آثار الشيكونين على مسار إشارات HIF-1α / VEGF في الفئران المصابة بإصابة الرئة الحادة الناجمة عن الإنتان

Laizan Zheng; Xiyi Hu

doi:10.3791/68085

يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

آثار الشيكونين على مسار إشارات HIF-1α / VEGF في الفئران المصابة بإصابة الرئة الحادة الناجمة عن الإنتان

530 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68085

⸱

يونيو 6, 2025

Laizan Zheng¹ , Xiyi Hu¹

¹The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University

في هذه المقالة

ملخص

يهدف البروتوكول إلى تقييم فعالية الشيكونين في التخفيف من إصابات الرئة الحادة الناجمة عن الإنتان في الفئران. من خلال استهداف مسار HIF-1α / VEGF ، تبحث الدراسة في كيفية تأثير الجرعات المختلفة من الشيكونين على معدلات البقاء على قيد الحياة ، وأمراض الرئة ، والتعبير عن علامات الالتهابات ، مما يسلط الضوء على فوائده العلاجية المحتملة.

الملخص

غالبا ما يسبب الإنتان إصابة الرئة الحادة (ALI) ، وهي مضاعفات عالية الوفيات. يلعب مسار HIF-1α / VEGF دورا رئيسيا في الإنتان ، وقد يخفف الشيكونين ، وهو مركب طبيعي له خصائص مضادة للالتهابات ، من إصابة الرئة من خلال استهداف هذا المسار. تم تقسيم فئران Balb / c بشكل عشوائي إلى أربع مجموعات: مجموعة الوهم ، والمجموعة النموذجية ، ومجموعة العلاج بجرعة منخفضة ، ومجموعة العلاج بجرعات عالية. خضعت المجموعة الوهمية لبضع البطن بدون ربط الرأس والثقب (CLP) ، بينما خضعت المجموعة النموذجية لعملية CLP للحث على إصابة رئوية حادة مرتبطة بالإنتان. وبعد النمذجة، تلقت مجموعات المعالجة ذات الجرعة المنخفضة والجرعة العالية الشيكونين عن طريق التزقيم بجرعات 12.5 ملغم/كغ و50 ملغم/كغ، على التوالي، مرة واحدة يوميا لمدة 14 يوما. تمت مراقبة معدل بقاء الفئران لمدة 7 أيام. تم استخدام تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوزين (HE) لتقييم أمراض أنسجة الرئة ، وتم قياس نسبة الوزن الرطب / الجاف في الرئة (W / D) ، وتم إجراء لطخة غربية للكشف عن التعبير عن HIF-1α و VEGF و TNF-α و IL-6 في أنسجة الرئة. أدى الشيكونين إلى تحسين معدل بقاء الفئران الإنتانية بشكل كبير ، مع أكبر تأثير لوحظ في مجموعة الجرعات العالية (ص < 0.05). بالمقارنة مع المجموعة النموذجية ، انخفضت نسبة W / D في الرئة وتلف الأنسجة في المجموعات المعالجة بالشيكونين بشكل ملحوظ بطريقة تعتمد على الجرعة. بالإضافة إلى ذلك ، قلل الشيكونين بشكل كبير من التعبير عن HIF-1α و VEGF و TNF-α و IL-6 ، حيث أظهرت مجموعة الجرعات العالية الانخفاض الأكثر وضوحا (ص < 0.05). يخفف الشيكونين من إصابة الرئة الحادة في الفئران الإنتانية ، وربما عن طريق تثبيط التعبير عن HIF-1α وتقليل إنتاج العوامل الالتهابية ذات الصلة.

