1024 |
| الأمبيسيلين | سيجما ألدريتش | قط#A9393 | |
| ألبومين مصل البقر (BSA) | VWR علوم الحياة | القط # N208-10g | |
| كورنينج 25 CM 2 < / sup > قوارير ثقافة مستطيلة | كورنينج | قط # 430639 | |
| عداد الخلايا الآلي للكونتيسة 3 | ثيرمو ساينتفيك | http://www.thermofisher.com/#AMQAX2000 | |
| شرائح غرفة عد خلية الكونتيسة | ثيرمو ساينتفيك | http://www.thermofisher.com/#C10228 | |
| خلاطات دوامة رقمية | ثيرمو ساينتفيك | https://www.thermofisher.com/ | |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد | سيجما ألدريتش | قطة # D2650 | |
| أنابيب Eppendorf Safe-Lock 1.5 ؛ مل | إيبندورف | القط # 022363204 | |
| طقم الكشف عن الميكوبلازما EZ-PCR | الصناعات البيولوجية | القط # 20-700-20 | |
| مصل الأبقار الجنينية ، مؤهل ، أستراليا | جيبكو | القط # 10099141 | |
| الملحق جلوتاماكس | جيبكو | قطة # 35050061 | |
| GraphPad المنشور 9 | برنامج GraphPad | https://www.graphpad.com/ | |
| HepG2 | المجموعة الوطنية لمزارع الخلايا المصادق عليها | #CSTR:19375.09.3101HUMSCSP510 http://www.cellbank.org.cn/ | |
| زيت الغمر نوع 37 | مختبرات كارجيل | القط # 16237 | |
| إنسولين | سيجما ألدريتش | القط # I5500-50MG | دافئ إلى 37 درجة ؛ C قبل الاستخدام |
| مرق LB (1x) | إنفيتروجين | القط # 10855001 | |
| الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM) | جيبكو | قط # 11095080 | دافئ إلى 37 درجة ؛ C قبل الاستخدام |
| mySPIN 12 جهاز طرد مركزي صغير | ثيرمو ساينتفيك | https://www.thermofisher.com/ | |
| نانو دروب واحد | ثيرمو ساينتفيك | https://www.thermofisher.com | |
| عدسة زيت نيكون بلان فلور 40 مرات؛ / 1.30 | نيكون | https://www.nikon.com/ | |
| نيس - عناصر - AR | نيكون | https://www.nikon.com/ | |
| الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) (100x) | جيبكو | القط # 11140050 | |
| لقطة واحدة LB أجار لوحات | إنفيتروجين | القط # A55802 | |
| لقطة واحدة Stbl3 المختصة كيميائيا E. القولونيه | إنفيتروجين | القط # C737303 | |
| بارافيلم | بارافيلم | قطة # B8R05606 | |
| PBS (محلول ملحي مخزن الفوسفات) | جيبكو | القط # 10010023 | |
| pEevee-iAkt-NES (7,033 bp) | ميورا وآخر al31 | https://benchling.com/s/seq-q46zFYCfl0swLAun0t28/edit | |
| البنسلين الستربتومايسين | جيبكو | قطة # 15070063 | |
| الوبلازموس الوقائي | إنفيفوجين | القط # ant-mpp | |
| بولي إل يسين هيدروبروميد ؛ | سيجما ألدريتش | القط # P4832 | |
| حمامات دقيقة للأغراض العامة | ثيرمو ساينتفيك | https://www.thermofisher.com/ | |
| طقم QIAprep للدوران miniprep | كياجين | القط # 27106 | |
| سناب جين | SnapGene من Dotmatics | https://www.snapgene.com | |
| بيروفات الصوديوم (100 ملم) | جيبكو | قطة # 11360070 | |
| وحدة تصفية الحقنة ، 0.22 ؛ μ m | ميليبور | القط # SLGP033RS | |
| حاضنة Tokai Hit أعلى المرحلة | ضرب توكاي | https://www.tokaihit-livecell.com/stagetopincubator | |
| ماء مقطر خال من DNase / RNase فائق النقاء | إنفيتروجين | القط # 10977015 | |
| كاشف Xfect Transfection | تاكارا بيو | القط # 631317 |
المراجع
- GBD 2021 Diabetes Collaborators. Global, regional, and national burden of diabetes from 1990 to 2021, with projections of prevalence to 2050: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2021. Lancet. 402 (10397), 203-234 (2023).
- Li, M., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
