ضبط أوضاع الانقباض والتشوه للتجميعات النشطة القائمة على الأكتين في المختبر: من الشبكات النشطة ثنائية الأبعاد إلى قطرات البلورات السائلة

Samantha Stam; Steven Huntley; Carolyn A. Feigeles; Veronica J. Armstrong; Margaret A. Cheves; Sam Rubin; Kimberly L. Weirich

doi:10.3791/68127

Method Article

ضبط أوضاع الانقباض والتشوه للتجميعات النشطة القائمة على الأكتين في المختبر: من الشبكات النشطة ثنائية الأبعاد إلى قطرات البلورات السائلة

DOI:

10.3791/68127

⸱

July 11th, 2025

Samantha Stam¹ , Steven Huntley*² , Carolyn A. Feigeles*² , Veronica J. Armstrong² , Margaret A. Cheves² , Sam Rubin² , Kimberly L. Weirich²

¹Institute of Biophysical Dynamics, University of Chicago, ²Department of Materials Science & Engineering, Clemson University

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Tuning the Contractility and Deformation Modes of Active Actin-Based Assemblies In Vitro: From Two-Dimensional Active Networks to Liquid Crystal Drops
Posted by JoVE Editors on 8/28/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68127

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم طرقا لتحضير مجموعات الأكتين البلورية السائلة شبه ثنائية الأبعاد (2D) المتشابكة والمتشابكة والمتصالبة من البروتينات المنقاة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم التحقيق على نطاق واسع في المواد القائمة على الهيكل الخلوي للأكتين كمواد خلوية نموذجية لتوضيح الآليات الفيزيائية لميكانيكا الخلية ، مثل تنظيم الشكل وإنتاج القوة ، بالإضافة إلى المواد البوليمرية اللينة المثيرة للاهتمام. في هذه الطريقة ، نقوم بتفصيل إنشاء تجميعات قائمة على الأكتين في المختبر باستخدام البروتين المنقى لدراسات الفحص المجهري الفلوري. نقوم ببلمرة خيوط الأكتين الطويلة في غرفة العينة ونستخدم مادة البوليمر المنفدة لحشد الخيوط في شبكة متشابكة ثنائية الأبعاد (2D) ضد سطح مخيل بطبقة خافضة للتوتر السطحي. تؤدي إضافة خيوط الميوسين II للعضلات الهيكلية في وجود أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) إلى تقلص شبكة الأكتين. من خلال تجميع خيوط الأكتين باستخدام الرابط المتقاطع ، نقوم بضبط انقباض التجميع ، والانتقال من مادة تلتصق إلى مادة تنزلق على نطاق صغير. من خلال تقليل طول خيوط الأكتين من خلال بلمرة الأكتين المشتركة في وجود بروتين السد ، نقوم بضبط المادة من كونها شبكة ثنائية الأبعاد إلى بلورة سائلة. يؤدي الربط المتقاطع لخيوط الأكتين القصيرة المشتتة إلى تكوين قطرات بلورية سائلة ثلاثية الأبعاد (3D).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المواد البيولوجية النشطة تكمن وراء العمليات الميكانيكية في مجموعة متنوعة من العمليات الفسيولوجية ، بما في ذلك النقل داخل الخلايا ، وهجرة الخلايا ، وتنظيم شكل الخلية ، وتوليد القوة البيولوجية¹^،²^،³. تعد التجميعات في المختبر لأنظمة الهيكل الخلوي ، المبنية من مكونات البروتين المنقاة والمصممة هندسيا المجمعة ذاتيا في المخزن المؤقت ، أداة راسخة لتوصيف العمليات الفيزيائية الحيوية والكيميائية الحيوية^{الأساسية 4}^،⁵^،⁶^،⁷....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: البروتينات ووضع العلامات: لأغراض هذا البروتوكول ، من المفترض أن يبدأ الباحث بمخزون من البروتينات النقية ، والتي يتم تصنيفها بالفلورسنت عند الاقتضاء للتحقيق في الفحص المجهري الفلوري. يمكن شراء هذه البروتينات أو تنقيتها وتصنيفها بالفلورسنت في المختبر³¹^،³²^،³³^،³⁴^،³⁵^،³⁶^،³⁷. في هذا البروتوكول ، تم استخدام مخزونات البروتينات التي تم تجميدها في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية. يمكن تصنيف الب....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن تشكيل مجموعة واسعة من مجموعات الأكتين في أنظمة نموذجية باستخدام بروتينات منقاة باتباع الإستراتيجية العامة الموضحة في هذه الطرق ، حيث يتم بلمرة الأكتين إلى خيوط في وجود بروتينات ملحقة تعدل بنية التجميع (الشكل 1). عندما يتم بلمرة الأكتين إلى خيوط بدون روابط متشابكة أو بروتين مغطى ، فإنه يشكل شبكات خيوط متشابكة (الشكل 1 أ). تؤدي إضافة الرابط المتقاطع إلى الشبكات المتشابكة إلى تكوين شبكات شبه ثنائية الأبعاد أو شبكات من الحزم (الشكل 1 ب

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك العديد من الاعتبارات لإنتاج مجموعات أكتين قابلة للتكرار. أحد أهم البيانات لإنتاج بيانات قابلة للتكرار وقابلة للتحليل هو سطح الغطاء الزجاجي لغرفة العينة. البروتينات الموجودة في عينات الأكتين في المختبر ، وخاصة الميوسين ، لزجة للغاية وستلتصق بالأسطح الزجاجية غير المعالجة أو سيئة المعالجة ، مما يجعل العينة غير صالحة للاستخدام (الشكل 5 أ). لقد ناقشنا طريقة قياسية لتحضير السطح لإنتاج عينات قابلة للتكرار من خلال تخميل غطاء سيلاني بطبقة خافضة للتوتر ا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تعارض للإفصاح عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر تود ثورنسون ومايك موريل وجنيفر روس وباتريك ماكول وأعضاء آخرين في مختبرات غاردل وكوفار (جامعة شيكاغو) على المناقشات المفيدة أثناء تطوير الأساليب. تم دعم MAC و SR جزئيا من قبل منح فرص البحث الجامعية لكلية الحوسبة الهندسية والعلوم التطبيقية بجامعة كليمسون ، وتم دعم VJ AB من قبل Clemson Biophysics REU بموجب جائزة NSF # 2349368 بتمويل من برامج DBI و EPSCoR. تم دعم هذا العمل أيضا جزئيا من قبل برنامج EPSCoR التابع للمؤسسة الوطنية للعلوم في إطار جائزة NSF #OIA-1655740 ، جزئيا من خلال برنامج Clemson Creative Inquiry + Bachelor Research Program.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
0.6 مل أنبوب الطرد المركزي	فيشر ساينتفيك	05-408-123
008-الفلوروخافض للتوتر السطحي	RAN Biotechnologies	00115081361-6525	بديل للمحلول المخلوط
مسبقا 008-FluoroSurtuant في HFE7500	RAN Biotechnologies	008-FluoroSurtuant-2wtH-50G	محلول مخلوط مسبقا
2-mercaptoethanol (& beta ؛ -mercaptoethanol)	Sigma Aldrich	63689	رقم سجل المستخلصات الكيميائية: 60-24-2 محلول المخزون: 25 ملي مولار في ماء MilliQ ، مخزن عند 4 درجات ؛ C
4- (2-هيدروكسي إيثيل) بيبيرازين -1-حمض الإيثان السلفونيك (HEPES)	سيجما ألدريتش	H3375	رقم CAS: 7365-45-9
5 دقائق إيبوكسي	ديفكون	14250
أكتين	الهيكل الخلوي ، Inc.	AKL99-A	>99٪ عضلة هيكلية نقية للأرانب (بديل للتنقية)
أكتين (مسمى الرودامين)	الهيكل الخلوي ، Inc.	AR05-A	عضلة الهيكل العظمي للأرانب (بديل للتنقية)
الأدينوزين 5 & رئيس ;-ثلاثي الفوسفات (ATP)	سيجما ألدريتش	A6419	رقم CAS: 34369-07-8 محلول المخزون: 25 ملي مولار في ماء MilliQ ، تخزينه عند -20 درجة ؛ C يحفظ مجمدا لتجنب التحلل المائي
كلوريد الكالسيوم (CaCl2)	Sigma Aldrich	C5670	رقم CAS: 10043-52-4
السد بروتين (الفأر)			منقى من الإفراط في التعبير في E.coli < / em> مع HisTag محلول المخزون: 20 ملي مولار في تغطية المخزن المؤقت للبروتين عند -80 درجة ؛ C
Catalase من كبد البقر	Sigma Aldrich	C9322	رقم CAS: 9001-05-2 محلول المخزون: 85 ku / مل ، تخزين مع الجلوكوز أوكسيديز عند -20 درجة ؛ C
غطاء	زجاجي فيشربراند	12544C	بورسليكات ، # 1.5 ، 24 مم × 40 مم Fisherbrand ليس Fisher Finest
D- (+) -Glucose	Sigma Aldrich	G8270	رقم CAS: 50-99-7 محلول المخزون: 225 مجم / مل في ماء MilliQ ، يخزن في -20 درجة ؛ C
Dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich	3860-OP	رقم CAS: 3483-12-3 محلول المخزون: 1 متر في ماء MilliQ ، يخزن في -20 درجة ؛
C شريط مزدوج الوجهين	3M	3136
إيثيل ألكوهول 200 دليل	PHARMCO	111000200	رقم CAS: 64-17-5 200 دليل
على الإيثيلين جلايكول مكرر (2-أمينوإيثيل إيثر) -N ، N ، N ، N & Prime ؛ N & N ؛ حمض رباعي الأسيتيك (EGTA)	سيجما ألدريتش	E3889	رقم CAS: 67-42-5
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)	سيجما ألدريتش	E9884	رقم سجل المستخلصات الكيميائية: 60-00-4
الجلوكوز أوكسيديز	سيجما ألدريتش	345386	رقم سجل المستخلصات الكيميائية: 9001-37-0 محلول المخزون: 135 مجم / مل في ماء MilliQ ، يخزن مع الكاتلاز عند -20 درجة ؛ C
Glycerol	Sigma Aldrich	356352M	رقم CAS: 56-81-5
Imidazole	Fisher Bioreagents	BP305-50	رقم CAS: 288-32-4
كلوريد المغنيسيوم (MgCl_{2< / sub>)}	الكواشف الحيوية فيشر ؛	BP214	رقم CAS: 7786-30-3 ، 7791-18-6
ميثيل السليلوز	سيجما ألدريتش	M0512	رقم CAS: 9004-67-5 15 سنتيبواز
مجهر شرائح علوم	المجهر الإلكتروني العادي / ختم الذهب	63710-05	؛ 3 "× 1" ، 1 مم
سمك MilliQ ماء	Millipore	CUFBI001	ماء عالي النقاء
Novec-7500 سائل هندسي	3M	7100134816	بديل لمحلول خلط
مسبقا كلوريد البوتاسيوم (KCl)	Sigma Aldrich	P3911	رقم CAS: 7447-40-7
فوسفات البوتاسيوم (KPO_{4< / sub>)}	Sigma Aldrich	P3786	رقم CAS: 7758-11-4
مسحوق الأسيتون للعضلات الهيكلية للأرانب	Pel-Freez Biologicals	41995-1	يستخدم عند تنقية الأكتين (بديل للشراء) تخزين حوالي 30 ملي مولار في الأكتين Buffer G عند -80 درجة ؛ C
أزيد الصوديوم	سيجما ألدريتش	71289	رقم سجل المستخلصات الكيميائية: 26626-22-8
تتراميثيل رودامين-C6-ماليميد	AnaSpec	AS-81445	رقم سجل المستخلصات الكيميائية: 174568-68-4 يستخدم عند تنقية الأكتين (بديل للشراء) تخزين حوالي 30 ملي مولار في الأكتين Buffer G عند -80 درجة مئوية. يستخدم عند وضع العلامات على الأكتين (بديل للشراء)
حمض الهيدروكلوريك تريس (تريس هيدروكلوريك كل	سيجما ألدريتش	648317	رقم سجل المستخلصات الكيميائية: 1185-53-1
بالموجات فوق الصوتية حمام	إيمرسون برانسون & nbsp ؛	CPX2800H

الدقيق )

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Marchetti, M. C., et al. Hydrodynamics of soft active matter. Rev Mod Phys. 85 (3), 1143-1189 (2013).
Needleman, D., Dogic, Z. Active matter at the interface between materials science and cell biology. Nat Rev Mater. 2 (9), 17048(2017).
Murrell, M., Oakes, P. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

ضبط أوضاع الانقباض والتشوه للتجميعات النشطة القائمة على الأكتين في المختبر: من الشبكات النشطة ثنائية الأبعاد إلى قطرات البلورات السائلة

In This Article

Erratum Notice

Erratum

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles