Method Article

نهج مبسط للبروتينات القائمة على قياس الطيف الكتلي باستخدام مناطق أنسجة مختارة

DOI:

10.3791/68076

⸱

April 18th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Science, School of Medicine, CHA University, 2Department of Proteomic Research, CHA Future Medicine Research Institute, 3Department of Pathology, Seoul National University Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نؤسس طريقة بروتينية قائمة على قياس الطيف الكتلي باستخدام مناطق معزولة ذات أهمية في أقسام الأنسجة الثابتة بالفورمالين والمدمجة في البارافين. يستخدم هذا البروتوكول لتحليل البروتيوم من مناطق أنسجة معينة في أقسام الأنسجة المؤرشفة المثبتة بالفورمالين والمضمنة في البارافين.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتيح البروتينات القائمة على قياس الطيف الكتلي (MS) تحليلا شاملا للبروتينات عبر مجموعة واسعة من العينات البيولوجية ، بما في ذلك الخلايا والأنسجة وسوائل الجسم. ظهرت أقسام الأنسجة المثبتة بالفورمالين والمضمنة في البارافين (FFPE) ، والتي يشيع استخدامها في الأرشفة طويلة الأجل ، كموارد قيمة للدراسات البروتينية. بالإضافة إلى فوائد التخزين الخاصة بهم ، يمكن للباحثين عزل مناطق الاهتمام (ROIs) عن مناطق الأنسجة الطبيعية من خلال الجهود التعاونية مع علماء الأمراض. على الرغم من هذه الإمكانات ، لا يزال هناك نقص في نهج مبسط للتجارب البروتينية التي تشمل عزل عائد الاستثمار ، وإعداد العينة البروتينية ، وتحليل التصلب المتعدد. في هذا البروتوكول، يتم تقديم سير عمل متكامل يجمع بين التشريح الكلي لعائد الاستثمار، وإعداد العينة المستندة إلى التراكب اللوني المعلق، وتحليل MS عالي الإنتاجية. من خلال هذا النهج ، تم تشريح عائد الاستثمار لأنسجة FFPE للمرضى ، والتي تتكون من الأورام الكيسية المصلية الحميدة (SCN) والأورام المخاطية الحليمية الحليمية محتملة التسرطن (IPMN) التي تم تشخيصها من قبل علماء الأمراض ، وجمعها وتحليلها ، مما أدى إلى تغطية عالية للبروتين. علاوة على ذلك ، تم تحديد الاختلافات الجزيئية بين الأورام الكيسية المميزة في البنكرياس بنجاح ، مما يدل على قابلية تطبيق هذا النهج لتطوير الأبحاث البروتينية مع أنسجة FFPE.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لعقود من الزمان ، تم أرشفة الأنسجة البشرية المستخلصة جراحيا ككتل مثبتة بالفورمالين ومدمجة في البارافين (FFPE). تحافظ كتل الأنسجة هذه في البداية على الهيكل ثلاثي الأبعاد (3D) المضمن في البارافين. يتم تقطيع الأنسجة لاحقا باستخدام ميكروتومات ، وتركيبها على شرائح ، وتلطيخها - عادة بالهيماتوكسيلين واليوزين (HE) أو الكيمياء المناعية (IHC) - لتسهيل التشخيص النسيجي المرضي من قبل أخصائيي علم الأمراض ذوي الخبرة1،2. توفر أنسجة FFPE مزايا مميزة للتخزين طويل الأجل بسبب تشابك البروتين الناجم عن الفورمالين ، والذي يوقف النشاط الأنزيمي والمحللللبروتين 3. نظرا لأنها تدعم بناء مجموعات عينات كبيرة ومؤرشفة جيدا ، فقد اعتبرت أنسجة FFPE حجر الزاوية لاكتشاف المؤشرات الحيوية عبر مجالات متنوعة ، بما في ذلك علم الجينوم4،5،6،7.

ومع ذلك ، فإن تطبيقها في البروتينات القائمة على الكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS) قد طرح تحديات تاريخيا. أحد القيود الرئيسية هو تشابك البروتين الناجم عن الفورمالين ، والذي يتداخل مع الهضم التربتسي - وهي خطوة حاسمة في تحليل البروتين العالمي8. علاوة على ذلك ، فإن الكمية الصغيرة من البروتين التي يمكن استردادها من شرائح الأنسجة غالبا ما تجعل طرق تحضير العينات التقليدية غير مناسبة. على الرغم من هذه التحديات ، فقد أظهرت التطورات أنه يمكن عكس الروابط المتشابكة للبروتين من خلال المعالجة المطولة بدرجات الحرارة العالية9،10،11. في الوقت نفسه ، أدت طرق تحضير العينات المحسنة لعينات البروتين منخفضة الكمية إلى توسيع استخدام أنسجة FFPE في أبحاث البروتينات12،13،14،15.

