Method Article

توليد وتوصيف الخلايا النجمية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من الإنسان والتي تفتقر إلى البروتين النووي الريبي X messenger الهش

DOI:

10.3791/68081

⸱

June 6th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Centre for High Impact Neuroscience and Translational Applications, TCG Centres for Research and Education in Science and Technology, 2Centre for Brain Development and Repair, 3National Centre for Biological Sciences, Tata Institute for Fundamental Research, 4Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف هنا بروتوكولا يسهل تمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية إلى خلايا نجمية وظيفية خاصة بالدماغ الأمامي. يتيح ذلك إجراء تحقيقات في دور الخلايا الدبقية في التسبب في اضطرابات النمو العصبي ، مثل متلازمة X الهشة ، ونمذجة اضطرابات الدماغ الأخرى.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت دراسة متلازمة X الهشة (FXS) ، وهي سبب وراثي رئيسي لاضطراب طيف التوحد والإعاقة الذهنية ، على نطاق واسع باستخدام نماذج القوارض. في الآونة الأخيرة ، تم أيضا استخدام أنظمة النماذج المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية لاكتساب رؤى ميكانيكية حول الفيزيولوجيا المرضية ل FXS. ومع ذلك ، فقد ركزت هذه الدراسات بشكل حصري تقريبا على الخلايا العصبية. علاوة على ذلك ، على الرغم من الأدلة المتزايدة على الدور الرئيسي للخلايا الدبقية في وظيفة الخلايا العصبية في الصحة والمرض ، لا يعرف سوى القليل عن كيفية تأثر الخلايا النجمية البشرية ب FXS.

لذلك ، في هذه الدراسة ، نجحنا في تطوير بروتوكول يلتقط المعالم الزمانية المكانية الرئيسية لنمو الدماغ ويتوافق مع عملية تكوين الخلايا الدبقية أيضا. يوفر هذا معا إطارا مفيدا لدراسة اضطرابات النمو العصبي. أولا ، قمنا بتصميم الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة عن الإنسان في سلالة الأديم العصبي مع المثبط المزدوج للأمهات ضد تثبيط شلل عشري خماعي (SMAD) والجزيئات الصغيرة. بعد ذلك ، استخدمنا عوامل نمو وسيتوكينات محددة لتوليد التحكم (CTRL) والخلايا السلفية النجمية المشتقة من المريض (APCs). علاج APCs بعامل التغذية العصبية الهدبية ، وهو سيتوكين متمايز ، ينظم ويدفع الخلايا السلفية نحو النضج النجمي ، مما ينتج عنه خلايا نجمية تعبر عن البروتين الليفي الدبقي الخاص بالدماغ الأمامي.

وجدنا أن هذه الخلايا النجمية تعمل ، كما يتضح من استجاباتها للكالسيوم لتطبيق ATP ، وتظهر استقلاب محلل السكر والميتوكوندريا غير منظم في FXS. مجتمعة ، توفر هذه النتائج منصة تجريبية مفيدة من أصل بشري للتحقيق في العواقب المستقلة للخلايا وغير المستقلة للخلايا للتغيرات في الوظيفة النجمية الناجمة عن اضطرابات النمو العصبي.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

متلازمة X الهشة (FXS) ، وهي شكل وراثي شائع من الإعاقة الذهنية واضطراب طيف التوحد (ASD) ، ناتجة عن نقص البروتين النووي الريبي X messenger الهش (FMRP) الذي ينتجه جين البروتين النووي الريبي X messenger 1 (FMR1) الهش (OMIM: # 300624 ، https://www.omim.org/entry/300624). يلعب FMRP دورا في تنظيم ترجمة mRNA ، وتكوين حبيبات mRNA ونقلها ، والتنظيم بوساطة microRNA للتعبير الجيني1. وبالتالي ، فإن فقدان FMRP لا يؤثر فقط على نمو الدماغ ولكن أيضا على وظائف دماغ البالغين. أظهرت مستويات نسخ mRNA ل FMR1 والتلوين المناعي ل FMRP في الدماغ تعبيرا عصبيا عاليا ، إلى جانب التعبير الكبير في الخلايا الدبقية أيضا2. ومع ذلك ، ركزت الغالبية العظمى من الدراسات السابقة في النماذج الحيوانية ل FXS بشكل أساسي على الخلايا العصبية والانحرافات في وظيفتها. وبالتالي ، لا يعرف سوى القليل عن دور الخلايا الدبقية في FXS3. ينظر إليها تقليديا على أنها خلايا "دعم سلبي"4 ، وهناك أدلة متراكمة على أن الخلايا النجمية حاسمة في التوسط في مجموعة واسعة من وظائف الخلايا العصبية5،6 ، بما في ذلك تعزيز تكوين التشابكالعصبي 7 ، وصقل تطوير الدوائر العصبية8 ، وإعادة تدوير الناقلات العصبية9. في موازاة ذلك ، هناك أدلة متزايدة على دور الخلايا النجمية في التسبب في المرض وقد ارتبطت العديد من الحالات العصبية بالخلل الوظيفي النجمي10.

في حين أن الكثير من العمل السابق باستخدام النماذج الحيوانية ل FXS ركز على تحديد والتحقق من صحة الأهداف الجزيئية المختلفة في الخلايا العصبية لعلاج FXS ، فإن هذه النتائج قبل السريرية لم تؤد دائما إلى نتائج سريرية ناجحة. علاوة على ذلك ، تؤكد النكسات في التجارب السريرية الأخيرة أيضا الحاجة إلى أنظمة نموذجية قائمة على الإنسان. تقدم نماذج الاضطرابات العصبية القائمة على خلايا الدماغ المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية استراتيجية قوية لسد هذه الفجوة بين الرؤى الميكانيكية من الدراسات التي أجريت على والنجاح المحدود مع النتائج السريرية للمرضى. ومع ذلك ، فقد ركزت حفنة فقط من هذه الدراسات على الخلايا النجمية وذلك في الغالب على الخلايا النجمية التي كانت في الأصل عمودي. وهذا بدوره مهم في ضوء الدراسات التي تظهر أن بنية ووظيفة الخلايا النجمية تختلف بين مناطق الدماغ11،12. وبالتالي ، فإن الفهم الأفضل للتغيرات الناجمة عن المرض في الخلايا النجمية البشرية يحتاج أيضا إلى مراعاة هذه الاختلافات الخاصة بمنطقة الدماغ في الخلايا النجمية. ومع ذلك ، فإن نماذج اضطرابات النمو العصبي التي تستخدم الخلايا النجمية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية الخاصة بالدماغ الأمامي لا تزال غير مستكشفة نسبيا13. ومن ثم, للبدء في معالجة هذه الفجوات, نصف بروتوكولات لتوليد الخلايا النجمية الخاصة بالدماغ الأمامي من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات المستحثة من قبل المريض (iPSCs) التي تحمل طفرات FXS; علاوة على ذلك ، نظهر أن الخلايا النجمية تعمل وتظهر عملية التمثيل الغذائي المتغيرة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء جميع التجارب باستخدام الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية (hiPSCs) (الجدول 1) بعد الحصول على الموافقات التنظيمية المؤسسية المناسبة. يمثل الشكل 1 أ بروتوكول التمايز الكامل لمركبات الدماغ المائية العالية إلى الخلايا النجمية الناضجة الخاصة بالدماغ الأمامي.