المقدمة

الإنتان هو استجابة التهابية جهازية شديدة تسببها العدوى. ¹ غالبا ما يؤدي إلى خلل وظيفي في أعضاء متعددة ويمكن أن يصبح مهددا للحياة مع تقدم الحالة. ² على الرغم من استخدام العلاجات مثل التهوية الميكانيكية والرعاية الداعمة، لا تزال معدلات الوفيات الناجمة عن ALI المرتبط بالإنتان مرتفعة، حيث تصل إلى 30٪ -40٪³. تعالج هذه العلاجات بشكل أساسي الأعراض بدلا من الأسباب الكامنة ، مما يحد من فعاليتها بشكل عام. لذلك ، فإن تحديد الأساليب العلاجية الجديدة التي تستهدف أسباب إصابة الرئة يمكن أن يحسن بشكل كبير نتائج المرضى في الإنتان.

حددت الدراسات الحديثة العامل المحفز لنقص الأكسجة -1α (HIF-1α) كمنظم حاسم في تطور ALI^{الناجم عن الإنتان 4}^،⁵. يتراكم HIF-1α في أنسجة الرئة أثناء الإنتان ، مما يؤدي إلى التعبير عن الجينات النهائية التي تؤدي إلى تفاقم الالتهاب وتلف الأنسجة⁶. تساهم هذه العملية بشكل كبير في تفاقم إصابة الرئة. لذلك ، فإن استهداف مسار إشارات HIF-1α يوفر نهجا واعدا للتخفيف من الاستجابات الالتهابية ونقص الأكسجين التي تظهر في ALI الناجم عن تعفن الدم.

في البحث عن علاجات أكثر فعالية ، قدم الطب الصيني التقليدي (TCM) رؤى قيمة⁷^،⁸. الشيكونين هو مركب أنثراكينون مستخرج من Lithospermum erythrorhizon⁷. يظهر تأثيرات ملحوظة مضادة^{للالتهابات 9} ، ومضادة للبكتيريا¹⁰ ، ومضادة للورم¹¹. يمكن أن يخفف الشيكونين من إصابة الرئة الناجمة عن عديد السكاريد الدهني (LPS) ، مما يشير إلى دوره العلاجي المحتمل في أمراض الرئة¹². في الوقت نفسه ، اقترحت بعض الدراسات أيضا أن الشيكونين قد يخفف من الضرر التأكسدي الناجم عن الإنتان عن طريق تنظيم نظام البلاعم أحادي النواة ، وتحقيق التوازن بين الاستجابات المؤيدة للالتهابات والمضادة للالتهابات. ومع ذلك ، فإن الآليات الكامنة وراء التأثيرات الوقائية للشيكونين في ALI الناجم عن الإنتان ليست مفهومة تماما. يمثل هذا فجوة خطيرة في البحث الحالي.

في هذه الدراسة ، نهدف إلى استكشاف التأثيرات الوقائية للشيكونين في نموذج فأر من ALI الناجم عن الإنتان باستخدام ربط الرأس والثقب (CLP). تلعب تقنية CLP دورا مهما في أبحاث الإنتان لأنها يمكن أن تحاكي الاستجابات الالتهابية الجهازية المعقدة والخلل الوظيفي متعدد الأعضاء ، مما يجعلها مناسبة لتقييم فعالية استراتيجيات العلاج الجديدة. تعد تقنية CLP أكثر صلة سريريا نسبيا مقارنة بطرق حقن LPS التقليدية: فهي تحاكي الاستجابة الالتهابية الجهازية الناجمة عن نقل ميكروبات الأمعاء ، وهي أقرب إلى العملية المرضية للتعفن السريري. يمكن تصنيفه والتحكم فيه: من خلال ضبط طول الربط وحجم الثقب ، يمكن التحكم في شدة المرض ، وهو مناسب لدراسة الإنتان بأكملها. بالإضافة إلى ذلك ، يمكنه محاكاة التغيرات الديناميكية المماثلة في الخلل الوظيفي متعدد الأعضاء واستجابة السيتوكين. من خلال التحقيق في دور الشيكونين في تعديل مسار إشارات HIF-1α / VEGF ، نأمل في تقديم رؤى حول الاستراتيجيات العلاجية الجديدة التي تعالج الآليات الأساسية لإصابة الرئة المرتبطة بالإنتان ، مما قد يحسن النتائج السريرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

حصل البروتوكول على موافقة من مركز التجريبية بجامعة ونتشو الطبية. تم استخدام ذكور C57Bl / 6 فئران (5-6 أشهر ؛ 20-25 جم) في الدراسة الحالية. تفاصيل الكواشف الرئيسية والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير نموذج فأر الإنتان

الفئران المنزلية تحت درجة حرارة ثابتة تبلغ 25 درجة مئوية ، ورطوبة 50٪ ، ودورة ضوء / ظلام لمدة 12 ساعة.
بعد فترة تأقلم مدتها 7 أيام ، قسم الفئران بشكل عشوائي إلى أربع مجموعات: مجموعة الشام ، والمجموعة النموذجية ، ومجموعة العلاج بجرعة منخفضة ، ومجموعة العلاج بالجرعات العالية ، مع 20 فأرا في كل مجموعة.
بناء على مراجع من دراسة سابقة¹³ ، عالج مجموعة الجرعات المنخفضة بتركيز 12.5 مجم / كجم من البوربورين لمدة 14 يوما ، ومجموعة الجرعات العالية بتركيز 50 مجم / كجم لمدة 14 يوما. بالنسبة لمجموعة الجراحة الصورية، قم بإجراء بضع البطن، والجر الرأسي، والتصغير، والإغلاق دون ربط أو ثقب، والعلاج بنفس الجرعة من المحلول الملحي الفسيولوجي لمدة 14 يوما. الخطوات التجريبية لمجموعة الإنتان هي كما يلي.
بعد الصيام طوال الليل (سمح بالماء) ، قم بتخدير الفئران بالبنتوباربيتال الصوديوم (40-80 مجم / كجم) في ظل ظروف معقمة طوال العملية. ضع مرهما بيطري على العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
تحقق من التخدير المناسب مثل تباطؤ معدل التنفس ، وانخفاض توتر العضلات ، وعدم وجود استجابة واضحة للإجهاد عند تثبيت الأطراف السفلية برفق باستخدام ملقط مرقئ.
إجراء التطهير مع 75 ٪ الإيثانول ، 3x. قم بعمل شق طولي يبلغ حوالي 1 سم في الوضع الأيسر الأوسط لبطن الفأر ، وافتح الجلد واللفافة والعضلات في طبقات لكشف تجويف البطن.
باستخدام ملقط العين غير الحاد في كلتا يديك ، استكشف تجويف البطن برفق ، وحدد موقع أعور الفأر وحرره ، وربطه على مسافة حوالي 1 سم من نهاية الأعور.
استخدم إبرة 21G لثقب نهاية الأعور وربطها ، واضغط برفق على كمية صغيرة من محتوى الأمعاء من موقع البزل باستخدام ملقط العين غير الحاد ثم استرجعه في الأعور.
قم بإجراء إنعاش السوائل تحت الجلد باستخدام 1 مل من محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪. لا تترك دون رقابة حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي. نلاحظ أن الذي خضع لعملية جراحية لا يتم إعادته إلى صحبة الأخرى حتى يتعافى تماما.
بعد 7 أيام من نمذجة CLP ، قم بإعطاء التخدير المفرط للقتل الرحيم.
ملاحظة: نظرا للآثار المهيجة المحتملة للبوربورين على الجلد والجهاز التنفسي والجهاز الهضمي ، فضلا عن سميتها العالية للكائنات المائية ، والتلوث البيئي ، استخدم الحماية الشخصية أثناء التجربة.

