نموذج حقن Cisterna Magna طفيف التوغل لدراسات ورم خبيث البريماني السحائي في الفئران

لا يزال المرض النقيلي هو التحدي الأكبر للمرضى الذين يعانون من السرطانات المتقدمة. يشير ورم خبيث سحائي (LM) إلى انتشار الخلايا السرطانية إلى الأم ، والأم العنكبوتية ، والفضاء تحت العنكبوتية. أصبح LM من الأورام الصلبة شائعا بشكل متزايد في سرطان الرئة (9٪ -25٪) وسرطان الثدي (5٪ -20٪) والورم الميلانيني (6٪ -18٪) ^1،2 ، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى البقاء على قيد الحياة لفترة أطول وتقنيات التشخيص المحسنة. يمكن للخلايا السرطانية أن تغزو الفضاء السحائي البريماني بطرق متعددة ، بما في ذلك 1) الغزو المباشر من خلال الهياكل الطرفية مثل الأم الجافية والعظام والأعصاب. 2) انتشار الدم من خلال الجهاز الوريدي. و 3) الدخول من خلال الدورة الدموية الشريانية ، حيث تنزلق الخلايا السرطانية عبر الأوعية المحشوقة إلى الضفيرة المشيمية ثم إلى البطينين المملوءين بالسائل النخاعي^3،4،5. تواجه الخلايا السرطانية التي تدخل الفضاء السحائي البريماني تحديات متعددة ، بما في ذلك الحرمان من عوامل النمو ، والمواد الوسيطة الأيضية المحدودة ، وحالات نقص الأكسجين⁶. ومع ذلك ، نظرا لعدم وجود الأدوات والتقنيات المناسبة ، فإن كيفية تنقل الخلايا السرطانية في هذه المسارات والتغلب على الظروف غير المضيافة لاستعمار الفضاء البريماني السحائي غير مفهومة جيدا. على الرغم من التقدم في العلاجات متعددة الوسائط ، بما في ذلك العلاج الإشعاعي والعلاج الجهازي والعلاج بالحقن داخل القراب ، إلا أن تشخيص مرضى LM لا يزال ضعيفا ، حيث يتراوح البقاء على قيد الحياة عادة من 2 إلى 4 أشهر^3،7،8،9. وبالتالي ، هناك حاجة ملحة لفهم أعمق لبيولوجيا ورم خبيث البريماني السحائي لتحسين العلاجات الحالية وتطوير علاجات جديدة مستهدفة. يتطلب تحقيق ذلك تطوير نماذج في الجسم الحي تلخص السمات المعقدة ل LM.

على عكس النقائل في أعضاء مثل الكبد والعظام والدماغ ، عادة ما يتطور LM بعد سنوات من تشخيص الورم الأولي^10،11،12. وبالمثل ، في نماذج الفئران المصابة بالورم الخبيث التلقائي ، فإن LM نادر بسبب انخفاض حدوثه وحقيقة أن الفئران عادة ما تستسلم للنقائل في مواقع أخرى. يمكن إنشاء نماذج LM التجريبية للفئران من خلال طرق مختلفة ، بما في ذلك داخل القلب ، أو الشريان السباتي ، أو بدلا من ذلك ، الحقن المباشر في صهريج الصهريج أو البطينين الدماغيين. بينما يستخدم الحقن داخل القلب للخلايا السرطانية^{على نطاق واسع 9} ، فإنه غالبا ما يؤدي إلى عبء كبير من الورم خارج الجمجمة ، مما يتسبب في وفيات لا علاقة لها بالمحور المحور. تتطلب الأساليب البديلة ، مثل حقن الخلايا السرطانية من خلال الشريان السباتي^{13 ، 14} ، موارد متخصصة واسعة النطاق وتؤدي إلى شقوق جراحية كبيرة ، وهي مؤلمة. علاوة على ذلك ، تؤدي هذه الطريقة أيضا في المقام الأول إلى ورم خبيث داخل أنسجة المخ نفسها ، بدلا من leptomenings ، وتستغرق وقتا طويلا وغير فعالة لإنشاء نماذج LM¹⁵. يتيح الحقن في صهريج ماجنا التوصيل المباشر للخلايا السرطانية إلى الفضاء السحائي البريمي. استخدمت العديد من الدراسات هذا النهج للتحقيق في آليات LM وتقييم العلاجات الجديدة^6،16،17.

