مقالة منهجية

أون الوجه التقطيع بالتبريد لشبكية العين الفأرية للتحليل الجزيئي المكاني عالي الأبعاد

DOI:

10.3791/68171

⸱

يوليو 8, 2025

 , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Colorado Anschutz Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تظهر شبكية العين تنظيما مكانيا معقدا عبر هيكلها الرقائقي. تتطلب تقنيات النسخ المكاني والتسلسل المكانية الحديثة أقساما < الأنسجة بسمك 20 ميكرومتر ، مما يحد من قابليتها لتطبيق أبحاث الشبكية. تنتج طريقة التقطيع بالتبريد المجمدة حديثا أقساما رقيقة من شبكية العين مع الحفاظ على العلاقات المكانية المستوية ، مما يتيح رسم خرائط جزيئية شاملة عبر الصفائح.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمثل الهيكل الصفحي المعقد لشبكية العين تحديات كبيرة لرسم الخرائط الجزيئية المكانية الشاملة. التقنيات الحالية للتحقيق في بنية الأنسجة والتفاعلات الجزيئية محدودة بسبب القيود التقنية التي تضر بالعلاقات المكانية أو تقيد التنميط الجزيئي. الطرق الحالية مثل المقطع العرضي ، ومستحضرات التثبيت بالكامل ، والتفكك الكيميائي أو الميكانيكي ، وأقسام الوجه السميكة إما تعطل سلامة الأنسجة ، أو تفقد السياق المكاني الحرج ، أو في أغلب الأحيان ، ببساطة غير متوافقة مع منصات التسلسل المكاني عالية الأبعاد.

تقدم هذه الدراسة تقنية التقطيع بالتبريد التي تنتج أقساما رقيقة (<20 ميكرومتر) في الوجه مع الحفاظ على العلاقات المكانية الأساسية لرسم خرائط لتوزيعات خلايا الشبكية. تحافظ الطريقة على سلامة الحمض النووي الريبي وبنية الأنسجة مع إنشاء أقسام متوافقة مع منصات التحليل الجزيئي عالية الإنتاجية. يتم الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي لأن هذه التقنية تقسم الأنسجة المجمدة الطازجة ، والتي يدعمها مصنعو منصات النسخ المكانية رسميا بالنسبة للأنسجة اللاحقة. نتحقق من صحة هذا النهج باستخدام طرق التنميط الجزيئي المتعددة ، مما يدل على التكامل الناجح مع كل من التهجين اليدوي RNAscope في الموقع (12 هدفا) والتسلسل المكاني للزينيوم (300 هدف). تحافظ هذه التقنية باستمرار على بنية الأنسجة عبر العينات مع الحفاظ على جودة الحمض النووي الريبي المناسبة لهذه التطبيقات الجزيئية الحساسة.

يتيح هذا التقدم المنهجي إجراء تحقيقات جديدة في توزيعات نوع خلايا الشبكية ، والتدرجات الجزيئية عبر الصفيحات ، والجوانب المكانية لأمراض الشبكية. يوفر تعدد استخدامات التقنية وتوافقها مع منصات البيولوجيا المكانية الحديثة أساسا لرسم خرائط جزيئية شاملة للتنظيم الخلوي المعقد لشبكية العين.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طورت الخلايا العصبية في الشبكية طبوغرافيا مكانية تسهل معالجة المعلومات ، والتي تؤدي في العديد من الأنواع إلى تخصصات إجمالية مثل النقرة ، والمنطقة المركزية ، والخطوط1،2،3. على عكس التنوع المفهوم جيدا لتوزيع المستقبلات الضوئية ، فإن التخصص المكاني لإخراج الشبكية ، الذي تتكون من خلايا العقدة الشبكية (RGCs) ، أقل وضوحا. بالنسبة لمعظم الأنواع ، فإن التوزيعات المكانية ل RGCs غير معروفة تماما. حتى بالنسبة للفأر ، الذي يمكن القول إنه نموذج الفقاريات الذي تمت دراسته للوظيفة البصرية ، إن لم يكن أفضل نموذج للفقاريات ، فقد تم تعيين أقل من ثلث الأنواع الفرعية RGC بتقنيات تقليدية مثل الكيمياء المناعية الكاملة2. تفشل هذه التقنيات لأن معظم الأنواع الفرعية ل RGC لا تحتوي على علامة وراثية محددة. بدلا من ذلك ، هناك حاجة إلى معلومات جزيئية ذات أبعاد أعلى لتصنيف RGC الدقيق4 عبر تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية5،6،7.