تكمن إحدى الميزات المهمة لاستخدام شرائح أنسجة FFPE في البروتينات في قدرتها على تمكين تحليل خاص بالمنطقة. تحتوي شرائح FFPE عادة على كل من الآفات والأنسجة الطبيعية المجاورة (ANT). يؤدي تحليل الأنسجة بأكملها بشكل عشوائي إلى إرباك النتائج بسبب التوقيعات الجزيئية المختلطة. في المقابل ، فإن عزل وتحليل مناطق الاهتمام (ROIs) - الآفات مقابل النمل - يتيح توصيفا أكثر دقة للسمات الجزيئية الخاصة بالمناطق المرضية. وبالتالي ، أصبحت الأساليب القائمة على FFPE شائعة بشكل متزايد في دراسات البروتينات16،17،18،19،20. على الرغم من تطبيقها المتزايد ، لا يزال سير العمل المبسط الذي يصف التجربة البروتينية بأكملها خطوة بخطوة نادرا. على وجه الخصوص ، لم يتم نشر بروتوكول قائم على الفيديو.

في هذه الدراسة ، تم إنشاء سير عمل قوي للبروتينات القائم على LC-MS مصمم للتنميط الدقيق للتغيرات الجزيئية داخل المناطق الخاصة بالآفة. باستخدام أنسجة FFPE التي تم تشخيصها بواسطة اثنين من علماء الأمراض ، تم تشريح عائد الاستثمار من الأورام الكيسية المصلية الحميدة (SCN) والأورام المخاطية الحليمية الحليمية السرطانية (IPMN) وجمعها وتحليلها. يشتمل البروتوكول على تشريح كبير لعائد الاستثمار ، وإعداد العينة المستند إلى محاصرة التعليق الأمثل للحد الأدنى من مدخلات البروتين ، وتحليل الاستحواذ المستقل عن البيانات (DIA) - MS ضيق المدى. مكنت هذه الطريقة من تحديد أكثر من 9,000 بروتين من مناطق الأنسجة التي تبلغ مساحتها حوالي 1 سم مربع ، وفك رموز التوقيعات البروتينية المميزة المرتبطة ب SCN و IPMN.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة هذه الدراسة والموافقة عليها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لمستشفى جامعة سيول الوطنية (IRB رقم 1904-114-1028). قدم جميع المشاركين موافقة خطية مستنيرة للمشاركة في الدراسة. يتم تقديم معلومات مفصلة عن جميع المواد المستخدمة في هذا البروتوكول في جدول المواد.

1. استرجاع مستضد أنسجة FFPE لإعداد عينة البروتينات

ملاحظة: تأكد من أن المشارط وجميع المواد ، مثل الأنبوب المستخدم ، معقمة لتجنب أي تلوث متبادل. يمكن تكييف بروتوكولات هذه الدراسة مع أي نسيج FFPE مع تعديلات طفيفة بناء على إعداد المختبر.

  1. قم بقص أقسام أنسجة FFPE سعة 10 ميكرومتر من كتل أنسجة FFPE كاملة التركيب وضعها على شرائح زجاجية.
    ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استخدام أنسجة FFPE لكيس البنكرياس البشري (نوعان مختلفان من الأنسجة الكيسية - SCN و IPMN) لإعداد عينة البروتينات.
  2. قم بإزالة شمع البارافين من أنسجة FFPE (إزالة البارافينات) بغسلتين في الزيلين بحذر: واحدة لمدة 5 دقائق والأخرى لمدة دقيقتين.
  3. أعد ترطيب الأنسجة من خلال غسيل تسلسلي بخليط الإيثانول المتدرج: 3 دقائق لكل منها 100٪ و 85٪ و 70٪ و 50٪ إيثانول ، متبوعا بشطف بالماء منزوع الأيونات.
    ملاحظة: تأكد من التعامل مع الزيلين والإيثانول في غطاء دخان كيميائي.