في هذه المخطوطة ، نقدم بروتوكول حقن مناسب عبر الصهاريج الماغنا يتضمن ثقبا مباشرا عن طريق الجلد لتوليد كمية أكبر من الفئران ذات المحور المحور وراثيا بسرعة وثبات. تتجاوز هذه الطريقة حاجز الدماغ والدم ، وبالتالي تتيح الطعم الفعال للخلايا السرطانية في مساحة السحيات البريمية. كما أنه يقلل بشكل كبير من الصدمة الجراحية ووقت الإجراء مع تحفيز LM بشكل موثوق في الفئران. أكدنا حدوث LM مع الحد الأدنى من التسلل إلى حمة الدماغ ، كما تم التحقق منه بواسطة الفحص المجهري ثنائي الفوتون والتحليل النسيجي. لذلك ، فإن النموذج الناتج يكرر بأمانة البيئة المكروية المعقدة للمحور المحور ، مما يوفر أداة قيمة لدراسة الآليات الخلوية والمرضية المرتبطة بالأمراض وتقييم العلاجات المحتملة.

تمت مراجعة جميع الإجراءات الحيوانية في هذه المخطوطة والموافقة عليها من قبل لجنة مراجعة رعاية والأخلاقيات في مختبر ZJU (ZJU20230155). تم الحصول على الفئران C57BL / 6J و NSG من ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض وإيوائها في مركز مختبر ZJU. يستخدم هذا البروتوكول خط خلايا سرطان الرئة الفئران ، وسرطان الرئة لويس (LLC1) ، وخط خلايا سرطان الرئة البشري ، A549 ، وكلاهما مصنف ب GFP و Firefly luciferase. يتم توفير كلا الخطين الخلويين من قبل الدكتور شيانغ إتش إف تشانغ (كلية بايلور للطب ، الولايات المتحدة الأمريكية) ¹⁸. هنا ، نستخدم خلايا LLC1 كمثال. إجراء حقن خلايا A549 متطابق تقريبا ، باستثناء أنه تم حقن 6 × 10⁴ خلايا A549 في فئران NSG.

1. تحضير الخلايا السرطانية للحقن

1. استزراع 1.0 × 10⁶ خلايا LLC1 في DMEM مكملة بمصل بقري جنيني 10٪ و0.1 ملغم/مل بنسلين ستربتومايسين عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₅ ٪. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 70٪ -90٪ ، قم بتسخينها لمدة دقيقة واحدة باستخدام 2 مل من محلول التربسين / EDTA بنسبة 0.25٪. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 × جم لمدة 3 دقائق ، واغسلها مرتين باستخدام PBS المثلج ، وأعد تعليقها في 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
2. قم بتقييم تركيز الخلايا القابلة للحياة باستخدام محلول Trypan Blue ومقياس كثافة الدم¹⁹. تأكد من أن صلاحية الخلية أكبر من 90٪ ، مع كون غالبية الخلايا مفردة. اضبط تركيز الخلية على 2 × 10⁶ خلايا / مل في PBS المثلج.
3. Aliquot 50 ميكرولتر من تعليق الخلية في أنابيب منفصلة للطرد المركزي الدقيق لتجنب سحب العينات بشكل متكرر.
4. احتفظ بتعليق الخلية على الجليد حتى تصبح جاهزة للحقن. حقن 10 ميكرولتر من خلايا LLC1 المسماة GFP-Luciferase لكل فأر في هذا البروتوكول ، بما يعادل 2 × 10⁴ خلايا لكل ماوس.
   ملاحظة: اضبط رقم الخلية حسب الحاجة بناء على الحركية النقيلية لخطوط الخلايا المحقونة.

2. تحضير الفئران

ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استخدام ذكور الفئران C57BL / 6J ، الذين تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع.

1. الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية والقفازات المليئة بالستائر الجراحية. قم بتعقيم المعدات غير الجراحية التي توضع على الطاولة بنسبة 75٪ من الإيثانول ، ثم قم بتغطية منطقة العمل بستائر مقاومة للماء.
2. قم بإعداد قفص سكن حيواني نظيف ووسادة تدفئة للتعافي بعد العملية.
3. تخدير الفأر عن طريق حقن 2٪ ثلاثي البروم إيثانول تحت الجلد (200 مجم / كغ). تحقق من عمق التخدير باستخدام اختبار القرص قبل المتابعة. ضع مرهما معقما للعيون لحماية العينين من تلف القرنية بمجرد تخدير الفأر.
4. احلق الفراء من المنطقة القذالية الخلفية باستخدام المقص ، متبوعا بوضع كريمات إزالة الشعر لإزالة الفراء تماما في نفس المنطقة.
5. ضع الماوس عرضة مع وضع رقبته فوق أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. قم بتأمين الرأس وأسفل الظهر بشريط لاصق والمس المسافة بين القفاة والفقرة C1 بإصبع السبابة (الشكل 1).
6. قم بتطهير المنطقة القذالية الخلفية بثلاث جولات من المسح باستخدام 75٪ من القطن المعقم المنقوع بالإيثانول ، متبوعا بمقشر الجراحي من البيتادين. قم بتغطية الأجزاء غير المعقمة من بستارة معقمة.

3. حقن صهريج ماجنا

ملاحظة: التقنيات المعقمة مطلوبة للخطوات التالية ، بما في ذلك استخدام معدات الحماية الشخصية والقفازات المعقمة.

1. قم بسحب معلق الخلية برفق وشفط 10 ميكرولتر للحقن باستخدام حقنة أنسولين 31 جم ، 8 مم.
2. ملامسة المنطقة الواقعة بين القفا و C1 من الفأر بإصبع السبابة لتحديد موقع البزل الدقيق في الهامش المتوسط السفلي للجمجمة القذالية الخلفية. ضع علامة على هذا الموقع إذا لزم الأمر.
3. أدخل الإبرة بزاوية 45 درجة -50 درجة في الصهريج من خلال موقع البزل المحدد ، مع التقدم إلى عمق 4 مم. يشير الإحساس المميز بالاختراق إلى أن الإبرة قد دخلت بنجاح صهريج ماجنا.
   1. إذا كان من الصعب تحديد موقع البزل ، فقم بعمل شق صغير بطول 3-5 مم على مستوى الأذن لكشف خط الوسط الخلفي. في حال الحاجة إلى شق جراحي، يتم تطبيق ميلوكسيكام (5 ملغ/كغ/يوم) وبوبرينورفين (0.1 ملغ/كغ) تحت الجلد قبل ساعة واحدة من الجراحة.
4. قم بحقن تعليق الخلية ببطء عن طريق دفع مكبس المحقنة ، مع الحفاظ على ثبات المحقنة مع وضع اليد على الطاولة.
5. بعد التلقيح ، أمسك المحقنة في مكانها لمدة 10 ثوان إضافية للسماح للضغط داخل الجمجمة بالتوازن. ثم اسحب الإبرة واضغط على موقع البزل بقطعة قطن معقمة لمدة 1-2 دقيقة.

4. رعاية ما بعد الحقن

1. انقل لتنظيف الأقفاص على وسادة التدفئة وراقبها عن كثب حتى تتعافى تماما.
   1. في حالة إجراء شق ، أغلق الجرح باستخدام غراء المناديل والمشابك. قم بإعطاء مسكنات إضافية للألم لمدة 2-3 أيام بعد الجراحة للسيطرة على الألم والمساعدة في الشفاء.
2. راقب الفئران عن كثب لمدة 7 أيام بعد الإجراء وتحقق من الأنشطة البدنية للحيوانات والمظهر المحيط بموقع الحقن يوميا.

5. تقييم نمو الورم السحائي

1. التصوير الحيوي
   1. تخدير الفأر وإعطاء D-luciferin (150 ميكروغرام / جم) في الوريد خلف الحجاج. ضع الفئران في غرفة التصوير ، وضعها في مخروط أنف مخصص على مشعب التخدير. استخدم حواجز الضوء بين لتقليل تداخل الإشارة.
   2. قم بتصوير على الفور باستخدام نظام IVIS مع وقت التعرض بين 0.5 ثانية إلى 2 دقيقة⁶. تأكد من نجاح تلقيح الخلايا السرطانية في الفضاء السحائي البريماني عن طريق إشارة مضيئة بيولوجية مشتتة عبر الرأس والحبل الشوكي (الشكل 2 أ).
   3. مراقبة تطور LM عن طريق التصوير الحيوي كل 4 أيام. اضبط فترات التصوير بناء على حركية نمو الورم.
2. التحليل النسيجي
   1. قم بتخدير الفئران عندما كانت أقل نشاطا بشكل ملحوظ أو فقدت 20٪ من وزن جسمها وقطع الجلد والأضلاع لفضح تجويف الصدر. أدخل قنية ذات رأس حاد بعناية في البطين الأيسر وتقدم القنية إلى الشريان الأورطي الصاعد. قم بتفريف ب 20 مل من PBS من خلال القنية ببطء.
   2. استخدم المقص لإزالة الرأس وعمل شق في خط الوسط لفروة الرأس لكشف الجمجمة. استئصال الأنسجة الرخوة المحيطة. اقطع على طول التلال المدارية ، ثم أدخل المقص في الثقبة العظمى ، وتقدم بعناية على طول السطح الداخلي للجمجمة بضغط تصاعدي لتجنب تلف الأنسجة.
   3. قم بإزالة عظام الجمجمة ، ثم استخرج الدماغ برفق. قم بإصلاح الدماغ في 4٪ بارافورمالدهيد عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة ثم قم بتوازنه في محلول PBS من السكروز بنسبة 15٪ لمدة 24 ساعة ، متبوعا بمحلول PBS من السكروز بنسبة 30٪ لمدة 24 ساعة أخرى عند 4 درجات مئوية.
   4. ضع الأنسجة في مادة كريومولد مملوءة بمركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) ثم قم بتخزينها على الثلج الجاف لمدة 30 دقيقة^{و 20}.
   5. قم بقص الدماغ المضمن في OCT إلى أقسام بسمك 10 ميكرومتر باستخدام ناظم البرد. قم بتخزين الأقسام في فريزر -80 درجة مئوية حتى مزيد من التطبيق.
   6. قم بإجراء تلطيخ الهيماتوكسيلين / الإيوزين (H & E) على شرائح الدماغ²¹. يشير وجود الخلايا السرطانية على حافة الدماغ إلى أن ورم خبيث يحدث حصريا في الفضاء البريماني السحائي (الشكل 3 والجدول 1).
3. الفحص المجهري ثنائي الفوتون
   1. تخدير الفئران باستخدام LM. قم بإزالة فروة الرأس التي تغطي سطح الجمجمة الظهرية بالملقط والمقص. استخدم شفرة مشرط لإزالة السمحاق الرقيق من سطح الجمجمة.
   2. قم بترقيق الجمجمة باستخدام مثقاب كاشطة حتى تظهر أوعية الحفر من خلال الجمجمة الرقيقة. قم بتثبيت منطقة المراقبة لرأس الماوس بغطاء رأس مثلث مؤمن بمادة لاصقة للأنسجة^22،23.
   3. يجب تطبيق 0.025 مل من 5٪ (وزن/حجم) TRITC-dextran، في الوريد تحت الحجاج لتوسيم الأوعية الدموية²².
   4. قم بإجراء فحص مجهري ثنائي الفوتون من خلال نوافذ التصوير وإعادة بناء الفضاء البريماني السحائي (الشكل 4). اكتشف العظم عن طريق التألق التوافقي الثاني عند انبعاث 450 نانومتر مع إثارة 900 نانومتر²⁴. تصور الخلايا السرطانية المسماة GFP والأوعية المسماة بالديكستران عن طريق جمع إشارات التألق عند انبعاث 507 نانومتر و 572 نانومتر مع إثارة 900 نانومتر و 1000 نانومتر ، على التوالي.
4. مجهر فلوري ستيريو
   1. قم بإزالة دماغ الفأر وضعه تحت مجهر مجسم. تصور الخلايا المسماة ب GFP باستخدام مجموعة مرشحات خاصة ب GFP (الشكل 5).

يوضح الشكل 1 وضع الماوس للحقن وموقع البزل من المناظر الجانبية والأمامية. يوضح الشكل 2 صورا تمثيلية للتلألؤ البيولوجي في الجسم الحي للحيوانات التي تم اختبارها لتوليد LM من خلال مناهج مختلفة. تم حقن خلايا LLC1 المسماة GFP-luciferase في من خلال طرق مختلفة ، تليها التصوير الحيوي. كما هو موضح في الشكل 2 أ ، بعد 10 أيام من حقن ماجنا داخل الخزان ، كانت إشارة الإضاءة الحيوية موجودة في دماغ الفأر وموزعة على طول الحبل الشوكي ، مما يشير إلى النقش الناجح للخلايا السرطانية في الفضاء البريمياتي السحائية. في المقابل ، أدت الحقن داخل الشريان السباتي للخلايا السرطانية في الغالب إلى حدوث ورم خبيث متني في الدماغ مع عدم وجود مشاركة كبيرة في السحايا البريمائية بعد 21 يوما من الحقن (الشكل 2 ب). بالنسبة لطريقة الحقن داخل القلب ، يظهر التصوير الحيوي من وضع الاستلقاء أن معظم النقائل تنمو في الأعضاء خارج الجمجمة (على اليسار) ، وأكدت الصور من المنظر المبطح أن أيا من الفئران الثلاثة لم يطور LM (يمين. الشكل 2 ج). لوحظ نفس التوزيع للخلايا السرطانية بعد 10 أيام من حقن الصهريج ماجنا لخلايا A549 المسماة ب GFP-Luciferase في فئران NSG (الشكل 2D) ، مما يشير إلى أن مثل هذا النهج يولد LM بقوة في سلالات الفئران المختلفة ذات خطوط الخلايا المختلفة.

يوضح الشكل 3 صورا تمثيلية للتلوين النسيجي والفلوري المناعي لأنسجة المخ بعد 14 يوما من حقن الخلايا السرطانية من خلال صهريج الماغنا. يظهر تلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين (H & E) غالبية المناطق السرطانية الموجودة في الفضاء البريماني السحائي (الشكل 3 أ). يوضح الشكل 3 ب أن معظم الخلايا السرطانية المسماة GFP كانت متجمعة في السحايا والبطينين ، في حين أن الخلايا السرطانية في منطقة الحمة هي في الغالب خلايا مفردة. يعرض الشكل 4 صورا تمثيلية ثنائية الفوتون لمساحة البريميات السحائية للفأر مع LM. تم الكشف عن عظم الجمجمة (الأزرق) عن طريق جمع التألق التوافقي الثاني عند انبعاث 450 نانومتر مع إثارة 900 نانومتر24. تم تصنيف الأوعية الدموية (الحمراء) بواسطة TRITC-dexterrn (70 كيلو دالتون). تم العثور على خلايا سرطانية تحمل علامة GFP (خضراء) بين عظم الجمجمة (الأزرق) وحمة الدماغ ، وتحديدا داخل منطقة البريميات السحائية. يوضح الشكل 5 وجود خلايا سرطانية تحمل علامة GFP على سطح الدماغ ، يتم تصورها باستخدام مجهر مضان مجسم. ويعرض الجدول 1 المقارنة بين الطرائق الثلاث.

الشكل 1: موقع تحضير والثقب للحقن داخل الصهريج. (أ) يوضع الفأر في وضع الانبطاح ، مع لف رقبته فوق أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. يتم تأمين الرأس وأسفل الظهر بشريط لاصق. يتم إدخال الإبرة بزاوية 45 درجة -50 درجة في صهريج ماجنا عند الهامش السفلي المتوسط. (ب) يتم إدخال الإبرة في الهامش السفلي المتوسط للجمجمة القذالية الخلفية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: صور التلألؤ البيولوجي التمثيلية في الجسم الحي للفئران التي تتلقى طرق حقن مختلفة. (أ)إشارة التلألؤ البيولوجي في الجسم الحي للحيوان بأكمله بعد حقن خلايا LLC1 داخل الصهريج. (ب) صورة التلألؤ البيولوجي في الجسم الحي للفئران بعد حقن الشريان السباتي لخلايا LLC1. (ج) إشارة التلألؤ البيولوجي في الجسم الحي للفئران بعد الحقن داخل القلب لخلايا LLC1. يظهر الجانب الأيسر المنظر المستلق والجانب الأيمن يظهر المنظر الانبطاح. (د) صورة التلألؤ البيولوجي لفئران NSG بعد حقن خلايا A549 من خلال الصهريج magna.a الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: صور تمثيلية للتلطيخ النسيجي والفلوري المناعي. (أ) يظهر تلطيخ H & E التمثيلي خلايا LLC1 المترسبة بشكل رئيسي على سطح السحايا وفي البطينين. شريط المقياس = 25 ميكرومتر. (ب) صور تلطيخ الفلورسنت المناعي للدماغ الحامل للورم LLC1. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: صور تمثيلية ثنائية الفوتون لفأر مع LM. تم العثور على الخلايا السرطانية المسماة ب GFP (الأخضر) حصريا بين الجمجمة (الأزرق) وحمة الدماغ (الأحمر). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: صور تمثيلية لمجهر مضان الاستريو. (أ) المجال البصري العالمي لدماغ الفأر تحت المجهر. (ب) تم تقديم الخلايا السرطانية المسماة GFP على سطح الدماغ ، والتي تنبعث منها مضان أخضر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: مقارنة بين ثلاث طرق حقن مختلفة من حيث مدة العملية ، وحدوث ورم خبيث في السحاء البريماني ، والأورام خارج الجمجمة ، ومعدل الأورام المتني في الدماغ الكبيرة.

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.