يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

طريقة بسيطة وفعالة لاختبار العوامل المعدلة للمناعة لتوليد الخلايا المتغصنة ذات التحمل من الخلايا الوحيدة البشرية CD14 +

1.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68159

⸱

أبريل 11, 2025

 , 
1Chemical and Biological Engineering Department, Drexel University

في هذه المقالة

ملخص

نصف إجراء لتقييم قدرة العوامل الدوائية على توليد خلايا متغصنة من خلايا شجيرية ساذجة مشتقة من الخلايا الأحادية في المختبر والتحقق من فعاليتها عن طريق توليد الخلايا التائية التنظيمية الذاتية.

الملخص

الخلايا التغصنية التحملية (tolDCs) هي مجموعة فرعية من الخلايا التغصنية (DCs) المعروفة بتأثيرها على الخلايا التائية الساذجة نحو النمط الظاهري للخلية التائية التنظيمية (Treg). تخضع TolDCs حاليا للتحقيق كعلاجات للمناعة الذاتية والزرع ، كعلاج خلوي وطريقة لحث tolDCs من DCs الداخلية. ومع ذلك ، حتى الآن ، فإن عدد العوامل المعروفة لتحفيز tolDCs من DCs الساذجة صغير نسبيا وكانت فعاليتها في توليد Tregs in vivo غير متسقة ، لا سيما العلاجات التي تحفز tolDCs من DCs الداخلية. يوفر هذا فرصة لاستكشاف مركبات جديدة لتوليد التسامح.

نصف هنا طريقة لاختبار المركبات المعدلة للمناعة الجديدة على DCs المشتقة من الخلايا الأحادية (moDCs) في المختبر والتحقق من صحة وظائفها لتوليد Tregs ذاتية المنشأ. أولا ، نحصل على PBMCs ونعزل الخلايا الوحيدة CD14 + والخلايا التائية CD3 + باستخدام مجموعات الفصل المغناطيسي المتوفرة تجاريا. بعد ذلك ، نقوم بتمييز الخلايا الوحيدة إلى moDCs ، ونعالجها باستخدام معدل مناعي راسخ ، مثل الرابامايسين أو الديكساميثازون أو IL-10 أو فيتامين D3 ، لمدة 24 ساعة ونختبر تغييرها في علامات التحمل كتحقق من صحة البروتوكول. أخيرا ، نشارك في زراعة tolDCs المستحثة مع الخلايا التائية الذاتية في وجود تحفيز مضاد ل CD3 / CD28 ونلاحظ التغيرات في مجموعات Treg وتكاثر الخلايا التائية. نتصور استخدام هذا البروتوكول لتقييم فعالية العوامل المناعية الجديدة لإعادة برمجة DCs المتمايزة بالفعل نحو tolDC.

المقدمة

الخلايا المتغصنة (DCs) هي وسطاء حاسمون بين المناعة الفطرية والتكيفية. DCs ، التي توجد بشكل أساسي في الأغشية المخاطية والجلد والأنسجة اللمفاوية ، هي الخلايا العارضة للمستضد الأولية (APCs)1. تمتص DCs البروتينات الغريبة وتعالجها وتقدمها على بروتينات التوافق النسيجي الرئيسية (MHC) للخلايا التائية الساذجة. تعبر DCs على وجه التحديد عن بروتينات معقد التوافق النسيجي الكبير من الفئة الثانية ، مثل مستضد الكريات البيض البشرية DR (HLA-DR) في البشر. تعد حالة تنشيط الترابط المستمر عند التعرض للمستضد أمرا بالغ الأهمية لاستجابة الخلايا التائية النهائية2. تعبر DCs غير الناضجة عن مستقبلات التعرف على الأنماط المختلفة (PRRs) التي تتعرف على فئات الجزيئات التي تسمى الأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض (PAMPs) ، مثل مكون الجدار البكتيري ، عديد السكاريد الدهني (LPS) 3. عند تحفيز PRR ، تصبح DCs ناضجة وتقوم بتنظيم البروتينات التحفيزية المشتركة للخلايا التائية المهمة ، مثل CD80 و CD86 و CD40 ، وتفرز السيتوكينات المؤيدة للالتهابات مثل عامل نخر الورم ألفا (TNFα) ، مما يسهل تمايز الخلايا التائية الساذجة إلى مستجيب تقليدي أو خلايا تائية مساعدة2. على العكس من ذلك ، إذا توقف نضج التيار المستمر أو إذا تطورت البلدان النامية في بيئة تحمل ، يمكن للبلدان النامية أن تولد حالة تيار مستمر (tolDCs)4. تقلل TolDCs من تنظيم مستقبلات الخلايا التائية الكلاسيكية المشاركة في تنظيم مستقبلات التسامح مثل ترابط موت الخلايا المبرمج 1 (PD-L1) ومخفف الخلايا الليمفاوية B و T (BTLA) وتوليد السيتوكينات المثبطة مثل الإنترلوكين 10 (IL-10) وتحويل عامل النمو بيتا (TGF-β) 4. هذه ليست قائمة شاملة بعلامات التسامح ، وفي الواقع ، هناك إجماع محدود حول علامات tolDC المناسبة لتحديد حالة tolDC5. بالنظر إلى ذلك ، نقترح توليد الخلايا التائية التنظيمية (Treg) كعلامة وظيفية يجب استخدامها لمقارنة فعالية عوامل الحث المختلفة tolDC.