تعد المعلومات حول توزيع RGC مهمة ، حيث تظهر الطبوغرافيا التي لوحظت في الفأر ارتباطات بيئية واضحة بين وضع RGC والوظيفة البصرية. المثال الأكثر لفتا للانتباه هو التنظيم المكاني ل ɑON-S RGCs ، التي تتجمع في شبكية العين الصدغية. تتلقى هذه المنطقة صورة الفريسة8 أثناء سلوكيات الصيد9. من المقام أيضا أن الأنواع الفرعية من RGC معرضة بشكل تفاضلي للإصابة بالمرض10 ، وبعض الأمراض الشائعة مثل الجلوكوما لها مكون مكاني لتطورها11،12. وبالتالي ، فإن السؤال المهم الذي يواجه هذا المجال هو: ما هو التنظيم المكاني للأنواع الفرعية RGC أثناء تجانب شبكيةالعين 1؟ هذه الفجوة في المعرفة تحد حاليا من الرؤى حول السلوكيات والأمراض الأخرى الموجهة بصريا.

ينصب تركيز الطريقة الحالية على معالجة هذه الفجوات المعرفية الجزيئية من خلال نهج التقطيع بالتبريد الذي يحافظ على العلاقات المكانية مع تمكين التحليل الجزيئي عالي الدقة. تمثل منصات التسلسل المكاني الحديثة مثل Xenium من 10X تقدما تحويليا في التنميط الجزيئي ، حيث تقدم رؤى غير مسبوقة حول تنظيم الأنسجة والتفاعلات الخلوية. ومع ذلك ، فإن هذه المنصات ، جنبا إلى جنب مع تقنيات الترميص السفلي مثل RNAscope وطرق التسلسل المشفرة مكانيا مثل Visium ، تشترك في قيود فنية حرجة: فهي تتطلب أقساما من الأنسجة أرق من 20 ميكرومتر. يمثل هذا المطلب تحديا خاصا لأنسجة الشبكية ، والتي يبلغ سمكها عادة 200 ميكرومتر.

حتى الآن ، اعتمد الباحثون بشكل أساسي على المقاطع العرضية عند تطبيق هذه التقنيات على أنسجة الشبكية13. في حين أن المقاطع العرضية تكشف بشكل فعال عن العلاقات الجزيئية داخل الطبقات النووية والشبكية في سياق الدوائر الرأسية ، إلا أنها أقل ملاءمة لالتقاط التوزيعات المكانية الأوسع لخلايا الشبكية التي كشفت عنها مستحضرات التثبيت الكاملةتقليديا 8. كانت المحاولات الأخيرة في التقسيم الوجهي محدودة بسبب قيود سمك المقطع ، حيث حققت الدراسات 50 ميكرومتر فقط من الأقسامبسمك 14 - أكثر من اللازم لمنصات التحليل الجزيئي الحديثة عالية البلطين. تشمل الأساليب التاريخية الأخرى التي تم نشرها لدراسة صفيحة الشبكية الفردية ولكنها غير متوافقة مع تقنيات التسلسل المكاني الحديثة الهضم الأنزيمي ، جنبا إلى جنب مع التفكك الميكانيكي15،16 ، أو التفكك الميكانيكي وحده17،18،19،20. نقدم هنا تقنية جديدة للاستئصال بالتبريد مصممة خصيصا لأنسجة الشبكية الرقيقة المنحنية التي تتغلب على هذه القيود. باختصار ، تتضمن طريقتنا استخراج الغرفة الخلفية للعين ، وإنشاء شقوق مريحة في كل من شبكية العين والصلبة ، وتسطيح الأنسجة بشبكية العين الداخلية مقابل غطاء زجاجي ، وتضمين الأنسجة في OCT ، وأخيرا ، القطع بالتبريد من شبكية العين الخارجية إلى الداخلية (الشكل 1). تحافظ طريقتنا على العلاقات المكانية مع إنتاج أقسام رقيقة بما يكفي (<20 ميكرومتر) لأدوات البيولوجيا المكانية عالية الأبعاد ، كما تم التحقق من صحتها من خلال التنفيذ الناجح مع كل من RNAscope اليدوي (12 هدفا) ومنصة Xenium الآلية (300 هدف) ، مما يدل على التوافق عبر مقاييس التعقيد المختلفة للتحليل الجزيئي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت جميع التجارب وفقا وبموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) والمبادئ التوجيهية المؤسسية ذات الصلة التي توافق على هذه الأساليب التي تشرف عليها جامعة كولورادو. يجب أن تتبع جميع الخطوات المتعلقة باستخدام والقتل الرحيم اللوائح المحلية والتصاريح التجريبية. تم إيواء جميع الفئران برعاية قياسية في منشأة بيطرية معتمدة مع حرية الوصول إلى الطعام والماء. تعتمد تقنية التقطيع بالتبريد على تقنيات تشريح الشبكية القياسية المحسنة للفئران C57BL / 6. لتطوير هذه التقنية تم استخدام ما يقرب من 150 فأرا من كلا الجنسين تتراوح أعمارهم بين 6 أسابيع و 2 سنة. التقنية النهائية التي يتم توصيلها هنا لها معدل نجاح يبلغ حوالي 95٪ بغض النظر عن الخصائص الديموغرافية للفأر. لاحظ أنه إذا لم يتم سرد درجة الحرارة لخطوة ، فمن المتوقع أن تكون درجة حرارة الغرفة حوالي 20-25 درجة مئوية. ستعمل المحاليل التي لا تحتوي على درجة حرارة مدرجة إذا كانت مبردة وبالتالي فإن نطاق درجة حرارة العمل للحلول هو 4-25 درجة مئوية.

1. تشريح

  1. قم بتخدير الفأر باستخدام الأيزوفلوران والتحقق من صحة التخدير بقرص إصبع القدم ، أو اتبع القواعد واللوائح المحلية للحث على التخدير وتأكيده لأن الطرق الأخرى مناسبة بنفس القدر.
  2. القتل الرحيم للفأر عن طريق خلع عنق الرحم: قم بتأمين رأس الفأر بيد وقاعدة الذيل باليد الأخرى ، ثم اسحب في اتجاهين متعاكسين. إجراء القتل الرحيم الثانوي عن طريق قطع الرأس.
  3. قم بتمييز القطب الزمني للكرة الأرضية على القرنية للحفاظ على الاتجاه وإنشاء نقطة ضعف للتشريح (الشكل 2 ب والشكل 3 أ).
  4. اغمر الكرة الأرضية في محلول أميس في طبق يحتوي على قطعة من ورق الترشيح (أكبر من الكرة الأرضية ولكنها أصغر من الطبق).
    ملاحظة: سيؤدي استخدام محاليل أخرى غير أميس إلى تدهور الشبكية (الشكل 4 أ).
  5. باستخدام ملقط حاد # 5 ومقص قزحية ، قم بإزالة جميع العضلات واللفافة والأوعية الدموية والأعصاب بعناية من الكرة الأرضية (الشكل 2E و F والشكل 3 ب) دون ثقب الصلبة (الشكل 2 د).
    ملاحظة: سيؤدي ثقب الصلبة خلال هذه الخطوة (الشكل 4 ب) إلى فتق الأنسجة (الشكل 4 ج).
  6. ضع طرف شفرة مقص قزحية العين بشكل عمودي على علامة القرنية ، مع مقص مواز لرأس العصب البصري. ثقب الكرة الأرضية في هذا الموضع (الشكل 3 ج ، د).
  7. قم بعمل شق واحد نظيف عبر القرنية والأطراف ، مع الاستمرار في الصلبة وشبكية العين باتجاه رأس العصب البصري (الشكل 3E).
    ملاحظة: لا تقطع رأس العصب البصري وإلا ستنفصل الصلبة والشبكية. سيختلف الطول الدقيق لهذا الشق اعتمادا على حجم الكرة الأرضية ، والذي يمكن أن يختلف بشكل كبير بين القديمة مقابل الصغيرة ، وكذلك في بعض خطوط Cre بالنسبة للحيوانات البرية. نوصي بترك ما يقرب من 1 مم من الأنسجة بين أعمق مدى لهذا الشق ورأس العصب البصري.
  8. ضع الشفرة بشكل عمودي على القطع الأولي (الشكل 3F ، G) ، خلف الطرف بحوالي 1 مم (الشكل 2 ج). ابدأ بقطع الصلبة والشبكية شعاعيا.
    1. حافظ على خط قطع متسق خلفيا وموازيا للطرف باستخدام ملقط حاد لتوجيه الكرة الأرضية وتدويرها. في حين أن تقليل التخفيضات أمر مثالي ، أعط الأولوية للحفاظ على مسار شعاعي نظيف. إذا انفصلت الشبكية عن الصلبة ، فقم بتغيير موضع شفرة مقص القزحية لقطعهما معا.
      ملاحظة: قد يتسبب قطع الحافة في انفصال الشبكية عن الصلبة أثناء استخراج العدسة. القصاصات الصغيرة والدورات مقبولة. تجنب استخدام القوة لتأمينها ، لأن هذا يخاطر بفتق الشبكية.
    2. قم بتقدير المسافة الخلفية 1 مم باستخدام العرض الأوسط لشفرة مقص القزحية. عندما تكون غير متأكد، تخطئ في وضع أكثر خلفية، حيث ينحني اتصال شبكية العين بالأطراف داخليا. يسهل القطع الخلفي استخراج الشبكية المسطحة.
  9. بعد الانتهاء من القطع الشعاعي بالتوازي مع الحافة ، افحص اتصالات الشبكية المتبقية. قم بقطعها بعناية باستخدام مقص القزحية حتى يتم فصل أقسام الكرة الأرضية الأمامية والخلفية.
  10. باستخدام زوجين من الملقط الحاد # 5 ، افصل برفق بين الأجزاء الأمامية والخلفية من الكرة الأرضية (الشكل 3H). في الفئران الأكبر سنا ، قد تربط الألياف الشفافة العدسة بكوب الشبكية. قم بقطعها بعناية باستخدام مقص القزحية مع تقليل فصل الشبكية عن الصلبة.
    ملاحظة: يجب أن تظل العدسة متصلة بالأطراف والقرنية.
  11. باستخدام ورق الترشيح كمنصة دعم ، قم بقص شبكية العين إلى ورقة البرسيم (المعروفة أيضا باسم الصليب الحديدي) باستخدام مقص القزحية (الشكل 3I-K).
    ملاحظة: يجب أن تكون شقوق أوراق البرسيم أقصر من شق التوجيه الأساسي الذي تم إجراؤه في البداية من خلال الحافة إذا كان اتجاه التسجيل بهذه الشريحة مطلوبا. نوصي بتقليل حجم هذه الشقوق الشعاعية الثلاثة الجديدة لتكون أقصر بحوالي 1-2 مم من الشق الأولي. إذا تم استخدام ميزة مختلفة ، مثل تدرج opsin ، للتوجيه ، فمن المناسب أن تكون جميع الشقوق بنفس الطول مع الاحتفاظ دائما بحوالي 1 مم من الأنسجة بين أعمق جزء من الشق ورأس العصب البصري لمنع انفصال شبكية العين والصلبة.
  12. كرر التشريح بالعين الثانية. لتقليل النخر ، قم بإزالة الحجرة الأمامية للعين الثانية بالكامل في غضون 10 دقائق من القتل الرحيم.