2. استخراج بروتين أنسجة FFPE

  1. قم بإعداد شريحة أنسجة ملطخة ب HE- أو IHC يشار إليها أخصائيو علم الأمراض.
  2. ضع شريحة الأنسجة غير الملوثة وانزلق الأنسجة الملطخة بحيث تكون جوانبها الخلفية متجهة لبعضها البعض ، وقم بمحاذاة بعضها البعض. تأكد من ملاحظة عائد الاستثمار من خلال الشريحة الزجاجية.
  3. قم بإزالة مناطق الأنسجة غير المثيرة للاهتمام باستخدام المشرط.
    ملاحظة: إذا كان يجب تحليل الأنسجة الطبيعية المجاورة ، فقم بجمعها في الأنابيب الأخرى.
  4. اكشط عائد الاستثمار للأنسجة إلى وسط الشريحة باستخدام المشرط وانقلها إلى أنابيب ربط نظيفة منخفضة البروتين سعة 1.5 مل.
  5. أضف 180 ميكرولتر من محلول تحلل كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) (5٪ SDS ، 2 ملي مولار تريس (2-كربوكسي إيثيل) فوسفين) [TCEP] ، 300 ملي مولار درجة الحموضة 8.5 تريس حمض الهيدروكلوريك في الماء منزوع الأيونات) إلى كل أنبوب.
    ملاحظة: تأكد من أن حجم المخزن المؤقت للتحلل كاف لإذابة الأنسجة أثناء الصوتنة وتعليق البروتينات المستخرجة. يمكن أن يؤدي المخزن المؤقت غير الكافي إلى تحلل الأنسجة غير المكتمل ، في حين أن المخزن المؤقت المفرط قد يخفف من محللات البروتين.
  6. أداء سونيكاسیون التحقيق بسعة 20٪ ، مع تطبيق 10 دورات من 5 ثوان و 5 ثوان قبالة.
  7. احتضان العينات عند 100 درجة مئوية لمدة 3.5 ساعة مع 1,000 × جم.
    ملاحظة: قم بإجراء صوتنة المياه للعينات لمدة 1 دقيقة كل ساعة أثناء الحضانة لاستخراج البروتين بكفاءة.
  8. بعد الحضانة ، قم بتبريد العينة في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10 دقائق. قم بالطرد المركزي للعينات عند 16,000 × جم لمدة 10 دقائق في RT لفصل بقايا الأنسجة عن المادة الطافية.
  9. اجمع المادة الطافية في أنبوب نظيف ومسمى وقم بتخزينه عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام الآخر.

3. القياس الكمي للبروتين من محللة أنسجة FFPE

ملاحظة: تستند معظم خطوات فحص حمض البيسنشونينيك لقياس البروتين على تعليمات الشركة المصنعة مع تعديلات طفيفة. يوصى بإعداد الكواشف وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.

  1. تحضير معايير ألبومين مصل الأبقار (BSA) بتركيزات متفاوتة عن طريق التخفيف المتسلسل لمحلول المخزون (2 ملغم / مل من BSA). إذا لزم الأمر ، قم بتخفيف العينات بعامل تخفيف 20 أو 40.
  2. قم بإعداد الماء منزوع الأيونات كفارغ ومخزن تحلل SDS كعنصر تحكم في العينة.
  3. ماصة 9 ميكرولتر من المعايير ، فارغة ، مراقبة العينة ، وعينات إلى مركز بئر الصفيحة الدقيقة.
  4. أضف 4 ميكرولتر من محلول كاشف التوافق إلى العينة في كل بئر.
  5. غطي الطبق واخلطيهم على شاكر طبق بسرعة متوسطة لمدة 1 دقيقة. بعد ذلك ، احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  6. أضف 260 ميكرولتر من كاشف عمل BCA إلى كل بئر ، ثم احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  7. قم بتبريد الطبق في RT لمدة 3 دقائق.
  8. قم بقياس امتصاص الآبار عند 562 نانومتر على قارئ الألواح.
  9. اطرح قيمة امتصاص 562 نانومتر للفراغ من قيمة جميع العينات والتحكم في العينة.
  10. علاوة على ذلك ، اطرح قيمة الامتصاص 562 نانومتر للتحكم في العينة المطروحة الفارغة من قيمة جميع العينات.
  11. ارسم واستخدم المنحنى القياسي لتحديد تركيز البروتين لكل عينة.
    ملاحظة: تأكد من استخراج ما يقدر بنحو 200-250 ميكروغرام من البروتينات من ثلاث شرائح زجاجية من أنسجة FFPE ، كل منها بمساحة تقريبية تبلغ 1 سم2.

4. ترسيب الأسيتون للبروتين

ملاحظة: تأكد من استخدام ما مجموعه 100-300 ميكروغرام من البروتين لترسيب الأسيتون وهضم البروتين القائم على التعليق.

  1. ضع عينة البروتين (المقابلة ل 100-300 ميكروغرام) في أنبوب متوافق مع الأسيتون.
  2. أضف -20 درجة مئوية من الأسيتون بحجم خمسة أضعاف حجم العينة إلى الأنبوب.
  3. احتضان الخليط عند -20 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.
  4. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 16,000 × جم لمدة 15 دقيقة.
  5. تخلص بعناية من المادة الطافية دون إزعاج حبيبات البروتين.
  6. أضف 500 ميكرولتر من -20 درجة مئوية من الأسيتون وكرر الخطوات 4.4-4.5.
  7. جفف العينة بالهواء.

5. هضم البروتين القائم على التعليق

ملاحظة: تم تكييف إجراء هضم البروتين القائم على مرشح محاصرة التعليق من تعليمات الشركة المصنعة مع تعديلات طفيفة.

