يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل واستزراع خلايا مولر الشبكية الأولية من فئران Sprague-Dawley (SD)

1.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68129

⸱

يونيو 17, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Eye School of Chengdu University of TCM, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Sichuan Province Ophthalmopathy Prevention & Cure and Visual Function Protection with TCM Laboratory, Eye School of Chengdu University of TCM, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Retinal Image Technology and Chronic Vascular Disease Prevention & Control and Collaborative Innovation Center, Eye School of Chengdu University of TCM, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Department of Ophthalmology, Ziyang Hospital of Traditional Chinese Medicine, 5Department of Ophthalmology, Ineye Hospital of Chengdu University of TCM, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

في هذه المقالة

ملخص

تقدم هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لعزل خلايا مولر الشبكية الأولية من فئران Sprague-Dawley (SD) حديثي الولادة. يتضمن الإجراء استئصال مقل العيون ، وتشريح أنسجة الشبكية ، واستخراج الخلايا وتحديدها ، والاعتبارات الرئيسية لزراعة الخلايا اللاحقة.

الملخص

تلعب خلايا مولر الشبكية (RMCs) دورا مهما في توفير الدعم الهيكلي وتنظيم الوظائف المختلفة داخل شبكية العين. كمكون أساسي للبيئة المكروية للشبكية ، تؤدي RMCs العديد من الوظائف الحيوية. من خلال القنوات الأيونية الوفيرة ، والروابط ، والمستقبلات ، وناقلات الغشاء ، وأنظمة الإنزيم ، تساهم هذه الخلايا في إفراز الناقل العصبي والعامل الغذائي ، وتنظيم عملية التمثيل الغذائي للشبكية ، والحفاظ على توازن أيون الماء. والجدير بالذكر أن RMCs قد تم تحديدها مؤخرا كمصدر مهم للخلايا الجذعية المتجددة للشبكية الداخلية ، مما يوفر أهدافا علاجية جديدة لعلاج الأمراض التنكسية في الشبكية. لذلك ، فإن دراسة RMCs ضرورية لفهم الآليات المرضية الكامنة وراء اضطرابات الشبكية. تضع هذه الدراسة بشكل منهجي بروتوكولا تجريبيا موحدا يتضمن هضم التربسين وتنقية RMCs الأولية ، والملاحظة المورفولوجية باستخدام الفحص المجهري البصري المقلوب وتلوين الهيماتوكسيلين واليوزين (HE) ، وتحديد البروتين المحدد من خلال تلطيخ التألق المناعي ، وتحليل نقاء الخلية عن طريق قياس التدفق الخلوي. يعمل هذا البروتوكول كمرجع قيم لكل من الأبحاث الأساسية والتطبيقات السريرية المتعلقة ب RMCs ، مما يدعم استكشاف آلياتها في أمراض الشبكية وتعزيز تطوير الاستراتيجيات العلاجية.

المقدمة

تشكل الخلايا الدبقية في شبكية العين (RMCs) ، وهي الخلايا الدبقية السائدة في شبكية العين ، جوهر وحدة الأوعية الدموية العصبية في الشبكية1،2. تمتد RMCs على طول سمك الشبكية بالكامل تقريبا ، وجميع الخلايا العصبية في الشبكية والأوعية الدموية الدقيقة تقريبا. تمتد عملياتهم لأعلى إلى الغشاء المحدد الداخلي (ILM) ، وتشكل أقدام نهائية قمية ، وهبوطا إلى الغشاء المحدد الخارجي (OLM) ، حيث يطورون ميكروفيليمتخصص 3. تمكن هذه البنية الفريدة RMCs من العمل كسقالة هيكلية أساسية لتنظيم الشبكية4،5.

يتم إثراء RMCs بالقنوات الأيونية ، والروابط ، والمستقبلات ، وناقلات الغشاء ، والإنزيمات6 ، وتشارك في استقلاب الجلوكوز في الشبكية عن طريق تحلل السكر7. تنظم قنوات أيونات البوتاسيوم (Kir2.1 ، Kir4.1) وبروتينات القناة المائية (AQP4 ، AQP9 ، AQP11) بشكل تعاوني توازن الأيونات والماء عبر غشاء الخلية ، مما يحافظ على التوازن الفسيولوجي لشبكيةالعين 7. بالإضافة إلى ذلك ، تمتص RMCs وتزيل الناقلات العصبية التي تطلقها الخلايا العصبية ، بما في ذلك الغلوتامات وحمض γ-أمينوبوتيريك (GABA) والجلايسين7،8.

يمكن للحالات المرضية مثل اعتلال الشبكية السكري7 ، والزرق9 ، والتهاب الشبكية الصباغي10 أن تلحق الضرر ب RMCs ، وتعطل حاجز الشبكية الدموي ، وتؤدي إلى الالتهاب ، وتزيد من نفاذية الأوعية الدموية ، وتضعف وظيفة الشبكية. يتم التعرف على RMCs أيضا كمصادر جوهرية كامنة لخلايا تجديد الشبكية11،12. في الأسماك وبعض البرمائيات ، يمكن أن تتمايز RMCs إلى خلايا سلفية في شبكية العين تحل محل الخلايا العصبية المفقودة بسبب الإصابة13. في شبكية الثدييات البالغة ، تعبر RMCs عن بروتينات العلامات المرتبطة بالخلايا الجذعية14،15 ، مما يمنحها القدرة على التمايز إلى خلايا عصبية في الشبكية واستبدال الخلايا التالفة في الأمراض التنكسية مثل الضمور البقعي المرتبط بالعمر ، والزرق ، واعتلال الشبكية السكري16. تحاكي RMCs الأولية عن كثب حالتها في الجسم الحي ولها قيمة كبيرة في دراسة وعلاج الأمراض التنكسية في الشبكية. ومع ذلك ، تحتوي الأدبيات على عدد قليل من الطرق الراسخة لعزل واستزراع RMCs الأولية ، خاصة من فئران Sprague-Dawley (SD) حديثي الولادة.

يستخدم هذا البروتوكول فئران SD حديثي الولادة البالغة من العمر 3-5 أيام ، دون تفضيل الجنس. في ظل الظروف المعقمة ، يتم استئصال مقل العيون ، ويتم هضم أنسجة الشبكية باستخدام التربسين. ثم يتم عزل RMCs الأولية عن طريق الطرد المركزي والتنقية للزراعة والمرور اللاحقين. كشف التحليل المورفولوجي باستخدام الفحص المجهري البصري المقلوب جنبا إلى جنب مع تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوزين (H & E) أن الخلايا المعزولة أظهرت سمات RMC مميزة. أكد تلطيخ التألق المناعي التعبير عن علامات البروتين الخاصة ب RMC ، بما في ذلك سينثيتاز الجلوتامين (GS) ، والبروتين المرتبط بالريتينالديهايد الخلوي (CRALBP) ، وفيمنتين ، وأكوابورين -4 (AQP4) ، وقناة البوتاسيوم المقوم الداخلي 4.1 (Kir4.1). أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي بعد وضع العلامات بالأجسام المضادة GS و CRALBP نقاء خلية بنسبة ≥90٪ ، والذي يفي بالمعايير المعمول بها للتجارب البيولوجية القائمة على RMC ويضمن الملاءمة للدراسات الوظيفية اللاحقة. خلال العملية التجريبية ، أظهرت الخلايا في المقطع الرابع انخفاضا في الالتصاق بقارورة الثقافة ، والتغيرات المورفولوجية ، وعلامات الشيخوخة ، مما أدى في النهاية إلى موت الخلايا. لذلك ، تم استخدام الخلايا فقط من المقاطع الثلاثة الأولى في التجارب اللاحقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أجريت جميع التجارب على وفقا لبيان ARVO لاستخدام في أبحاث طب العيون والرؤية وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات بجامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي (رقم الأخلاقيات: 2024069). تم استخدام خمسين فأرا محددا خاليا من مسببات الأمراض (SPF) من Sprague-Dawley (3-5 أيام ، الجنس غير محدد ، وزن الجسم 7-10 جم) في الدراسة. تم الحصول على تجاريا وإيوائها في مركز التجريبية بجامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي (رقم ترخيص استخدام المنشأة: SYXK [Sichuan] 2024-049) في ظل ظروف معملية قياسية. وترد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد.

1. عزل وثقافة RMCs الأولية

  1. إعداد العناصر التجريبية
    1. عقم العناصر التالية تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة على الأقل على المقعد النظيف قبل الاستخدام: قوارير ثقافة T25 ، وأنابيب ورفوف أجهزة الطرد المركزي ، والماصات والحوامل ، وحاويات النفايات السائلة ، وولاعات السجائر ، ومصابيح الكحول الروحية ، وأقلام التحديد.
    2. قم بتعقيم العناصر التالية عن طريق التعقيم قبل الاستخدام: أطراف ماصة سعة 1 مل ، ولوحة ثني ، وأطباق بتري زجاجية بأغطية ، وملاقط منحنية ، وشبكة نايلون 45 ميكرومتر (300 شبكة) ، وملاقط مسننة ، وملاقط بدون أسنان ، ومقص قرنية صغير.
  2. التحضير البيئي: تطهير البيئة وطاولة العمليات لتشريح مقلة العين بالأشعة فوق البنفسجية لأكثر من 30 دقيقة. رش الكحول على يدي المجرب في كل مرة قبل الدخول وبعد مغادرة المقعد النظيف. اضبط الحاضنة على 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. رش يدي المجرب بالكحول قبل وبعد فتح الحاضنة.
  3. تحضير المحلول: تحضير محلول D-Hank ، محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM عالي الجلوكوز) ، مصل الأبقار الجنيني (FBS ، معطل حراريا) ، محلول البنسلين / الستربتومايسين (100x) ، و 0.25٪ محلول التربسين-EDTA.
    ملاحظة: قم بتسخين DMEM و FBS في حمام مائي 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
    1. قم بإعداد محاليل D-Hank و PBS التي تحتوي على 1٪ بنسلين / ستربتومايسين عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من محلول البنسلين / الستربتومايسين إلى 10 مل من محلول D-Hank أو PBS ، على التوالي.
    2. قم بإعداد وسط الاستزراع الكامل بإضافة 100 ميكرولتر من محلول البنسلين / الستربتومايسين و 2 مل من FBS إلى 10 مل من DMEM عالي الجلوكوز.
      ملاحظة: قم بإعداد المحاليل على مقعد نظيف في المختبر واستخدمها على الفور عندما يكون ذلك ممكنا. قم بتخزين وسط الاستزراع الكامل عند 4 درجات مئوية وتسخينه إلى 37 درجة مئوية قبل كل استخدام. تخلص منه إذا تم تخزينه لأكثر من أسبوع.
  4. إزالة العين
    1. القتل الرحيم للفئران SD حديثي الولادة عن طريق خلع عنق الرحم (بدون اختناق ثاني أكسيد الكربون2) على منضدة عمل معقمة باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا. اغمر الجثث في كحول بنسبة 75٪ لمدة 5 دقائق للتطهير ، ثم انقلها إلى طبق منحني معقم.
    2. صب محلول D-Hank في طبقين زجاجيين مقاس 10 سم.
    3. استخدم ملاقط مسننة لتمزيق الجفن على طول الشق الجني لكشف مقلة العين.
    4. استخدم ملاقط بدون أسنان مثبتة مفتوحة وموازية للشق الجني للضغط على الحجاج. بمجرد الوصول إلى العصب البصري وكشف مقلة العين ، أغلق الملقط لرفع مقلة العين واستخراجها.
    5. ضع مقلة العين في طبق زجاجي مع محلول D-Hank ، واشطفها ، وانقلها إلى طبق آخر بمحلول D-Hank الطازج.
      ملاحظة: تأكد من بقاء مقلة العين سليمة. من الناحية المثالية ، يجب أن يظل جزء من العصب البصري متصلا لتسهيل فصل أنسجة الشبكية.
  5. تسلخ الشبكية
    1. قم بإعداد طبق ثقافة فارغ معقم بغطاء واضبط المجهر.
    2. ضع طبق الثقافة الزجاجية من الخطوة 1.4.5 تحت المجهر. استخدم ملقط العين المجهري المنحني لإصلاح المنطقة الواقعة بين القرنية والعصب البصري برفق لكشف القرنية.
    3. ثقب الوصلة القرنية باستخدام مقص القرنية الدقيقة. اقطع على طول الحافة بطريقة دائرية ، ثم قم بعمل شقوق صلبية متناظرة بطول 2 مم تقريبا. حرر الملقط وأعد تثبيته عند تقاطع العصب البصري والصلبة.
    4. استخدم ملقطا ثانيا للضغط برفق بالقرب من جذر العصب البصري ، وتوجيه الضغط نحو واجهة العصب البصري للقرنية. عندما يظهر نسيج العدسة ، قم بإزالته بعناية ، واستمر في الضغط حتى يظهر نسيج الشبكية.
      ملاحظة: قم بإزالة العدسة بعناية لتجنب استخراج أنسجة الشبكية عن غير قصد.
    5. انقل أنسجة الشبكية المنفصلة إلى طبق ثقافة معقم آخر باستخدام الملقط. غطي الطبق ورشه بالكحول وضعيه على المقعد النظيف.
  6. استخراج RMCs الأولية
    1. قم بتشغيل مفتاح تهوية مقاعد البدلاء النظيف.
    2. افتح غطاء طبق الثقافة. استخدم ماصة بطرف 1 مل لماصة أنسجة الشبكية لأعلى ولأسفل حوالي 15 مرة لتقسيمها إلى قطع صغيرة. أضف 1 مل من 0.25٪ تربسين واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    3. أخرج طبق الثقافة من الحاضنة وضعه على المقعد النظيف. أضف 2 مل من الوسط الكامل والماصة برفق لوقف الهضم.
      ملاحظة: استخدم ضعف حجم التربسين لإنهاء الهضم. على سبيل المثال ، إذا تم استخدام 1 مل من التربسين ، فقم بإنهاء 2 مل من الوسط الكامل.
    4. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال شاشة نايلون 300 شبكة في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. اغسل الطبق باستخدام PBS المحضر واجمع المعلق المتبقي.
    5. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 878 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). استنشق وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات في 2 مل من الوسط الكامل وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 878 × جم لمدة 5 دقائق لتنقية الخلايا.
    6. بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في 2 مل من الوسط الكامل. أضف 3 مل من الوسط الكامل إلى كل قارورة T25 مسبقا ، ثم أضف 1 مل من تعليق الخلية. رج القارورة في نمط متقاطع وضعها في الحاضنة.
    7. قم بإجراء أول تغيير متوسط بعد 48 ساعة من الحضانة. أخرجي القارورة من الحاضنة وضعيها على المقعد النظيف. تخلص من الوسط المستهلك واغسل السطح الملتصق بالخلية ثلاث مرات باستخدام 1 مل من PBS.
      1. أضف 5 مل من الوسط الطازج الكامل. استمر في تغيير الوسط كل يومين حتى يتجاوز التقاء الخلية 90٪ ، ثم تابع الزراعة الفرعية.

2. مرور RMCs

ملاحظة: قم بتمرير الخلايا عندما يتجاوز التقاء 90٪. في هذا البروتوكول ، تتطلب الثقافات الأولية عادة المرور بعد 5-6 أيام بعد العزل. قد يختلف توقيت الممر الأول حسب كثافة الطلاء. اضبط كثافة الخلية على 4 × 103 خلايا / مل وزرع الخلايا في قوارير ثقافة T25. عندما يصل الالتقاء إلى >90٪ بعد 3-4 أيام ، تابع المرور.

  1. قم بإزالة قارورة ثقافة T25 من الحاضنة. تخلص من وسط المزرعة واغسل الخلايا ثلاث مرات ب 1 مل من محلول PBS الذي يحتوي على 1٪ بنسلين / ستربتومايسين.
  2. أضف 1 مل من محلول التربسين EDTA بنسبة 0.25٪ إلى القارورة واحتضنه لمدة 1 دقيقة و 30 ثانية.
  3. راقب القارورة تحت المجهر المقلوب. عندما تظهر الخلايا مستديرة ومنفصلة وتبدأ في الطفو ، قم بإزالة القارورة من الحاضنة. انقله إلى المقعد النظيف وأضف 2 مل من وسط الثقافة الكامل لإنهاء الهضم.
  4. استخدم ماصة لشفط معلق الخلية. ضع الماصة برفق على جدار القارورة لإخراج أي خلايا ملتصقة متبقية.
  5. انقل معلق الخلية بالكامل إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. اشطف جدار القارورة ب 2 مل من PBS الذي يحتوي على 1٪ بنسلين / ستربتومايسين وأضفه إلى نفس الأنبوب. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 878 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
  6. تخلص من المادة الطافية. أعد تعليق حبيبات الخلية في حجم مناسب من الوسط الكامل. قم بتمرير الخلايا بنسبة 1: 2 أو 1: 3 حسب الحاجة.
    ملاحظة: استخدم الخلايا في الممر 2 (P2) للتجارب النهائية (الشكل 1).

3. تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E)

  1. ممر البذور 2 (P2) خلية في صفيحة من 6 آبار تحتوي على أغطية معقمة موضوعة مسبقا بكثافة 2 × 105 خلايا لكل بئر. أضف 2 مل من وسط الثقافة الكامل لكل بئر. عندما تصل الخلايا إلى ما يقرب من 80٪ من التقاء ، تخلص من وسط المزرعة واشطف كل بئر برفق مرتين باستخدام 1 مل من PBS.
  2. أضف 1 مل من مثبت بارافورمالدهيد بنسبة 4٪ لكل بئر واحتضانه لمدة 30 دقيقة لإصلاح الخلايا. تخلص من المثبت واغسل الخلايا مرتين باستخدام 1 مل من PBS.
  3. أضف 1 مل من صبغة الهيماتوكسيلين إلى كل بئر واحتضنه لمدة 15 دقيقة. تخلص من محلول التلوين واشطف الآبار 2-3 مرات باستخدام 1 مل من PBS.
  4. راقب الخلايا تحت المجهر. إذا ظهرت صبغة الهيماتوكسيلين داكنة جدا ، فاستخدم كحول حمض الهيدروكلوريك بنسبة 1٪ لتمييز وإزالة البقعة السيتوبلازمية الزائدة. يغسل 2-3 مرات مع 1 مل من PBS.
  5. أضف 1 مل من محلول تلطيخ اليوزين إلى كل بئر. راقب التلوين تحت المجهر لمدة 30 ثانية تقريبا أو حتى يتم تحقيق كثافة اللون المطلوبة. شطف الآبار 2-3 مرات مع 1 مل من PBS. قم بتركيب الغطاء على الشرائح باستخدام الراتنج المحايد.

4. تلطيخ التألق المناعي

  1. خلايا البذور P2 في صفيحة من 6 آبار تحتوي على أغطية معقمة موضوعة مسبقا بكثافة 2 × 105 خلايا لكل بئر. أضف 2 مل من وسط الثقافة الكامل لكل بئر.
    1. عندما تصل الخلايا إلى ما يقرب من 80٪ من التقاء ، تخلص من وسط الاستزراع. قم بإزالة الغطاء وضعه في برطمان تلطيخ. اغسل الغطاء ثلاث مرات باستخدام 1 مل من PBS ، 5 دقائق في كل مرة.
  2. أضف ما يقرب من 50 ميكرولتر من محلول النفاذية (Triton X-100: PBS = 1: 200) لتغطية الخلايا. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ، ثم اغسله ثلاث مرات ب 1 مل من PBS ، 5 دقائق في كل مرة. أضف ما يقرب من 50 ميكرولتر من محلول حجب BSA بنسبة 3٪ واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
  3. تخلص من محلول الحظر برفق. أضف ما يقرب من 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية المحضرة في PBS لتغطية الشريحة: AQP4 (1: 100) ، Kir4.1 (1: 200) ، GS (1: 200) ، CRALBP (1:50) ، أو Vimentin (1: 200). ضع الغطاء في غرفة رطبة واحتضانه طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  4. اغسل الغطاء ثلاث مرات باستخدام 1 مل من PBS ، 5 دقائق في كل مرة.
  5. أضف ما يقرب من 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي IgG للماعز المضاد للأرانب المسمى FITC17. احتضن في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 50 دقيقة. اغسل الغطاء ثلاث مرات باستخدام 1 مل من PBS ، 5 دقائق في كل مرة.
  6. تلطخ النوى ب DAPI لمدة 10 دقائق. اغسل ثلاث مرات باستخدام 1 مل من PBS ، 5 دقائق في كل مرة.
  7. أضف قطرة واحدة من وسيط التثبيت المضاد للبهتان إلى الشريحة. قم بتركيب جانب خلية الغطاء لأسفل. ختم ومراقبة تحت المجهر الفلوري.

5. قياس التدفق الخلوي

  1. اضبط تركيز الخلية على 1.0 × 107 خلايا / مل باستخدام مخزن تلطيخ قياس التدفق الخلوي.
  2. Aliquot 100 ميكرولتر من التعليق أحادي الخلية في أنبوبين منفصلين للعينة لكل حالة. قم بتعيين أنبوب واحد كعنصر تحكم سلبي (غير ملطخ).
  3. أضف 100 ميكرولتر من وسط النفاذية A (من المجموعة التي تم الحصول عليها تجاريا ، انظر جدول المواد) إلى كل أنبوب. اخلطيها برفق وحتضنيها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  4. أضف 3 مل من المخزن المؤقت لتلوين قياس التدفق الخلوي المبرد مسبقا إلى كل أنبوب. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في RT وتخلص من المادة الطافية.
  5. أضف 100 ميكرولتر من وسط النفاذية B (من المجموعة التي تم الحصول عليها تجاريا) إلى كل أنبوب ودوامة للخلط. أضف 0.1 ميكرولتر من الجسم المضاد CRALBP إلى أنابيب العينة المخصصة ، و 0.8 ميكرولتر من الجسم المضاد GS إلى الأنابيب المقابلة. لا تضيف أي جسم مضاد إلى أنبوب التحكم السلبي. احتضن عند 4 درجات مئوية في الظلام لمدة 30-60 دقيقة.
  6. أضف 3 مل من المخزن المؤقت لتلوين قياس التدفق الخلوي إلى كل أنبوب. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في RT وتخلص من المادة الطافية.
  7. أعد تعليق كل أنبوب في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتلوين قياس التدفق الخلوي. أضف 1 ميكرولتر من الماعز المترافق ب FITC المضاد للأرانب IgG (H & L) إلى كل أنبوب ملطخ ب CRALBP ، و 1 ميكرولتر من IgG مضاد للأرانب من الماعز المترافق ب PE (H & L) إلى كل أنبوب ملطخ ب GS. لا تضيف أي جسم مضاد إلى أنبوب التحكم السلبي. احتضن عند 4 درجات مئوية في الظلام لمدة 30-60 دقيقة.
  8. أضف 3 مل من المخزن المؤقت لتلوين قياس التدفق الخلوي إلى كل أنبوب. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية.
  9. أعد تعليق كل أنبوب في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتلوين قياس التدفق الخلوي. المضي قدما في تحليل قياس التدفق الخلوي على الفور ؛ بدلا من ذلك ، قم بإعادة التعليق في 500 ميكرولتر من 1٪ -4٪ بارافورمالدهايد ، وتخزينها في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية في الظلام ، وقم بتحليلها في غضون 24 ساعة.
  10. تحليل العينات السالبة والإيجابية باستخدام برنامج قياس التدفق الخلوي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

بعد زرع الخلايا الأولية في قارورة الاستزراع ، تساعد التغييرات المتوسطة اللاحقة والمرور في القضاء على RMCs ضعيفة الالتصاق وإزالة الحطام الخلوي المتولد أثناء المرور ، وبالتالي إثراء سكان RMC في المزرعة. تم تحديد RMCs بناء على مورفولوجيتها باستخدام مجهر بصري مقلوب (الشكل 1) وتلوين الهيماتوكسيلين واليوزين (H & E) (الشكل 2). تم إجراء تلطيخ التألق المناعي باستخدام أجسام مضادة محددة ضد GS و Vimentin و CRALBP و AQP4 و Kir4.1 لمراقبة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

توفر هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لعزل RMCs الأولية من الفئران SD حديثي الولادة. يغطي البروتوكول جميع المراحل ، بما في ذلك الاستعدادات قبل التجريبية ، واستئصال مقلة العين ، وعزل أنسجة الشبكية ، والإجراءات خطوة بخطوة لاستخراج RMC ، والثقافة ، والمرور ، وتحديد الهوية. كما يؤكد على الاعتبارات الرئيسية التي يجب مراعاتها طوال عملية زراعة الخلايا بأكملها ، ويقدم إرشادات فنية موحدة للأبحاث ذات الصلة.

لاستخراج RMC ، تم اختيار فئران SD حديثي الولادة الذين تتراوح أعمارهم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى جميع المؤلفين تضارب في المصالح يتعلق بمحتوى هذه المقالة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل صندوق مؤسسة الطبيعة لمقاطعة سيتشوان (2023NSFSC0690).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.1٪ Triton X-100SolarbioT8200
0.25٪ Trypsin-EDTAHyclone SH30042.01B
1٪ كحول حمض الهيدروكلوريكBIOSYSTEMS3803651E
4٪ بارافورمالديهايدSolarbioP1110
45 & mu ؛ شبكة نايلون M (300 شبكة)SolarbioYA0926
6 ألواح آبارServicebioIMC202302001
6 سم طبق بتري زجاجينورماكس5058541
75٪ كحولKESHIGEA004
Aquaporin-4 (AQP4)Proteintech Group، Inc16473-1-AP
BSAServicebioGC305010
حاضنة ثقافة الخليةبروتين مرتبط بالريتينالديهايد الخلوي
الحرارية (CRALBP)HUABOIHA721330
جهاز طرد مركزيهونان شيانغيTDZ5-WS
مقعد نظيفZHICHENGZHJH-C12
مقص القرنيةJinzhongBXGJ
DAPISolarbioG1012
D-Hank solutionSolarbioH1045
DMEM  ارتفاع نسبة الجلوكوز المتوسطةجيبكوC11995500BT
مصل الأبقار الجنينية (FBS)Sbjbio Life SciencesBC-SE-FBS01
FIX& PERM متوسط أمتعدد العلومGAS006 / 2
FIX & PERM Medium BMultiSciencesGAS006 / 2
التدفق الخلوي تلطيخ العازلةMultiSciencesS1001
Fluoromount-G وسائط تركيب الفلورسنتSourthernBiotech0100-01
الجلوتامين سينثيتاز متعدد النسيلة الأجسامالمضادة Proteintech Group، IncPTG-11037-2-AP-50ul
Goat 324 Anti-Rabbit IgG H& L PEBiossbs-0295G-PE
Goat Anti- 323 Rabbit IgG H& L FITCBiossbs-0295G-FITC
طقم تلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين (HE)SolarbioG1120
آلة التطهير بالضغطالعالي zealway (xiamen) instrument IncGI80DS
مجهر مضان مقلوبنيكون   ؛SMZ1500
مجهر تباين الطور المقلوبLeica DMIL
4.1 (Kir4.1)Proteintech Group، Inc12503-1-AP
راتينج محايدSolarbioG8590-100
محلول البنسلين الستربتومايسين (100 مرة)HycloneSV30010
محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS) (pH7.2- 7.4)SolarbioP1020-500ml
الجسم المضاد الثانوي (مضاد للأرانب المسمى FITC)ServicebioGB22303
Sprague-Dawley rats تشنغدو داشو التجريبي المحدودةرقم ترخيص الإنتاج: SCXK [Sichuan] 2020-0030
قارورة ثقافة T25Cornning 430639
أنابيب تورنادو: 15 ملWHB & nbsp ؛أنابيب تورنادو WHB-15-1
: 50 ملWHB & nbsp ؛WHB-50-1
معقم التطهير بالأشعة فوق البنفسجيةGEMEISIxd06
VimentinAbcamab92547
FORMA311 قناة البوتاسيوم المقوم الداخلي

المراجع

  1. Bringmann, A., Pannicke, T., Grosche, J., et al. Müller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).
  2. Kugler, E. C., Greenwood, J., MacDonald, R. B. The "neuro-glial-vascular" unit: The role of glia in neurovascular unit formation and dysfunction. Front Cell Dev Biol. 9, 732820(2021).
  3. Reichenbach, A., Bringmann, A. Glia of the human retina. Glia. 68 (4), 768-796 (2020).
  4. Subirada, P. V., Paz, M. C., Ridano, M. E., et al. A journey into the retina: Müller glia commanding survival and death. Eur J Neurosci. 47 (12), 1429-1443 (2018).
  5. Wang, J., O'Sullivan, M. L., Mukherjee, D., et al. Anatomy and spatial organization of Müller glia in mouse retina. J Comp Neurol. 525 (8), 1759-1777 (2017).
  6. Beverley, K. M., Pattnaik, B. A. Inward rectifier potassium (Kir) channels in the retina: Living our vision. Am J Physiol Cell Physiol. 323 (3), C772-C782 (2022).
  7. Lai, D., Wu, Y., Shao, C., et al. The role of Müller cells in diabetic macular edema. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (10), 8(2023).
  8. Coughlin, B., Schnabolk, G., Joseph, K., et al. Systemic complement inhibition reduces intraocular inflammation and retinal cell death in murine models of glaucoma. J Neuroinflammation. 16, 212(2019).
  9. Alarcon-Martinez, L., Shiga, Y., Villafranca-Baughman, D., et al. Neurovascular dysfunction in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 97, 101217(2023).
  10. Strong, S., Liew, G., Michaelides, M. Retinitis pigmentosa-associated cystoid macular oedema: Pathogenesis and avenues of intervention. Br J Ophthalmol. 101 (1), 31-37 (2017).
  11. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nat Rev Neurosci. 15 (7), 431-442 (2014).
  12. Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. J. Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems. Dev Dyn. 245 (7), 727-738 (2016).
  13. Norrie, J. L., et al. Latent epigenetic programs in Müller glia contribute to stress and disease response in the retina. Dev Cell. 60 (8), 1199-1216.e7 (2025).
  14. Too, L. K., Gracie, G., Hasic, E. Adult human retinal Müller glia display distinct peripheral and macular expression of CD117 and CD44 stem cell-associated proteins. Acta Histochem. 119 (2), 142-149 (2017).
  15. Bhatia, B., Jayaram, H., Singhal, S. Differences between the neurogenic and proliferative abilities of Müller glia with stem cell characteristics and the ciliary epithelium from the adult human eye. Exp Eye Res. 93 (6), 852-861 (2011).
  16. Grigoryan, E. N. Cell sources for retinal regeneration: Implication for data translation in biomedicine of the eye. Cells. 11 (23), 3755(2022).
  17. Dong, S., Li, X., Chen, Z. MMP28 recruits M2-type tumor-associated macrophages through MAPK/JNK signaling pathway-dependent cytokine secretion to promote the malignant progression of pancreatic cancer. J Exp Clin Cancer Res. 44 (1), 60(2025).
  18. Vardimon, L., Ben-Dror, I., Havazelet, N. Molecular control of glutamine synthetase expression in the developing retina tissue. Dev Dyn. 196 (4), 276-282 (1993).
  19. Xu, Q. A., Boerkoel, P., Hirsch-Reinshagen, V. Müller cell degeneration and microglial dysfunction in the Alzheimer's retina. Acta Neuropathol Commun. 10 (1), 145(2022).
  20. Bunt-Milam, A. H., Saari, J. C. Immunocytochemical localization of two retinoid-binding proteins in vertebrate retina. J Cell Biol. 97 (3), 703-712 (1983).
  21. Masri, R. A., et al. Immunohistochemistry and spatial density of Müller cells in the human fovea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (2), 46(2025).
  22. Kolesnikov, A. V., Kiser, P. D., Palczewski, K. Function of mammalian M-cones depends on the level of CRALBP in Müller cells. J Gen Physiol. 153 (1), e202012675(2021).
  23. Xue, Y., Shen, S. Q., Jui, J. CRALBP supports the mammalian retinal visual cycle and cone vision. J Clin Invest. 125 (2), 727-738 (2015).
  24. Pereiro, X., Beriain, S., Rodriguez, L. Characteristics of whale Müller glia in primary and immortalized cultures. Front Neurosci. 16, 854278(2022).
  25. Tran, T. L., Bek, T., Holm, L. Aquaporins 6-12 in the human eye. Acta Ophthalmol. 91 (6), 557-563 (2013).
  26. Gusel'nikova, V. V., Korzhevskiy, D. E. NeuN as a neuronal nuclear antigen and neuron differentiation marker. Acta Naturae. 7 (2), 42-47 (2015).
  27. Zeng, Q., Xia, X. B. Study on the differentiation of retinal ganglion cells from rat Müller cells in vitro. Yan Ke Za Zhi. 46 (7), 615-620 (2010).
  28. Backstrom, J. R., et al. Phenotypes of primary retinal macroglia: Implications for purification and culture conditions. Exp Eye Res. 182, 85-92 (2019).
  29. Liu, X., Tang, L., Liu, Y. Mouse Müller cell isolation and culture. Bio Protoc. 7 (15), e2429(2017).
  30. Pereiro, X., et al. Optimization of a method to isolate and culture adult porcine, rats and mice Müller glia in order to study retinal diseases. Front Cell Neurosci. 14 (7), (2020).
  31. Wang, M., Ma, W., Zhao, L. Adaptive Müller cell responses to microglial activation mediate neuroprotection and coordinate inflammation in the retina. J Neuroinflammation. 8, 173(2011).
  32. Tomaszewski, R., Gad, M. S., Negoita, P. Isolation of primary mouse retinal glial Müller cells. J Vis Exp. (210), e66237(2024).
  33. Li, Q., Cheng, Y., Zhang, S. TRPV4-induced Müller cell gliosis and TNF-α elevation-mediated retinal ganglion cell apoptosis in glaucomatous rats via JAK2/STAT3/NF-κB pathway. J Neuroinflammation. 18 (1), 271(2021).
  34. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  35. Reichenbach, A., Wolburg, H., Richter, W. Membrane ultrastructure preservation and membrane potentials after isolation of rabbit retinal glial (Müller) cells by papain. J Neurosci Methods. 32 (3), 227-233 (1990).
  36. Harstad, H. K., Ringvold, A. Scanning and transmission electron microscopy of Müller cells isolated from rabbit retina. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 223 (1), 29-34 (1985).
  37. Guidry, C. Isolation and characterization of porcine Müller cells. Myofibroblastic dedifferentiation in culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 37 (5), 740-752 (1996).
  38. Qiu, A. W., Wang, N. Y., Yin, W. J. Retinal Müller cell-released exosomal miR-92a-3p delivers interleukin-17A signal by targeting Notch-1 to promote diabetic retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (1), 1(2025).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Sprague Dawley
عزل واستزراع خلايا مولر الشبكية الأولية من فئران Sprague-Dawley (SD)
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.