2. الحفظ بالتبريد

  1. قم بإعداد ماصة بلاستيكية قابلة للنقل يمكن التخلص منها عن طريق قطع الطرف لإنشاء فتحة أكبر من الشبكية والصلبة المقطعة (يشار إليها فيما يلي باسم شبكية العين).
  2. قم بشفط شبكية العين برفق في الماصة ووضعها على شريحة مجهر زجاجي. باستخدام منديل مختبري ، قم بإزالة محلول أميس الزائد بعناية حول شبكية العين حتى لا تطفو بحرية ويمكن تسويتها.
  3. باستخدام ملقطين حادين # 5 ، افتح شبكية العين وضعها بشكل مسطح مع توجيه كوب العين الداخلي لأعلى. اعتمادا على حجم الأنسجة ، قم بعمل قطع تنفيذ من 0.5 إلى 2 مم في كل جزء من أوراق البرسيم لزيادة تسطيح شبكية العين ، وضبط الأنسجة بعناية لمنع الطي (الشكل 5 أ). قم بإزالة محلول أميس الإضافي حتى يظل السائل مجاورا لشبكية العين فقط.
  4. باستخدام غطاء ، اضغط بسرعة على شبكية العين وانقلها (الشكل 5 ب) مع السائل المحيط بها بحيث تكون الصلبة الخارجية متجهة لأعلى وتلامس كوب العين الداخلي مع الغطاء ، أي أن خلايا العقدة الشبكية ستواجه لأعلى (الشكل 5 ج).
  5. تحقق من عدم طي شبكية العين وإجراء التعديلات حسب الحاجة ؛ أضف حل أميس لتسهيل التلاعب. نظرا لأن السائل الزائد سيؤدي إلى تجعد الأنسجة ، استخدم منديل مختبري لإزالة كل محلول أميس الزائد والسماح لشبكية العين بالجفاف في الهواء لمدة 5-10 ثوان.
    ملاحظة: قد يؤدي عدم السماح بتجفيف الهواء لفترة وجيزة بشكل عشوائي إلى فصل الأنسجة OCT أثناء التشريح بالتبريد. قد يؤدي التجفيف المفرط للهواء إلى تلف الأنسجة المرتبطة ببلورات الملح.
  6. ضع وسط OCT لتغطية شبكية العين واستخدم الملقط لنشر هذه الطبقة بالتساوي عبر الغطاء ، مما يمنع تعويم الشبكية. اترك 30 ثانية لوسط OCT لاختراق شبكية العين.
  7. قم بتجميد شبكية العين في OCT (الشكل 5D) باستخدام صفيحة معدنية مبردة بشكل غير مباشر ببخار النيتروجين السائل أو عن طريق ملامسة مباشرة للثلج الجاف.
  8. قم بتخزين شبكية العين على الثلج الجاف إذا كنت تستخدم على الفور أو في فريزر -80 درجة مئوية في كيس بلاستيكي أو وعاء يحتوي على مواد مجففة في حالة تخزينها على المدى الطويل.

3. التقطيع بالتبريد

  1. اضبط حجرة التبريد على -18 درجة مئوية والمرحلة على -12 درجة مئوية. ضع شبكية العين في الغرفة لتتوازن مع درجة الحرارة.
  2. قم بإنشاء قبة OCT على ظرف العينة. إذا كنت تستخدم نفس نموذج cryosta ، فتأكد من أن هذه القبة تشغل الحلقات الداخلية 2-3. بمجرد التجميد ، قم بقص قبة OCT لإنشاء سطح مرحلة مسطح مواز للشفرة الموجودة على الظرف للاحتفاظ بالتسطيح الرقائقي (الشكل 6 أ).
  3. قم بإنشاء أو ملاحظة دليل التوجيه المرتبط بالظرف بمرحلة ناظم البرد.
    ملاحظة: في نموذج cryostat الذي نوصي به ، يكون دليل التوجيه عبارة عن خط مركزي محفور في موضع الساعة 12 فوق حامل الظرف ، بينما يحتوي ظرف الظرف نفسه على قطع مثلث على الحلقات الخارجية. نشير معا إلى هذه الميزات على أنها دليل التوجيه. إذا لم يكن ناظم البرد الخاص بك يحتوي على مثل هذه الميزات ، فإننا نوصي باستخدام علامة دائمة لصنعها بنفسك.
  4. جهز شبكية العين للنقل باستخدام شفرة حلاقة عن طريق إزالة OCT الزائد المحيط بشبكية العين بشكل جانبي ثم فصل شبكية العين بعناية عن الغطاء لجعلها متحركة.
  5. قم بإزالة ظرف الظرف من المسرح وقم بتطبيق قطرة صغيرة من السائل OCT على سطح مرحلة OCT المسطح المجهز.
  6. ضع شبكية العين مباشرة على السائل OCT. باستخدام شريحة زجاجية مبردة مسبقا (-18 درجة مئوية) ، اضغط مع الاستمرار على شبكية العين على مرحلة OCT لمدة 10-30 ثانية حتى تتجمد.
  7. ضع OCT إضافيا على شبكية العين والمرحلة لضمان الترابط الكامل. قم بتجميد منطقة التجميد السريع في ناظم التبريد. احتضان مرحلة شبكية العين / OCT في ناظم البرد لمدة 30 دقيقة على الأقل لضمان الترابط الكامل.
  8. ابدأ التقسيم:
    1. قم بقص OCT الزائد بعناية حتى تصبح شبكية العين مرئية (الشكل 6 ب). استخدم شفرة الحلاقة لإزالة OCT الزائد من حواف الكتلة.
      ملاحظة: قم دائما بسحب المرحلة قبل استئناف التقسيم بعد أي تشذيب يدوي شعاعي. لتقليم الشرائح en الوجه ، نوصي باستخدام نفس سمك القطع الذي سيتم استخدامه للأقسام المرغوبة ؛ ومع ذلك ، قد يتراوح سمك التشذيب بين 10 ميكرومتر و 100 ميكرومتر بناء على تفضيلات المستخدم.
    2. استمر في التشذيب أثناء فحص الأقسام بحثا عن وجود الصلبة. عندما تكون الصلبة مرئية ، اضبط زاوية المرحلة حسب الحاجة. استمر في التشذيب حتى تظهر الأقسام توزيعا متساويا للصلبة ، مما يضمن التسطيح الأمثل ومساحة أوراق البرسيم القصوى في كل قسم.
    3. اجمع أقسام الأنسجة (الشكل 6 ج).
      ملاحظة: يعتمد السماكة المثلى على الفحص النهائي الذي يتم إجراؤه ويجب أن يلتزم ببروتوكول المصب هذا. على سبيل المثال ، إذا تم استخدام 10X Xenium ، فإننا نوصي بأقسام بسمك 20 ميكرومتر. بينما بالنسبة ل 10X Visium ، تكون الأقسام بسمك 15 ميكرومتر أكثر ملاءمة.
    4. استخدم الشرائح المبردة مسبقا وقم بمعالجة الأقسام في موضعها باستخدام فرشتين للرسم.
    5. ضع إصبعا أسفل القسم حتى يذوب OCT ويلتصق الأنسجة (حوالي 5 ثوان).
    6. أعد الشريحة إلى سطح بارد لإعادة تجميد الأنسجة.
      ملاحظة: عند جمع الأقسام في مناطق صغيرة (على سبيل المثال ، للزينيوم) ، قد تكون دورات التجميد والذوبان متعددة ضرورية. في حين أن هذا لا يؤثر على التقنيات القائمة على المسبار ، إلا أنه قد يؤثر على جودة الحمض النووي الريبي لأساليب التسلسل غير المتحيزة.
  9. قم بتخزين الشرائح على الثلج الجاف للاستخدام الفوري ، عند -20 درجة مئوية لمنظار RNAscope في اليوم التالي وعند -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.

4. الكشف عن الهدف والفحص المجهري

ملاحظة: في حين أن هذه التقنية متوافقة مع طرق التنميط الجزيئي الأخرى ، فإننا نفصل RNAscope كمثال واحد تم التحقق من صحته.

  1. تحضير العينة:
    1. قم بإزالة الشرائح من التخزين -80 درجة مئوية وقم بتسخينها عند -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
      ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 12 ساعة قبل بدء بقية هذا الإجراء ولكن لا ينبغي تركها عند -20 درجة مئوية لفترة طويلة جدا لتقليل تدهور الحمض النووي الريبي.
  2. قم بتسخين الشرائح بسرعة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 ثوان.
  3. قم بإصلاح المناديل عن طريق غمر الشرائح في 4٪ PFA طازج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. اغسل الشرائح جيدا باستخدام 1x PBS.
  5. جفاف الأنسجة من خلال سلسلة الإيثانول: 50٪ إيثانول لمدة 5 دقائق ، 70٪ إيثانول لمدة 5 دقائق ، 100٪ إيثانول لمدة 5 دقائق ، إيثانول طازج 100٪ لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: هذه خطوة حاسمة لمراقبة الجودة لتركيب الأنسجة. إذا حدث انفصال الأنسجة أثناء الجفاف ، فهذا يشير إلى تداخل OCT من الأقسام المجاورة أثناء التركيب. يمنع التشذيب الدقيق ل OCT الزائد أثناء التقسيم والتركيب هذه المشكلة.
  6. إعداد الحاجز:
    1. جفف الشرائح في الهواء على سطح الطاولة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. باستخدام قلم حاجز كاره للماء ، ارسم حاجزا حول كل قسم من أقسام الأنسجة. اترك الحاجز يجف تماما لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  7. الكشف الجزيئي:
    1. تطبيق علاج البروتياز الوريدي لنفاذية الأنسجة.
    2. تابع بروتوكول الشركة المصنعة لتهجين المسبار المستهدف (2 ساعة عند 40 درجة مئوية) ، وخطوات تضخيم الإشارة (ثلاثة مكبرات صوت متسلسلة) ، والكشف عن الفلوروفور (أربع جولات متسلسلة للتلوين ثلاثي الطوابق).
  8. التصوير:
    1. قم بإجراء التلوين النووي DAPI قبل كل تركيب زجاجي للغطاء.
    2. قم بتركيب الغطاء الزجاجي باستخدام وسيط تركيب مضاد للبهتان.
    3. الصورة باستخدام المجهر الفلوري مع مجموعات المرشحات المناسبة.
    4. للكشف عن تعدد الإرسال ، التقط نفس الحقل عبر جميع جولات الكشف الأربع للتسجيل الحسابي.
    5. حافظ على إعدادات تعريض ضوئي متسقة بين الجولات لمقارنة دقيقة للإشارة.
      ملاحظة: للحصول على تفاصيل كاملة حول تنفيذ RNAscope ، راجع بروتوكولات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). بالنسبة للمنصات المؤتمتة بالكامل مثل Xenium ، اتبع جميع خطوات بروتوكول الشركة المصنعة تماما كما هو موضح. بالنسبة لجميع البروتوكولات ، توقع أن يحدث الفشل بسبب انفصال الأنسجة على الأرجح أثناء خطوة الجفاف أو الغسيل المبكرة ، بسبب تداخل OCT ، كما هو مذكور في هذا البروتوكول النموذجي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ينتج عن التنفيذ الناجح لهذا البروتوكول أقسام شبكية سليمة ومناسبة لأساليب التنميط الجزيئي المتعددة مع الحفاظ على العلاقات المكانية عبر سطح الشبكية. نظهر فائدة البروتوكول من خلال نهج التحقق المنهجي ، والتقدم من الكيمياء المناعية التقليدية من خلال الكشف اليدوي عن الحمض النووي الريبي متعدد الإرسال إلى التنميط الجزيئي الآلي عالي الإنتاجية.