  1. تحضير المخزن المؤقت لتحلل التعليق (5٪ SDS ، 5 ملي مولار TCEP ، 50 ملي مولار درجة الحموضة 8.5 TEAB في الماء منزوع الأيونات).
  2. أضف 40 ميكرولتر من المخزن المؤقت إلى أنبوب العينة والدوامة جيدا لإذابة حبيبات البروتين المجففة بالهواء.
  3. احتضان العينة عند 100 درجة مئوية مع الرج عند 1,000 × جم لمدة 35 دقيقة.
  4. أضف 10 ميكرولتر من الكاشف المؤلكل (100 ملي مولار كلوروأسيتاميد [CAA] في 100 ملي مولار ، درجة الحموضة 8.5 ، رباعي إيثيل الأمونيوم بروميد [TEAB]) إلى العينة.
  5. احتضان في RT مع الرج عند 300 × جم لمدة 1 ساعة.
  6. قم بإعداد محمض (10٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك [TFA] في الماء منزوع الأيونات) بحذر. تأكد من التعامل مع TFA ، وهو حمض قوي ، في غطاء دخان كيميائي.
  7. أضف 5 ميكرولتر من المحمض إلى العينة لتحقيق تركيز نهائي قدره 1٪ TFA (حجم العينة النهائي: 55 ميكرولتر).
  8. تحقق من الرقم الهيدروجيني للعينة باستخدام ورق الأس الهيدروجيني. تأكد من أن الرقم الهيدروجيني أقل من 1.
  9. أضف 350 ميكرولتر من مخزن الربط / الغسيل -1 (0.1 م ، درجة الحموضة 8.5 TEAB في 90٪ MeOH) إلى العينة لاحتجاز البروتينات.
    ملاحظة: تجنب الدوامة والطرد المركزي أثناء محاصرة البروتين (الخطوة 5.9) لمنع فقدان العينة. تضمن الكميات الكافية من البروتين تكوين جسيمات البروتين الغروية المرئية ذات المظهر الشفاف.
  10. ضع عمود الانحباس المعلق في أنبوب سعة 2 مل وانقل العينة بأكملها، بما في ذلك أي مادة غير قابلة للذوبان، إلى عمود محاصرة التعليق.
  11. الطرد المركزي العمود عند 4,000 × جم لمدة 50 ثانية لاحتجاز البروتينات.
    ملاحظة: تأكد من مرور كل العينة عبر العمود ؛ إذا لم يكن الأمر كذلك ، كرر الطرد المركزي حتى الترشيح الكامل.
  12. أضف 400 ميكرولتر من مخزن الغسيل -2 (50٪ CHCl3/50٪ MeOH) إلى العمود ، وجهاز الطرد المركزي عند 4000 × جم لمدة 50 ثانية ، وتخلص من التدفق.
  13. كرر الخطوة 5.12 ثلاث مرات.
  14. أضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت -1 ، وجهاز الطرد المركزي عند 4000 × جم لمدة 50 ثانية ، وتخلص من التدفق.
  15. كرر الخطوة 5.14 ثلاث مرات.
  16. جهاز طرد مركزي عند 4000 × جم لمدة 1.25 دقيقة لضمان مرور المخزن المؤقت -1 بالكامل.
  17. انقل عمود محاصرة التعليق إلى أنبوب عينة جديد للهضم الأنزيمي.
  18. أضف 125 ميكرولتر من المخزن المؤقت للهضم (0.16 ميكروغرام / ميكرولتر من التربسين / Lys-C في 50 ملي مولار ، درجة الحيازة 8.5 TEAB) إلى عمود محاصرة التعليق وقم بتغطيته لمنع التبخر.
    ملاحظة: يجب أن تكون نسبة التربسين / Lys-C 1:10 (الوزن / الوزن). تأكد من 10 ميكروغرام على الأقل من التربسين / Lys-C للهضم الفعال.
  19. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة دون اهتزاز.
  20. قم بإعداد مخازن الشطف التالية: Buffer-1 (50 ملي مولار من درجة الحموضة 8.5 TEAB في الماء منزوع الأيونات) ، العازلة -2 (0.2٪ FA في الماء منزوع الأيونات) ، والمخزن المؤقت -3 (50٪ أسيتونيتريل [ACN] في الماء منزوع الأيونات).
  21. أضف 80 ميكرولتر من محلول الشطف-1 إلى عمود محاصرة التعليق وجهاز الطرد المركزي عند 4000 × جم لمدة 1.25 دقيقة.
  22. كرر الخطوة 5.20 مع 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف -2 والمخزن المؤقت -3.
  23. تجمع الببتيدات المملوثة ونقلها إلى أنبوب نظيف وجديد.