بالإضافة إلى حالات تنشيط التيار المستمر / الناضجة ، يمكن أيضا تصنيف DCs بناء على نسبها أو موقع الأنسجة ، حيث تعرض كل مجموعة فرعية وظائف مختلفة قليلا. في حين أن تقسيم tolDC / DC الناضج أقل تحديدا وموجود أكثر كسلسلة متصلة ، فإن أقسام النسب لها علامات محددة جيدا في كل من الإنسان والفئران. تتشكل سلائف التيار المستمر في نخاع العظام ، ولكن هناك نوعان فرعيان رئيسيان من DCs بناء على نسبها: 1) الخلايا المتغصنة البلازمية (pDCs) ، والتي تستمد من السلالات اللمفاوية و 2) الخلايا المتغصنة التقليدية (cDCs) ، والتي تستمد من السلالات النخاعية. في البشر ، تنضج pDCs في الأعضاء اللمفاوية ، وتعبر عن CD303 ، وتستجيب بشكل كبير للالتهابات الفيروسية6. وفي الوقت نفسه ، تنضج CD11c التي تعبر عن cDCs في الأنسجة المحيطية وتوجد في نوعين فرعيين متميزين ، CD1c + cDC1s و CD141 + cDC2 ، والتي يولد كل منهما استجابات مميزة للخلاياالتائية 7. علاوة على ذلك ، يمكن أن توجد جميع cDCs في الحالات الفرعية المقيمة في الأنسجة (CD103-) أو المهاجرة (CD103 +)8. أخيرا ، في ظل ظروف معينة ، يمكن تحفيز الخلايا من سلالات الخلايا الوحيدة (CD14 +) نحو النمط الظاهري للخلية المتغصنة ويتم تحديدها على أنها CD14- و CD141 + و CD1c + 9. هذه الخلايا ، المعروفة باسم DCs المشتقة من الخلايا الوحيدة (moDCs) ، هي الأكثر استخداما لتحليل خارج الجسم الحي في البشر حيث تشكل الخلايا الوحيدة ما يقرب من 10-30٪ من خلايا الدم المحيطية البشرية أحادية النواة (PBMCs) ، بينما تشكل pDCs 1-3٪ 10 فقط. هذا يجعل moDCs خيارا جذابا ، ولكن من المعروف أيضا أن moDCs أكثر التهابا من cDCs النموذجية المعزولة من الأنسجةالأولية 9.

يوجد حاليا فئتان عريضتان من الجهود المبذولة لتوظيف tolDCs لتوليد التسامح السريري. أولا ، يتم إنشاء tolDCs من الخلايا الوحيدة لاستخدامها كعلاج للخلايا. في هذا النموذج ، يتم تمييز moDCs عادة باستخدام IL-4 / GM-CSF بالتزامن مع معدلات المناعة مثل فيتامين D3 أو الرابامايسين (rapa) أو IL-10 أو ديكساميثازون أو مجموعات من هؤلاء11،12. تم استكشاف tolDCs هذه كعلاجات خلوية ذاتية للمناعة الذاتية وعمليات الزرع13. الاستخدام الآخر ل tolDCs هو إعادة برمجة DCs الداخلية تجاه tolDCs باستخدام الأدوية المجانية أو الناقلات النانوية لتقديم كل من معدل المناعة والمستضد ذي الأهمية14،15،16. ومع ذلك ، فإن تحريض DCs المتمايزة بالفعل هو أكثر صعوبة ، نظرا لتطوير أنماط ظاهرية استقلابية قوية من DCs والتي تتناقض عادة مع استقلاب tolDC17،18. هذا مستوى مرتفع لمعظم معدلات المناعة الدوائية. لهذا السبب ، تشير معظم دراسات إعادة برمجة التيار المستمر الداخلية إلى قمع فعال للتيار المستمر وغالبا ما يكون بعض تحريض Treg ، ولكنها تفتقر إلى النجاح السريري ، غالبا بسبب نقص ثبات الخلايا التائية15،19،20. هذا يسلط الضوء على الحاجة إلى استراتيجيات لتحديد عوامل تحريض tolDC المحتملة من DCs الحالية.

هنا ، نقدم طريقة للتقييم المختبري للعوامل المعدلة للمناعة مقابل moDCs المتمايزة مع المقياس النهائي لتحريض Treg الذاتي. تم تصميم هذا البروتوكول لتقييم فعالية العوامل المعدلة للمناعة لإعادة برمجة moDCs البشرية المتمايزة بالفعل نحو التسامح. علاوة على ذلك ، يتحقق هذا البروتوكول من صحة وظائف tolDCs المعاد برمجتها لإنشاء Tregs مقابل خلايا T ذاتية المنشأ معزولة من نفس عينة PBMC. هذا على عكس البروتوكولات الأخرى التي تحفز التسامح أثناء التمايز و / أو تحدي tolDCs مع الخلايا التائية من المتبرعين الخيفي21. في هذا البروتوكول ، نستخدم عامل التسامح المشترك rapa كمثال ولكننا نوضح أيضا الفعالية المحدودة ل moDCs المعالجة بالرابا لتوليد Tregs. في نتائجنا التمثيلية ، نظهر أيضا فعالية العلاجات المناعية الشائعة الأخرى مثل IL-10 وديكساميثازون وفيتامين D3. نتصور استخدام هذا البروتوكول لفحص عوامل تحريض tolDC التي يحتمل أن تكون أكثر فاعلية مقابل moDCs22 التي تم إنشاؤها بالفعل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم الحصول على جميع عينات الخلايا أحادية النواة للدم المحيطي البشري (PBMC) من مركز المناعة البشرية بجامعة بنسلفانيا من متبرعين مجهولي الهوية بموافقة مسبقة من مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة بنسلفانيا (IRB) بموافقة المريض.

اختياري: بينما في هذه الطريقة ، استخدمنا PBMCs المعزولة حديثا التي تم الحصول عليها من مختبر أكاديمي ، يمكن عزل PBMCs إما من الدم الكامل أو منتجات الدم المخصبة بفصادة الكريات الدم. نوصي باستخدام طريقة الطرد المركزي لتدرج الكثافة ، حيث أن هذه طريقة راسخة وموثوقة موصوفة في مكان آخر23.

1. عزل الخلايا الوحيدة / الخلايا التائية وتمايز moDC

  1. عزل الخلايا الوحيدة والخلايا التائية من PBMCs - اليوم 1
    1. الحصول على 200 مليون PBMCs بشرية من متبرع سليم. احتفظ بالخلايا في أنبوب سعة 15 مل وانقلها على الثلج.
    2. Aliquot 50 مل من عازلة الفصل (متوفرة في مجموعات الفصل المتاحة تجاريا) في أنبوب مخروطي الشكل.
      ملاحظة: يمكن أيضا استبدال المخزن المؤقت للفصل ب DPBS بمصل بقري جنيني بنسبة 2٪ (FBS) و 1 ملي مولار حمض إيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA).
    3. قم بإزالة أنبوب PBMC من الجليد واملأه ب Separation Buffer. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
    4. شفط المادة الطافية باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل. أعد تعليق حبيبات الخلية في 4 مل من الوسط الموصى به باستخدام ماصة مصلية.
    5. قسم التعليق إلى أنبوبين مختلفين سعة 15 مل ، مع إضافة 2 مل لكل أنبوب (5 × 107 خلايا / مل لكل أنبوب). قم بتسمية أنبوب واحد "T" والآخر "الخلايا الأحادية".
    6. استرجع مجموعة عزل الخلايا الأحادية البشرية واتبع بروتوكول الشركة المصنعة لعزل الخلايا الوحيدة من الأنبوب المسمى أحادي الخلية.
    7. استرجع مجموعة عزل الخلايا التائية البشرية واتبع بروتوكول الشركة المصنعة للأنبوب الثاني لعزل الخلايا التائية.
  2. طلاء الخلايا الوحيدة لتمايز وتجميد الخلايا التائية - اليوم 1
    1. سخن 50 مل من وسط ثقافة moDC (الجدول 1) عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق على الأقل.
    2. الطرد المركزي الأنابيب سعة 15 مل مع الخلايا الوحيدة المخصبة والأنبوب 15 مل مع الخلايا التائية من الخطوة 1.1 عند 250 × جم لمدة 5 دقائق.
    3. شفط المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا الوحيدة في 1 مل من وسيط ثقافة moDC والخلايا التائية في وسط زراعة الخلايا التائية (الجدول 1) عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل. تأكد من تشتيت الحبيبات بشكل صحيح.
    4. عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي أو مقياس الدم اليدوي باستخدام تلطيخ التربان الأزرق.
      ملاحظة: بالنسبة للبيانات التمثيلية ، تم عزل 10 ملايين خلية تائية و 3 ملايين خلية وحيدية.
    5. خذ الأنبوب مع الخلايا الوحيدة وأضف 9 مل من وسيط ثقافة moDC الدافئ إلى التعليق للحصول على حجم نهائي يبلغ 10 مل. ثم أضف 100 ميكرولتر لكل من 10 ميكروغرام / مل من مخزون GM-CSF و 10 ميكروغرام / مل من مخزون IL-4 للحصول على تركيز نهائي قدره 100 نانوغرام / مل من كل من GM-CSF و IL-4 في الوسائط. انقل المعلق إلى طبق بتري وقم بتسميته باسم "moDC" (اليوم 1) واحتضانه عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
    6. خذ أنبوب الخلية التائية واخلط 1 مل من وسط تجميد الخلايا التائية (الجدول 1) مع 1 مل من تعليق الخلايا التائية. يقسم إلى اثنين من cryovials سعة 2 مل (1 مل / قارورة) ؛ ختم بإحكام (التركيز النهائي ل 5 ملايين خلية لكل قارورة). ضع المبردات في غرفة تجميد مع أنابيب موازنة في آبار غير مستخدمة. قم بتخزين الحجرة في درجة حرارة -80 درجة مئوية طوال الليل ، ثم انقل المبردات إلى خزان تبريد.
    7. في اليوم 4 ، قم بتحديث الوسط بإضافة 5 مل من وسيط ثقافة moDC الطازج وأضف 100 ميكرولتر لكل من مخزون GM-CSF و IL-4. ستكون moDCs المتمايزة جاهزة في اليوم 7.

