Method Article

ضبط أوضاع الانقباض والتشوه للتجميعات النشطة القائمة على الأكتين في المختبر: من الشبكات النشطة ثنائية الأبعاد إلى قطرات البلورات السائلة

DOI:

10.3791/68127

⸱

July 11th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biophysical Dynamics, University of Chicago, 2Department of Materials Science & Engineering, Clemson University

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم طرقا لتحضير مجموعات الأكتين البلورية السائلة شبه ثنائية الأبعاد (2D) المتشابكة والمتشابكة والمتصالبة من البروتينات المنقاة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم التحقيق على نطاق واسع في المواد القائمة على الهيكل الخلوي للأكتين كمواد خلوية نموذجية لتوضيح الآليات الفيزيائية لميكانيكا الخلية ، مثل تنظيم الشكل وإنتاج القوة ، بالإضافة إلى المواد البوليمرية اللينة المثيرة للاهتمام. في هذه الطريقة ، نقوم بتفصيل إنشاء تجميعات قائمة على الأكتين في المختبر باستخدام البروتين المنقى لدراسات الفحص المجهري الفلوري. نقوم ببلمرة خيوط الأكتين الطويلة في غرفة العينة ونستخدم مادة البوليمر المنفدة لحشد الخيوط في شبكة متشابكة ثنائية الأبعاد (2D) ضد سطح مخيل بطبقة خافضة للتوتر السطحي. تؤدي إضافة خيوط الميوسين II للعضلات الهيكلية في وجود أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) إلى تقلص شبكة الأكتين. من خلال تجميع خيوط الأكتين باستخدام الرابط المتقاطع ، نقوم بضبط انقباض التجميع ، والانتقال من مادة تلتصق إلى مادة تنزلق على نطاق صغير. من خلال تقليل طول خيوط الأكتين من خلال بلمرة الأكتين المشتركة في وجود بروتين السد ، نقوم بضبط المادة من كونها شبكة ثنائية الأبعاد إلى بلورة سائلة. يؤدي الربط المتقاطع لخيوط الأكتين القصيرة المشتتة إلى تكوين قطرات بلورية سائلة ثلاثية الأبعاد (3D).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المواد البيولوجية النشطة تكمن وراء العمليات الميكانيكية في مجموعة متنوعة من العمليات الفسيولوجية ، بما في ذلك النقل داخل الخلايا ، وهجرة الخلايا ، وتنظيم شكل الخلية ، وتوليد القوة البيولوجية1،2،3. تعد التجميعات في المختبر لأنظمة الهيكل الخلوي ، المبنية من مكونات البروتين المنقاة والمصممة هندسيا المجمعة ذاتيا في المخزن المؤقت ، أداة راسخة لتوصيف العمليات الفيزيائية الحيوية والكيميائية الحيويةالأساسية 4،5،6،7. تسمح أنظمة النموذج المبسطة هذه بدراسة البروتينات دون تعقيد البيئات الخلوية ، مما يسمح بتحديد أدوار المكونات الفردية. بالإضافة إلى دعم الدراسات البيولوجية الأساسية ، تم أيضا تطوير تجميعات الهيكل الخلوي في المختبر على نطاق واسع كأنظمة تجريبية للتحقيق في المواد البلورية السائلة والنشطة أو الخارجة عن التوازن8،9،10،11،12،13،14،15.

الأكتين هو بوليمر حيوي رئيسي في تجميعات الهيكل الخلوي الذي ينظم ميكانيكا الخلية وديناميكياتها من خلال القوى الحركية والبلمرة3،16. تسمح تجارب الفحص المجهري الفلوري بتصور التغييرات الهيكلية لشبكة الأكتين أثناء عمليات مثل الانكماش الذي يحركه المحرك وتجميع الأكتين عن طريق البروتينات المتقاطعة. إن تصوير شبكات الأكتين ثلاثية الأبعاد أثناء إعادة تشكيلها بواسطة بروتينات حركية مدمجة قد أضاء دور الروابط المتشابكة الأكتين لتقلص الشبكة وتشكيلالنمط 12،17،18،19. ومع ذلك ، تتغلب شبكات الأكتين شبه ثنائية الأبعاد على التحديات في التصوير بدقة زمانية مكانية كافية لالتقاط التغييرات الهيكلية للشبكة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن هياكل الأكتين عالية الكثافة وشبه ثنائية الأبعاد هي تقليد أقرب للتجمعات الخلوية مثل قشرة الأكتين الكثيفة للخلية20. تضمنت استراتيجيات إنتاج هياكل الأكتين شبه ثنائية الأبعاد ربط بروتينات نواة الأكتين بغطاء21،22 ، واقتران الأكتين بسطح من خلال جزيئات الرابط10،23،24 ، وتشكيل حزم الأكتين الكثيفة المتصلة بالخرز على سطح غطاء25،26 ، وتركيز خيوط الأكتين على سطح غطاء مع عوامل الازدحام الجزيئي10، 27.

هنا ، نقوم بتفصيل طريقة لإنشاء تجميعات قائمة على الأكتين النموذجية القابلة للتكرار وكيفية تعديلها لإعداد الاختلافات من الشبكات النشطة إلى البلورات السائلة شبه ثنائية الأبعاد والقطرات النيماتيكية. لقد استخدمنا سابقا طرقا مماثلة لدراسة تكوين قطرات بلورية سائلة مفصولة عن الطور لخيوط الأكتين القصيرة مع إضافة الرابطالمتقاطع 11 ، والتغيرات في أوضاع تشوه شبكة الأكتين الناتجة عن الميوسين الثاني (على سبيل المثال ، التواء الفتيل أو الانزلاق النسبي) مع الربط المتبادل للفتيل والاتصال28 ، والاختلافات في القوى المولدة من الميوسين الثاني على حزم الأكتين ذات التباعد والامتثال المتفاوتة29 ، ونقل الميوسين الثاني30. يسمح استخدام بروتينات الربط المتقاطع وبروتينات تغطية الأكتين بالتباين المنهجي لطول خيوط الأكتين وبنية التجميع.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: البروتينات ووضع العلامات: لأغراض هذا البروتوكول ، من المفترض أن يبدأ الباحث بمخزون من البروتينات النقية ، والتي يتم تصنيفها بالفلورسنت عند الاقتضاء للتحقيق في الفحص المجهري الفلوري. يمكن شراء هذه البروتينات أو تنقيتها وتصنيفها بالفلورسنت في المختبر31،32،33،34،35،36،37. في هذا البروتوكول ، تم استخدام مخزونات البروتينات التي تم تجميدها في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية. يمكن تصنيف البروتينات عادة من خلال طرق مماثلة. يمكن تصنيف البروتين على أنه خطوة للتنقية أو من مخزون مجمد. قم بإذابة مخزون البروتين المجمد على الثلج قبل متابعة وضع العلامات. فيما يلي طريقة لوضع العلامات بالفلورسنت على العضلات الهيكلية الميوسين الثاني (الميوسين) باستخدام فلوروفور وظيفي ماليميد (مقتبس من38).

1. تحضير الميوسين المسمى بالفلورسنت

  1. ابدأ ب ~ 2 مل من الميوسين بتركيز 5-10 مجم / مل.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول ، تم استخدام ميوسين العضلات الهيكلية II المنقى من عضلة الدجاج باستخدام الطرقالمنشورة 35 . يتم تخزين الميوسين في مخزن تخزين الميوسين (25 ملي مولار KPO4 ، 0.6 M KCl ، 10 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) ، 1 ملي مولار ديثيوثريتول (DTT) ، درجة الحموضة 6.6) ، إما بعد التنقية مباشرة أو من المخزون المجمد. من المهم الحفاظ على برودة الميوسين في جميع الأوقات لمنع فقدان النشاط الحركي.
  2. أضف DTT إلى محلول الميوسين المذاب إلى تركيز نهائي يبلغ 10 مليمتر. استخدم حل مخزون 1 M DTT للحد من الحجم.
    ملاحظة: يقلل DTT من مجموعة الثيول على السيستين في بروتين الميوسين ، مما يهيئها للتفاعل مع الماليميد لوضع العلامات.
  3. لمنع التداخل مع تفاعل الملصقات ، قم بإزالة DTT عن طريق غسيل الكلى طوال الليل في 50 ملي مولار HEPES ، 500 ملي كلوريد كلوريد ، 1 ملي مولار EDTA ، درجة الحموضة 7.6 ، عند 4 درجات مئوية.
  4. بعد غسيل الكلى ، قم بالطرد المركزي لمحلول الميوسين عند 100,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة لتكسير أي مجاميع. اجمع المادة الطافية.
  5. تحديد تركيز الميوسين في المادة الطافية باستخدام مقياس الطيف الضوئي. قم بتقدير تركيز الميوسين باستخدام معامل الانقراض عند 280 نانومتر من ~ 148,000 م -1سم -1 لميوسين العضلات الهيكلية38. يفترض معامل الانقراض هذا أن "المونومر" يتكون من سلسلة ثقيلة واحدة ، وسلسلة خفيفة أساسية ، وسلسلة خفيفة تنظيمية واحدة.
  6. قم بإعداد الفلوروفور لتفاعل الملصقات عن طريق تعليق مسحوق الفلوروفور في ثنائي ميثيل سلفوكسيد الجاف (DMSO) إلى تركيز 5 ملي مولار من الفلوروفور.
    ملاحظة: يجب أن يعمل أي فلوروفور مع مجموعة تفاعلية ماليميد. تم استخدام Alexa 647 maleimide. DMSO استرطابي ويتراكم الماء. يشير DMSO "الجاف" إلى DMSO الذي تم تخزينه في بيئة لمنع تراكم المياه. للتأكد من أن المذيب جاف DMSO ، تم استخدام أمبولة مفتوحة حديثا من DMSO لهذه الخطوة. لا تضع حلول DMSO على الجليد. تبلغ درجة انصهار DMSO 19 درجة مئوية ، لذلك يجب أن تكون درجة حرارة الغرفة (أو أكثر دفئا قليلا) للماصة39.
    تنبيه: يمكن ل DMSO اختراق القفازات ، لذلك من الممارسات الجيدة ارتداء قفازات النتريل المزدوجة والحرص على منع الانسكابات.
  7. لتحضير الميوسين لإضافة الفلوروفور ، انزع محلول الميوسين لفترة وجيزة عن الجليد واتركه دافئا إلى درجة حرارة الغرفة (RT).
    ملاحظة: لا تترك الميوسين في RT لفترة أطول من اللازم. قم بهذه الخطوة بعد تعليق الفلوروفور في DMSO.
  8. بمجرد أن يكون محلول الميوسين قريبا من RT ، أضف محلول الفلوروفور إلى الميوسين واخلطه بسرعة بحيث تكون هناك نسبة مولارية 5: 1 من الفلوروفور: الميوسين. ضع محلول الميوسين على الثلج بمجرد خلطه بالفلوروفور.
  9. احتضن على الجليد لمدة ساعة واحدة ، محميا من الضوء ، ثم أوقف التفاعل عن طريق إضافة DTT إلى تركيز 1 ملليمتر. استخدم مخزون 1 مليون DTT لتقليل الحجم المضاف.
  10. قم بإزالة الفلوروفورات غير المتفاعلة. استخدم أيا من الطريقتين الموضحين أدناه:
    1. الخيار 1:
      1. بلمرة الميوسين عن طريق تخفيفه ببطء إلى عازلة F (10 ملي مولار إيميدازول ، 50 ملي كلوريد الرأس ، 1 ملي ملي مغنيدكلوريد 2 ، 2 ملي مولار EGTA ، 4 ملي مولار ATP ، درجة الحموضة 7.5). هذا هو تخفيف 10x تقريبا ، اعتمادا على حجم الصبغة المضاف في الخطوة 1.8.
      2. احتضن على الثلج لمدة 20 دقيقة. تدور عند 8,000 × جم في جهاز طرد مركزي مبرد عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق للحبيبات.
      3. تخلص من المادة الطافية التي تحتوي على صبغة حرة وأعد تعليق / إزالة بلمرة الميوسين باستخدام مخزن تخزين الميوسين (من الخطوة 1). لإزالة أي صبغة متبقية ، قم بتحويل الكالى إلى 5 ملي مولار 2- [4- (2-سلفوإيثيل) بيبيرازين -1-يل] حمض الإيثان سلفونيك (PIPES) ، 0.45 M KCl ، درجة الحموضة 7.0 (>100 ضعف الحجم الزائد) ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة لكل منها باستخدام كوب غسيل الكلى المقطوع 10 كيلو دالتون.
    2. الخيار 2:
      1. استخدم عمود تحلية المياه لتبادل المخزن المؤقت إلى أنابيب 5 ملي مولار ، 0.45 مليونلا كلوريد كلوريد ، درجة الحموضة 7.0 ، مع البروتوكول القياسي من الشركة المصنعة للأعمدة.
  11. قم بتقدير نسبة الفلوروفور إلى البروتين عن طريق قياس تركيز الميوسين والفلوروفور باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، باستخدام معاملات الانقراض للميوسين عند 280 نانومتر وللفلوروفور كما أبلغت الشركة المصنعة. نسبة 2-4 نموذجية.
    ملاحظة: الميوسين المسمى جاهز الآن للتجميد السريع في النيتروجين السائل. يتم تخزين Aliquots عند -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.

2. اختياري: إجراء لإزالة الميوسين غير النشط

ملاحظة: يمكن استخدام الميوسين مباشرة من الاقتباس المذاب في التجارب ، لكن جزءا من الميوسين سيكون غير نشط. يصف الإجراء التالي كيفية إزالة الميوسين غير النشط. هذه خطوة اختيارية ، لكنها قد تكون حاسمة لقابلية التكرار. تستخدم كميات الميوسين لمدة 3 أيام تقريبا بعد الذوبان ، ويتم تخزينها عند 4 درجات مئوية أو على الجليد.

  1. بلمرة الأكتين غير المسمى ، المستقر بالفالويدين:
    1. امزج 10 ميكرولتر من 10x F-buffer ، و 1 ميكرولتر من 100 mM ATP ، و ddH2O بحيث يكون الحجم النهائي (بما في ذلك الأكتين في الخطوة 2.1.2) 100 ميكرولتر في أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
    2. أضف مونومر الأكتين إلى التركيز النهائي البالغ 20 ميكرومتر ومزيج الماصة.
    3. لتثبيت خيوط الأكتين ، أضف الفالودين إلى التركيز النهائي البالغ 6.7 ميكرومتر باستخدام مخزون من 100 ميكرومولار من الفالودين في مزيج الميثانول والماصات.
      تحذير: الفالودين هو مادة سامة40. تجنب الانسكابات والتلوث.
    4. احتضن على الجليد لمدة 20 دقيقة للسماح للأكتين بالبلمرة. بعد البلمرة ، قم بتخزين الأكتين عند 4 درجات مئوية للدوران المستقبلي.
  2. يمزج الماصة 10 ميكرولتر من الأكتين المستقر بالفالويدين ، و 3 ميكرولتر من 10x F-buffer ، و 0.3 ميكرولتر من 100 ملي مولار ATP ، و 6 ميكرولتر من 2 M KCl ، و ddH2O إلى حجم نهائي قدره 30 ميكرولتر (بما في ذلك الحجم المرتبط بإضافة الميوسين في الخطوة التالية) في أنبوب طرد مركزي دقيق على الجليد.
  3. أضف الميوسين المسمى باللون الثنائي من المخزون المحضر إلى التركيز المطلوب ، مع الحفاظ على نسبة مولية من الميوسين إلى الأكتين ≤ 1: 6.
  4. جهاز الطرد المركزي المحلول الناتج بارد (4 درجات مئوية) عند 100,000 × جم لمدة 30 دقيقة. سوف يرتبط الميوسين غير النشط بخيوط الأكتين ويظل مرتبطا. ستشكل خيوط الميوسين والأكتين غير النشطة حبيبات أثناء الطرد المركزي.
  5. قم بإزالة المادة الطافية (التي تحتوي على الميوسين النشط) وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية لاستخدامها في التجارب.
  6. تقدير تركيز الميوسين باستخدام نفس طريقة القياس الطيفي لقياس تركيز الميوسين بعد وضع العلامات.
    ملاحظة: عند تركيزات البروتين و ATP المتبقية في المادة الطافية ، يتم حجب ذروة الامتصاص البالغة 280 نانومتر بواسطة ذروة امتصاص ATP البالغة 260 نانومتر ، لذا فإن قياس التركيز من خلال الامتصاص المرتبط بالفلوروفور أو قياس التألق النسبي يكون أكثر دقة.

3. تحضير محلول الفاعل بالسطح

ملاحظة: يمكن أيضا شراء محلول الفاعل بالسطح ممزوجا مسبقا وجاهزا للاستخدام.

  1. ابدأ بقارورة زجاجية نظيفة. اشطف القارورة بالماء والإيثانول لإزالة الملوثات المحتملة في الزيت ، وهو مذيب للفاعل بالسطح. استخدم قوارير زجاجية من البورسليكات بغطاء مبطن بالبولي تترافلورو إيثيلين (PTFE).
  2. التقط 5-20 مجم من الفلوروسورسطحي باستخدام طرف الماصة وقم بإيداعه بالقرب من قاع قارورة زجاجية. قم بقياس كمية المادة الخافضة للتوتر السطحي بالوزن باستخدام ميزان بدقة دون المليغرام.
  3. قم بسحب الحجم المناسب من الزيت المفلور لعمل محلول 2 بالوزن وإغلاق القارورة.
    ملاحظة: الزيت متطاير ، لذا أغلق القارورة مباشرة بعد القياس.
  4. دوامة بسرعة منخفضة للخلط.
    ملاحظة: يمكن الآن تخزين المحلول عند 4 درجات مئوية لبضعة أسابيع. يمكن أن يؤثر عمر الفاعل بالسطح وجودته على كل من الازدحام وظهور الأكتين. قد يشير الأكتين الذي يبدو مرقطا أو ملتصقا بالسطح أو لا يتزاحم على السطح إلى ضرورة وجود محلول خافض للتوتر السطحي جديد. يمكن أن يؤدي التخزين تحت غاز النيتروجين إلى تحسين مدة الصلاحية.

4. تحضير غرفة العينة (ثلاثة خيارات)

ملاحظة: يوفر هذا القسم إجراء لبناء ثلاث غرف عينات قياسية تستخدم لإعداد العينات للفحص المجهري. يغطي القسمان التاليان تحضير العينة الفعلية وتخميل غرفة العينة لتحميل العينة.

  1. الخيار 1: Flowcell
    ملاحظة: خلية التدفق البسيط هي طريقة قياسية لعمل عينات المجهر في العديد من المختبرات. بالنسبة لهذا البروتوكول ، فهو مناسب بشكل خاص للعينات المغلفة بقطرات مستحلب. قد يكون من الصعب تحقيق مجالات رؤية كبيرة ومسطحة باستخدام طلاء سطح الفاعل بالسطح الموصوف في هذا البروتوكول ، لذلك بالنسبة للعينات ثنائية الأبعاد ، غالبا ما يكون الخياران 2 و 3 أكثر قابلية للتكرار. قد تتسبب هندسة القناة أيضا في اختلاط غير متساو للمكونات المضافة في أوقات لاحقة ، مثل الميوسين.
    1. ضع قطعتين من الشريط على الوجهين بالتوازي مع بعضهما البعض عبر عرض شريحة المجهر لتشكيل حدود قناة Flowcell. يجب أن يكون عرض القناة المتكونة بين قطعتي الشريط حوالي 2 مم.
      ملاحظة: تساعد القنوات الأصغر على منع المستحلبات من التعلق في الجزء الأول من القناة. لعمل ختم جيد ، استخدم قطعا من الشريط أطول بقليل من عرض الشريحة الزجاجية وقم بقصها بعد إنشاء خلية الانسياب.
    2. ضع الغطاء فوق قناة الشريط. تأكد من أن الغطاء عمودي على شريحة المجهر. استخدم غطاء مقاس 30 مم × 40 مم لهذا الغرض لأنه يوفر نتوءا صغيرا عند وضعه على شريحة.
    3. لإنشاء ختم جيد والتخلص من الجيوب الهوائية بين الشريط والغطاء ، اضغط لأسفل على منطقة الغطاء الملامسة للشريط على الوجهين.
      ملاحظة: احرص على عدم كسر زلة الغطاء أثناء الضغط حول الحواف. يعمل فرك المنطقة بجسم مستدير ، مثل نهاية علامة مغطاة ، بشكل جيد للضغط على الشريط.
    4. باستخدام شفرة حلاقة ، قم بقص أي شريط زائد من شريحة المجهر والغطاء ، بحيث يكون الشريط المرئي الوحيد داخل قناة العينة.
      ملاحظة: كن حذرا عند إكمال هذه الخطوة ، حيث من السهل كسر الغطاء عن طريق الخطأ أثناء محاولة إزالة الشريط.
  2. الخيار 2: أسطوانة على غطاء غير معالج
    ملاحظة: هذا الخيار مناسب للعينات المستوية ثنائية الأبعاد. إنه مناسب لإضافة مكونات في أوقات مختلفة أثناء تجارب الفحص المجهري. لا ينبغي استخدام غرفة العينة هذه للمستحلبات ، التي تكريم بدلا من الرواسب ، مما يجعل التصوير صعبا.
    1. اشطف الغطاء وأسطوانة استنساخ الزجاج بالماء والإيثانول والماء. يجف في الهواء.
    2. باستخدام طبقة رقيقة من الإيبوكسي لمدة 5 دقائق ، قم بلصق أسطوانة استنساخ الزجاج على الغطاء.
      ملاحظة: من المفيد تطبيق القوة على الأسطوانة أثناء جفاف الإيبوكسي عن طريق وضع جسم نظيف فوق الأسطوانة. يمكن أن يعمل غطاء طبق بتري الصغير أو صندوق الغطاء بشكل جيد.
  3. الخيار 3: أسطوانة على غطاء مغلف بالسيلان
    ملاحظة: ينتج عن هذا الخيار بشكل متكرر منطقة كبيرة مستوية في وسط الغرفة ويقلل من التدفق السائب للعينة. لتحقيق ذلك ، تم إنشاء منطقة كارهة للماء محاطة بمنطقة محبة للماء على الغطاء ، مما ينتج عنه عينة نهائية تحتوي على شبكة أكتين في منطقة مختللة ومحصورة حيث يرتكز الأكتين على المناطق المحبة للماء على حافة الغرفة. لا ينبغي استخدام غرفة العينة هذه للمستحلبات ، التي تغمرها بدلا من الرواسب في المخزن المؤقت ، مما يجعل التصوير صعبا.
    1. قم بإعداد أغطية بطبقة سيلان لجعلها كارهة للماء.
      1. قم بتحميل الأغطية الزجاجية النظيفة في رف من الفولاذ المقاوم للصدأ. تنظيف الزجاج عن طريق صوتنة في المنظفات أو الإيثانول إذا رغبت في ذلك.
      2. في طبق تلطيخ زجاجي ، قم بتخفيف تريميثوكسي (أوكتيل) سيلان إلى محلول 2٪ في الأيزوبروبانول.
      3. اغمر الأغطية في المحلول لمدة 10 دقائق.
      4. للشطف ، استبدل المحلول بالماء. ارفع رفوف الغطاء وأعد غمرها ست مرات. كرر العملية أربع مرات إضافية مع تبادل المياه بينهما.
      5. قم بتغطية الرفوف بورق الألمنيوم لحماية الأغطية من الغبار وتجفيفها عند 25-30 درجة مئوية.
    2. ضع غطاء معالج بالأوكتيل سيلان في قاع طبق بتري زجاجي أو أي وعاء زجاجي مفتوح آخر يتناسب مع منظف الأشعة فوق البنفسجية (UV) والأوزون.
    3. باستخدام الملقط ، ضع مربعا من PTFE مقاس 2 مم × 2 مم (مقطوع من ورقة) على الغطاء الذي سيكون بمثابة قناع للمعالجة التالية للأشعة فوق البنفسجية والأوزون
    4. عالج الغطاء باستخدام الأشعة فوق البنفسجية والأوزون لمدة 10 دقائق. هذه العملية تجعل الزجاج محبا للماء في المناطق المكشوفة التي لا يغطيها قناع PTFE.
    5. قم بإزالة الطبق بعناية دون إزعاج الغطاء أو مربع PTFE. قم بلصق أسطوانة استنساخ زجاجية على الغطاء باستخدام الايبوكسي لمدة 5 دقائق. تأكد من أن الأسطوانة تحيط بمربع PTFE ، والذي يمكن إزالته بالملقط بعد جفاف الإيبوكسي.
      ملاحظة: يمكن إعادة استخدام مربع PTFE في التجارب المستقبلية.

5. تجميع شبكة الأكتين

ملاحظة: ما يلي لتحضير عينة سعة 50 ميكرولتر. بالنسبة لعينات الأسطوانة ، يمكن أن يقلل الحجم الأكبر من آثار الغضروف المفصلي ويزيد من ثبات العينة.

  1. إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، أضف 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت 10x F ، ddH2O ضروري لرفع الحجم النهائي إلى 50 ميكرولتر ، 1 ميكرولتر من 25٪ فول ٪ بيتا ميركابتو إيثانول ، 1 ميكرولتر من 225 مجم / مل جلوكوز ، 1 ميكرولتر من خليط من الجلوكوز أوكسيديز (135 مجم / مل) والكاتالاز (85،000 وحدة / مل) ، 1 ميكرولتر من 25 ملي مولار ATP ، و 10 ميكرولتر من 2 بالوزن 15 سنتيبواز ميثيل السليلوز. مزيج البيبت جيدا.
    ملاحظة: بيتا ميركابتو إيثانول هو مادة سامة. تجنب الانسكابات والتلوث. توجد الكواشف الجلوكوز أوكسيديز والكاتالاز والجلوكوز وبيتا ميركابتو إيثانول في العينة لإنشاء نظام كسح الأكسجين. يتم تحضير محلول مخزون ميثيل السليلوز عن طريق التقليب عند 4 درجات مئوية ويمكن تخزينه عند 4 درجات مئوية لعدة أسابيع. يمكن أن يترسب ميثيل السليلوز من المحلول ويجب إعادة تحضيره إذا كان هناك راسب مرئي أو إذا كان ازدحام الأكتين ضعيفا.
  2. اختياري: أضف بروتين الربط المتقاطع (0.1-1 بروتين متشابك لكل 1 مونومر أكتين). مزيج البيبت.
    ملاحظة: يمكن أيضا إضافة بروتين (بروتينات) الربط المتقاطع بعد بلمرة الأكتين والسماح لها بالارتباط لمدة 10-20 دقيقة قبل إضافة الميوسين. يفضل هذا لتركيزات الربط المتقاطع التي تكون عالية بما يكفي لتجميع خيوط الأكتين - يتم توزيع الحزم بشكل متساو ومتكرر في واجهة الماء الخافض للتوتر السطحي. غرفة عينة الأسطوانة قابلة لإضافة الوصلة المتشابكة بعد بلمرة الأكتين.
  3. أضف الفالودين (1 فالودين لكل 1-3 مونومرات أكتين) ، إذا رغبت في ذلك. مزيج البيبت.
  4. في أنبوب منفصل ، امزج الأكتين غير المسمى والملصق بحيث عندما يضاف مزيج الأكتين إلى عينة 50 ميكرولتر ، سيكون التركيز الكلي 2.64 ميكرومتر. استخدم نسبة 1 مونومر أكتين مسمى لكل 9 مونومرات أكتين غير مصنفة. مزيج البيبت.
    ملاحظة: ستبدأ مونومرات الأكتين في البلمرة عند إضافتها إلى محلول العينة. يمكن أن تؤدي إضافة الأكتين المسمى وغير المسمى بشكل منفصل إلى ظهور الأكتين المرقط بمناطق مظلمة وفلورية على طول محيط خيوط واحدة. يتم خلط مخزون مونومر الأكتين لضمان خيوط الأكتين ذات العلامات الموحدة. تم وصف تنقية الأكتين ووضع العلامات عليه في31.
  5. اختياري: لعمل بلورات سائلة أو تجارب أخرى باستخدام خيوط الأكتين القصيرة ، أضف بروتين السد إلى مزيج الأكتين من الخطوة 5.4. تعتمد الكمية الدقيقة لبروتين السد على الجزء النشط من البروتين وطول خيوط الأكتين المستهدفة ، ولكن عادة ما يكون حوالي 1-10 مول٪ من البروتين السد (فيما يتعلق بالأكتين) كافيا لإنشاء خيوط قصيرة لتجارب البلورات السائلة. تم وصف تنقية البروتين السد في36.
  6. لبدء بلمرة الأكتين ، أضف مزيج الأكتين إلى محلول F-buffer ومزيج الماصات.
  7. اترك الأكتين لبلمرة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق في RT ، ثم أضفه إلى خلية العينة بعد 10-30 دقيقة.
  8. اختياري: في حالة تحضير عينة أسطوانة، اسحب المحلول بالكامل في طرف ماصة بحيث يكون جاهزا للسحب في الخطوة 7.4 من تحميل حجرة عينة الأسطوانة.

6. اختياري: تحضير المستحلبات

ملاحظة: من الملائم في بعض الأحيان تحضير هذه العينات في مستحلبات ، والتي توفر غرفة عينة محصورة. يتم تحضير المستحلبات باستخدام كواشف مماثلة مثل Chowdhury et al. ، مما ينتج عنه طور مستمر للزيت يحتوي على مستحلب مائي بوساطة خافض للتوترالسطحي 41 قطرة. في وجود عامل استنفاد ، مثل ميثيل السليلوز ، المستخدم في هذا البروتوكول ، سوف تزدحم عينات الأكتين في الواجهة المائية لهذا المستحلب. بالنسبة للعينات التي يستند إليها هذا البروتوكول ، لا يظهر فرق بين بلمرة الأكتين قبل أو بعد إضافته إلى المستحلبات. ومع ذلك ، فقد أفيد أن خطوة البلمرة مهمة يجب مراعاتها في بعض تجارب التغليف42.

  1. أضف 3.5 ميكرولتر من الزيت الخافض للتوتر السطحي إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. استخدم أنبوب طرد مركزي دقيق شفاف أو فاتح اللون أو شفاف لهذه الخطوة.
  2. بدون خلط ، أضف 5 ميكرولتر من محلول الأكتين إلى الجزء العلوي من طبقة الزيت الخافض للتوتر السطحي. أغلق أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
  3. أثناء الإمساك بالجزء العلوي من أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، قم بنفض الغبار على الحافة السفلية للأنبوب لإنشاء رغوة بها مستحلبات مرئية في البداية. استمر في تحريك الأنبوب حتى لا تظهر الرغوة أي ميزات مميزة عند الإضاءة الخلفية ، مما يشير إلى المستحلبات الدقيقة.
    ملاحظة: عند تحضير عينة في المستحلبات ، يجب أن تكون خلية التدفق أو غرفة العينة الأخرى جاهزة قبل عمل عينة الأكتين. لا تعمل غرفة عينة الأسطوانة الزجاجية بشكل جيد مع المستحلبات لأنها ستتحول إلى واجهة الهواء بدلا من الرواسب على سطح الغطاء الزجاجي.

7. قم بتحميل غرفة العينة (غرف الأسطوانة)

  1. Pipet 5 ميكرولتر من محلول الزيت الخافض للتوتر السطحي في قاع حجرة الأسطوانة الزجاجية
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن عمل عينات عن طريق تخميل السطح بطبقة ثنائية دهنية مدعومة11،29،30.
  2. قم بإمالة الغطاء وتدويره ببطء بحيث يتم طلاء سطح الغطاء والأسطوانة السفلية بمحلول الفاعل بالسطح.
  3. قم بإزالة محلول الزيت الزائد الخافض للتوتر السطحي باستخدام ماصة للحصول على طبقة الزيت رقيقة قدر الإمكان مع عدم السماح للزيت المتطاير بالتبخر تماما.
  4. أضف محلول العينة على الفور من الخطوة 5.7 إلى الغرفة.
  5. قم بتغطية الغرفة بقطعة صغيرة من شريط PTFE لمنع التبخر والتدفق.

8. البديل: قم بتحميل غرفة العينة (خلية التدفق)

  1. للتحضير لتحميل خلية التدفق ، امزج كمية صغيرة من 5 دقائق من الايبوكسي. عادة ما يكون القطرة التي تقل مساحتها عن 0.5 سم2 كافية.
  2. لوضع العينة في خلية التدفق ، قم أولا بإدخال 1-3 ميكرولتر من محلول الزيت الخافض للتوتر السطحي في قناة العينة لخلية التدفق لإنشاء سدادة صغيرة من المحلول تبلل القناة.
  3. قم على الفور بإدخال حجم من محلول العينة أو تعليق المستحلب ببطء في مدخل خلية التدفق لملء القناة. عادة ، بالنسبة للقناة التي يبلغ حجمها حوالي 2 مم ، يكون الحجم حوالي 8 ميكرولتر. المدخل هو الجانب الذي تمت إضافة محلول الزيت الخافض للتوتر السطحي إليه.
    1. إذا تجاوز حجم العينة حجم خلية التدفق ، فقم بفك العينة عبر خلية التدفق عن طريق وضع مسح أو ورق ترشيح خال من النسالة في الطرف الآخر من القناة.
    2. إذا انحسر الغضروف المفصلي لمحلول الزيت الخافض للتوتر السطحي ، مما أدى إلى وجود فجوة هوائية ، فقم أولا بإمالة خلية التدفق لإزالة فجوة الهواء عند المدخل قبل إضافة العينة.
  4. إذا لزم الأمر ، أضف محلول إضافي للتوتر السطحي بالزيت حتى يختفي الهواء مرئيا في القناة أو لدفع العينة (خاصة للمستحلبات) إلى أبعد من ذلك في القناة.
  5. أغلق كل جانب من جوانب القناة بالإيبوكسي لمدة 5 دقائق (مختلط مباشرة قبل تحميل خلية التدفق).

9. صورة وإضافة الميوسين

  1. قم بتركيب العينة على المجهر وابدأ التصوير بفاصل زمني للأكتين باستخدام هدف 20x أو 40x أو 60x أو 100x مع الغمر بالزيت أو الماء لتوفير فتحة رقمية كبيرة بما يكفي للتصوير عالي الدقة. في حالة البلمرة في غرفة العينة ، اترك البلمرة لمدة ~ 30 دقيقة أو حتى لا يكون هناك إطالة أو حركة خيوط مرئية.
  2. اختياري: إضافة أداة الربط المتقاطع.
  3. أضف الميوسين من خلال الخيارين 1 أو 2 أدناه.
    1. أضف الميوسين على شكل ثنائي ماصة إلى الجزء العلوي من العينة (لا يلزم الخلط لأن ثنائي الميوسين سينتشر).
    2. أضف الميوسين كخيوط مبلمرة مسبقا. تمزج الماصة ما يقرب من نصف الحجم الكلي ببطء شديد لتجنب إزعاج الأكتين المزدحم.
      ملاحظة: قد تختلف الطريقة المثالية للميوسين بالإضافة إلى الحصول على كثافة أو حجم الخيوط المطلوبة على سطح الغطاء باختلاف معماريات الأكتين وتحتاج إلى تحديدها تجريبيا.
  4. ابدأ التصوير بفاصل زمني.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن تشكيل مجموعة واسعة من مجموعات الأكتين في أنظمة نموذجية باستخدام بروتينات منقاة باتباع الإستراتيجية العامة الموضحة في هذه الطرق ، حيث يتم بلمرة الأكتين إلى خيوط في وجود بروتينات ملحقة تعدل بنية التجميع (الشكل 1). عندما يتم بلمرة الأكتين إلى خيوط بدون روابط متشابكة أو بروتين مغطى ، فإنه يشكل شبكات خيوط متشابكة (الشكل 1 أ). تؤدي إضافة الرابط المتقاطع إلى الشبكات المتشابكة إلى تكوين شبكات شبه ثنائية الأبعاد أو شبكات من الحزم (الشكل 1 ب

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك العديد من الاعتبارات لإنتاج مجموعات أكتين قابلة للتكرار. أحد أهم البيانات لإنتاج بيانات قابلة للتكرار وقابلة للتحليل هو سطح الغطاء الزجاجي لغرفة العينة. البروتينات الموجودة في عينات الأكتين في المختبر ، وخاصة الميوسين ، لزجة للغاية وستلتصق بالأسطح الزجاجية غير المعالجة أو سيئة المعالجة ، مما يجعل العينة غير صالحة للاستخدام (الشكل 5 أ). لقد ناقشنا طريقة قياسية لتحضير السطح لإنتاج عينات قابلة للتكرار من خلال تخميل غطاء سيلاني بطبقة خافضة للتوتر ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تعارض للإفصاح عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر تود ثورنسون ومايك موريل وجنيفر روس وباتريك ماكول وأعضاء آخرين في مختبرات غاردل وكوفار (جامعة شيكاغو) على المناقشات المفيدة أثناء تطوير الأساليب. تم دعم MAC و SR جزئيا من قبل منح فرص البحث الجامعية لكلية الحوسبة الهندسية والعلوم التطبيقية بجامعة كليمسون ، وتم دعم VJ AB من قبل Clemson Biophysics REU بموجب جائزة NSF # 2349368 بتمويل من برامج DBI و EPSCoR. تم دعم هذا العمل أيضا جزئيا من قبل برنامج EPSCoR التابع للمؤسسة الوطنية للعلوم في إطار جائزة NSF #OIA-1655740 ، جزئيا من خلال برنامج Clemson Creative Inquiry + Bachelor Research Program.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.6 مل أنبوب الطرد المركزيفيشر ساينتفيك05-408-123
008-الفلوروخافض للتوتر السطحيRAN Biotechnologies00115081361-6525بديل للمحلول المخلوط
مسبقا 008-FluoroSurtuant في HFE7500RAN Biotechnologies008-FluoroSurtuant-2wtH-50Gمحلول مخلوط مسبقا
2-mercaptoethanol (& beta ؛ -mercaptoethanol)Sigma Aldrich63689رقم سجل المستخلصات الكيميائية: 60-24-2
محلول المخزون: 25 ملي مولار في ماء MilliQ ، مخزن عند 4 درجات ؛ C
4- (2-هيدروكسي إيثيل) بيبيرازين -1-حمض الإيثان السلفونيك (HEPES)سيجما ألدريتشH3375رقم CAS: 7365-45-9
5 دقائق إيبوكسيديفكون14250
أكتينالهيكل الخلوي ، Inc.AKL99-A>99٪ عضلة هيكلية نقية للأرانب
(بديل للتنقية)
أكتين (مسمى الرودامين)الهيكل الخلوي ، Inc.AR05-Aعضلة الهيكل العظمي للأرانب
(بديل للتنقية)
الأدينوزين 5 & رئيس ;-ثلاثي الفوسفات (ATP)سيجما ألدريتشA6419رقم CAS: 34369-07-8
محلول المخزون: 25 ملي مولار في ماء MilliQ ، تخزينه عند -20 درجة ؛ C
يحفظ مجمدا لتجنب التحلل المائي
كلوريد الكالسيوم (CaCl2)Sigma AldrichC5670رقم CAS: 10043-52-4
السد بروتين (الفأر)منقى من الإفراط في التعبير في E.coli < / em> مع HisTag
محلول المخزون: 20 ملي مولار في تغطية المخزن المؤقت للبروتين عند -80 درجة ؛ C
Catalase من كبد البقرSigma AldrichC9322رقم CAS: 9001-05-2
محلول المخزون: 85 ku / مل ، تخزين مع الجلوكوز أوكسيديز عند -20 درجة ؛ C
غطاءزجاجي فيشربراند12544Cبورسليكات ، # 1.5 ، 24 مم × 40 مم
Fisherbrand ليس Fisher Finest
D- (+) -GlucoseSigma AldrichG8270رقم CAS: 50-99-7
محلول المخزون: 225 مجم / مل في ماء MilliQ ، يخزن في -20 درجة ؛ C
Dithiothreitol (DTT)Sigma Aldrich3860-OPرقم CAS: 3483-12-3
محلول المخزون: 1 متر في ماء MilliQ ، يخزن في -20 درجة ؛
C شريط مزدوج الوجهين3M3136
إيثيل ألكوهول 200 دليلPHARMCO111000200رقم CAS: 64-17-5
200 دليل
على الإيثيلين جلايكول مكرر (2-أمينوإيثيل إيثر) -N ، N ، N ، N & Prime ؛ N & N ؛ حمض رباعي الأسيتيك (EGTA)سيجما ألدريتشE3889رقم CAS: 67-42-5
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)سيجما ألدريتشE9884رقم سجل المستخلصات الكيميائية: 60-00-4
الجلوكوز أوكسيديزسيجما ألدريتش345386رقم سجل المستخلصات الكيميائية: 9001-37-0
محلول المخزون: 135 مجم / مل في ماء MilliQ ، يخزن مع الكاتلاز عند -20 درجة ؛ C
GlycerolSigma Aldrich356352Mرقم CAS: 56-81-5
ImidazoleFisher Bioreagents BP305-50رقم CAS: 288-32-4
كلوريد المغنيسيوم (MgCl2< / sub>)الكواشف الحيوية فيشر   ؛BP214رقم CAS: 7786-30-3 ، 7791-18-6
ميثيل السليلوزسيجما ألدريتشM0512رقم CAS: 9004-67-5
15 سنتيبواز
مجهر شرائح علومالمجهر الإلكتروني العادي / ختم الذهب63710-05  ؛ 3 "× 1" ، 1 مم
سمك MilliQ ماءMilliporeCUFBI001ماء عالي النقاء
Novec-7500 سائل هندسي3M7100134816بديل لمحلول خلط
مسبقا كلوريد البوتاسيوم (KCl)Sigma AldrichP3911رقم CAS: 7447-40-7
فوسفات البوتاسيوم (KPO4< / sub>)Sigma AldrichP3786رقم CAS: 7758-11-4
مسحوق الأسيتون للعضلات الهيكلية للأرانبPel-Freez Biologicals41995-1يستخدم عند تنقية الأكتين (بديل للشراء)
تخزين حوالي 30 ملي مولار في الأكتين Buffer G عند -80 درجة ؛ C
أزيد الصوديومسيجما ألدريتش71289رقم سجل المستخلصات الكيميائية: 26626-22-8
تتراميثيل رودامين-C6-ماليميدAnaSpecAS-81445رقم سجل المستخلصات الكيميائية: 174568-68-4 يستخدم عند تنقية الأكتين (بديل للشراء)
تخزين حوالي 30 ملي مولار في الأكتين Buffer G عند -80 درجة مئوية. يستخدم عند وضع العلامات على الأكتين (بديل للشراء)
حمض الهيدروكلوريك تريس (تريس هيدروكلوريك كلسيجما ألدريتش648317رقم سجل المستخلصات الكيميائية: 1185-53-1
بالموجات فوق الصوتية حمامإيمرسون برانسون & nbsp ؛CPX2800H
الدقيق )

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marchetti, M. C., et al. Hydrodynamics of soft active matter. Rev Mod Phys. 85 (3), 1143-1189 (2013).
  2. Needleman, D., Dogic, Z. Active matter at the interface between materials science and cell biology. Nat Rev Mater. 2 (9), 17048(2017).
  3. Murrell, M., Oakes, P. W., Lenz, M., Gardel, M. L. Forcing cells into shape: the mechanics of actomyosin contractility. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (8), 486-498 (2015).
  4. Cáceres, R., Abou-Ghali, M., Plastino, J. Reconstituting the actin cytoskeleton at or near surfaces in vitro. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1853 (11), 3006-3014 (2015).
  5. Burla, F., Mulla, Y., Vos, B. E., Aufderhorst-Roberts, A., Koenderink, G. H. From mechanical resilience to active material properties in biopolymer networks. Nat Rev Phys. 1 (4), 249-263 (2019).
  6. Bezanilla, M., Gladfelter, A. S., Kovar, D. R., Lee, W. -L. Cytoskeletal dynamics: a view from the membrane. J Cell Biol. 209 (3), 329-337 (2015).
  7. Alfaro-Aco, R., Petry, S. Building the microtubule cytoskeleton piece by piece. J Biol Chem. 290 (28), 17154-17162 (2015).
  8. Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
  9. Foster, P. J., Fürthauer, S., Shelley, M. J., Needleman, D. J. Active contraction of microtubule networks. eLife. 4, e10837(2015).
  10. Murrell, M. P., Gardel, M. L. F-actin buckling coordinates contractility and severing in a biomimetic actomyosin cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (51), 20820-20825 (2012).
  11. Weirich, K. L., et al. Liquid behavior of cross-linked actin bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (9), 2131-2136 (2017).
  12. Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state. Nat Phys. 9 (9), 591-597 (2013).
  13. Keber, F. C., et al. Topology and dynamics of active nematic vesicles. Science. 345 (6201), 1135-1139 (2014).
  14. Zhang, R., Kumar, N., Ross, J. L., Gardel, M. L., De Pablo, J. J. Interplay of structure, elasticity, and dynamics in actin-based nematic materials. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (2), E124-E133 (2018).
  15. Schaller, V., Weber, C., Semmrich, C., Frey, E., Bausch, A. R. Polar patterns of driven filaments. Nature. 467 (7311), 73-77 (2010).
  16. Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility. Physiol Rev. 94 (1), 235-263 (2014).
  17. Bendix, P. M., et al. A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks. Biophys J. 94 (8), 3126-3136 (2008).
  18. Köhler, S., Schaller, V., Bausch, A. R. Structure formation in active networks. Nat Mater. 10 (6), 462-468 (2011).
  19. Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: dynamics of patterning and self-organization. Phys Biol. 3 (4), 264-273 (2006).
  20. Svitkina, T. M. Actin cell cortex: structure and molecular organization. Trends Cell Biol. 30 (7), 556-565 (2020).
  21. Reymann, A. -C., et al. Actin network architecture can determine myosin motor activity. Science. 336 (6086), 1310-1314 (2012).
  22. Reymann, A. -C., et al. Nucleation geometry governs ordered actin network structures. Nat Mater. 9 (10), 827-832 (2010).
  23. Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments. eLife. 2, e00116(2013).
  24. Liebe, N. L., et al. Bioinspired membrane interfaces: controlling actomyosin architecture and contractility. ACS Appl Mater Interfaces. 15 (9), 11586-11598 (2023).
  25. Thoresen, T., Lenz, M., Gardel, M. L. Thick filament length and isoform composition determine self-organized contractile units in actomyosin bundles. Biophys J. 104 (3), 655-665 (2013).
  26. Stachowiak, M. R., et al. Self-organization of myosin II in reconstituted actomyosin bundles. Biophys J. 103 (6), 1265-1274 (2012).
  27. Winkelman, J. D., Bilancia, C. G., Peifer, M., Kovar, D. R. Ena/VASP enabled is a highly processive actin polymerase tailored to self-assemble parallel-bundled F-actin networks with fascin. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (11), 4121-4126 (2014).
  28. Stam, S., et al. Filament rigidity and connectivity tune the deformation modes of active biopolymer networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (47), E10037-E10045 (2017).
  29. Weirich, K. L., Stam, S., Munro, E., Gardel, M. L. Actin bundle architecture and mechanics regulate myosin II force generation. Biophys J. 120 (10), 1957-1970 (2021).
  30. Scholz, M., Weirich, K. L., Gardel, M. L., Dinner, A. R. Tuning molecular motor transport through cytoskeletal filament network organization. J Soft Mat. 16 (8), 2135-2140 (2020).
  31. Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. J Biol Chem. 246 (15), 4866-4871 (1971).
  32. Li, Y., et al. The F-actin bundler αactinin Ain1 is tailored for ring assembly and constriction during cytokinesis in fission yeast. Mol Biol Cell. 27 (11), 1821-1833 (2016).
  33. Skau, C. T., Kovar, D. R. Fimbrin and tropomyosin competition regulates endocytosis and cytokinesis kinetics in fission yeast. Curr Biol. 20 (16), 1415-1422 (2010).
  34. Vignjevic, D., et al. Role of fascin in filopodial protrusion. J Cell Biol. 174 (6), 863-875 (2006).
  35. Margossian, S. S., Lowey, S. Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle. Methods Enzymol. 85, 55-71 (1982).
  36. Palmgren, S., Ojala, P. J., Wear, M. A., Cooper, J. A., Lappalainen, P. Interactions with PIP2, ADPactin monomers, and capping protein regulate the activity and localization of yeast twinfilin. J Cell Biol. 155 (2), 251-260 (2001).
  37. Craig, S. W., Lancashire, C. L., Cooper, J. A. Preparation of smooth muscle alphaactinin. Methods Enzymol. 85, 316-321 (1982).
  38. Verkhovsky, A. B., Borisy, G. G. Nonsarcomeric mode of myosin II organization in the fibroblast lamellum. J Cell Biol. 123 (3), 637-652 (1993).
  39. LeBel, R. G., Goring, D. A. I. Density, viscosity, refractive index, and hygroscopicity of mixtures of water and dimethyl sulfoxide. J Chem Eng Data. 7 (1), 100-101 (1962).
  40. Lengsfeld, A. M., Lowt, I., Wielandt, T., Dancker, P., Hasselbach, W. Interaction of phalloidin with actin. Proc Natl Acad Sci U S A. 31, 846(1974).
  41. Chowdhury, M. S., et al. Dendronized fluorosurfactant for highly stable waterinfluorinated oil emulsions with minimal interdroplet transfer of small molecules. Nat Commun. 10 (1), 4546(2019).
  42. Alvarado, J., Mulder, B. M., Koenderink, G. H. Alignment of nematic and bundled semiflexible polymers in cellsized confinement. J Soft Mat. 10 (14), 2354-2364 (2014).
  43. Weirich, K. L., Israelachvili, J. N., Fygenson, D. K. Bilayer edges catalyze supported lipid bilayer formation. Biophys J. 98 (1), 85-92 (2010).
  44. Tan, A. J., et al. Topological chaos in active nematics. Nat Phys. 15 (10), 1033-1039 (2019).
  45. Nasirimarekani, V., Strübing, T., Vilfan, A., Guido, I. Tuning the properties of active microtubule networks by depletion forces. Langmuir. 37 (26), 7919-7927 (2021).
  46. Heymann, E. Studies on solgel transformations: I. the inverse solgel transformation of methylcellulose in water. Trans Faraday Soc. 31, 846(1935).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Tuning the Contractility and Deformation Modes of Active Actin-Based Assemblies In Vitro: From Two-Dimensional Active Networks to Liquid Crystal Drops
Posted by JoVE Editors on 8/28/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68127

Tags

Actin Based AssembliesActin PolymerizationMyosin II FilamentsFluorescence MicroscopyLiquid Crystal DropsCrosslinked Actin NetworksTwo Dimensional NetworksNetwork ContractilityCapping ProteinTime Lapse Imaging

Related Articles