2. تقييم النماذج الحيوانية

مراقبة بقاء الفأر
1. قم بالتعامل مع كما هو موضح أعلاه. سجل معدل الوفيات في غضون أسبوع واحد بعد النمذجة للتحليل الإحصائي. تموت بعض الفئران بدون تعفن الدم قبل القتل الرحيم ، بينما تتمتع الفئران النموذجية CLP بمعدل وفيات معين (الجدول 1).
2. قياس نسبة الوزن الرطب إلى الجاف في الرئة
  1. بعد 24 ساعة من النمذجة ، قم بتخدير الفئران مرة أخرى وفقا للخطوات 1.4-1.5.
  2. قم بعمل شق طولي بطول 1 سم تقريبا على الجانب الأيسر من خط الوسط الترقوة للفأر ، وقم بإزالة طبقات الجلد واللفافة والعضلات لكشف تجويف الصدر بالمقص الجراحي والملقط.
  3. قم بإزالة الرئة اليسرى وتصريف السائل السطحي. قم بقياس الوزن الرطب ثم جففه في فرن 80 درجة مئوية لمدة 72 ساعة إلى وزن ثابت للحصول على الوزن الجاف.
  4. احسب محتوى ماء الرئة على النحو التالي:
    محتوى ماء الرئة = (الوزن الرطب - الوزن الجاف) / الوزن الرطب × 100٪.
3. مقارنة نسيجية مرضية لأنسجة الرئة
  1. في نقاط زمنية محددة، اجمع الرئة اليسرى كما هو موضح أعلاه في الخطوة 2.2. ثبت الرئة في الفورمالديهايد المحايد بنسبة 10٪ ، وقم بتضمينها في البارافين ، وقم بتقسيمها بسمك 5 ميكرومتر.
  2. قم بإزالة الشمع من الرئة في الزيلين ، 2x ، لمدة 5-10 دقائق في كل مرة. قم بإجراء سلسلة من الإماهة بالإيثانول بنسبة 100٪ و 95٪ و 85٪ و 75٪ لمدة 3 دقائق لكل تدرج. نقع في الماء المقطر لمدة 2 دقيقة.
  3. قم بتلطيخ ما يقرب من 100 مل من محلول الهيماتوكسيلين لمدة 10 دقائق ، ثم اشطفه بالماء المقطر لإزالة أي لون عائم.
  4. أضف حوالي 70 مل من محلول التمايز وانقعه لمدة 30 ثانية. ثم انقع في ماء الصنبور 2x ، كل مرة لمدة 3-5 دقائق.
  5. أضف ما يقرب من 100 مل من محلول صبغة اليوزين بالتنقيط لمدة دقيقتين. اسكب محلول الصبغة الزائد وقم بتجفيفه بسرعة كما هو موضح أدناه.
  6. قم بإجراء الجفاف والشفافية والختم كما هو موضح أدناه.
    1. انقع العينات في الإيثانول المتدرج: 75٪ و 85٪ و 95٪ و 100٪ إيثانول (I) لمدة 2-3 ثوان لكل منهما. نقع في 100٪ من الإيثانول (II) لمدة دقيقة واحدة ، وانقع في الزيلين 2x لمدة دقيقة واحدة في كل مرة. باستخدام ماصة أو قطارة ، قم بتقطير اللثة المحايدة على سطح شرائح الأنسجة ووزعها بالتساوي قدر الإمكان لتجنب تكوين الفقاعات. ختم ومراقبة تحت المجهر عند 400x.
  7. حدد 10 حقول عشوائية لكل قسم من الرئة. اطلب من أخصائي علم الأمراض تسجيل التغيرات المرضية مثل الوذمة السنخية والنزيف وتسلل العدلات من 0 (طبيعي) إلى 4 (ضرر شديد). استخدم النتيجة الإجمالية للتقييم.
4. النشاف الغربي
  1. استخرج البروتينات النووية من أنسجة الرئة وفقا لتعليمات مجموعة استخراج البروتين النووي ، وقياس تركيز البروتين باستخدام طريقة BCA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. قم بإعداد عينات تحميل البروتين مع 50 ميكروغرام من البروتين المحملة لكل عينة. تحضير جل فصل SDS-PAGE (10٪) وجل التكديس (3٪). قم بإجراء الرحلان الكهربائي عند 80 فولت لمدة 45 دقيقة ، ثم انقل البروتين إلى غشاء PVDF عند 110 فولت لمدة 60 دقيقة بعد دخول العينات إلى هلام الفصل.
  3. نقل البروتينات إلى الغشاء وكتلة لمدة 60 دقيقة. احتضان بالأجسام المضادة الأولية (انظر جدول المواد ، 1: 1000) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية ، متبوعا بحضانة الجسم المضاد الثانوي (انظر جدول المواد ، 1: 1000) عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.
  4. اغسل الغشاء باستخدام TBST واستخدم ECL للتصور. في غرفة مظلمة ، أضف الكواشف المحضرة إلى غشاء PVDF وقم بإجراء التصوير الاهتزازي والفلورة. تتفاعل كواشف ECL مع الجزيئات الحيوية الموجودة على الغشاء ، مما ينتج عنه تفاعلات تلألؤ كيميائي قوية ، والتي يتم تسجيلها بواسطة أدوات التصوير الفلوري.
  5. قم بتحليل قيمة التدرج الرمادي لنطاقات البروتين باستخدام نظام تحليل الصور ، وطريقة القياس الكمي للنطاق (للحصول على معلومات مفصلة عن النظام المستخدم لتحليل قياس كثافة النطاق ، انظر صورة المعاهد الوطنية للصحة).
5. التحليل الإحصائي
  1. استخدم SPSS 26.0 للتحليل الإحصائي. استخدم ANOVA أحادي الاتجاه لمقارنة وسائل المجموعات المتعددة ، واختبارات LSD-t للمقارنات الزوجية. ضع في اعتبارك قيمة p < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لتقييم الإمكانات العلاجية للشيكونين ، قمنا أولا بتقييم تأثيره على البقاء على قيد الحياة في الفئران الإنتانية على مدى 7 أيام. أدى العلاج بالشيكونين إلى تحسين معدلات البقاء على قيد الحياة بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 1).

نظرا لانتشار إصابة الرئة في الإنتان ، قمنا أيضا بتقييم الوذمة الرئوية في الفئران. تم تقييم الوذمة الرئوية عن طريق قياس نسبة الوزن الرطب إلى الجاف في الرئة (W / D). ارتفعت نسبة W / D بشكل ملحوظ في المجموعة النموذجية مقارنة بالمجموع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

باعتباره النموذج القياسي الذهبي لأبحاث الإنتان ، يعد نموذج CLP خطوة أساسية في هذه التجربة لأن CLP يحاكي تعقيد الإنتان البشري بشكل أفضل من العديد من النماذج الأخرى. لا يزال مرض التهاب الغدة الدعامة الليفوري المرتبط بالإنتان يمثل تحديا سريريا خطيرا بسبب معدلات الوفيات المرتفعة والفعالية المحدودة للعلاجات الحالية¹⁴^،¹⁵. توضح دراستنا ، لأول مرة ، أن الشيكونين يحسن بشكل كبير من البقاء على قيد الحياة في الفئران الإنتانية عن طريق تعديل ك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

تم دعم الدراسة من قبل مشروع ونتشو للعلوم والتكنولوجيا (Y2020976).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي
H& طقم تلطيخ طقم وصمة عار E	Solaibao Technology	G1120HE
جهاز طرد مركزي بدرجة حرارة منخفضة	Sigma	3K15
قارئ صفيحة حيوية		طراز 680
أرنب أحادي النسيلة VEGF-receptor1 الجسم المضاد	Abcam	ab238632
الأرنب متعدد النسيلة HIF-1 & ألفا الجسم المضاد	Abcam	ab51608
SDS-PAGE نظام الرحلان الكهربائي	Bio-Rad	MINI Protean2
Shikonin	MedChemExpress	HY-N0822

المراجع

Hotchkiss, R. S., Karl, I. E. The pathophysiology and treatment of sepsis. N Engl J Med. 348 (2), 138-150 (2003).
Vincent, J. L. Current sepsis therapeutics. EBioMed. 86, 104318(2022).
Li, W., et al. Classic signaling pathways in alveolar injury and repair involved in sepsis-induced ali/ards: New research progress and prospect. Dis Markers. 2022, 6362344(2022).
Mokrá, D. Acute lung injury - from pathophysiology to treatment. Physiol Res. 69 (Suppl 3), S353-S366 (2020).
Prangsaengtong, O., Jantaree, P., Lirdprapamongkol, K., Svasti, J., Koizumi, K. Shikonin suppresses lymphangiogenesis via nf-kappab/hif-1alpha axis inhibition. Biol Pharm Bull. 41 (11), 1659-1666 (2018).
Liu, Y., Xiang, D., Zhang, H., Yao, H., Wang, Y. Hypoxia-inducible factor-1: A potential target to treat acute lung injury. Oxid Med Cell Longev. 2020, 8871476(2020).
Fan, T. T., Cheng, B. L., Fang, X. M., Chen, Y. C., Su, F. Application of chinese medicine in the management of critical conditions: A review on sepsis. Am J Chin Med. 48 (6), 1315-1330 (2020).
Liang, X., et al. Efficacy of traditional chinese medicine on sepsis: A systematic review and meta-analysis. Int J Clin Exp Med. 8 (11), 20024-20034 (2015).
Boulos, J. C., Rahama, M., Hegazy, M. F., Efferth, T. Shikonin derivatives for cancer prevention and therapy. Cancer Lett. 459, 248-267 (2019).
Guo, Y., et al. Recent advances in shikonin for the treatment of immune-related diseases: Anti-inflammatory and immunomodulatory mechanisms. Biomed Pharmacother. 165, 115138(2023).
Guo, C., et al. Pharmacological properties and derivatives of shikonin-a review in recent years. Pharmacol Res. 149, 104463(2019).
Zhang, Y., et al. Shikonin ameliorates lipoteichoic acid‑induced acute lung injury via promotion of neutrophil apoptosis. Mol Med Rep. 23 (2), 133(2021).
Bai, G. Z., et al. Shikonin attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice. J Surg Res. 182 (2), 303-311 (2013).
Fein, A. M., Calalang-Colucci, M. G. Acute lung injury and acute respiratory distress syndrome in sepsis and septic shock. Crit Care Clin. 16 (2), 289-317 (2000).
Sun, B., et al. Acute lung injury caused by sepsis: How does it happen. Front Med. 10, 1289194(2023).
Song, Y., Lin, W., Zhu, W. Traditional chinese medicine for treatment of sepsis and related multi-organ injury. Front Pharmacol. 14, 1003658(2023).
Li, M. Y., et al. Shikonin suppresses proliferation and induces cell cycle arrest through the inhibition of hypoxia-inducible factor-1alpha signaling. Chem Biol Interact. 274, 58-67 (2017).
Shi, J., et al. Dexmedetomidine ameliorates endotoxin-induced acute lung injury in vivo and in vitro by preserving mitochondrial dynamic equilibrium through the hif-1a/ho-1 signaling pathway. Redox Biol. 41, 101954(2021).
Das, U. N. Infection, inflammation, and immunity in sepsis. Biomolecules. 13 (9), 1332(2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

العلاج بالشيكونينين نموذج فأر مصاب بتعفن الدم عامل HIF-1 ألفا مسار VEGF السيتوكينات الالتهابية لطخة ويسترن باثولوجيا الرئة صبغ الهيماتوكسيلين والإيوسين معدل البقاء على قيد الحياة

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

أبقِني على اطلاع: