Method Article

طريقة بسيطة وفعالة لاختبار العوامل المعدلة للمناعة لتوليد الخلايا المتغصنة ذات التحمل من الخلايا الوحيدة البشرية CD14 +

DOI:

10.3791/68159

⸱

April 11th, 2025

 , 
1Chemical and Biological Engineering Department, Drexel University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف إجراء لتقييم قدرة العوامل الدوائية على توليد خلايا متغصنة من خلايا شجيرية ساذجة مشتقة من الخلايا الأحادية في المختبر والتحقق من فعاليتها عن طريق توليد الخلايا التائية التنظيمية الذاتية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا التغصنية التحملية (tolDCs) هي مجموعة فرعية من الخلايا التغصنية (DCs) المعروفة بتأثيرها على الخلايا التائية الساذجة نحو النمط الظاهري للخلية التائية التنظيمية (Treg). تخضع TolDCs حاليا للتحقيق كعلاجات للمناعة الذاتية والزرع ، كعلاج خلوي وطريقة لحث tolDCs من DCs الداخلية. ومع ذلك ، حتى الآن ، فإن عدد العوامل المعروفة لتحفيز tolDCs من DCs الساذجة صغير نسبيا وكانت فعاليتها في توليد Tregs in vivo غير متسقة ، لا سيما العلاجات التي تحفز tolDCs من DCs الداخلية. يوفر هذا فرصة لاستكشاف مركبات جديدة لتوليد التسامح.

نصف هنا طريقة لاختبار المركبات المعدلة للمناعة الجديدة على DCs المشتقة من الخلايا الأحادية (moDCs) في المختبر والتحقق من صحة وظائفها لتوليد Tregs ذاتية المنشأ. أولا ، نحصل على PBMCs ونعزل الخلايا الوحيدة CD14 + والخلايا التائية CD3 + باستخدام مجموعات الفصل المغناطيسي المتوفرة تجاريا. بعد ذلك ، نقوم بتمييز الخلايا الوحيدة إلى moDCs ، ونعالجها باستخدام معدل مناعي راسخ ، مثل الرابامايسين أو الديكساميثازون أو IL-10 أو فيتامين D3 ، لمدة 24 ساعة ونختبر تغييرها في علامات التحمل كتحقق من صحة البروتوكول. أخيرا ، نشارك في زراعة tolDCs المستحثة مع الخلايا التائية الذاتية في وجود تحفيز مضاد ل CD3 / CD28 ونلاحظ التغيرات في مجموعات Treg وتكاثر الخلايا التائية. نتصور استخدام هذا البروتوكول لتقييم فعالية العوامل المناعية الجديدة لإعادة برمجة DCs المتمايزة بالفعل نحو tolDC.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا المتغصنة (DCs) هي وسطاء حاسمون بين المناعة الفطرية والتكيفية. DCs ، التي توجد بشكل أساسي في الأغشية المخاطية والجلد والأنسجة اللمفاوية ، هي الخلايا العارضة للمستضد الأولية (APCs)1. تمتص DCs البروتينات الغريبة وتعالجها وتقدمها على بروتينات التوافق النسيجي الرئيسية (MHC) للخلايا التائية الساذجة. تعبر DCs على وجه التحديد عن بروتينات معقد التوافق النسيجي الكبير من الفئة الثانية ، مثل مستضد الكريات البيض البشرية DR (HLA-DR) في البشر. تعد حالة تنشيط الترابط المستمر عند التعرض للمستضد أمرا بالغ الأهمية لاستجابة الخلايا التائية النهائية2. تعبر DCs غير الناضجة عن مستقبلات التعرف على الأنم....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على جميع عينات الخلايا أحادية النواة للدم المحيطي البشري (PBMC) من مركز المناعة البشرية بجامعة بنسلفانيا من متبرعين مجهولي الهوية بموافقة مسبقة من مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة بنسلفانيا (IRB) بموافقة المريض.

اختياري: بينما في هذه الطريقة ، استخدمنا PBMCs المعزولة حديثا التي تم الحصول عليها من مختبر أكاديمي ، يمكن عزل PBMCs إما من الدم الكامل أو منتجات الدم المخصبة بفصادة الكريات الدم. نوصي باستخدام طريقة الطرد المركزي لتدرج الكثافة ، حيث أن هذه طريقة راسخة وموثوقة موصوفة في مكان آخر23.

1. عزل الخلايا الوحيدة / الخلايا التا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد وصفنا بروتوكولا ل PBMCs البشرية ، وعزل كل من خلايا CD3 + T والخلايا الوحيدة CD14 + باستخدام مجموعات الفصل المغناطيسي المتاحة تجاريا ، وتمييز الخلايا الوحيدة إلى CD14- و HLA-DR + و CD141 + و CD1c + moDCs باستخدام GM-CSF و IL-4 ، ومعالجتها لمدة 24 ساعة ، والزراعة المشتركة مع الخلايا التائية الذاتية مع التحفيز المضاد ل CD3 / CD28 لمدة 72 ساعة. يظهر الرسم التخطيطي التجريبي في الشكل 1.

عزل ال.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف هنا طريقة موثوقة ومتعددة الاستخدامات لتقييم وظائف العوامل المعدلة للمناعة لحث tolDCs من moDCs والتحقق من صحة وظائفها لتوليد Tregs من الخلايا التائية الذاتية خارج الجسم الحي. هناك العديد من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول. أولا ، الخلايا الوحيدة هي خلايا حساسة معروفة ويجب الحصول عليها من PBMCs الطازجة وليست المجمدة مسبقا للحصول على أفضل النتائج. يجب عزل الخلايا الوحيدة في أسرع وقت ممكن ووضعها في كوكتيل التمايز. عادة ما يكون ضعف إنتاج الخلايا الوحيدة أو ارتفاع معدلات موت الخ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر مركز المناعة البشرية (HIC) بجامعة بنسلفانيا على توفير PBMCs بشرية جديدة من المتبرعين. يتم دعم التحالف الدولي للموئل جزئيا من قبل AI045008 المعاهد الوطنية للصحة P30 و P30 CA016520.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.1-10 وميكرو ؛ L نصائح ماصة مصفاةVWR76322-158ثقافة الخلية العامة
1.5 مل أنبوب الطرد المركزيVWR77508-358ثقافة الخلية العامة
10 مل ماصات مصليةVWR414004-267ثقافة الخلية العامة
100-1000 & micro ؛ L نصائح ماصة مصفاةVWR76322-164ثقافة الخلية العامة
15 مل أنبوب مخروطيVWR77508-212ثقافة الخلية العامة
20-200 & micro ؛ L نصائح ماصة مصفاةVWR76322-160ثقافة الخلية العامة
2-MercaptoethanolMP الطب الحيوي194834ثقافة الخلايا التائية
50 مل أنبوب مخروطيVWR21008-736ثقافة الخلية العامة
60 × 15 مم طبق ، Nunclon DeltaThermo Fischer150326ثقافة الخلية العامة
96 لوحة سفلية مخروطية جيدا (V) ،غير معالج حراري فيشر277143ثقافة الخلية العامة
96 بئر لوحة مسطحةالقاع الحرارية161093ثقافة الخلية العامة
APC / Cyanine7 المضادة للإنسان CD272 (BTLA) الأجسام المضادةBiolegendBiolegend 344518قياس التدفق الخلوي
Attune NxT (ليزر أحمر / أزرق ، 7 قنوات)Thermo FischerA24863قياس التدفق
الخلوي BSAThermo Fischer15260-037الخلية العامة ثقافة
CD14 الجسم المضاد أحادي النسيلة (61D3) ، PEThermo Fischer12-0149-42قياس التدفق
الخلوي CD1c الجسم المضاد أحادي النسيلة (L161) ، PE-Cyanine7Thermo Fischer25-0015-42قياس التدفق الخلوي
CD209 (DC-SIGN) الجسم المضاد أحادي النسيلة (eB-h209) ، PerCP-Cyanine5.5Thermo Fischer45-2099-42قياس التدفق
الخلوي CD25 الجسم المضاد أحادي النسيلة (CD25-4E3) ، APCThermo Fischer17-0257-42قياس التدفق
الخلوي CD274 (PD-L1 ، B7-H1) الجسم المضاد أحادي النسيلة (MIH1) ، PEThermo Fischer12-5983-42قياس التدفق
الخلوي CD4 الجسم المضاد أحادي النسيلة (RPA-T4) ، Alexa Fluor 488Thermo Fischer53-0049-42قياس التدفق الخلوي
CD40 الجسم المضاد أحادي النسيلة (5C3) ، APCThermo Fischer17-0409-42قياس التدفق
الخلوي CD40 الجسم المضاد أحادي النسيلة (5C3) ، APC-eFluor 780Thermo Fischer47-0409-42قياس التدفق
الخلوي CD69 الجسم المضاد أحادي النسيلة (FN50) ، PEThermo FischerMA1-10276قياس التدفق
الخلوي CD86 الجسم المضاد أحادي النسيلة (BU63) ، FITCThermo FischerMHCD8601قياس التدفق
الخلوي CD8a الجسم المضاد أحادي النسيلة (RPA-T8) ، PE-Cyanine7Thermo Fischer25-0088-42التدفق
الخلويقاع مخروطي (V-well) 96 بئر لوحةThermo Fischer2605لقياس التدفق
الخلوي ، 2 ملThermo Fischer430488T Cell Cultures
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، تسلسل الصفThermo Fischer20688ثقافة الخلية
العامة DPBSThermo Fischer14200166ثقافة الخلية العامة
EasySep طقمعزل الخلايا الأحادية البشريةتقنيات الخلايا الجذعية19359الخلايا
EasySep مجموعة عزل الخلايا التائية البشريةتقنيات الخلايا الجذعية17951فصل الخلايا
الخلايا الجذعيةالمغناطيسية18000الخلايا
EDTAThermo FischerAIM9260Gثقافة الخلايا العامة
Falcon أنابيب البوليسترين المستديرة القاع ، 5 ملتقنياتالخلايا الجذعية38025فصل الخلايا
Fc مستقبلات Fc مثبط ربط الأجسام المضادة متعددة النسيلةThermo Fischer14-9161-73قياس التدفق
الخلوي مصل الأبقار الجنينيThermo FischerA5670701ثقافة الخلية العامة
قابلة للإصلاح صبغة البقاء eFluor 780Thermo Fischer65-0865-18قياس التدفق الخلوي
Foxp3 / مجموعة العازلة لعامل النسخThermo Fischer00-5523-00قياس التدفق
FOXP3 الجسم المضاد أحادي النسيلة (PCH101) ، PE-Cyanine5.5Thermo Fischer35-4776-42قياس التدفق الخلوي
HBSSThermo Fischer14170-112ثقافة الخلية العامة
المعطلة حراريا مصل الأبقارالجنين الحراريA5670801ثقافة الخلية العامة
HEPES (1 م)Thermo Fischer15630106moDC Cell ثقافة
HLA-DR الجسم المضاد أحادي النسيلة (L243) ، Alexa Fluor 488Thermo FischerA51009قياس التدفق الخلوي
البشري CD3 / CD28 / CD2 منشط الخلايا التائيةتقنيات الخلايا الجذعية10970ثقافة الخلايا التائية
البشرية GM-CSF البروتين المؤتلفThermo Fischer300-03moDC ثقافة الخلايا
البشرية IL-10 ELISA Kit ، عالية الحساسيةالحرارية FischerBMS215-2HSاليسا
IL-4 البشري ، بروتين مؤتلف خال منThermo FischerAF-200-04moDC ثقافة الخلايا
PBMC البشرية (معزولة حديثا)UPenn HICN N /A CELLS
HUMAN TNF ALPHA ELISA KitThermo FischerBMS223-4ELISA
Light Microscope (DMi1)Lucia391240ثقافة الخلايا العامة
بولي ساكاريد الدهون (LPS)Invivogentlrl-eblpsmoDC ثقافة الخلايا
LIVE / DEAD قابلة للإصلاح بالقرب من الأشعة تحت الحمراء طقم بقع الخلايا الميتةThermo FischerL34975قياس التدفق
الخلوي MEM محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية (100x)Thermo Fischer11140050T Cell Cell
Penicillin-Streptomycin (100x)Thermo Fischer15140122لثقافة الخلايا العامة
VWR77575-370ثقافة الخلية العامة
راباميسين ، 98 + ٪ثيرمو فيشرJ62473. MFmoDC Cell Culture
RPMI 1640 مع GlutamaxThermo Fischer61870-036ثقافة الخلية
العامة 20144الخلايا
كوكتيل تحفيز الخلايا التائية (500x)Thermo Fischer00-4970-93T Cell Culture
UltraComp eBead Plus تعويض الخرزThermo Fischer01-3333-41Flow
مجموعة الماصات المتغيرةفيشر العلمي05-403-152ثقافة الخلية العامة
سطح قياس قوارير مبردة فصل EasySep تقنيات فصل الخلوي Culture وحدة التحكم في الماصة تقنيات الخلايا الجذعية العازلة لفصل فصل لقياس الخلايا

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18 (1), 767-811 (2000).
  2. Blander, J. M., Medzhitov, R. Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells. Nature. 440 (7085), 808-812 (2006).
  3. Anderson....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tolerogenic Dendritic CellsMonocyte Derived Dendritic CellsImmunomodulatory AgentsRegulatory T CellsCD14 Positive MonocytesFlow CytometryMagnetic Cell SeparationT Cell ProliferationImmunomodulator TreatmentFoxp3 Treg Induction

Related Articles