6. القياس الكمي للببتيد

ملاحظة: يتم تكييف معظم خطوات فحص الببتيد اللوني الكمي من تعليمات الشركة المصنعة مع تعديلات طفيفة. يوصى بإعداد الكواشف وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.

  1. قم بإعداد سلسلة من المعايير عن طريق التخفيف المتسلسل لمحلول المخزون للمعيار (1 مجم / مل). إذا لزم الأمر ، قم بتخفيف العينات باستخدام عامل تخفيف 4 أو 5.
  2. قم بإعداد الماء منزوع الأيونات كفارغ وخليط من المحلول المخزن المؤقت -1 و Buffer-2 و Buffer-3 بنسب متساوية كمراقبة العينة.
  3. ضع 20 ميكرولتر من المعايير ، فارغة ، ومراقبة العينات ، والعينات في وسط كل بئر صفيحة دقيقة.
  4. أضف 180 ميكرولتر من كاشف العمل إلى كل بئر واخلط اللوحة جيدا على شاكر اللوحة لمدة 1 دقيقة.
  5. غطي الطبق واحتضان الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  6. اترك الطبق يبرد في RT لمدة 3 دقائق.
  7. قم بقياس امتصاص الآبار عند 480 نانومتر باستخدام قارئ الألواح.
  8. اطرح قيمة امتصاص الفراغ البالغة 480 نانومتر من قيمة جميع العينات والتحكم في العينة.
  9. علاوة على ذلك ، اطرح قيمة الامتصاص البالغة 480 نانومتر للتحكم في العينة المطروحة الفارغة من قيمة جميع العينات.
  10. ارسم واستخدم المنحنى القياسي لحساب تركيز الببتيد لكل عينة.

7. تحليل الكروماتوغرافيا السائلة - قياس الطيف الكتلي

  1. بعد القياس الكمي للببتيد ، قم بتجميد 20 ميكروغرام من الببتيدات.
  2. إعادة إذابة الببتيدات في 40 ميكرولتر من العازلة المائية (3٪ ACN في 0.1٪ حمض الفورميك [FA] الماء) لمدة 10 دقائق في حمام صوتنة. سيكون تركيز الببتيد الناتج 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر.
  3. قم بالطرد المركزي للعينة عند 16,000 × جم لمدة 60 دقيقة ونقل العينات إلى قوارير لتحليل MS.
  4. حقن 2 ميكرولتر من كل عينة باستخدام جهاز أخذ العينات الآلي لنظام NANO LC-MS / MS.
  5. الببتيدات المنفصلة على عمود الطور العكسي (عمود 0.075 مم المعرف × 150 مم ، معبأ بمادة C18 3 ميكرومتر ، باستخدام تدرج 127 دقيقة من الأسيتونيتريل 5٪ -35٪ عند 100 نانو لتر / دقيقة.
  6. تحليل الببتيدات باستخدام طريقة اكتساب محدودة المدى مستقلة عن البيانات21.
  7. قم بتطبيق إعداد معلمة MS التالي: نطاق MS m / z: 495-745 ، هدف الدقة: 15000 ، هدف AGC: 3 × 10E6 ، الحد الأقصى لوقت الحقن: تلقائي ، نافذة MS / MS: محدد من قبل المستخدم (ملف تكميلي 1) ، هدف الدقة: 45000 ، هدف AGC 3 × 10E6 ، أقصى وقت للحقن: تلقائي ، طاقة تصادم HCD: 22٪ ، 26٪ ، 30٪.
    ملاحظة: يوصى بإجراء فحص أولي للجودة للأداة عن طريق تحليل العينات القياسية قبل التحليل. استخدم برنامج الحصول على بيانات MS لتكوين المعلمات (راجع جدول المواد).

8. تحليل البيانات للبحث عن البروتينات

ملاحظة: للبحث البروتيني عن بيانات MS الأولية ، تم استخدام أدوات مفتوحة المصدر لتحويل تنسيق بيانات LC-MS وإجراء بحث عن البروتين (راجع جدول المواد). يتم تفصيل المعلمات المستخدمة لتحليل البيانات في الملف التكميلي 2. للحصول على إرشادات الاستخدام الأساسية للأدوات مفتوحة المصدر، راجع الارتباط المضمن في جدول المواد.

  1. قم بإخفاء ملفات طيف MS / MS الأولية (* .raw) التي تم الحصول عليها من LC-MS إلى تنسيق * .mzML باستخدام برنامج مفتوح المصدر.
  2. استخدم الملفات الأولية المحولة بالتنسيق (* .mzML) كمدخلات لمحرك بحث مفتوح المصدر لإجراء البحث عن البروتينات.
  3. ابدأ البحث البروتيني بناء على المعلمات المحددة في الملف التكميلي 2.