يستخدم التحقق الأولي من بروتوكولنا علامتين متميزتين جيدا لتقييم سلامة الأنسجة والحفاظ على الهيكل عبر جميع صفيحة الشبكية (الشكل 7

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعالج الطريقة المعروضة هنا حاجزا تقنيا حاسما في البيولوجيا المكانية للشبكية من خلال تمكين إنتاج أقسام رقيقة مناسبة لتقنيات التنميط الجزيئي الحديثة. تتمحور الخطوات الأكثر أهمية في البروتوكول حول التعامل مع الأنسجة أثناء التشريح الأولي والتحكم الدقيق في درجة الحرارة والترطيب أثناء الحفظ بالتبريد والتقسيم. يعتمد التنفيذ الناجح بشكل خاص على تحقيق تسطيح الأنسجة بشكل صحيح قبل تضمين OCT والحفاظ على تحكم ثابت في درجة الحرارة طوال عملية التقسيم.

القطع ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الموارد المشتركة لمراقبة المناعة البشرية (RRID: SCR_021985) داخل مركز السرطان بجامعة كولورادو (P30CA046934) على مساعدتهم المتخصصة في تشغيل منصة 10X Xenium. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01EY035293).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أميس وبرايم. متوسطSigma-AldrichA1420-10X1Lعلامة تجارية محددة ليست مهمة
Beadsmith Thread Zap ، Thread BurnerThe Beadsmith Store7.90524E + 11يمكن استخدام الكي
البديل CryostatLeicacm1950الاعتبارات المهمة هي الحجم الذي يمكن التحكم فيه بشكل منفصل مقابل درجة حرارة المرحلة.
الثلج الجافNANANA
أدوات العلوم الدقيقة دومون # 5 ملقطأدوات العلوم الدقيقة 1129500NC9889584علامة تجارية محددة ليست مهمة
فيشر للرعاية الصحية الأنسجة بالإضافة إلى OCT مركبفيشر العلمي23-730-571علامة تجارية محددة ليست مهمة
Fisherbrand عالية الدقة مستقيمة نحيلة نقطة دقيقة ملاقط / ملقطفيشر Scientific12-000-127علامة تجارية محددة ليست مهمة
مقص تشريح قياسي فيشرساينتيك08-951-20علامة تجارية محددة ليست مهمة
Fisherbrand Superfrost Plus MicroscopeSlides Fisher Scientific22-037-246علامة تجارية محددة ليست مهمة
Integra Miltex Noyes Iris ScissorsIntegra Miltex 18151012-460-278علامة تجارية محددة غير مهمة
أوليمبوس IX81 الغزل قرص مجهرللشكل 7
RNAscope HiPlexACDBio
نظارات غطاء مستطيلةفيشر Scientific12-541-033علامة تجارية محددة ليست مهمة
بيكربونات الصوديومSigma-AldrichS6014-25Gعلامة تجارية محددة ليست مهمة
أطباق القاع الزجاجي Thermo ScientificNunc Fisher Scientific12-567-400علامة تجارية محددة ليست مهمة
الدقة العالمية دقة تكبير ستيريو مجهر ثلاثي العينيات (IV) على حامل ذراع الرافعةأداة الدقة العالمية PZMTIVBS50-253-8607علامة تجارية محددة ليست مهمة
Zeiss Axio Imager.M2 مجهر التألق  تم تمكين التقسيم البصري (للشكل 8)
epifluorescence أداة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baden, T., Euler, T., Berens, P. Understanding the retinal basis of vision across species. Nat Rev Neurosci. 21 (1), 5-20 (2020).
  2. Heukamp, A. S., Warwick, R. A., Rivlin-Etzion, M. Topographic variations in retinal encoding of visual space. Annu Rev Vis Sci. 6, 237-259 (2020).
  3. Collin, S. P. A web-based archive for topographic maps of retinal cell distribution in vertebrates. Clin Exp Optom. 91 (1), 85-95 (2008).
  4. Budoff, S. A., Poleg-Polsky, A. GraSP gene targets to hierarchically infer sub-classes with CuttleNet. bioRxiv. , (2024).
  5. Rheaume, B. A., et al. Single cell transcriptome profiling of retinal ganglion cells identifies cellular subtypes. Nat Commun. 9 (1), 2759(2018).
  6. Tran, N. M., et al. Single-cell profiles of retinal ganglion cells differing in resilience to injury reveal neuroprotective genes. Neuron. 104 (6), 1039-1055.e12 (2019).
  7. Yan, W., et al. Mouse retinal cell atlas: Molecular identification of over sixty amacrine cell types. J Neurosci. 40 (27), 5177-5195 (2020).
  8. Bleckert, A., Schwartz, G. W., Turner, M. H., Rieke, F., Wong, R. O. L. Visual space is represented by nonmatching topographies of distinct mouse retinal ganglion cell types. Curr Biol. 24 (3), 310-315 (2014).
  9. Holmgren, C. D., et al. Visual pursuit behavior in mice maintains the pursued prey on the retinal region with least optic flow. eLife. 10, e70838(2021).
  10. Tapia, M. L., Nascimento-dos-Santos, G., Park, K. K. Subtype-specific survival and regeneration of retinal ganglion cells in response to injury. Front Cell Dev Biol. 10, 956279(2022).
  11. Berchuck, S. I., Mukherjee, S., Medeiros, F. A. Estimating rates of progression and predicting future visual fields in glaucoma using a deep variational autoencoder. Sci Rep. 9 (1), 18113(2019).
  12. de Gainza, A., et al. The trajectory of glaucoma progression in 2-dimensional structural-functional space. Ophthalmol Glaucoma. 3 (6), 466-474 (2020).
  13. Choi, J., et al. Spatial organization of the mouse retina at single cell resolution by MERFISH. Nat Commun. 14 (1), 4929(2023).
  14. Kremers, L., et al. Super-resolution STED imaging in the inner and outer whole-mount mouse retina. Front Ophthalmol. 3, 1126338(2023).
  15. Simon, P., Thanos, S. Combined methods of retrograde staining, layer-separation and viscoelastic cell stabilization to isolate retinal ganglion cells in adult rats. J Neurosci Methods. 83 (2), 113-124 (1998).
  16. Lindqvist, N., Vidal-Sanz, M., Hallböök, F. Single cell RT-PCR analysis of tyrosine kinase receptor expression in adult rat retinal ganglion cells isolated by retinal sandwiching. Brain Res Brain Res Protoc. 10 (2), 75-83 (2002).
  17. Fontaine, V., Kinkl, N., Sahel, J., Dreyfus, H., Hicks, D. Survival of purified rat photoreceptors in vitro is stimulated directly by fibroblast growth factor-2. J Neurosci. 18 (23), 9662-9672 (1998).
  18. Sandu, C., Hicks, D., Felder-Schmittbuhl, M. -P. Rat photoreceptor circadian oscillator strongly relies on lighting conditions: Molecular clock in rat photoreceptors. Eur J Neurosci. 34 (3), 507-516 (2011).
  19. Jaeger, C., et al. Circadian organization of the rodent retina involves strongly coupled, layer-specific oscillators. FASEB J. 29 (4), 1493-1504 (2015).
  20. Hecht, R. M., Shi, Q., Garrett, T. R., Sivyer, B., Morgans, C. Split retina as an improved flatmount preparation for studying inner nuclear layer neurons in vertebrate retina. J Vis Exp. (203), e65757(2024).
  21. Budoff, S. A., Poleg-Polsky, A. A Complete spatial map of mouse retinal ganglion cells reveals density and gene expression specializations. bioRxiv. , (2025).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

RNAscope Xenium RNA

مقالات ذات صلة