1. صيانة وتوسيع hiPSCs

  1. قبل يوم واحد من طلاء iPSCs, معطف طبق 6 آبار مع 1:60 مخفف Matrigel (مصفوفة خارج الخلية [ECM]) في وسط النسر المعدل Dulbecco المتقدم/F-12 هام (DMEM/F12) وتخزينها في 2-8 درجة مئوية.
    ملاحظة: تجنب تخزين الأطباق المغلفة ب Matrigel لمدة >5 أيام عند 2-8 درجات مئوية ، لأن ذلك قد يتسبب في تدهور البروتين في ECM بمرور الوقت. لتجنب تجفيف الطبق ، قم بتغطية ما لا يقل عن 1 مل من 1:60 Matrigel المخفف لكل بئر واحد من طبق مكون من 6 آبار ووزعها بالتساوي عبر الطبق. إذا كنت تستخدم نفس اليوم ، احتفظ باللوحة في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة ساعة.
  2. في يوم زراعة hiPSCs ، قم بإزالة مادة الطلاء وأضف 1 مل من وسط Essential 8 الكامل (الوسط القاعدي E8 مع مكمل أساسي 8) جنبا إلى جنب مع مثبط ROCK 1x التركيز النهائي واحتفظ بالطبق في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 قبل إضافة hiPSCs.
  3. أعد تعليق hiPSCs في وسط E8 كامل جنبا إلى جنب مع مثبط ROCK بتركيز نهائي 1x لتحسين الالتصاق المستعمرات.
    ملاحظة: لا تحضر كميات كبيرة من وسط الاستزراع. استعد فقط لمدة 3-4 أيام كحد أقصى وخزنها في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية.
  4. في اليوم التالي ، قم بتجديد وسط E8 الكامل بدون مثبط ROCK حتى تتلاقى الخلايا بنسبة 80٪ (حوالي 4-5 أيام).
  5. عندما تصل إلى 80٪ من التقاء ، افصل المستعمرات إنزيميا.
    1. لتمرير iPSCs, إزالة الوسائط المستهلكة من الطبق وإضافة 1 مل لكل بئر من التدفئة المسبقة (37 درجة مئوية) خليط من الكولاجيناز (2 ملغ/مل) وتباين (1 ملغ/مل) بنسبة 1:1 واحتضان عند 37 درجة مئوية لأكثر من 20-30 دقيقة للسماح لمستعمرات iPSC لرفع.
      ملاحظة: لا تترك الأطباق عند 37 درجة مئوية لأكثر من 20-30 دقيقة ؛ بعد هذه الفترة ، سوف تتفكك المستعمرات وتموت الخلايا.
  6. عندما تبدأ المستعمرات في الرفع ، أخرج الأطباق من الحاضنة وقم بتحييد نشاط الإنزيم عن طريق إضافة 2 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) من Dulbecco.
  7. اكشط المستعمرات باستخدام DPBS واجمع المعلق في أنبوب مخروطي سعة 15 مل باستخدام ماصة مصلية عريضة التجويف سعة 10 مل.
  8. قم بتقطيع المعلق برفق 2-3x لتفتيت المستعمرات باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل ، واترك المستعمرات تستقر.
    ملاحظة: لا تجعل المستعمرات في خلايا مفردة. قد يؤدي ذلك إلى عدم التصاق الخلايا بالطبق ويسبب المزيد من موت الخلايا. علاوة على ذلك ، لا تتركهم كمستعمرات كبيرة. سيؤدي هذا إلى مستعمرات أكثر تمايزا لاحقا.
  9. بمجرد أن تستقر المستعمرات (بعد دقيقتين تقريبا) ، قم بشفط خليط إنزيم DPBS مع ترك ما يقرب من 1 مل في الأنبوب.
  10. أضف 2 مل من DPBS إلى الأنبوب ، واخلط المستعمرات عن طريق النقر ، واتركها تستقر. كرر هذا 2x لإزالة كل الإنزيم المتبقي من المستعمرات. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المادة الطافيةبعد الغسيل الثاني ، وأعد تعليق المستعمرات في 1 مل من E8 Medium الكامل ، وقم بوضعها في طبق طازج كما هو مذكور في الخطوات 1.2-1.3.
  11. بدلا من ذلك ، الحفاظ على نسبة من المستعمرات بالتبريد باستخدام 10٪ من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) كمحلول تجميد للتوسع والاستخدام في المستقبل.
    1. قم بإعداد وسط الحفظ بالتبريد طازجا عن طريق خلط 90٪ من E8 المتوسط الكامل و 10٪ DMSO كمحلول تجميد ووضعه في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  12. للحفظ بالتبريد، اتبع الخطوات 1.5-1.10.
  13. خلال الخطوة 1.10 ،بعد الغسيل الثاني ، اسمح للمستعمرات بالاستقرار وإزالة المادة الطافية. أضف إلى المستعمرات 1 مل من وسط الحفظ بالتبريد الطازج وانقله إلى المبردات.
    ملاحظة: بعد إضافة وسيط الحفظ بالتبريد إلى المستعمرات ، انقل المحتويات بسرعة إلى cryovials. قد يؤدي التأخير إلى انخفاض معدل الإحياء لأن DMSO هو مادة حاصلة بالتبريد يمكن أن تلحق الضرر بالخلايا.
  14. انقل المبردات على الفور إلى صندوق التبريد واحتفظ بها في فريزر -80 درجة مئوية طوال الليل.
  15. في اليوم التالي ، قم بتحويل جميع المواد المبردة إلى خزان النيتروجين السائل (خزان LN2 ) لاستخدامها في المستقبل.
    ملاحظة: يجب أن يتم تنميط الخلايا العصبية العليا بشكل روتيني باستخدام G-banding (الشكل التكميلي S1) لأي تشوهات ، تتميز باستخدام كيمياء الخلايا المناعية لتعدد القدرات (الشكل 1 ب) ، واختبارها بحثا عن الميكوبلازما.
    1. لتوصيف hiPSCs باستخدام الكيمياء الخلوية المناعية ، قم بلوحة المستعمرات على 1:60 مغلفة ب Matrigel ، وأغطية زجاجية مقاس 13 مم. بمجرد أن تصبح 40٪ ملتقية ، اغسل الخلايا باستخدام PBS-T (PBS-0.1٪ Tween 20) ، وثبتها بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 10 دقائق ، وتخلل 0.3٪ Triton X-100 في PBS لمدة 10 دقائق ، وقم بحظر ألبومين مصل الأبقار بنسبة 3٪ (BSA) في PBS لمدة ساعة واحدة لمنع الارتباط غير المحدد.
    2. بعد الحظر ، احتضن الثقافات بالأجسام المضادة الأولية لمدة ساعة واحدة ثم اغسل 3x باستخدام PBS-T لمدة 5 دقائق لكل منها ، متبوعة بالأجسام المضادة الثانوية المقابلة (جدول المواد) في الظلام لمدة 1 ساعة.
    3. قم بتركيب الأغطية على شرائح زجاجية ذات وسيط تثبيت واحصل على صور عن طريق المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر عند 405 نانومتر و 488 نانومتر و 561 نانومتر و 633 نانومتر. التقاط الصور بدقة 512 × 512 بكسل ؛ اضبط حجم خطوة Z على 0.5 ميكرومتر مع وحدة واحدة جيدة التهوية بقطر الثقب.

2. توليد وتوصيف الخلايا السلفية النجمية (APCs)

  1. ارفع hiPSCs إنزيميا كما هو مذكور في الخطوات 1.5-1.10 وقم بوضعها على طبق ثقافة معلق غير ملتصق (100 مم) مع وسط محددكيميائيا 14 يحتوي على 50٪ من Iscove's Dulbecco's Medium (IMDM) ، و 50٪ من مزيج المغذيات F-12 من لحم الخنزير (F12) ، و 5 مجم / مل BSA ، و 1٪ مركز دهني محدد كيميائيا (CD-Lipid) ، 450 ميكرومتر أحادي الجلسرين ، 7 ميكروغرام / مل أنسولين ، 15 ميكروغرام / مل ترانسفيرين ، 1٪ بنسلين ستربتومايسين مكمل بميتوجينات نمط الدماغ الأمامي N-acetyl Cysteine (1 ملليمتر) ، LDN 193189 (0.1 ميكرومتر) ، و SB431542 (10 ميكرومتر) لمدة 7 أيام.
    ملاحظة: مثبطات الجزيئات الصغيرة SB431542 و LDN-193189 (LDN) هي مثبطات للبروتين المورفولوجي للعظام وتحويل مسارات إشارات عامل النمو بيتا.
    من هذه النقطة فصاعدا ، تم تجديد الوسيط مرة واحدة كل يومين أو باتباع بروتوكول الاثنين / الأربعاء / الجمعة.
  2. ضع تعليق الخلية على شاكر مداري عند 40 دورة في الدقيقة لمدة 7 أيام في ظل ظروف طبيعية للمساعدة في تطوير القشرة القشرية (الشكل 1 أ).
  3. في اليوم 8 ، انقل القشرة إلى وسط تكاثر الخلايا يحتوي على DMEM / F12 المتقدم مع 1٪ مضاد حيوي ومضاد للفطريات ، ومكملات N2 ٪ ، وبديل جلوتامين 1٪ ، ومكملات B27 بنسبة 0.1٪ ، وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) لمدة 7 أيام.
  4. حث المجالات على المواصفات الدبقية عن طريق إخضاعها لوسط تخصيب الدبقي الذي يحتوي على DMEM / F12 المتقدم مع 1٪ مضاد حيوي مضاد للفطريات ، 1٪ N2 ، 1٪ بديل الجلوتامين ، 0.1٪ مكمل B27 ، 20 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة (EGF) ، bFGF-H (20 نانوغرام / مل bFGF-5 مجم / مل من الهيبارين) لمدة أسبوعين للحصول على الغلاف الدبقي المبكر (الشكل 1 أ).
  5. لنضج الغلاف الدبقي المبكر ، استبدل bFGF-H بعامل مثبط لسرطان الدم 20 نانوغرام / مل (LIF) وحافظ على الكرات لمدة 4 أسابيع.
  6. بعد 4 أسابيع في وسط النضج ، حافظ على الكرات في وسط التخصيب الدبقي لفترات طويلة. لمنع التراكم وفقدان الجدوى ، كل أسبوعين ، قم بتقطيع الغلاف الدبقي ميكانيكيا باستخدام شفرة صناعية معقمة واستبدل الوسط بأكمله ب DNase I لإزالة شظايا الحمض النووي المتولدة عن التقطيع.
  7. قم بفصل الغلاف الدبقي إلى طبقات أحادية من ناقلات الجنود المدرعة باستخدام مجموعة تفكك غراء ولوحة على طبق ملتصق معالج بزراعة الخلايا مع تخفيف 1:80 من طلاء Matrigel.
  8. قم بنشر APCs في وسط تخصيب الدبقي حتى 80٪ من التقاء وتمريرها إنزيميا باستخدام وسط انفصال خلية الإنزيم (انظر جدول المواد).
  9. لتمرير:
    1. قم بإزالة الوسائط المستهلكة وجمعها في أنبوب مخروطي الشكل. إلى الخلايا ، أضف وسط انفصال خلية الإنزيم وانتظر لمدة 1-2 دقيقة. بمجرد أن تبدأ الخلايا في الانفصال ، أضف الوسائط المستهلكة لتحييد نشاط الإنزيم.
    2. اجمع تعليق الخلية وجهاز الطرد المركزي عند 800 × ɡ لمدة دقيقتين.
    3. استنشق المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في وسط التخصيب الدبقي ، وقم بوضع ما يقرب من 1 × 106 خلايا / بئر على طبق 6 آبار مطلي ب 1:80.
  10. للحفظ بالتبريد:
    1. أعد تعليق الخلايا في خليط بارد من وسط تكاثر القشرة القشرية بنسبة 90٪ (بدون bFGF) و 10٪ من المواد المبردة. نقل الخلايا المعلقة إلى cryovials.
    2. انقل المبردات على الفور إلى صندوق التبريد واحتفظ بها في فريزر -80 درجة مئوية طوال الليل.
    3. في اليوم التالي ، قم بتحويل جميع المواد المبردة إلى خزان النيتروجين السائل (خزان LN2 ) لاستخدامها في المستقبل.
      ملاحظة: تم حفظ نادرات الجنود المدرعة بالتبريد باستخدام 10٪ DMSO حتى المقطع رقم 6.
  11. قم بتمييز APCs المنفصلة عن طريق التلوين المناعي (كما هو مذكور في الخطوات 1.15.1-1.15.3) بعلامات vimentin و Nuclear Factor IA (NFIA) (الشكل 1C ، D) (انظر جدول المواد للتخفيفات).
  12. لتأكيد الخصوصية الإقليمية للدماغ الأمامي لناقلات الجنود المدرعة المشتقة من hiPSC ، اختبر الخلايا بحثا عن علامة الدماغ الأمامي مثل صندوق الشوكة البشري G1 (hFOXG1) (إيجابي) وعلامة الدماغ الخلفي مثل Homeobox B4 البشري (hHOXB4) (سلبي) باستخدام qPCR في الوقت الفعلي (الشكل 1E ، F).
    ملاحظة: تم إدراج التسلسلات التمهيدية المستخدمة في هذه التجارب في الجدول التكميلي S1.

3. توليد وتوصيف مجموعة متجانسة من الخلايا النجمية الخاصة بالدماغ الأمامي

  1. تمايز الخلايا النجمية عن الخلايا النادرة المدرعة
    1. استخدم وسط التمايز النجمي (ADM) لمدة 14 يوما للتمييز بين الخلايا النادرة المدرعة إلى خلايا نجمية. يحتوي وسط التمايز النجمي على Neurobasal ، و 1٪ مضاد حيوي - مضاد للفطريات ، و 1٪ بديل جلوتامين ، و 1٪ مكمل N2 ، و 0.2٪ مكمل B27 ، و 1٪ وسط من الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) ، و 10 نانوغرام / مل عامل التغذية العصبية الهدبي (CNTF).
    2. تأكد من الهوية النجمية باستخدام التلوين المناعي (كما هو مذكور في الخطوات 1.15.1-1.15.3.) مع البروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) وعلامات التعبير S100β (الشكل 2 أ ، ب).
  2. تخليق البروتين De novo في APCs والخلايا النجمية
    1. حافظ على ناقلات الجنود المدرعة والنجمية المشتقة من hiPSC على أغطية زجاجية معقمة مقاس 13 مم وقم بتلطيخها كما هو مذكور في الخطوات 1.15.1-1.15.3.
    2. لتخليق البروتين من جديد ، استخدم طريقة وضع العلامات على الأحماض الأمينية غير الفلورية غير الكنسية (FUNCAT) ، الموضحة بإيجاز في الخطوات 3.2.3-3.2.6 (الشكل 3 أ).
    3. لضمان نقص الميثيونين ، قم بإزالة وسط النمو من المزارع واستبدلها بوسط خال من الميثيونين والسيستين ممزوجا ب 1 ملي مولار L-azidohomoalanine (AHA) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    4. اغسل الثقافات باستخدام PBS-T ، وثبتها بنسبة 4٪ بارافورمالدهايد لمدة 10 دقائق ، وتخلل 0.3٪ Triton X-100 في PBS لمدة 10 دقائق ، وقم بكتلة 3٪ BSA في PBS لمدة ساعة واحدة لمنع الارتباط غير المحدد.
    5. احتضان الثقافات في الظلام لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة باستخدام مزيج تفاعل كيمياء الخلية Click و Alkyne Alexa Fluor 647 ، متبوعا بالأجسام المضادة الأولية لمدة ساعة واحدة والأجسام المضادة الثانوية المقابلة (جدول المواد) لمدة ساعة واحدة (الشكل 3 ب).
    6. قم بتركيب الغطاء على شرائح زجاجية مع وسيط تركيب واستخدمه لمزيد من تحليل الصورة.
      1. احصل على الصور عن طريق المسح بالليزر متحد البؤر عند 405 نانومتر و 488 نانومتر و 561 نانومتر و 633 نانومتر.
      2. التقاط الصور بدقة 512 × 512 بكسل ؛ اضبط حجم خطوة Z على 0.5 ميكرومتر مع وحدة واحدة جيدة التهوية بقطر الثقب.
      3. حافظ على معلمات الفحص المجهري والتصوير في إعداد ثابت عبر أنواع الخلايا. التقط صورا لكل نسخة مكررة بيولوجية في نفس الجلسة.
      4. قم بإجراء قياسات الشدة باستخدام أي برنامج قياسي لتحليل الصور (على سبيل المثال ، فيجي أو إيماريس). في Imaris ، استخدم وحدة SURFACES لإنتاج قياسات حجمية لأجسام الخلايا إيجابية لإشارة وضع العلامات على الأحماض الأمينية غير الفلورية (FUNCAT) مع Vimentin (APCs) و GFAP (الخلايا النجمية) التي تحد من نطاق voxel (250-350) لإزالة الحطام.
        ملاحظة: الحفاظ على المعلمات عبر جميع التكرارات البيولوجية لكلا النوعين من الخلايا.
  3. الأدينوزين 5′-ثلاثي الفوسفات (ATP) موجات الكالسيوم التذبذبية الناجمة عن
    1. صفيحة الخلايا النجمية على طبق زجاجي القاع (35 مم) عند 5 × 103 خلايا / طبق لقياس الاستجابة الخلوية ل ATP.
    2. اسمح للخلايا بالالتصاق بالقاع الزجاجي لمدة 24 ساعة ، واغسلها 3 مرات باستخدام HBSS (20 ملي مولار HEPES ، 137 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي مولار KCl ، 10 ملي جلوكوز ، 1 ملي مولار MgCl2 ، الرقم الهيدروجيني = 7.3) بدون الكالسيوم ، واحتضن في وسط الاستزراع بنسبة 5 ميكرومتر صبغة مترية Fura-2AM و 0.02٪ Pluronics F127 لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: Fura-2AM مادة كيميائية حساسة للضوء ودرجة الحرارة. يخزن في -20 درجة مئوية.
    3. بعد الحضانة ، اغسل 2x بوسط الاستزراع واستبدله ب 2 ملي مولار Ca2+ يحتوي على HBSS وقم بتصوير الخلايا بسرعة 2 إطارا في الثانية باستخدام هدف زيت 60x (1.35 NA) في مجهر مقلوب يعوض الانجراف بتركيز.
    4. سجل استجابات الكالسيوم التي يسببها ATP عن طريق تطبيق حمام ATP عند التركيز النهائي البالغ 5 ملي مولار عند 25ثانية (الشكل 4 أ).
    5. ارسم مناطق الاهتمام حول كل خلية باستخدام Fiji / ImageJ واحسب نسبة F340 / F380 عبر جميع النقاط الزمنية (الشكل 4 ب).
  4. فحوصات التمثيل الغذائي للخلايا
    ملاحظة: تم قياس معدل استهلاك الأكسجين (OCR) ومعدل التحمض خارج الخلية (ECAR) للخلايا الحية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
    1. قبل يوم واحد من الفحص ، اسمح للخلايا النجمية بالالتصاق بالصفيحة الدقيقة (1.5 × 104 كثافة البذر) في وسط CNTF وتحتضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
    2. لفحص إجهاد تحلل السكر:
      1. استبدل وسط زراعة الخلية بوسط أساسي مكمل ب 2 ملي مولار من الجلوتامين (تم تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7.4) واحتضانه في غرفة غير ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
        ملاحظة: يجب ضبط الرقم الهيدروجيني في حمام مائي 37 درجة مئوية.
      2. أدخل لوحة الخرطوشة في الجهاز لمعايرة المستشعر. بعد المعايرة ، استبدل لوحة الخرطوشة بلوحة زراعة الخلية بتركيز نهائي لمكونات المجموعة التالية: 10 ملي مولار جلوكوز ، 1 ميكرومتر أوليغومايسين ، و 50 ملي مولار 2-ديوكسي جلوكوز (2-DG) (الشكل 5 أ).
      3. في نهاية الاختبار ، قم بتحليل الخلايا وتقدير محتوى البروتين الكلي.
    3. لاختبار إجهاد الميتوكوندريا:
      1. يستبدل وسط CNTF بوسط أساسي مكمل ب 2 ملي مولار من الجلوتامين ، 1 ملي مولار بيروفات ، 10 ملي مولار جلوكوز (درجة الحموضة المعدلة إلى 7.4) في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
      2. احتضان اللوحة في غرفة غير CO2 عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. في هذه الأثناء ، أدخل لوحة الخرطوشة في الجهاز لمعايرة المستشعر.
      3. بعد المعايرة ، استبدل لوحة الخرطوشة بلوحة زراعة الخلية بتركيز نهائي لمكونات المجموعة التالية: 1.5 ميكرومتر أوليغومايسين ، 1 ميكرومتر كربونيل سيانيد -4 (ثلاثي فلوروميثوكسي) فينيل هيدرازون (FCCP) ، و 0.5 ميكرومتر روتينون / أنتيمايسين أ (الشكل 5 ج).
      4. في نهاية الاختبار ، قم بتحليل الخلايا وتقدير محتوى البروتين الكلي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحفاظ على مستعمرات الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية (hiPSC) باستخدام وسيط محدد متاح تجاريا ومنعي لعلامات متعددة القدرات ، Oct4 و Nanog (الشكل 1 ب). أظهرت مجدرات الجنود المدرعة FXS و CTRL نسبا عالية التخصيب للخلايا الإيجابية للمناعة للفيمنتين والخلايا غير الطبيعية (الشكل 1 ج ، د). وجدنا أن APCs المشتقة من hiPSCs الصحية و FXS أظهرت تنظيما كبيرا ل FOXG1 مقارنة ب HOXB4 (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نصف طريقة لتوليد الخلايا النجمية البشرية المشتقة من iPSC والتي تعمل كمنصة فحص لتوصيف التغييرات الوظيفية التي يسببها FXS. هذه الخلايا النجمية قابلة للحياة وظيفيا في الثقافة وتظهر خصائص مختلفة ، كما يتضح من مجموعة من القياسات التي أجريت في هذه الدراسة. خطوة حاسمة في هذا البروتوكول هي التحويل الأولي ل iPSCs إلى الغلاف الجوي باستخدام طريقة الرفع الأنزيمية. في هذه المرحلة ، يعد تحسين وقت الحضانة للكولاجيناز من النوع الرابع والتباين أمرا بالغ الأهمية. إذا لم يتم تحسين ذلك, قد يتسبب ذلك ف...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر البروفيسور سومانترا تشاتارجي على الأموال الداخلية. نشكر البروفيسور جايتي حسن على الوصول إلى إعداد تصوير الكالسيوم ، ومرفق التصوير والتدفق المركزي - المركز الوطني للعلوم البيولوجية ، وبادماناب سينغ وبرانگیا هوتا للتدقيق اللغوي والاقتراحات ، وفريق Labmate Asia لمساعدتهم في إجراء فحوصات Seahorse XF.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1-ثيوجليسريلسيجما-ألدريتشM6145
أكوتا   ؛ حلSigma-AldrichA6964إنزيم انفصال الخلايا المتوسطة 
ملح الأدينوزين 5 وبرايم ثلاثي الفوسفات المغنيسيومسيجما ألدريتشA9187
Advanced DMEM / F-12ThermoFisher Scientific12634010
المضاد الحيوي ومضاد للفطريات (100x)مكمل ThermoFisher Scientific15240062
B-27 (50x) ، خال من المصلThermoFisherScientific 17504044
ألبومينمصل الأبقارSigma-AldrichA9418
الدهون المحدد كيميائياThermoFisher Scientific11905031
كولاجيناز ، النوع الرابع ، مسحوقThermoFisher Scientific17104019
Deoxyribonuclease IWorthington Biochemical CorporationLK003170
ثنائي ميثيل سلفوكسيدسيجما ألدريتشD2650
Dispase II ، مسحوقThermoFisher Scientific17105041
DPBS ، خال من الكالسيوم ، خال من المغنيسيومThermoFisher Scientific14190144
Essential 8Medium ThermoFisher ScientificA1517001
FXS1 ، FXS2 & nbsp ؛معهد كوريل للبحوث الطبية GM07072 ، GM05848خلايا مريض FXS
مكمل GlutaMAXThermoFisher Scientific35050061بديل الجلوتامين
Ham's F-12 NutrientMix ThermoFisher Scientific11765054
Healthy Control Cells مركز سيدارز سيناي الطبي ND30625خلايا تحكم صحية   ؛
ملح الصوديوم الهيبارين من الغشاء المخاطي المعوي للخنازيرSigma-AldrichH3149
IMDMThermoFisher Scientific12440053
الأنسولين ، Rocheالبشري 11376497001
LDN 193189  ؛Stratech ScientificS2618-SEL
مثبط لسرطان الدم البشريسيجما-ألدريتشL5283
ماتريجل & nbsp ؛ مصفوفة غشاء القاعدة المخفضة لعامل النمو (GFRCorning354230
MEM محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية (100x)ThermoFisherScientific 11140050
Mouse FGF-basic (FGF-2 / bFGF) البروتين المؤتلفPeprotech450-33
حاوية التجميد السيد فروستيThermoFisher Scientific5100-0001cryobox
N-2 Supplement (100x)ThermoFisherScientific 17502048
N-Acetyl-L-cysteineSigma-AldrichA9165
Neurobasal mediumThermoFisherScientific 21103049
Nunc البنوك الحيوية وزراعة الخلايا الأنابيب المبردةThermoFisher Scientific377267
Nunc Cell Culture المعالجة 6 أطباق جيدةThermoFisher Scientific140675
نظام تفكك غراءشركة ورثينجتون للكيمياء الحيويةLK003150
البنسلين الستربتومايسينثيرموفيشر العلمي15140122
المؤتلف البشري CNTF البروتين ، CF & nbsp ؛R & D Systems257-NT-010
بروتين EGF البشري المؤتلف ، CFR & D Systems236-EG-01M
RevitaCell Supplement (100x)ThermoFisher ScientificA2644501
SB431542Tocris1614
Seahorse XFe24 Analyzer Agilent Technologies
Seahorse XF Cell Mito Stress TestKit Agilent Technologies103015-100
XF طقم اختبار إجهاد تحلل السكرAgilent Technologies103020-100
أطباق زراعة الأنسجة - 100 سمBiostar LifetechTCD000100
TransferrinRoche10652202001
VWR Razor شفراتVWR الدولية55411-050
Antibodies  < / قوي >
<قوي > الجسم المضاد الأساسي < / قوي >< قوي > الشركة < / قوي >< قوي > رقم الكتالوج < / قوي >< قوي > تخفيفه < / قوي>
أكتوبر 4 (C-10)سانتا كروز للتكنولوجيا الحيويةsc-5279التخفيف: 1: 250
الجسم المضاد الثانوي: الماعز المضاد للفأر IgG ، Alexa Fluor 568
NanogR & amp D SystemsAF1997التخفيف: 1: 100
الجسم المضاد الثانوي: الحمار المضاد للماعز IgG ، Alexa Fluor 488
VimentinAbcamAb5733التخفيف: 1: 500
الجسم المضاد الثانوي: الماعز المضاد للدجاج IgY ، Alexa Fluor 488
NFIAAbcamAb41851التخفيف: 1: 500
الجسم المضاد الثانوي: الماعز المضاد للأرانب IgG ، Alexa Fluor 568
GFAP-cy3SigmaC9205التخفيف: 1: 500
الجسم المضاد الثانوي: NA
GFAPDAKOZ0334التخفيف: 1: 500
الجسم المضاد الثانوي: الماعز المضاد للأرانب IgG ، Alexa Fluor 568
S100 & beta ؛DAKOIR504: 1: 500
الجسم المضاد الثانوي: الماعز المضاد للأرانب IgG ، Alexa Fluor 488
الجسم المضاد المضاد للنوى ، استنساخ 235-1Merck MilliporeMAB1281التخفيف: 1: 1000
الجسم المضاد الثانوي: الماعز المضاد للفأر IgG1 ، Alexa Fluor 555
< قوي > الأجسام المضادة الثانوية   ؛ < / قوي >< قوي > تخفيفه < / قوي >
الماعز المضاد للفأر IgG ، Alexa Fluor 568Thermo Fisher Scientific   ؛A110041: 1000
الحمار المضاد للماعز IgG ، Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific   ؛A110551: 1000
الماعز المضادة للدجاج IgY ، Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific   ؛A110391:1000
الماعز المضادة للأرانب IgG ، Alexa Fluor 568Thermo Fisher Scientific   ؛A110111: 1000
الماعز المضادة للأرانب IgG ، Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific   ؛A110341: 1000
الماعز المضادة للفأر IgG1 ، Alexa Fluor 555Thermo Fisher Scientific   ؛أ211271:1000
مركز عامل ) Seahorse تخفيف

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Santoro, M. R., Bray, S. M., Warren, S. T. Molecular of fragile X syndrome: A twenty-year perspective. Annu Rev Pathol. 7, 219-245 (2012).
  2. Wang, H., et al. Developmentally-programmed FMRP expression in oligodendrocytes: A potential role of FMRP in regulating translation in oligodendroglia progenitors. Hum Mol Genet. 13 (1), 79-89 (2004).
  3. Pacey, L. K. K., Doering, L. C. Developmental expression of FMRP in the astrocyte lineage: Implications for fragile X syndrome. Glia. 55 (15), 1601-1609 (2007).
  4. Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
  5. Allen, N. J., Barres, B. A. Neuroscience: Glia - more than just brain glue. Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).
  6. Khakh, B. S., McCarthy, K. D. Astrocyte calcium signaling: From observations to functions and the challenges therein. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (4), a020404(2015).
  7. Allen, N. J., et al. Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors. Nature. 486 (7403), 410-414 (2012).
  8. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  9. Rothstein, J. D., et al. Knockout of glutamate transporters reveals a major role for astroglial transport in excitotoxicity and clearance of glutamate. Neuron. 16 (3), 675-686 (1996).
  10. Almad, A., Maragakis, N. J. A stocked toolbox for understanding the role of astrocytes in disease. Nat Rev Neurol. 14 (6), 351-362 (2018).
  11. Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: An underappreciated topic in neurobiology. Curr Opin Neurobiol. 20 (5), 588-594 (2010).
  12. Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neurosci. 14 (5), 311-321 (2013).
  13. Bradley, R. A., et al. Regionally specified human pluripotent stem cell-derived astrocytes exhibit different molecular signatures and functional properties. Development. 146 (13), dev170910(2019).
  14. Das Sharma, S., et al. Astrocytes mediate cell non-autonomous correction of aberrant firing in human FXS neurons. Cell Rep. 42 (4), 112344(2023).
  15. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
  16. Hu, X., et al. The JAK/STAT signaling pathway: from bench to clinic. Sig Transduct Target Ther. 6, 402(2021).
  17. Baser, A., et al. Onset of differentiation is post-transcriptionally controlled in adult neural stem cells. Nature. 566 (7742), 100-104 (2019).
  18. Pal, R., Bhattacharya, A. Modelling protein synthesis as a biomarker in fragile x syndrome patient-derived cells. Brain Sci. 9 (3), 1-12 (2019).
  19. Gross, C., Bassell, G. J. Excess protein synthesis in FXS patient lymphoblastoid cells can be rescued with a p110β-selective inhibitor. J Mol Med. 18 (3), 336-345 (2012).
  20. Kumari, D., et al. Identification of fragile X syndrome specific molecular markers in human fibroblasts: A useful model to test the efficacy of therapeutic drugs. Hum Mutat. 35 (12), 1485-1494 (2014).
  21. Jacquemont, S., et al. Protein synthesis levels are increased in a subset of individuals with fragile X syndrome. Hum Mol Genet. 27 (12), 2039-2051 (2018).
  22. Bowser, D. N., Khakh, B. S. ATP excites interneurons and astrocytes to increase synaptic inhibition in neuronal networks. J Neurosci. 24 (39), 8606-8620 (2004).
  23. Schmunk, G., Boubion, B. J., Smith, I. F., Parker, I., Gargus, J. J. Shared functional defect in IP3R-mediated calcium signaling in diverse monogenic autism syndromes. Transl Psychiatry. 5 (9), e643-e710 (2015).
  24. Peteri, U. K., et al. Generation of the human pluripotent stem-cell-derived astrocyte model with forebrain identity. Brain Sci. 11 (2), 209(2021).
  25. Alvarez-Mora, M. I., et al. Impaired mitochondrial function and dynamics in the pathogenesis of FXTAS. Mol Neurobiol. 54 (9), 6896-6902 (2017).
  26. Giulivi, C., et al. Mitochondrial dysfunction in autism. JAMA. 304 (21), 2389-2396 (2010).
  27. Anitha, A., et al. Brain region-specific altered expression and association of mitochondria-related genes in autism. Mol Autism. 3 (1), 12(2012).
  28. Teves, J. M. Y., et al. Parkinson's disease skin fibroblasts display signature alterations in growth, redox homeostasis, mitochondrial function, and autophagy. Front Neurosci. 11, 737(2018).
  29. Yao, J., et al. Mitochondrial bioenergetic deficit precedes Alzheimer's pathology in female mouse model of Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (34), 14670-14675 (2009).
  30. Sonntag, K. C., et al. Late-onset Alzheimer's disease is associated with inherent changes in bioenergetics profiles. Sci Rep. 7 (1), 14038(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fragile X SyndromeInduced Pluripotent Stem CellsAstrocyte Progenitor CellsAstrocyte DifferentiationGlial Enrichment MediumCalcium ImagingGlycolytic MetabolismMitochondrial RespirationImmunostaining MarkersNeurodevelopmental Disorders

Related Articles