9. التحليل الإحصائي

ملاحظة: للتحليل الإحصائي لتحديد البروتينات المعبر عنها تفاضليا ، تم استخدام أداة مفتوحة المصدر لإجراء تحليل أحادي المتغير (على سبيل المثال ، اختبار t للطالب ؛ راجع جدول المواد). يوصى بالرجوع إلى تعليمات الاستخدام الأساسية للأداة مفتوحة المصدر عبر الرابط الموجود في جدول المواد.

  1. قم باستيراد قائمة البروتينات المحددة (* .txt) إلى الأداة مفتوحة المصدر.
  2. تصنيف العينات إلى مجموعات. في هذه الدراسة ، تم تعيين مجموعتين: SCN و IPMN.
  3. قم بإجراء تحويل السجل2 لقيم الوفرة لضبط توزيع البيانات على التوزيع الطبيعي التقريبي.
  4. قم بتطبيق خطوة تصفية لإزالة البروتينات ذات القيم المفقودة. في هذه الدراسة، كان مطلوبا ما لا يقل عن قيمتين صحيحتين في كل مجموعة لإدراجها.
  5. حساب القيم المفقودة باستخدام نهج قائم على التوزيع العادي لإنشاء قائمة شاملة من البروتينات الكمية لتحليل أحادي المتغير اللاحق.
  6. قم بإجراء اختبار t للطالب لتحديد البروتينات المعبر عنها بشكل تفاضلي بين المجموعتين. في هذه الدراسة ، تم تطبيق تصحيح معدل الاكتشاف الخاطئ Benjamini-Hochberg (FDR).
  7. استخراج البروتينات المعبر عنها تفاضليا التي تفي بالمعايير التالية: Benjamini-Hochberg FDR < 0.05 و |fold- change| ≥ 2.

10. تحليل المعلوماتية الحيوية

ملاحظة: تم استخدام أداة معلوماتية حيوية تجارية لتحليل الإفراط في التمثيل (على سبيل المثال ، تحليل مسار الإبداع ، راجع جدول المواد). قبل استخدام هذه الأداة ، يوصى بالرجوع إلى تعليمات الشركة المصنعة.

  1. قم باستيراد قائمة DEPs (*.txt) إلى الأداة التجارية.
  2. بدء التحليل الأساسي لإجراء تحليل التمثيل الزائد.
  3. تصدير مسارات أساسية مهمة مخصبة من DEPs باستخدام اختبار فيشر الدقيق (قيمة p المعدلة < 0.05). تحديد المسارات ذات الصلة بالبحث.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطبيق إعداد عينة البروتينات القائمة على مرشح محاصرة التعليق ، جنبا إلى جنب مع القياس الكمي الخالي من الملصقات باستخدام الاستحواذ المستقل عن البيانات أحادية اللقطة ، على أنسجة FFPE الكيسية في البنكرياس (الشكل 1). تم تحقيق عزل دقيق لعائد الاستثمار أثناء معالجة أنسجة FFPE عبر أنسجة FFPE الكيسية المختلفة في البنكرياس (الشكل 2 أ) ، مما أدى إلى الحصول على كروماتوغرامات الأيونات الكلية القابلة للتكرار بين التكرارات البيولوجية الثلاثية لكل نوع من الأورام الكيسية البن...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد هذا البروتوكول طريقة البروتينات السريعة والفعالة التي تستخدم عائد الاستثمار المعزول من أقسام أنسجة FFPE المثبتة على شرائح زجاجية للتشخيص المرضي. عندما يكون التدخل الجراحي مفيدا ، يتم استئصال الأورام الصلبة مثل السرطانات والخراجات جراحيا وحفظها للتقييم المرضي. للتخزين طويل الأجل ، يتم تثبيت الأنسجة في الفورمالين وتضمينها في البارافين (FFPE). ثم يتم تقسيم كتل أنسجة FFPE بسمك 4-10 ميكرومتر ، ومثبتة على شرائح زجاجية ، وتخضع لاسترجاع المستضد ، وتلطخها ب HE أو IHC. يقوم علماء الأمراض بتقي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للإعلان عنه