2. إضافة أدوية معدلة للمناعة لتوليد moDCs تحمل المنشأ

  1. قم بإعداد لوحة moDC.
    1. في اليوم 7 ، استرجع moDCs المتمايزة من الحاضنة وانقل تعليق خلية moDC إلى أنبوب سعة 50 مل.
    2. جهاز الطرد المركزي التعليق عند 250 × جم لمدة 5 دقائق. قم بشفط المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسائط ثقافة moDC الدافئة عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم وتخفيف الخلايا إلى تركيز 3 × 105 خلايا / مل في وسط ثقافة moDC دافئ يحتوي على 100 نانوغرام / مل GM-CSF و IL-4.
    3. أضف 3 × 104 خلايا / بئر في 100 ميكرولتر إلى العدد المطلوب من الآبار في صفيحة زراعة الأنسجة ذات القاع المسطح 96 بئر.
      ملاحظة: بالنسبة للنتائج التمثيلية، استخدمنا ما مجموعه 48 بئرا (أربعة شروط تم إجراؤها في ثلاث مرات أعدت لأربعة تحليلات مختلفة في القسمين 3 و 4)، ولكن يمكن تعديل ذلك لما يصل إلى 60 بئرا. املأ جميع الآبار المتبقية ب 100 ميكرولتر / بئر PBS لمنع الجفاف ، وخاصة الآبار الخارجية. نوصي بإعداد لوحات مختلفة لكل طريقة من طرق التحليل.
    4. أضف 1 ميكرولتر / بئر من الأدوية المعدلة للمناعة إلى الآبار المرغوبة (هنا 10 نانوغرام / مل رابا). احتضان اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
      ملاحظة: إذا كنت تتضمن التحفيز المناعي في اليوم 8 ، فقم بإعداد الآبار للدواء المناعي مع وبدون التحفيز المناعي. يعد استخدام التحفيز المناعي للناضجين أمرا اختياريا.
  2. إعادة إذابة الخلايا التائية.
    1. في اليوم 8 ، استرجع اثنين من cryovials من خزان التبريد وقم بإذابة الجليد في حمام حبة ساخن أو حمام مائي عند 37 درجة مئوية حتى تبدأ المحتويات في الذوبان (في <3 دقائق).
    2. عندما تبدأ المحتويات في الذوبان ، انقل القوارير إلى غطاء مزرعة الخلايا وأنبوب 1 مل من وسائط زراعة الخلايا التائية الدافئة في القارورة لإذابة الجليد بسرعة. انقل محتويات القارورة بالكامل إلى أنبوب سعة 50 مل. اشطف المبردات ب 1 مل من وسط زراعة الخلايا التائية لضمان نقل جميع الخلايا إلى الأنبوب.
    3. قم بتعبئة التعليق بمحلول تلطيخ التدفق (الجدول 1) إلى 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 10 دقائق وشفط المادة الطافية. ثم, أعد تعليق الحبيبات في 5 مل من محلول تلطيخ التدفق وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى.
    4. استنشاق المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من وسط زراعة الخلايا التائية الدافئة. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
      ملاحظة: يجب أن تكون الجدوى >70٪ في هذه المرحلة؛ إذا بقيت كميات كبيرة من الخلايا الميتة ، فقم بنقلها إلى أنبوب جديد ، وأضف 10 مل من محلول صبغة الخلية ، وجهاز الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق ، وأعد تعليقها في 1 مل من وسائط الخلايا التائية ، وأعد العد.
    5. أضف 9 مل من وسط زراعة الخلايا التائية الدافئة لعمل حجم نهائي يبلغ 10 مل. انقل المعلق إلى طبق بتري. قم بتسميته على أنه "الخلايا التائية المعاد إذابتها" واحتضانه طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 للسماح للخلايا بالراحة.
  3. اغسل لوحة moDC وأضف المحفز المناعي إذا رغبت في ذلك.
    1. في اليوم 8 ، قم بالطرد المركزي للوحة moDC (من اليوم 7) عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
    2. شفط المادة الطافية ، واغسلها باستخدام HBSS الدافئ ، وكرر الطرد المركزي ، والشفط مرة أخرى ، وأعد تعليق الخلايا في وسط ثقافة moDC دافئ يحتوي على GM-CSF و IL-4 (100 ميكرولتر / بئر).
      ملاحظة: احرص على عدم إزعاج الخلايا. قم بإمالة اللوحة أثناء الشفط. يمكن أن يبقى ما يقرب من 10 ميكرولتر في البئر.
    3. في حالة استخدام التحفيز المناعي ، أضف 1 ميكرولتر / بئر من 100x مخزون LPS (أو عامل محفز مناعي آخر) إلى الآبار المرغوبة. احتضان اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.

3. تحليل التدفق ل moDC (التحقق + التسامح)

  1. تحليل التدفق للتحقق من صحة moDC
    1. في اليوم 8 ، قم بإعداد كوكتيلات الأجسام المضادة للجنة التحقق من الصحة ، مستهدفة العلامات التالية: HLA-DR و CD14 و الليكتين من النوع C الخاص بالخلايا المتغصنة (DC-SIGN) و CD1c و CD40 كما هو موضح في الجدول 2. تمييع جميع الأجسام المضادة بمحلول صبغة التدفق.
      ملاحظة: تم تصميم اللوحة لمقياس تدفق الليزر الأحمر / الأزرق ذو 7 قنوات.
    2. استرجع لوحة moDC من الحاضنة. الطرد المركزي للوحة على حرارة 300 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المواد الطافية. اختياري: احتفظ بالمواد الطفية لتحليل ELISA للسيتوكينات IL-10 و TNFα باستخدام المجموعات المتوفرة تجاريا وفقا لتعليمات الشركات المصنعة.
    3. أضف 200 ميكرولتر / بئر من محلول تلطيخ التدفق. جهاز الطرد المركزي للوحة على حرارة 300 × جم لمدة 5 دقائق.
    4. شفط المادة الطافية وأضف 50 ميكرولتر / بئر من الجسم المضاد المثبط لربط مستقبلات Fc المخفف 1: 200 في محلول تلطيخ التدفق لمنع الارتباط غير المحدد. احتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة.
    5. أضف 50 ميكرولتر / بئر من كوكتيل الأجسام المضادة للوحة التحقق من الصحة المحضر.
    6. قم بإعداد أدوات التحكم في التعويض في اللوحة أو في أنابيب سعة 1.5 مل عن طريق خلط 50 ميكرولتر من حبات التعويض مع 50 ميكرولتر من كل جسم مضاد مخفف. احتضان اللوحة عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.
      ملاحظة: يتم استخدام حبات التعويض هنا بدلا من الخلايا للتعويض بسبب التعبير المنخفض المحتمل عن العلامات على moDCs.
    7. يغسل عن طريق الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، وإزالة المادة الطافية ، وإعادة التعليق في 200 ميكرولتر من محلول تلطيخ التدفق. قم بغسلتين.
    8. بعد الغسيل النهائي ، قم بجهاز الطرد المركزي مرة أخرى وأعد تعليق الخلايا في 110 ميكرولتر / بئر من محلول تلطيخ التدفق. العينات جاهزة الآن لتحليل قياس التدفق الخلوي.
  2. تحليل التدفق ل moDC (لوحة التسامح)
    1. على غرار الخطوة 3.1 في اليوم 8 ، قم بإعداد كوكتيلات الأجسام المضادة للوحة التسامح ، مستهدفة العلامات التالية: CD86 و PD-L1 و DC-SIGN و CD1c و BTLA و CD40 (الجدول 2).
    2. كرر الخطوات 3.1.2-3.1.8 ، واستبدل كوكتيل الأجسام المضادة بكوكتيل لوحة التسامح .

4. تحليل تدفق الخلايا التائية

  1. اجمع بين الخلايا التائية وخلايا التحمل المعالجة.
    1. في اليوم 9 ، استرجع طبق بتري الخلية التائية المعاد إذابته من الحاضنة وانقل جميع الخلايا التائية إلى أنبوب سعة 50 مل. قم بتعبئة محلول تلطيخ التدفق.
    2. اختياري: في حالة إجراء تحليل تكاثر الخلايا التائية ، قسم الخلايا التائية إلى أنبوبين.
      1. باستخدام الأنبوب الأول ، قم بالدوران لأسفل عند 250 × جم لمدة 5 دقائق وقم بإزالة المادة الطافية. تلطخ هذا الأنبوب بصبغة تكاثر الخلايا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
        ملاحظة: استخدمنا صبغة قابلة للإصلاح eFluor 670 ، والتي تتطلب خطوة حضانة مدتها 30 دقيقة ، متبوعة بخطوتي غسيل. نقترح استخدام أنابيب مخروطية سعة 50 مل لمنع فقدان الخلايا واستخدام HBSS مع 10٪ HIFBS للغسيل بعد التلوين.
      2. استخدم الأنبوب الثاني الذي يحتوي على خلايا تائية غير ملطخة لتحليل Treg. وبالمثل ، قم بالدوران عند 250 × جم لمدة 5 دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليقها في وسط زراعة الخلايا الدافئة ، واحتفظ بها في الحاضنة أثناء عملية التلوين. إذا لم تكن هناك حاجة إلى تكاثر الخلايا التائية ، فقم بتدوير جميع الخلايا التائية واستبدلها بوسائط زراعة الخلايا التائية الدافئة.
    3. عد الخلايا واحصل على ما لا يقل عن 4 ملايين (لتحليل Treg فقط) أو 8 ملايين (لتحليل انتشار Treg و T).
    4. استرجع لوحة moDC من الحاضنة مع الآبار المتبقية ، وجهاز الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، وقم بتقطيع المواد الطاففة. أضف 200 ميكرولتر / خلايا تائية بئر عند 1.6 × 105 خلايا / بئر. أضف الخلايا التائية غير الملوثة للوحات تحليل Treg والخلايا التائية الملطخة لألواح تكاثر الخلايا التائية.
      ملاحظة: سيحافظ هذا على نسبة خلية T إلى moDC تبلغ 5: 1 ، حيث تتوسع وحدات moDCs الأولية 3 ×104 بشكل طفيف.
    5. أضف 25 ميكرولتر / مل من كوكتيل الأجسام المضادة المضادة ل CD3 / CD28 إلى جميع المجموعات باستثناء آبار التحكم السلبية لتحفيز الخلايا التائية. احتضان اللوحة لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 حتى اليوم 12.
      ملاحظة: تأكد من استخدام الخلايا التائية الملطخة لتحليل التكاثر وغير ملوثة لتحليل Treg.
  2. تحليل تدفق Treg
    1. تلطيخ علامة السطح
      1. في اليوم 12 ، قم بإعداد كوكتيلات الأجسام المضادة للوحة Treg (الجدول 2).
      2. انقل جميع معلقات الخلايا من لوحة الثقافة المكونة من 96 بئرا إلى لوحة قاع على شكل حرف V مع محلول تلطيخ التدفق. احتفظ بالمواد الطافية لتحليل السيتوكين.
      3. اغسل الخلايا 2x عن طريق الطرد المركزي (200 × جم لمدة 5 دقائق متبوعا ب 200 ميكرولتر من محلول بقع التدفق). خصص بعض الخلايا لضوابط التعويض. ضع واحدة جانبا لتلوين FOXP3 وأدوات التحكم غير الملطخة.
        ملاحظة: نقترح تمشيط 10 ميكرولتر من جميع العينات قبل الدوران النهائي في الخطوة 4.2.1.3 للحصول على ضوابط التعويض اللازمة. يوفر هذا عينة تمثيلية لجميع تعبيرات مستوى السطح لكل علامة على الخلايا.
      4. بعد الغسيل الثاني ، قم بجهاز الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة والشفق ، ثم أضف 50 ميكرولتر / بئر الجسم المضاد المثبط لربط مستقبلات Fc (مخفف 1: 200 في محلول تلطيخ التدفق). احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
      5. أضف 50 ميكرولتر / بئر من كوكتيل الأجسام المضادة Treg Panel المحضر.
      6. لعناصر التحكم في التعويض ، امزج 50 ميكرولتر من خلايا التعويض غير الملوثة مع 50 ميكرولتر من كل جسم مضاد ملطخ.
      7. احتضان اللوحة وأدوات التحكم في التعويض عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة. اغسل الطبق مرة واحدة باستخدام محلول Flow Stain Solution وجهاز الطرد المركزي على حرارة 300 × جم لمدة 5 دقائق.
      8. وصمة عار مع صبغة حية / ميتة قريبة من الأشعة تحت الحمراء مخففة في HBSS (1: 1,000) عند 200 ميكرولتر / بئر. احتضان عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
      9. اغسل الطبق مرة واحدة بمحلول تلطيخ التدفق (200 ميكرولتر / بئر) عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
    2. وصمة عار مع FoxP3 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، الأمر الذي سيتطلب حضانة بين عشية وضحاها. لمحة موجزة عن بروتوكول تلطيخ FoxP3 موصوفة أدناه .
      1. قم بإعداد حل عمل التثبيت / النفاذية FoxP3 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. امزج جزءا واحدا من تركيز التثبيت / النفاذية FoxP3 مع 3 أجزاء من تخفيف التثبيت / النفاذية FoxP3. تحضير 200 ميكرولتر من محلول العمل لكل عينة.
      2. احتضان جميع العينات في 200 ميكرولتر / بئر من محلول التثبيت / النفاذية العاملة. اتركيه عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.
      3. تحضير 1x النفاذية عازلة: امزج جزءا واحدا من 10x نفاذية المخزن المؤقت (تم الحصول عليه من مجموعة تجارية) مع 9 أجزاء من الماء المقطر.
      4. اغسل الطبق 2x باستخدام 1x permeabilization Buffer (200 ميكرولتر / بئر) عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
      5. وصمة عار بالجسم المضاد FoxP3 (PE-Cy5.5 ، تخفيف 1: 300 في 1x النفاذية عازلة): أضف 100 ميكرولتر / بئر من الجسم المضاد FoxP3 المخفف واحتضنه عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
      6. اغسل الطبق 2x باستخدام 1x permeabilization Buffer (200 ميكرولتر / بئر) عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
      7. أعد تعليق الخلايا في 110 ميكرولتر / بئر من محلول تلطيخ التدفق.
      8. إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي.
  3. تحليل تكاثر الخلايا التائية
    1. قم بإعداد كوكتيلات الأجسام المضادة للوحة انتشار T (الجدول 2).
    2. انقل جميع معلقات الخلايا من لوحة الثقافة المكونة من 96 بئرا إلى لوحة قاع على شكل حرف V مع محلول تلطيخ التدفق. احتفظ بالمواد الطاففية لتحليل السيتوكين.
    3. اغسل الخلايا 2x عن طريق الطرد المركزي (200 × جم لمدة 5 دقائق متبوعا ب 200 ميكرولتر من محلول بقع التدفق). خصص بعض الخلايا لضوابط التعويض. ضع واحدة جانبا لتلوين FOXP3 وأدوات التحكم غير الملطخة.
      ملاحظة: نقترح تمشيط 10 ميكرولتر من جميع العينات قبل الدوران النهائي في الخطوة 4.3.3 للحصول على ضوابط التعويض اللازمة. يوفر هذا عينة تمثيلية لجميع تعبيرات مستوى السطح لكل علامة على الخلايا.
    4. بعد الغسيل الثاني ، جهاز الطرد المركزي (200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة) والشفط ، ثم أضف 50 ميكرولتر / بئر الجسم المضاد لمثبط ربط مستقبلات Fc (مخفف 1: 200 في محلول تلطيخ التدفق). احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
    5. أضف 50 ميكرولتر / بئر من كوكتيل الأجسام المضادة للوحة T Proliferation المحضرة.
    6. لعناصر التحكم في التعويض ، امزج 50 ميكرولتر من خلايا التعويض غير الملوثة مع 50 ميكرولتر من كل جسم مضاد ملطخ.
    7. احتضان اللوحة وأدوات التحكم في التعويض عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة. اغسل الطبق مرة واحدة باستخدام محلول Flow Stain Solution وجهاز الطرد المركزي على حرارة 300 × جم لمدة 5 دقائق.
    8. وصمة عار مع صبغة حية / ميتة قريبة من الأشعة تحت الحمراء مخففة في HBSS (1: 1,000) عند 200 ميكرولتر / بئر. احتضان عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
    9. اغسل الطبق مرة واحدة بمحلول تلطيخ التدفق (200 ميكرولتر / بئر) عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
    10. إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لقد وصفنا بروتوكولا ل PBMCs البشرية ، وعزل كل من خلايا CD3 + T والخلايا الوحيدة CD14 + باستخدام مجموعات الفصل المغناطيسي المتاحة تجاريا ، وتمييز الخلايا الوحيدة إلى CD14- و HLA-DR + و CD141 + و CD1c + moDCs باستخدام GM-CSF و IL-4 ، ومعالجتها لمدة 24 ساعة ، والزراعة المشتركة مع الخلايا التائية الذاتية مع التحفيز المضاد ل CD3 / CD28 لمدة 72 ساعة. يظهر الرسم التخطيطي التجريبي في الشكل 1.

عزل ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

نصف هنا طريقة موثوقة ومتعددة الاستخدامات لتقييم وظائف العوامل المعدلة للمناعة لحث tolDCs من moDCs والتحقق من صحة وظائفها لتوليد Tregs من الخلايا التائية الذاتية خارج الجسم الحي. هناك العديد من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول. أولا ، الخلايا الوحيدة هي خلايا حساسة معروفة ويجب الحصول عليها من PBMCs الطازجة وليست المجمدة مسبقا للحصول على أفضل النتائج. يجب عزل الخلايا الوحيدة في أسرع وقت ممكن ووضعها في كوكتيل التمايز. عادة ما يكون ضعف إنتاج الخلايا الوحيدة أو ارتفاع معدلات موت الخ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

نود أن نشكر مركز المناعة البشرية (HIC) بجامعة بنسلفانيا على توفير PBMCs بشرية جديدة من المتبرعين. يتم دعم التحالف الدولي للموئل جزئيا من قبل AI045008 المعاهد الوطنية للصحة P30 و P30 CA016520.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.1-10 وميكرو ؛ L نصائح ماصة مصفاةVWR76322-158ثقافة الخلية العامة
1.5 مل أنبوب الطرد المركزيVWR77508-358ثقافة الخلية العامة
10 مل ماصات مصليةVWR414004-267ثقافة الخلية العامة
100-1000 & micro ؛ L نصائح ماصة مصفاةVWR76322-164ثقافة الخلية العامة
15 مل أنبوب مخروطيVWR77508-212ثقافة الخلية العامة
20-200 & micro ؛ L نصائح ماصة مصفاةVWR76322-160ثقافة الخلية العامة
2-MercaptoethanolMP الطب الحيوي194834ثقافة الخلايا التائية
50 مل أنبوب مخروطيVWR21008-736ثقافة الخلية العامة
60 × 15 مم طبق ، Nunclon DeltaThermo Fischer150326ثقافة الخلية العامة
96 لوحة سفلية مخروطية جيدا (V) ،غير معالج حراري فيشر277143ثقافة الخلية العامة
96 بئر لوحة مسطحةالقاع الحرارية161093ثقافة الخلية العامة
APC / Cyanine7 المضادة للإنسان CD272 (BTLA) الأجسام المضادةBiolegendBiolegend 344518قياس التدفق الخلوي
Attune NxT (ليزر أحمر / أزرق ، 7 قنوات)Thermo FischerA24863قياس التدفق
الخلوي BSAThermo Fischer15260-037الخلية العامة ثقافة
CD14 الجسم المضاد أحادي النسيلة (61D3) ، PEThermo Fischer12-0149-42قياس التدفق
الخلوي CD1c الجسم المضاد أحادي النسيلة (L161) ، PE-Cyanine7Thermo Fischer25-0015-42قياس التدفق الخلوي
CD209 (DC-SIGN) الجسم المضاد أحادي النسيلة (eB-h209) ، PerCP-Cyanine5.5Thermo Fischer45-2099-42قياس التدفق
الخلوي CD25 الجسم المضاد أحادي النسيلة (CD25-4E3) ، APCThermo Fischer17-0257-42قياس التدفق
الخلوي CD274 (PD-L1 ، B7-H1) الجسم المضاد أحادي النسيلة (MIH1) ، PEThermo Fischer12-5983-42قياس التدفق
الخلوي CD4 الجسم المضاد أحادي النسيلة (RPA-T4) ، Alexa Fluor 488Thermo Fischer53-0049-42قياس التدفق الخلوي
CD40 الجسم المضاد أحادي النسيلة (5C3) ، APCThermo Fischer17-0409-42قياس التدفق
الخلوي CD40 الجسم المضاد أحادي النسيلة (5C3) ، APC-eFluor 780Thermo Fischer47-0409-42قياس التدفق
الخلوي CD69 الجسم المضاد أحادي النسيلة (FN50) ، PEThermo FischerMA1-10276قياس التدفق
الخلوي CD86 الجسم المضاد أحادي النسيلة (BU63) ، FITCThermo FischerMHCD8601قياس التدفق
الخلوي CD8a الجسم المضاد أحادي النسيلة (RPA-T8) ، PE-Cyanine7Thermo Fischer25-0088-42التدفق
الخلويقاع مخروطي (V-well) 96 بئر لوحةThermo Fischer2605لقياس التدفق
الخلوي ، 2 ملThermo Fischer430488T Cell Cultures
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، تسلسل الصفThermo Fischer20688ثقافة الخلية
العامة DPBSThermo Fischer14200166ثقافة الخلية العامة
EasySep طقمعزل الخلايا الأحادية البشريةتقنيات الخلايا الجذعية19359الخلايا
EasySep مجموعة عزل الخلايا التائية البشريةتقنيات الخلايا الجذعية17951فصل الخلايا
الخلايا الجذعيةالمغناطيسية18000الخلايا
EDTAThermo FischerAIM9260Gثقافة الخلايا العامة
Falcon أنابيب البوليسترين المستديرة القاع ، 5 ملتقنياتالخلايا الجذعية38025فصل الخلايا
Fc مستقبلات Fc مثبط ربط الأجسام المضادة متعددة النسيلةThermo Fischer14-9161-73قياس التدفق
الخلوي مصل الأبقار الجنينيThermo FischerA5670701ثقافة الخلية العامة
قابلة للإصلاح صبغة البقاء eFluor 780Thermo Fischer65-0865-18قياس التدفق الخلوي
Foxp3 / مجموعة العازلة لعامل النسخThermo Fischer00-5523-00قياس التدفق
FOXP3 الجسم المضاد أحادي النسيلة (PCH101) ، PE-Cyanine5.5Thermo Fischer35-4776-42قياس التدفق الخلوي
HBSSThermo Fischer14170-112ثقافة الخلية العامة
المعطلة حراريا مصل الأبقارالجنين الحراريA5670801ثقافة الخلية العامة
HEPES (1 م)Thermo Fischer15630106moDC Cell ثقافة
HLA-DR الجسم المضاد أحادي النسيلة (L243) ، Alexa Fluor 488Thermo FischerA51009قياس التدفق الخلوي
البشري CD3 / CD28 / CD2 منشط الخلايا التائيةتقنيات الخلايا الجذعية10970ثقافة الخلايا التائية
البشرية GM-CSF البروتين المؤتلفThermo Fischer300-03moDC ثقافة الخلايا
البشرية IL-10 ELISA Kit ، عالية الحساسيةالحرارية FischerBMS215-2HSاليسا
IL-4 البشري ، بروتين مؤتلف خال منThermo FischerAF-200-04moDC ثقافة الخلايا
PBMC البشرية (معزولة حديثا)UPenn HICN N /A CELLS
HUMAN TNF ALPHA ELISA KitThermo FischerBMS223-4ELISA
Light Microscope (DMi1)Lucia391240ثقافة الخلايا العامة
بولي ساكاريد الدهون (LPS)Invivogentlrl-eblpsmoDC ثقافة الخلايا
LIVE / DEAD قابلة للإصلاح بالقرب من الأشعة تحت الحمراء طقم بقع الخلايا الميتةThermo FischerL34975قياس التدفق
الخلوي MEM محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية (100x)Thermo Fischer11140050T Cell Cell
Penicillin-Streptomycin (100x)Thermo Fischer15140122لثقافة الخلايا العامة
VWR77575-370ثقافة الخلية العامة
راباميسين ، 98 + ٪ثيرمو فيشرJ62473. MFmoDC Cell Culture
RPMI 1640 مع GlutamaxThermo Fischer61870-036ثقافة الخلية
العامة 20144الخلايا
كوكتيل تحفيز الخلايا التائية (500x)Thermo Fischer00-4970-93T Cell Culture
UltraComp eBead Plus تعويض الخرزThermo Fischer01-3333-41Flow
مجموعة الماصات المتغيرةفيشر العلمي05-403-152ثقافة الخلية العامة
سطح قياس قوارير مبردة فصل EasySep تقنيات فصل الخلوي Culture وحدة التحكم في الماصة تقنيات الخلايا الجذعية العازلة لفصل فصل لقياس الخلايا

المراجع

  1. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18 (1), 767-811 (2000).
  2. Blander, J. M., Medzhitov, R. Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells. Nature. 440 (7085), 808-812 (2006).
  3. Anderson, A. E., et al. LPS activation is required for migratory activity and antigen presentation by tolerogenic dendritic cells. J Leukoc Bio. 85 (2), 243-250 (2009).
  4. Iberg, C. A., Hawiger, D. Natural and induced tolerogenic dendritic cells. J Immunol. 204 (4), 733-744 (2020).
  5. Ness, S., Lin, S., Gordon, J. R. Regulatory dendritic cells, T cell tolerance, and dendritic cell therapy for immunologic disease. Front Immunol. 12, 633436(2021).
  6. Ali, S., et al. Sources of type I interferons in infectious immunity: Plasmacytoid dendritic cells not always in the driver's seat. Front Immunol. 10, 778(2019).
  7. Fossum, E., et al. Targeting antigens to different receptors on conventional type 1 dendritic cells impacts the immune response. J Immunol. 205 (3), 661-673 (2020).
  8. Kedl, R. M., et al. Migratory dendritic cells acquire and present lymphatic endothelial cell-archived antigens during lymph node contraction. Nat Comm. 8 (1), 2034(2017).
  9. Chow, K. V., Sutherland, R. M., Zhan, Y., Lew, A. M. Heterogeneity, functional specialization and differentiation of monocyte-derived dendritic cells. Immun Cell Biol. 95 (3), 244-251 (2017).
  10. Johnson, R. K., Overlee, B. L., Sagen, J. A., Howe, C. L. Peripheral blood mononuclear cell phenotype and function are maintained after overnight shipping of whole blood. Sci Rep. 12 (1), 19920(2022).
  11. Boks, M. A., et al. IL-10-generated tolerogenic dendritic cells are optimal for functional regulatory T cell induction - A comparative study of human clinical-applicable DC. Clinl Immunol. 142 (3), 332-342 (2012).
  12. Navarro-Barriuso, J., et al. Vitamin D3-induced tolerogenic dendritic cells modulate the transcriptomic profile of T CD4+ cells towards a functional hyporesponsiveness. Front Immunol. 11, 599623(2021).
  13. Moorman, C. D., Sohn, S. J., Phee, H. Emerging therapeutics for immune tolerance: Tolerogenic vaccines T cell therapy, and IL-2 therapy. Front Immunol. 12, 657768(2021).
  14. Kenison, J. E., et al. Tolerogenic nanoparticles suppress central nervous system inflammation. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (50), 32017-32028 (2020).
  15. Neshat, S. Y., et al. Improvement of islet engrafts via Treg induction using immunomodulating polymeric tolerogenic microparticles. ACS Biomater Sci Eng. 9 (6), 3522-3534 (2023).
  16. Deak, P., Knight, R., Esser-Kahn, A. Robust tolerogenic dendritic cells via push/pull pairing of toll-like-receptor agonists and immunomodulators reduces EAE. Biomaterials. 286, 121571(2022).
  17. Møller, S. H., Wang, L., Ho, P. -C. Metabolic programming in dendritic cells tailors immune responses and homeostasis. Cell Mol Immunoly. 19 (3), 370-383 (2022).
  18. Adamik, J., et al. Distinct metabolic states guide maturation of inflammatory and tolerogenic dendritic cells. Nat Comm. 13 (1), 5184(2022).
  19. Hals, I. K., et al. Investigating optimal β-cell-preserving treatment in latent autoimmune diabetes in adults: Results from a 21-month randomized trial. Diabetes Obes Metab. 21 (10), 2219-2227 (2019).
  20. Gammon, J. M., et al. Engineering the lymph node environment promotes antigen-specific efficacy in type 1 diabetes and islet transplantation. Nat Comm. 14 (1), 681(2023).
  21. Sim, W. J., Malinarich, F., Fairhurst, A. -M., Connolly, J. E. Generation of immature, mature and tolerogenic dendritic cells with differing metabolic phenotypes. J Vis Exp. (112), e54128(2016).
  22. Jia, S., Kim, J., Esser-Kahn, A. P., Deak, P. High-throughput screening identification of novel immunomodulatory combinations for the generation of tolerogenic dendritic cells. Front Med. 10, 1298424(2024).
  23. Dinh, B., et al. Isolation and cryopreservation of highly viable human peripheral blood mononuclear cells from whole blood: A guide for beginners. J Vis Exp. (212), e66794(2024).
  24. Akkaya, B., et al. Regulatory T cells mediate specific suppression by depleting peptide-MHC class II from dendritic cells. Nat Immunol. 20 (2), 218-231 (2019).
  25. Stallone, G., et al. mTOR inhibitors effects on regulatory T cells and on dendritic cells. J Trans Med. 14 (1), 152(2016).
  26. Dahlqvist, G., et al. Modulatory effect of rapamycin and tacrolimus on monocyte-derived dendritic cells phenotype and function. Immunobiology. 226 (1), 152031(2021).
  27. Cimen Bozkus, C., Blazquez, A. B., Enokida, T., Bhardwaj, N. A T-cell-based immunogenicity protocol for evaluating human antigen-specific responses. STAR Protoc. 2 (3), 100758(2021).
  28. Nakayama, M., Michels, A. W. Determining antigen specificity of human islet infiltrating T cells in type 1 diabetes. Front Immunol. 10, 365(2019).
  29. Gregori, S., et al. Differentiation of type 1 T regulatory cells (Tr1) by tolerogenic DC-10 requires the IL-10-dependent ILT4/HLA-G pathway. Blood. 116 (6), 935-944 (2010).
  30. Taner, T., Hackstein, H., Wang, Z., Morelli, A. E., Thomson, A. W. Rapamycin-treated, alloantigen-pulsed host dendritic cells induce Ag-specific T cell regulation and prolong graft survival. Am J Transpl. 5 (2), 228-236 (2005).
  31. Baroja-Mazo, A., Revilla-Nuin, B., Ramírez, P., Pons, J. A. Immunosuppressive potency of mechanistic target of rapamycin inhibitors in solid-organ transplantation. World J Transplant. 6 (1), 183-192 (2016).
  32. Phillips, B. E., Garciafigueroa, Y., Trucco, M., Giannoukakis, N. Clinical tolerogenic dendritic cells: Exploring therapeutic impact on human autoimmune disease. Front Immunol. 8, 1279(2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الخلايا الغصنية المشتقة من الخلايا الوحيدةالخلايا التائية التنظيميةالخلايا الوحيدة الموجبة لـ CD14قياس التدفق الخلويالفصل المغناطيسي للخلاياتكاثر الخلايا التائيةالعلاج بالمعدلات المناعيةتحفيز خلايا Treg Foxp3
طريقة بسيطة وفعالة لاختبار العوامل المعدلة للمناعة لتوليد الخلايا المتغصنة ذات التحمل من الخلايا الوحيدة البشرية CD14 +
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.