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إنشاء جميع الأشكال في هذه المقالة باستخدام BioRender (http://www.biorender.com). تم دعم هذا العمل من خلال منح من المؤسسة الوطنية للبحوث الكورية (NRF) (المنحة رقم RS-2023-00253403 و RS-2024-00454407).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.1٪ FA في ACN (درجة LC-MS) فيشركيميكالLS120-212
0.1٪ FA في الماء (درجة LC-MS) فيشركيميكالLS118-4
0.5M TCEPThermo Scientific77720
10٪ SDSInvitrogen2679093
1M TEAB (درجة الحموضة 8.5)Sigma-Aldrich102545001
1M Tris-cl (درجة الحموضة 8.5)BIOSOLUTIONBTO21
A-14C جهاز طرد مركزيساتوريوس167709
الأسيتون (درجة HPLC) فيشرScientificA949-4
ACN (درجة HPLC)JTBaker9017-88
CHCl3 (درجة HPLC) ThermoScientific022920.k2
CR ورقةADVANTEC70406001
DIA-NN الإصدار 1.9 المصدر المفتوح https://github.com/vdemichev/DiaNNمحرك بحث Proteomics 
قارئ الألواح الدقيقة EPOCH2Agilent 2106208
الإيثانولMERCKK50505283 836
FA (درجة LC-MS) تحليلالإبداع من فيشر كيميكالA117-50
(IPA)QIAGEN830018 أداة المعلوماتية الحيوية
Lyophilizer (SRF110R + مصيدة vaper) ThermoScientificSRF-110-115
MeOH (درجة HPLC)MERCKUN1230
Microplate BCA البروتين فحص كيت-عامل اختزال متوافقمع الحرارة العلمية23252
MSConvert المصدر المفتوح http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtmlبرنامج تحويل البيانات
MS Orbitrap Exploris 480Thermo ScientificMA10813CMS
PepMAP RSLC C18 عمود الفصل  Thermo ScientificES903
Perseusأداةإحصائية مفتوحة المصدر https://cox-labs.github.io/coxdocs/perseus_instructions.html
PIERCE كلورو أسيتاميد بدون وزن تنسيقThermo ScientificA39270
PIERCE فحص الببتيد اللوني الكميThermo Scientific23275
Plate shaker أخضر SSerikerVS-202D
مسبار سونيكاتورVibraCellTMVCX750
أنبوب بروتين LoBind 1.5 ملEppendorf22431081
QSP 10 & L ماصة طرفحراري علميTLR102RS-Q
QSP 300 & L طرف ماصةThermo ScientificTLR106RS-Q
مشرطBard-Parker372615
S-Trap: عينة MS سريعة عالمية الإعداديةPROTIFICO2-mini-40
قارورة SureSTART 0.2 ملThermo Scientific6pk1655
TFASigma-Aldrich102614284
ThermoMixer CEppendorf5382
Trypsin / Lys-C (درجة LC-MS)PromegaV5073
Vanquish NEOThermo Scientific8348249LC
Water (درجة HPLC)HoneywellAH365-4
Xcalibur ver 4.7Thermo Scientific30966MS برنامج الحصول على البيانات
XyleneSigma-Aldrich102033629
مسار

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Van Maldegem, F., et al. Effects of processing delay, formalin fixation, and immunohistochemistry on RNA recovery from formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Diagn Mol Pathol. 17 (1), 51-58 (2008).
  2. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. J Histochem Cytochem. 33 (8), 845-853 (1985).
  3. Fraenkel-Conrat, H., Olcott, H. S. The reaction of formaldehyde with proteins; cross-linking between amino and primary amide or guanidyl groups. J Am Chem Soc. 70 (8), 2673-2684 (1948).
  4. Basyuni, S., et al. Large-scale analysis of whole genome sequencing data from formalin-fixed paraffin-embedded cancer specimens demonstrates preservation of clinical utility. Nat Commun. 15 (1), 7731(2024).
  5. Gracia Villacampa, E., et al. Genome-wide spatial expression profiling in formalin-fixed tissues. Cell Genomics. 1 (3), 100065(2021).
  6. Zhang, X., et al. Characterization of the genomic landscape in large-scale Chinese patients with pancreatic cancer. EBioMedicine. 77, 103897(2022).
  7. Ren, Z., Ordway, B., Lin, P. -H. Archival FFPE blocks: the gift that keeps giving. Innov. 5 (1), 100532(2024).
  8. Magdeldin, S., Yamamoto, T. Toward deciphering proteomes of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues. Proteomics. 12 (7), 1045-1058 (2012).
  9. Soni, R. K. Protocol for deep proteomic profiling of formalin-fixed paraffin-embedded specimens using a spectral library-free approach. STAR Protoc. 4 (3), 102381(2023).
  10. Gustafsson, O. J. R., Arentz, G., Hoffmann, P. Proteomic developments in the analysis of formalin-fixed tissue. Biochim Biophys Acta Proteins Proteomics. 1854 (6), 559-580 (2015).
  11. O'Rourke, M. B., Padula, M. P. Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval. Biotechniques. 60 (5), 229-238 (2016).
  12. Ye, X., et al. Integrated proteomics sample preparation and fractionation: method development and applications. TrAC Trends Anal Chem. 120, 115667(2019).
  13. Nwosu, A. J., et al. In-depth mass spectrometry-based proteomics of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues with a spatial resolution of 50-200 µm. J Proteome Res. 21 (9), 2237-2245 (2022).
  14. Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis. J Pathol. 251 (1), 100-112 (2020).
  15. Makhmut, A., et al. A framework for ultra-low-input spatial tissue proteomics. Cell Syst. 14 (11), 1002-1014.e5 (2023).
  16. Shin, D., et al. Identification of TUBB2A by quantitative proteomic analysis as a novel biomarker for the prediction of distant metastatic breast cancer. Clin Proteomics. 17 (1), 16(2020).
  17. Lee, H., et al. Dual oxidase 2 (DUOX2) as a proteomic biomarker for predicting treatment response to chemoradiation therapy for locally advanced rectal cancer: using high-throughput proteomic analysis and machine learning algorithm. Int J Mol Sci. 23 (21), 12923(2022).
  18. Tüshaus, J., et al. Towards routine proteome profiling of FFPE tissue: insights from a 1,220-case pan-cancer study. EMBO J. 44 (1), 304-329 (2024).
  19. Schweizer, L., et al. Quantitative multiorgan proteomics of fatal COVID-19 uncovers tissue-specific effects beyond inflammation. EMBO Mol Med. 15 (9), e17459(2023).
  20. Kobayashi, G., et al. Proteomic profiling of FFPE specimens: discovery of HNRNPA2/B1 and STT3B as biomarkers for determining formalin fixation durations. J Proteomics. 301, 105196(2024).
  21. Kawashima, Y., et al. Single-shot 10k proteome approach: over 10,000 protein identifications by data-independent acquisition-based single-shot proteomics with ion mobility spectrometry. J Proteome Res. 21 (6), 1418-1427 (2022).
  22. Li, W., et al. Identification and prognostic analysis of biomarkers to predict the progression of pancreatic cancer patients. Mol Med. 28 (1), 43(2022).
  23. Martinelli, P., et al. GATA6 regulates EMT and tumour dissemination, and is a marker of response to adjuvant chemotherapy in pancreatic cancer. Gut. 66 (9), 1665-1676 (2017).
  24. Racu, M. -L., et al. Smad4 positive pancreatic ductal adenocarcinomas are associated with better outcomes in patients receiving FOLFIRINOX-based neoadjuvant therapy. Cancers. 15 (15), 3765(2023).
  25. Roy, L. D., et al. MUC1 enhances invasiveness of pancreatic cancer cells by inducing epithelial to mesenchymal transition. Oncogene. 30 (12), 1449-1459 (2011).
  26. Shi, H., Tsang, Y., Yang, Y. Identification of CEACAM5 as a stemness-related inhibitory immune checkpoint in pancreatic cancer. BMC Cancer. 22 (1), 1291(2022).
  27. Waters, A. M., Der, C. J. KRAS: the critical driver and therapeutic target for pancreatic cancer. Cold Spring Harb Perspect Med. 8 (9), a031435(2018).
  28. Yao, H., et al. Glypican-3 and KRT19 are markers associating with metastasis and poor prognosis of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Biomark. 17 (4), 397-404 (2016).
  29. Zhan, L., Chen, L., Chen, Z. Knockdown of FUT3 disrupts the proliferation, migration, tumorigenesis and TGFβ induced EMT in pancreatic cancer cells. Oncol Lett. 16 (1), 924-930 (2018).
  30. Frohlich, K., Furrer, R., Schori, C., Handschin, C., Schmidt, A. Robust, precise, and deep proteome profiling using a small mass range and narrow window data-independent-acquisition scheme. J Proteome Res. 23 (3), 1028-1038 (2024).
  31. Li, K. W., Gonzalez-Lozano, M. A., Koopmans, F., Smit, A. B. Recent developments in data independent acquisition (DIA) mass spectrometry: application of quantitative analysis of the brain proteome. Front Mol Neurosci. 13, 564446(2020).
  32. Searle, B. C., et al. Chromatogram libraries improve peptide detection and quantification by data independent acquisition mass spectrometry. Nat Commun. 9 (1), 5128(2018).
  33. Prakash, J., Shaked, Y. The interplay between extracellular matrix remodeling and cancer therapeutics. Cancer Discov. 14 (8), 1375-1388 (2024).
  34. Perez, V. M., Kearney, J. F., Yeh, J. J. The PDAC extracellular matrix: a review of the ECM protein composition, tumor cell interaction, and therapeutic strategies. Front Oncol. 11, 751311(2021).
  35. Ferrara, B., et al. The extracellular matrix in pancreatic cancer: description of a complex network and promising therapeutic options. Cancers. 13 (17), 4442(2021).
  36. Weniger, M., Honselmann, K. C., Liss, A. S. The extracellular matrix and pancreatic cancer: a complex relationship. Cancers. 10 (9), 316(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mass Spectrometry ProteomicsFFPE TissueRegion Of InterestSuspension TrappingProtein DigestionPancreatic NeoplasmsData Independent AcquisitionPeptide QuantificationLiquid ChromatographyBioinformatics Analysis

Related Articles