يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

في الجسم الحي تطبيق وضع العلامات على القرب المستندة إلى TurboID في ذبابة الفاكهة السوداء

2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68193

⸱

يونيو 13, 2025

 , 
1Soonchunhyang Institute of Medi-bio-Science, Soonchunhyang University, 2Department of Integrated Biomedical Science, Soonchunhyang University

في هذه المقالة

ملخص

في هذه الدراسة ، أنشأنا بروتوكولا مفصلا لوضع العلامات القريبة المستندة إلى TurboID (PL) في D. melanogaster المبيض ، يغطي الخطوات من مكملات البيوتين وتشريح المبيض إلى التحقق من صحة التعبير الجيني وإثراء الببتيدات الحيوية لقياس الطيف الكتلي.

الملخص

يعد وضع العلامات على القرب (PL) طريقة قوية لرسم خرائط لشبكات تفاعل البروتين والبروتين. أدى التقدم في وضع العلامات على الإنزيمات ، وخاصة TurboID ، إلى توسيع نطاق استخدامه عبر الأنظمة البيولوجية. يعد TurboID مفيدا بشكل خاص للتطبيقات في الجسم الحي نظرا لقوته وعدم سميته، وسهولة استخدامه. يقوم هذا الإنزيم بإيوتينيل الجزيئات الحيوية القريبة بشكل غير ملتئ ، بما في ذلك البروتينات والأحماض النووية ، في نطاق حوالي 10 نانومتر في وجود البيوتين. طبقنا هذه الطريقة للتحقيق في تفاعل الكوسة (Zuc) ، وهو عامل رئيسي في التكوين الحيوي للحمض النووي الريبي المتفاعل مع البيوي (piRNA) على غشاء الميتوكوندريا الخارجي (OMM) في خلايا السلالة الجرثومية في ذبابة الفاكهة المبيض البطن . من خلال التعبير عن Zuc-TurboID في الخلايا الجرثومية ومكملات البيوتين ، قمنا بتحفيز البيوتينيل لبروتينات Zuc-proximal. حدد تحليل قياس الطيف الكتلي بعد إثراء الببتيدات الحيوية البروتينات على مقربة من Zuc ، بما في ذلك المتفاعلات المعروفة في التكوين الحيوي ل piRNA. ومن المثير للاهتمام ، أننا اكتشفنا تفاعلات جديدة ل Zuc تشارك في طي البروتين ، وتنظيم الأغشية ، وتهريب الحويصلات.

المقدمة

غالبا ما تفشل طرق رسم خرائط التفاعل بين البروتين والبروتين (PPI) التقليدية ، مثل تنقية تقارب الطيف الكتلي (AP-MS) وأنظمة الخميرة -2-الهجينة (Y2H) ، في التقاط البروتينات منخفضة الوفرة أو المعبرة بشكل عابر أو المرتبطة بالغشاء. ينشأ هذا القيد من عدم قدرتهم على تكرار الظروف الفسيولوجية الأصلية للخلية الحية1،2،3. للتغلب على هذه التحديات ، برزت PL كتقنية قوية لرسم خرائط البروتيوم عالية الدقة على مستوى العضيات الفرعية في الجسم الحي. يستفيد PL من اندماج إنزيم مختلط مع بروتين الطعم ، مما يمكن الإنزيم من تحفيز تكوين جزيئات تفاعلية قصيرةالعمر 1. هذه الجزيئات التفاعلية ، مثل البيوتين ، تسمي البروتينات تساهميا في غضون بضعة نانومترات من بروتين الاندماج4. بعد ذلك ، يتم عزل البروتينات الحيوية وتحليلها بواسطة قياس الطيف الكتلي لتسهيل تحديد البروتين على نطاقواسع 5،6.

على مدى السنوات الماضية ، تم تطوير العديد من الإنزيمات المختلطة لتطوير تقنيات PL. اثنان من الإنزيمات المستخدمة على نطاق واسع هما الإشريكية القولونية المشتق من الإشريكية القولونية R118G بيوتين ليغاز (BioID) وإنزيم الأسكوربات بيروكسيداز المشتق من البازلاء 2 (APEX2). يحول BioID البيوتين و ATP إلى بيوتينيل -5'-أدينيلات (bioAMP) 1. يرتبط هذا الجزيء التفاعلي تساهميا ببقايا اللايسين للبروتينات القريبة داخل دائرة نصف قطرها ± 10 نانومتر. الميزة الرئيسية ل PL المستند إلى BioID هي استخدام البيوتين. إنه جزيء حيوي طبيعي وغير سام في الكائنات الحية ، مما يسمح بوضع العلامات الآمنة في الجسم الحي 6. ومع ذلك ، فإن BioID له قيود ، بما في ذلك حركية وضع العلامات البطيئة (18-24 ساعة) ومتطلبات درجة الحرارة المرتفعة (37 درجة مئوية) للنشاط التحفيزي الأمثل4. يمكن أن تعيق هذه السمات تطبيقها في دراسة العمليات البيولوجية الديناميكية. وفي الوقت نفسه ، يحفز APEX2 تكوين جذور البيوتين والفينوكسيل في وجود البيوتين والفينول وبيروكسيد الهيدروجين (H2O2)7. تتفاعل هذه الجذور بشكل أساسي مع السلسلة الجانبية للأحماض الأمينية الغنية بالإلكترون مثل التيروزين ويمكنها أيضا ربط السيستين والهيستيدين والتربتوفان8. إن قدرة وضع العلامات السريعة لإنزيم البيروكسيديز (< 1 دقيقة) مناسبة لالتقاط مثبطات مضخة البروتون الديناميكية والعابرة9. علاوة على ذلك ، لديها نطاق كشف أوسع (يصل إلى 20 نانومتر) من البيوتين ليغاز. ومع ذلك ، فإن PL المستند إلى APEX2 له عيوبه ، بما في ذلك متطلبات عامل مؤكسد سام ، H2O2 ، والنفاذية المنخفضة للبيوتين الفينول ، مما يحد من قابلية التطبيق في الجسم الحي10.

في عام 2018 ، طور برانون وآخرون بيوتين ليغاز جديد يسمى TurboID ، وهو نسخة متحولة 35 كيلو دالتون من BirA (البيوتين ليغاز الموجود في الإشريكية القولونية)4. يشتمل هذا الإنزيم على طفرة في موضع R118 (R118S) مع 15 طفرة أخرى بالنسبة إلى BirA. يظهر نشاطا تحفيزيا أعلى بمرتين من BioID. ينتج البيوتينيل الناجم عن TurboID في 10 دقائق بيانات بروتينية بحجم وخصوصية يمكن مقارنتها ب 18 ساعة من وضع العلامات بواسطة BioID. علاوة على ذلك ، فإنه يوضح نشاط وضع العلامات الممتاز عند 30 درجة مئوية4. لذلك ، يعد TurboID أكثر ملاءمة للتطبيق في الكائنات الحية مثل ذبابة الفاكهة أو Caenorhabditis elegans ، والتي تربى عادة عند 25 درجة مئوية و 20 درجة مئوية ، على التوالي.

في هذه الدراسة ، نهدف إلى استخدام PL المستند إلى TurboID لدراسة interactome في ذبابة الفاكهة المبيض. يتم استخدام البروتوكولات الموضحة هنا لرسم خريطة لتفاعل Zuc في خلايا السلالة الجرثومة. Zuc هو نوكلياز داخلي مترجم على غشاء الميتوكوندريا الخارجي (OMM) ، والذي يتوسط في التكوين الحيوي ل piRNAs ، وهي RNAs الصغيرة غير المشفرة الحاسمة للحفاظ على سلامة الجينوم11،12،13. من خلال مقارنة البروتينات الحيوية التي تم تحديدها من تحليل Zuc-TurboID مع تلك الموجودة في اثنين من عناصر التحكم الإضافية ، NES-TurboID و Tom20-TurboID ، حددنا المرشحين المتفاعلين مع Zuc المتميزين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. PL في ذبابة الكبار

  1. تحضير غذاء البيوتين
    1. تحضير محلول 1 M هيدروكسيد الصوديوم عن طريق تخفيف 10 م من مخزون هيدروكسيد الصوديوم في الماء المقطر الثلاثي (TDW). قم بتخزينه في درجة حرارة الغرفة (RT). قم بإعداد محلول مخزون البيوتين 1 متر عن طريق إذابة 0.0049 جم من مسحوق البيوتين في 20 مل من TDW. أضف 150-200 ميكرولتر من 1 M هيدروكسيد الصوديوم لزيادة قابلية ذوبان البيوتين. دوامة لتجانس الحل. قم بتخزين محلول مخزون البيوتين في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    2. أخرج طعام الذباب من القارورة وضعه في الميكروويف لمدة دقيقتين حتى يذوب.
      ملاحظة: يحتوي طعام الذباب القياسي على 5٪ دقيق ذرة ، و 3٪ خميرة ، و 10٪ سكروز ، و 1٪ أجار ، و 0.3٪ حمض البروبيونيك ، و 0.3٪ ميثيل 4-هيدروكسي بنزوات13.
    3. أضف مخزون البيوتين إلى الطعام المذاب بتركيز نهائي يبلغ 100 ميكرومتر ، ثم اخلطه عن طريق الدوامة. قم بتوزيع 4.5 مل على الفور من الطعام المكممل على البيوتين في كل قارورة فارغة باستخدام ماصة مصلية. اتركي الطعام يبرد لمدة 30 دقيقة ، ضعي غطاء قطني على القارورة ، ثم خزني طعام البيوتين على حرارة 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يجب إضافة البيوتين قبل أن يبرد الطعام ويتماسك.
  2. تغذية البيوتين
    1. اعبر الذباب المعدل وراثيا الذي يفرط في التعبير عن بروتين اندماج TurboID مع ذباب GAL4 الخاص بالأنسجةأو الخلية 14،15،16. كعنصر تحكم سلبي ، يذباب من النوع البري المتقاطع مع ذباب سائق GAL4 لضمان عدم تحريض البيوتينيل.
    2. بعد حوالي 10 أيام من العبور ، ستبدأ النسل في الفقس. قم بإذابة مسحوق الخميرة الجافة في TDW وحركه حتى يصبح عجينة ناعمة. ضع ملعقة مختبر من معجون الخميرة على جدار قارورة جديدة. اضغط برفق على القارورة القديمة التي تحتوي على ذباب حديث الفقس لجمع الذباب في الأسفل. اقلب القارورة القديمة على القارورة الجديدة التي تحتوي على عجينة الخميرة ، مع التأكد من محاذاة حواف كلا القواريرتين لمنع الذباب من الهروب.
    3. اضغط على تلك القوارير معا لنقل الذباب من القارورة القديمة إلى الجزء السفلي من القارورة الجديدة. بمجرد نقل الذباب ، ضع أغطية قطنية بإحكام مرة أخرى على كل من القوارير الجديدة والقديمة. انتظر لمدة 3 أيام. يمكن تخزين معجون الخميرة في RT لبضعة أيام.
      ملاحظة: يجب أن يتم نقل الذباب في أسرع وقت ممكن لأن الذباب لن يصعق إلا مؤقتا.
    4. تحضير محلول حمض البروبيونيك 0.5٪ عن طريق تخفيف 250 ميكرولتر من مخزون حمض البروبيونيك في 50 مل TDW. قم بتخزينه في RT.
    5. فياليوم الثالث ، قم بإعداد محلول عمل البيوتين 100 ميكرومتر عن طريق تخفيف مخزون البيوتين 1 متر في TDW ، ثم أضف 500 ميكرولتر من حمض البروبيونيك 0.5٪. اخلطي محلول عمل البيوتين مع مسحوق الخميرة الجافة وقلبي حتى تتكون عجينة. أضف ملعقة معملية من معجون خميرة البيوتين إلى جدار قارورة طعام البيوتين. يمكن تخزين معجون البيوتين والخميرة في RT لبضعة أيام.
    6. قسم الذباب إلى مجموعتين. احتفظ بمجموعة واحدة في قارورة الطعام العادية كعنصر تحكم وانقل المجموعة الأخرى إلى قارورة غذاء البيوتين (إضافة معجون خميرة البيوتين) لبدء البيوتينيل. بعد 16 ساعة من البيوتينيل ، ينقل الذباب إلى قارورة طعام طبيعية جديدة.
      ملاحظة: لقد أجرينا سابقا اختبار تغذية البيوتين لمدة 4 ساعات و 8 ساعات و 16 ساعة. كانت إشارة البيوتينيل أقوى بعد 16 ساعة من التغذية ، لذلك اخترنا هذه النقطة الزمنية للتجارب اللاحقة.
  3. ذبابة الفاكهة مجموعة المبيض
    1. ضع الذباب في وسادةذبابة ثاني أكسيد الكربون 2 ، واحتفظ بالإناث ، وتخلص من الذكور. بعد تخدير الذباب بشكل صحيح (لم يعد يتحرك بعد الآن) ، ضع ماصة 1 مل من وسط حشرات جريس البارد على طبق التشريح.
    2. خذ ذبابة إلى طبق التشريح باستخدام ملقط رفيع الرأس واتركه يغمر في الوسط. امسك صدر الذبابة بالملقط ، احرص على عدم سحق الجسم. بعد ذلك ، استخدم ملقطا آخر لإزالة طرف البطن الخلفي برفق (حيث يوجد الجزء التناسلي).
    3. استخدم الملقط للضغط ببطء على المبايض (بدءا من الجزء العلوي من البطن إلى الأسفل).
    4. بمجرد خروجها ، قم بإزالة شبكات العضلات والأنسجة الأخرى المحيطة بالمبايض. احرص على عدم إتلاف المبايض.
    5. انقل المبايض النظيفة بعناية إلى أنبوب سعة 1.7 مل باستخدام ملقط ؛ احتفظ بالأنبوب على الجليد. كرر الخطوات 1.3.2 - 1.3.4 للذباب التالي.
    6. قم بتدوير الأنبوب عند 3,500 × جم لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية ، ثم استخدم أطراف الماصة الدقيقة لإزالة الوسط المتبقي. احرص على عدم لمس المبايض.
    7. قم بتجميد الأنبوب بالنيتروجين السائل ، ثم قم بتخزين المبايض عند -80 درجة مئوية. عينات المبيض مستقرة لمدة 1 سنة.

2. التعبير الجيني المعدل والكشف عن البروتين الحيوي عن طريق فحص اللطخة الغربية

ملاحظة: بالنسبة لمقايسة اللطخة الغربية ، اجمع حوالي خمسة أزواج من المبايض لكل عينة.

  1. تحلل الأنسجة
    1. قم بإذابة أنسجة المبيض المجمدة. أضف 50 ميكرولتر من محلول تحلل RIPA (50 ملي مولار Tris-HCl درجة الحموضة 8 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.1٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ، 0.5٪ ديوكسيكولات الصوديوم ، 1٪ تريتون X-100) ، مع مكمل كوكتيل مثبط البروتياز 1x (PI) و 1 ملي مولار فينيل ميثان سولفونيل فلوريد (PMSF). قم بتخزين المخزن المؤقت للتحلل RIPA (بدون كوكتيل 1x PI و 1 ملي مولار PMSF) عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يجب إضافة كوكتيل PI و PMSF فقط قبل التجربة مباشرة.
    2. تعطيل المبايض باستخدام الخالط اليدوي إلى جانب مدقة بلاستيكية (1 دقيقة لكل أنبوب). من الضروري إجراء عملية تحلل الأنسجة على الجليد لمدة 10 دقائق لضمان التحلل الكامل ، متبوعا بالتجانس.
    3. جهاز طرد مركزي عند 13,500 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لفصل محللات البروتين عن الحطام.
    4. تحلل البروتين الشفاف في أنبوب جديد سعة 1.7 مل (تجنب أخذ طبقة الدهون في الأعلى) ، ثم قم بتخزين المحللة عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام الآخر.
  2. قياس تركيز البروتين بواسطة مقايسة حمض البيسنشونيك (BCA)
    1. تحضير كاشف عمل حمض البيسنشونيك (BCA) عن طريق خلط الكاشف A والكاشف B بنسبة 50: 1. امزج 1 ميكرولتر من محللة أو معيار BSA المخفف مع 200 ميكرولتر من WR في صفيحة مكونة من 96 بئرا (في نسخ مكررة) ، ثم احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      1. احسب مقدار WR الضروري باستخدام هذه الصيغة:
        (# المعايير + # العينات) × (# يكرر) × (حجم WR لكل عينة)
        لعمل مجموعة من معايير البروتين ، قم بإعداد عدة تخفيفات من 2 مجم / مل من ألبومين مصل الأبقار (BSA) في محلول تحلل RIPA (بدون كوكتيل PI و PMSF) بتركيزات نهائية 0 و 25 و 125 و 250 و 500 و 750 و 1000 و 1500 و 2000 ميكروغرام / مل.
    2. قم بقياس الامتصاص باستخدام قارئ صفيحة دقيقة بطول موجي 495 نانومتر. قم بإنشاء منحنى قياسي من قيم امتصاص BSA ، ثم حدد تركيز البروتين.
  3. فحص اللطخة الغربية
    1. الرحلان الكهربائي للهلام
      1. أضف 30-50 ميكروغرام من محللات البروتين إلى المخزن المؤقت لتحميل 2x SDS. أضف TDW (إذا لزم الأمر) لعمل تركيز نهائي للبروتين 2 ميكروغرام / ميكرولتر وتركيز نهائي 1x SDS ، ثم اغلي العينة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
      2. قم بإعداد المخزن المؤقت للتشغيل عن طريق خلط 25 مل من المخزن المؤقت 20x MOPS مع 500 مل من TDW لعمل تركيز 1x من المخزن المؤقت للتشغيل. قم بتخزينه في RT.
      3. اشطف آبار جل Bis-Tris ب 1 مل من المخزن المؤقت (3x) ، ثم ضع جل Bis-Tris في حجرة الرحلان الكهربائي. املأ الجانب الأمامي من الغرفة بمخزن مؤقت التشغيل الجديد حتى يتم غمر جميع الآبار (± 250 مل). املأ الجانب الخلفي من الغرفة بمخزن التشغيل المستخدم (نصف حجم المخزن المؤقت الجديد المستخدم كاف).
      4. قم بتحميل العينة على جل Bis-Tris واستخدم 4 ميكرولتر من سلم البروتين الملون مسبقا كعلامة. إجراء الرحلان الكهربائي (200 فولت ، 30 دقيقة). أخرج الجل من الكاسيت واشطفه باستخدام TDW.
    2. نشاف الغشاء
      1. قم بعمل مخزن مؤقت للنقل عن طريق إضافة 20 مل من المخزن المؤقت للنقل (25 ضعفا من المخزون) و 50 مل من الميثانول إلى 430 مل من TDW.
      2. رتب شطيرة تتكون من وسادات نشاف وورق ترشيح وهلام وغشاء النيتروسليلوز في وحدة لطخة. قبل تكديس طبقة جديدة ، استخدم الأسطوانة لإزالة الفقاعات.
      3. قم بتثبيت وحدة اللطخة على غرفة النقل ، ثم املأ الغرفة ب 500 مل من المخزن المؤقت للنقل. نقل البروتينات لمدة 1 ساعة عند 175 مللي أمبير.
        ملاحظة: يجب تحضير المخزن المؤقت للنقل حديثا قبل التجربة.
    3. حظر
      1. أضف 5 مل من مخزون Tween20 إلى 45 مل من TDW لعمل محلول مخزون Tween20 بنسبة 10٪. قم بإذابة قرصين من المحلول الملحي المتعاقد مع الفوسفات (PBS) في 400 مل من TDW. قم بإزالة 4 مل من المحلول ، ثم أضف 4 مل من 10٪ Tween20 (التركيز النهائي 0.1٪) لعمل محلول 1x PBST. قم بتخزينه في RT.
      2. قم بإزالة الغشاء الملطخ من غرفة النقل ، ثم اشطفه باستخدام 1x PBST.
        ملاحظة: إذا احتاج الغشاء إلى التحضين بأجسام مضادة مختلفة ، فقم بقصه بشفرة نظيفة من الفولاذ المقاوم للصدأ وفقا لأحجام البروتين المتوقعة قبل تنفيذ خطوة الحظر.
      3. للتحقق من التعبيرات الجينية ، استخدم 2٪ BSA في 1x PBST لخطوة الحظر (1 ساعة ، RT). اصنع محلول BSA بنسبة 2٪ عن طريق إضافة 1 جم من BSA إلى 50 مل من 1x PBST. لاكتشاف البروتين الحيوي ، قم بإجراء الحجب باستخدام 3٪ BSA في 1x PBST (بين عشية وضحاها ، 4 درجات مئوية). قم بإذابة 1.5 جم من مسحوق BSA في 50 مل من 1x PBST لعمل محلول BSA بنسبة 3٪. تخزين حلول الحجب عند 4 درجات مئوية.
        ملاحظة: يختلف BSA المستخدم عن الاختبار المستخدم في اختبار BCA. BSA لمقايسة BCA هي جزء من مجموعة BCA.
    4. حضانة الأجسام المضادة الأولية
      1. قم بتخفيف 1 ميكرولتر من α-V5 في 10 مل من 2٪ BSA (1: 10,000) و 10 ميكرولتر من جين التدبير المنزلي α-HSP90 في 2٪ BSA (1: 1,000). أضف 2.7 ميكرولتر من الستربتافيدين والفجل بيروكسيداز المترافق (SA-HRP) إلى 9 مل من محلول 1x PBST لصنع محلول SA-HRP 0.3 ميكروغرام / ملليتر.
      2. للتحقق من التعبيرات الجينية ، احتضان الغشاء بالجسم المضاد الأولي طوال الليل عند 4 درجات مئوية. لاكتشاف البروتين الحيوي ، احتضان الغشاء لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية. قم بتخزين الجسم المضاد الأساسي مرة أخرى عند 4 درجات مئوية. يمكن استخدامه عدة مرات.
      3. اغسل الغشاء ب 1x PBST لمدة 3x في RT لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
    5. حضانة الأجسام المضادة الثانوية
      1. قم بإعداد محلول الأجسام المضادة الثانوية عن طريق إضافة 2 ميكرولتر من IgG مضاد للأرانب أو الفئران (بيروكسيداز الفجل الحار (HRP) مترافق) في 10 مل من 2٪ BSA (1: 5,000).
        ملاحظة: بالنسبة إلى SA-HRP ، ليست هناك حاجة إلى جسم مضاد ثانوي. انتقل مباشرة إلى خطوة التصور. يجب تخفيف الأجسام المضادة الثانوية حديثا قبل التجربة.
      2. احتضان الغشاء في محلول الأجسام المضادة الثانوية لمدة 40 دقيقة في RT. اغسل الغشاء ب 1x PBST لمدة 3x في RT لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
    6. الكشف عن البروتين باستخدام طريقة التلألؤ الكيميائي المحسن (ECL)
      1. امزج 750 ميكرولتر من اللومينول و 750 ميكرولتر من محلول HRP (نسبة 1: 1). حافظ على رطوبة الغشاء في مخزن الغسيل أثناء تحضير الخليط.
        ملاحظة: يجب تحضير هذا الخليط طازجا قبل التجربة. نظرا لأن المواد الكيميائية حساسة للضوء ، احتفظ بها بعيدا عن أشعة الشمس أو مصادر الضوء المكثفة الأخرى (التعرض قصير المدى لإضاءة المختبر جيد).
      2. اغمس الغشاء في المحلول لمدة 30 ثانية ، ثم ضعه بين صفائح بلاستيكية شفافة. راقب نطاقات البروتين الملطخة باستخدام أداة Chemidoc.

3. التعبير الجيني المعدل والتحقق من صحة التوطين عن طريق تلطيخ التألق المناعي

ملاحظة: للتحقق من التعبير الجيني وتوطينه ، قم بتشريح حوالي خمسة أزواج من المبايض لكل عينة من الإناث البالغات من العمر يومين يتغذين على عجينة الخميرة. يحتوي المبايض الصغيرة في الغالب على مراحل مبكرة من غرف البويضات ، والتي تعتبر مثالية لتلوين التألق المناعي بسبب وفرة الخلايا الممرضة (خلايا السلالة الجرثومية) وأغشيتها القابلة للاختراقنسبيا 17. تكون المراحل المتأخرة من غرف البيض أكثر صلابة ويصعب اختراقها بسبب تكوين مركب قشر البيض ، والذي يبدأ في المرحلة 918. بالنسبة لاختبار بيوتينيل البروتين ، قم بتشريح حوالي خمسة أزواج من المبايض لكل عينة من الإناث البالغات من العمر 4 أيام يتغذين على البيوتين ، كما هو موضح في الخطوة 1.2.

  1. تحضير العينة
    1. ثبت الجزء الخلفي من المبيض المقطوع في مكانه باستخدام الملقط. استخدم ملقطا آخر لفصل المبيض برفق إلى غرف البويضات الفردية. اعمل بحذر لتجنب تمزق غرف البيض. تم وصف بروتوكول عزل حجرة البيض بالتفصيل في19. ضع غرف البيض الماصة بحذر في أنبوب سعة 1.7 مل ، ثم اغسلها ب 1 مل من 1x PBS (RT). قم بقص حافة أطراف الماصة قبل سحب العينة لمنع غرف البيض من الالتصاق في الأطراف.
      ملاحظة: استخدم غرف البيض فقط في المرحلة ≤ 9 (الغرف الشفافة). تخلص من البويضات الناضجة وغرف البيض في المرحلة المتأخرة ≥ 10. سيؤدي سحب العينات إلى طفو غرف البيض في المحلول. لذلك ، دع غرف البيض تستقر في القاع (لمدة 5 دقائق) قبل الانتقال إلى الخطوات التالية.
  2. تثبيت
    1. قم بتخفيف 3.125 مل من مخزون الفورمالديهايد (FA) بنسبة 16٪ في 6.875 مل من 1x PBS لعمل محلول FA بنسبة 5٪. قم بتخزينه في RT.
      ملاحظة: FA حساس للضوء ، لذا احتفظ به بعيدا عن الضوء.
    2. ماصة 1 مل من 5٪ فورمالديهايد (FA) في الأنبوب الذي يحتوي على بويضات. ضع الأنبوب على الدوارات المتعددة ، ثم ثبت البويضات لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: من التثبيت حتى خطوة التلوين النووي ، يتم إجراء التجارب على جهاز متعدد الدوران مع دوران لطيف.
    3. قم بإعداد 0.5٪ Triton X-100 في 1x PBS (1x PBT) كمحلول غسيل عن طريق إضافة 10 مل من مخزون Triton X-100 بنسبة 10٪ إلى 190 مل من 1x PBS. قم بتخزينه في RT.
    4. اشطف غرف البيض الثابتة 1x ، متبوعا بغسل 3x في RT لمدة 10 دقائق. استخدم 1 مل من 1x PBT لكل من خطوات الشطف والغسيل.
  3. حظر
    1. تحضير مصل بقري الجنين بنسبة 5٪ (FBS) عن طريق إضافة 250 ميكرولتر من مخزون FBS إلى 4.75 مل من 1x PBT.
      ملاحظة: يجب أن يكون هذا المحلول طازجا قبل التجربة.
    2. أضف 1 مل من FBS 5٪ إلى الأنبوب وقم بتنفيذ خطوة الحجب لمدة 1 ساعة في RT. اشطف البويضات 1x.
  4. حضانة الأجسام المضادة الأولية
    1. للتحقق من التعبير عن الجينات المعدلة وتوطينها ، قم بتخفيف 2 ميكرولتر من α-V5 و 2 ميكرولتر من α-ATP5A أو α-Tom20 (كعلامة ميتوكوندريا) في 400 ميكرولتر من 1x PBT (نسبة 1: 200).
      ملاحظة: على الرغم من أنه يمكن استخدام جسمين مضادين معا لتلطيخ عينة واحدة ، إلا أن مضيفيهما يجب أن يكونوا مختلفين. هو تجنب الارتباط المتداخل للأجسام المضادة الثانوية اللاحقة.
    2. احتضان غرف البيض ب 400 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية المخفف (بين عشية وضحاها ، 4 درجات مئوية).
      ملاحظة: على غرار اختبار اللطخة الغربية ، يمكن استخدام الأجسام المضادة الأولية عدة مرات للتلوين المناعي. قبل تخزين محلول الأجسام المضادة مرة أخرى ، تأكد من أنه لا يحتوي على أي غرف بويض.
    3. اشطف غرف البيض 1x ، متبوعا بغسل 3x في RT لمدة 10 دقائق.
  5. حضانة الأجسام المضادة الثانوية
    1. قم بتخفيف 2 ميكرولتر من الماعز α-Rb IgG Alexa Fluor 488 و 2 ميكرولتر من Goat α-M IgG Alexa Fluor 594 في 400 ميكرولتر من 1x PBT (نسبة 1: 200). احتضان غرف البيض ب 400 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية المخففة لمدة ساعتين في RT. للكشف عن البيوتينيل ، أضف 2 ميكرولتر من Alexa Fluor 594 المترافق بالستربتافيدين إلى 1x PBT (نسبة 1: 200) واحتضنه مع جسم مضاد ثانوي.
      ملاحظة: من هذه الخطوة ، قم بحماية العينة من الضوء. يجب تخفيف الأجسام المضادة الثانوية حديثا قبل التجربة. يمكن استخدام أجسام مضادة ثانوية متعددة معا ، ولكن يجب تعيين كل جسم مضاد أولي إلى فلوروفورات مختلفة نشأت من مضيفين مختلفين أيضا لتجنب تداخل الإشارات. على سبيل المثال ، سوف يرتبط 488 Goat α-Rb بالأرانب α-V5. أما بالنسبة للفأر α-ATP5A ، فيستخدم 594 Goat α-M كجسم مضاد ثانوي تكميلي. في حالة الكشف عن البيوتينيل ، يجب حذف استخدام الأصباغ الأخرى بنفس الطول الموجي المترافق للستربتافيدين.
    2. اشطف غرف البيض 1x ، متبوعا بغسل 3x في RT لمدة 10 دقائق.
  6. تلطيخ نووي
    1. تمييع 1 ميكرولتر من DAPI في 1 مل من 1x PBS (نسبة 1: 1,000). احتضن غرف البيض ب 1 مل من محلول DAPI المخفف لمدة 5 دقائق في RT.
      ملاحظة: يجب تخفيف DAPI حديثا قبل التجربة.
    2. اشطف غرف البيض 1x ، متبوعا بغسل 3x في RT لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: يمكن تخزين غرف البيض في محلول 1x PBS عند 4 درجات مئوية لبضع ساعات قبل التركيب ، ولكن يوصى بالمتابعة في أسرع وقت ممكن.
  7. تركيب الشريحة
    1. نظف الشريحة الزجاجية بمنديل خال من النسالة ، ثم اكتب عينة المعلومات عليها. قم بإزالة 1x PBS من الأنبوب ، لكن اترك كمية صغيرة لمنع الجفاف.
    2. قم بقص حافة أطراف الماصات الدقيقة ، ثم ضع غرف البيض الماصة بعناية على الشريحة الزجاجية. استخدم الملقط لتوزيع غرف البيض بعناية على الشريحة الزجاجية وتجنب أي تكتل. راقب الشرائح تحت المجهر (يكفي التكبير 2x) للتأكد من توزيع غرف البيض بالتساوي.
    3. قم بإزالة PBS المتبقي من الشريحة الزجاجية باستخدام ماصة دقيقة. ماصة 15-30 ميكرولتر من المحلول المضاد للبهتان (حساس للضوء) على الشريحة الزجاجية وتأكد من ملامستها لجميع غرف البيض.
    4. استخدم الملقط لتثبيت حافة غطاء الشريحة ، ثم ضعه فوق الشريحة الزجاجية (بدءا من حافة إلى أخرى) بحيث تغطي غرف البيض. افعل ذلك ببطء لتجنب أي فقاعات. امسح المحلول الزائد بمنديل خال من النسالة ، ثم أغلق حواف الغطاء باستخدام طلاء الأظافر. دع طلاء الأظافر يجف بشكل صحيح (± 5 دقائق).
    5. صور الشرائح باستخدام مجهر متحد البؤر. تخزين الشرائح عند -20 درجة مئوية.

4. تخصيب الببتيد البيوتينيل لتحليل قياس الطيف الكتلي

ملاحظة: هناك حاجة إلى حوالي 3 مجم من البروتينات لعينة قياس الطيف الكتلي. لذلك ، قم بتشريح حوالي 100 زوج من المبايض للحصول على هذه الكمية.

  1. تحلل الأنسجة
    1. قم بإذابة أنسجة المبيض المجمدة. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد محلول ملحي مخزن ثلاثي 1x (TBS) عن طريق إذابة قرص 1 تيرابايت في 500 مل من TDW. قم بتخزينه في RT. قم بإعداد 2٪ SDS في 1x TBS كمخزن مؤقت للتحلل عن طريق تخفيف 4 مل من مخزون SDS بنسبة 10٪ في 16 مل من 1x TBS. قم بتخزينه في RT.
    2. أضف 500 ميكرولتر من 2٪ SDS في 1x TBS (مكمل بكوكتيل 1x PI) في الأنبوب الذي يحتوي على المبايض. انتظر عدة دقائق حتى يتم تحلل الخلايا ويصبح المحلول لزجا.
    3. تحلل الماصة إلى أنبوب ميلي بحجم 1 مل يحتوي على ألياف صوتيات مركزة تكيفية (AFA). قص أطراف الماصة قبل الاستخدام. لضمان صوتنة فعالة ، قم بنقل 500 ميكرولتر كحد أقصى من المحللة لكل أنبوب.
    4. أداء صوتنة مع الشروط التالية: ذروة قوة الحادث 75 واط ، عامل العمل 10٪ ، دورات لكل انفجار 200 ، الوقت 180 ثانية ، درجة الحرارة 6 درجة مئوية.
      ملاحظة: إذا كان يجب أن تخضع عينة للصوتنة عدة مرات ، فقم بإعداد بعض الفواصل الزمنية بينهما لتجنب توليد الحرارة الزائدة.
  2. ترسيب الأسيتون
    1. انقل المحللة إلى أنبوب منخفض الارتباط سعة 5 مل ، ثم أضف الأسيتون البارد إلى الأنبوب عند 6 أضعاف حجم العينة. على سبيل المثال ، أضف 3 مل من الأسيتون إلى 500 ميكرولتر من المحللة.
      ملاحظة: يجب تبريد الأسيتون مسبقا عند -20 درجة مئوية قبل الاستخدام.
    2. أنبوب الدوامة ، قم بتحميله في جهاز متعدد الدوران واحتضانه طوال الليل (± 16 ساعة) عند -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: هذه نقطة توقف ، مما يعني أنه يمكن إيقاف التجربة مؤقتا بعد هذه الخطوة.
    3. ترسب البروتينات المترسبة في الحبيبات عند 15,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية ، ثم قم بتدوير الأنبوب عند 4 درجات مئوية.
    4. أضف 2 مل من محلول خليط يتكون من 90٪ أسيتون بارد و 10٪ 1x TBS. ماصة بحركة لأعلى ولأسفل لخلط الحبيبات والمحلول. قص أطراف الماصة قبل الاستخدام.
    5. أنبوب الدوامة ، ثم قم بتحميله في الدوارات المتعددة واحتضانه لمدة 2 ساعة عند -20 درجة مئوية.
    6. بروتينات الحبيبات عند 15,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية ، ثم قم بتدوير الأنبوب عند 4 درجات مئوية. افتح الأنبوب وجفف الحبيبات بالهواء لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: لا تفرط في تجفيف الحبيبات لأنه سيكون من الصعب إعادة تعليقها لاحقا.
    7. قم بإعداد محلول مخزون بيكربونات الأمونيوم (ABC) 500 ملي مولار عن طريق إذابة 0.7906 جم ABC في 20 مل من TDW. اصنع حل عمل ABC 50 ملي مولار عن طريق تخفيف 3 مل من محلول مخزون ABC 500 ملي في 27 مل من TDW.
    8. تحضير محلول اليوريا 8 M بإضافة 0.4805 جم من اليوريا في 1 مل من 50 ملي ABC.
      ملاحظة: يجب تحضير محلول اليوريا طازجا قبل التجربة.
    9. أعد تعليق حبيبات البروتين في 500 ميكرولتر من 8 M اليوريا. يمكن تقليل حجم 8 M اليوريا لزيادة تركيز البروتين.
    10. نقل البروتين المعلق إلى أنبوب ميلي بحجم 1 مل يحتوي على ألياف AFA ، ثم قم بإجراء صوتنة بنفس الشروط الموضحة في الخطوة 4.1.4.
    11. إجراء اختبار BCA لتحديد تركيز البروتين. هذه الخطوة هي نقطة توقف. قم بتخزين عينة البروتين في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام الآخر.
  3. هضم التربسين
    1. امزج 3 ملغ من البروتينات مع TDW (إذا لزم الأمر) في أنبوب منخفض الارتباط سعة 5 مل ليصبح المجموع 500 ميكرولتر من المحلول.
    2. قم بتغيير طبيعة البروتينات باستخدام الكتلة الحرارية عند 450 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.
    3. أضف 5 ميكرولتر من 1 M DTT (مذاب في TDW) في الأنبوب لعمل تركيز نهائي يبلغ 10 ملي مولار DTT ، ثم قلل البروتينات باستخدام كتلة حرارية عند 450 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.
    4. تحضير 400 ملي مولار يودوأسيتاميد عن طريق إذابة 0.0111 جم يودوأسيتاميد في 150 ميكرولتر من ABC. أضف 55 ميكرولتر من 400 ملي مولار يودوأسيتاميد في الأنبوب (التركيز النهائي 40 مليمتر) ، ثم بروتينات الألكيلات باستخدام الكتلة الحرارية عند 450 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: اليودوأسيتاميد حساس للضوء ، ويجب تحضير جميع محاليل اليودوأسيتاميد طازجة قبل التجربة.
    5. قم بتخفيف العينة بإضافة محلول ABC 50 ملي مولار حتى يصل الحجم الإجمالي إلى 4 مل. بعد التخفيف ، يبلغ تركيز اليوريا في المحلول حوالي 1 متر.
    6. اصنع محلول مخزون 1 M CaCl2 عن طريق إذابة 1.1098 جم CaCl2 في 10 مل من TDW. أضف 4 ميكرولتر من مخزون 1 M CaCl2 في الأنبوب لعمل تركيز نهائي 1 ملي مولار ، ثم قم بتدوير الماصة لأعلى ولأسفل لتجانس المحلول.
    7. قم بإعداد محلول مخزون التربسين 1 مجم / مل عن طريق إضافة 0.001 جم من التربسين إلى 1 مل من ABC. أضف 150 ميكرولتر من التربسين إلى الأنبوب (التربسين: العينة = نسبة 1:20). هضم البروتين باستخدام الكتلة الحرارية عند 450 دورة في الدقيقة لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: يجب إذابة التربسين حديثا قبل التجربة. هذه الخطوة هي نقطة توقف. قم بتخزين الببتيدات المهضومة على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام الآخر.
  4. إثراء الببتيد الحيوي
    ملاحظة: يجب تحضير مخازن الغسيل والشطف حديثا قبل التجربة.
    1. تحضير 2 م من اليوريا في محلول 1x TBS عن طريق إضافة 1.2012 جم من اليوريا في 10 مل من 1x TBS.
    2. استخدم 150 ميكرولتر من الخرزات المغناطيسية المترافقة بالستربتافيدين لكل عينة 3 ملغ. اغسل حبات الستربتافيدين ب 1 مل من 2 م من اليوريا في 1x TBS. كرر هذه الخطوة 4x. بعد كل غسلة ، ضع الأنبوب على رف مغناطيسي لمدة 1 دقيقة ، ثم تخلص من مخزن الغسيل.
      ملاحظة: يوصى باستخدام حبات بيرس ستربتافيدين المغناطيسية لأنها تقلل من إشارات الخلفية الشبيهة ب PEG في نتائج قياس الطيف الكتلي.
    3. ماصة 1 مل من الببتيدات المهضومة في الأنبوب المحتوي على الخرزة ، واخلطها برفق ، ثم اخلطي الخليط مع العينة المتبقية في أنبوب منخفض الارتباط سعة 5 مل. ضع الأنبوب على جهاز متعدد الدوران واحتضانه لمدة 1 ساعة في RT.
    4. انقل 1 مل من الخليط إلى أنبوب سعة 1.5 مل وضعه على الرف المغناطيسي لمدة 1 دقيقة. تخلص من المادة الطافية. كرر هذه الخطوة حتى يتم جمع كل الخرز.
    5. تحضير 2 م يوريا في 50 ملي أبو سي عن طريق إذابة 0.7207 جم يوريا في 6 مل من 50 ملي أبجد. اغسل الخرزات ب 1 مل من 2 م يوريا في 50 ملي 2x وب 1 مل من TDW مرة واحدة. بعد كل غسلة ، ضع الأنبوب على رف مغناطيسي لمدة 1 دقيقة ، ثم تخلص من مخزن الغسيل.
    6. تحضير محلول مخزون حمض الفورميك بنسبة 10٪ عن طريق إذابة 1 مل من حمض الفورميك في 9 مل من TDW. تحضير مخزن الشطف الذي يتكون من 80٪ أسيتونيتريل و 0.1٪ حمض الفورميك في TDW. على سبيل المثال ، امزج 1.2 مل من الأسيتونيتريل ، و 15 ميكرولتر من مخزون حمض الفورميك بنسبة 10٪ ، و 285 ميكرولتر من TDW لعمل مخزن مؤقت للشطف 1.5 مل.
      تنبيه: الأسيتونيتريل وحمض الفورميك ضاران بسبب خصائصهما المتطايرة ، لذا ارتد قناعا وتوخي الحذر عند التعامل معهما.
    7. ماصة 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف في الأنبوب ، وتتجانس برفق ثم تخلص الببتيدات باستخدام كتلة حرارية عند 300 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق عند 60 درجة مئوية. بعد الشطف ، ضع الأنبوب على رف مغناطيسي وانقل المصفاة إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل. تجنب أخذ الخرز عند نقل التصفيف. كرر هذه الخطوة 5x.
    8. ضع الأنبوب الذي يحتوي على 500 ميكرولتر من التحفيص على رف مغناطيسي لمدة 5 دقائق ، ثم انقله إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل لضمان الإزالة الكاملة للخرز. يمكن بعد ذلك تجفيف العينات المخففة واستخدامها لتحليل قياس الطيف الكتلي.
    9. للحصول على معلومات إضافية حول تحليل LC-MS / MS لعينات الببتيد المخصبة ومعالجة بيانات MS ، تحقق من Nguyen et al.20.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم تصوير المخرجات على الأمثلة في الشكل 1 ، الشكل 2 ، الشكل 3 ، الشكل 4 تم نشرها سابقا بواسطة Nguyen et al.20. يوضح الشكل 1 الإجراء التجريبي ل PL المستند إلى TurboID في ذبابة الفاكهة المبيض. أولا ، تم إنشاء بنية تجمع بين Zuc و TurboID (Zuc-V5-TurboID). كما تم دمج سكان العضيات الفرعية المعروفة والمتميزة، وهي إش...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا ، نقدم إجراء شاملا لوضع العلامات القريبة (PL) المستندة إلى TurboID في ذبابة الفاكهة ، تم تطويره من خلال استكشاف الأخطاء وإصلاحها على نطاق واسع للتغلب على التحديات المختلفة. تضمنت إحدى القضايا الرئيسية التركيبات الجينية ، حيث أثرت تخطيطات الاندماج المختلفة بشكل كبير على التعبير عن البروتين وكفاءة البيوتينيل. على سبيل المثال ، أظهر NES-V5-TurboID تعبيرا وبيوتينيل أضعف مقارنة بالجينات المعدلة وراثيا الأخرى ، مما يعقد أحيانا تفسير فحوصات المصب. ومع ذلك ، أظهر البناء المنقح مع NE...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نشكر أعضاء المختبر على مناقشاتهم ومساعدتهم. تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للبحوث (NRF) بتمويل من الحكومة الكورية (MSIT) (RS-2024-00345327 إلى M.L. ؛ RS-2023-00219563 إلى M.L.).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي >أجسام مضادة < / قوي >
الماعز المضاد للفأر IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي ، HRPInvitrogen31430درجة تحليلية ،
مضاد ثانوي للماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) شديد الامتصاص ، أليكسا فلور بلس 488InvitrogenA32731درجة تحليلية ،
مضاد ثانوي IgG مضاد للأرانب (H + L) حساس للضوء، HRPInvitrogen31460درجة تحليلية ،
جسم مضاد HSP90 حساس للضوء (أرنب)تقنية إشارات الخلية4874الجسم المضاد متعدد النسيلة
بيرس بروتين الستربتافيدين ، HRPThermo Fisher Scientific21126من الدرجة التحليلية
، Alexa Fluor 594 المترافقInvitrogenS11227حساس للضوء ، درجة
تحليليةالجسم المضاد V5 علامة (الماوس)InvitrogenR960-25الجسم المضاد أحادي النسيلة
V5-tag الأجسام المضادة (أرنب) (D3H8Q)إشارات الخلية13202الجسم المضاد أحادي
النسيلة <قوي >خطوط الطيران < قوي ><قوي > الشركة < / قوي >< قوي > رقم الكتالوج < / قوي >< قوي > تعليقات / وصف < / strong>
pUASp Tom20 V5-TurboID / TM3كوريا ذبابة الفاكهة مركزالأسهم 2373-2ذبابة
2188ذبابة
الكوري ذبابة الفاكهة مركزالأسهم 2635-4ذبابة
الذهبي مع [*] ؛ P{w[+mC]=matalpha4-GAL-VP16}V2HBloomington ذبابة الفاكهة ستوك سنتر7062Fly stock
Equipments and ConsummablesCompanyCatalog NumberComments / Description
Analytical BalanceMettler ToledoME2040.1 mg Readability
Amersham Protran 0.45 NC نيتروسليلوز أغشية النشاف الغربية (300 مم & مرات ؛ 4 م)Cytiva
10600002-Axygen 1.7 مل MaxyClear Snaplock Microcentrifuge TubeCorningMCT-175-CCo-polymer
BRAND   غطاء زجاجي (22 مم × 22 مم)Sigma-AldrichBR470055زجاج البورسليكات
أطراف ماصة سائبة (10 وميكرو ؛ L)Vertex4110N00
أطراف ماصة البروبيلين السائبة (1000 & micro; L)Vertex4330N00
أطراف ماصة البروبيلين السائبة (200 & micro; L)Vertex4230N00
لوحة ثقافة خلايا البروبيلين (96 بئر)SPL300096البوليسترين ،
جهاز طرد مركزي من النوع المسطح القاع (مع دوار بحجم الأنبوب 1.5-2 مل)Eppendorf5424 Rمبرد بزاوية ثابتة
(مع دوار بحجم أنبوب 5 مل)Eppendorf5425 Rمبردة بزاوية
ثابتة -- نظام التصوير المصنوع من الفولاذ المقاوم
ChemiDocBiorad12003153نظام تصوير اللطخة
الغربية CO2< / sub> وسادة ذبابة-لوح التخدير
CO2< / sub> خزان ومنظم-الحذر من غاز الضغط العالي والدوخة
حاضنة مدمجةJSRJSGI-10Tتحذير من ارتفاع درجة الحرارة
مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤرZeissLSM 710الحذر من شعاع الليزر المكثف
أنبوب مخروطي الشكل (15 مل)SPL50015بولي بروبيلين / بولي إيثيلين عالي الكثافة   ؛
أنبوب مخروطي (50 مل) SPL50050بولي بروبيلين / بولي إيثيلين عالي الكثافة   ؛
التوازن الرقمي---
مؤقت رقمي---
طبق تشريح-ملقط#5SF السيليكون
دومون   ؛أدوات العلومالدقيقة 11252-00نصائح فائقة الدقة ، الحذر من كائن حاد
مغناطيس DynaMag-2Invitrogen12321Dلأنابيب الطرد المركزي الدقيقة بحجم 1.5-2 مل
Fisherbrand   ؛ شرائح مجهر Superfrost Plus (25 مم × 75 مم)فيشر ساينتفيك12-550-15تحذير من جسم حاد
يطير زجاجات الطعام (مع سدادة ورقية)Hansol TechFFB-21010-Fly
قوارير طعام (مع غطاء قطني)Hansol TechFFV-11010-Focused-ultrasonicator
CovarisM220تحذير من سكين جل الموجات فوق الصوتية
InvitrogenEI9010الفولاذ المقاوم للصدأ بمقبض بلاستيكي
ورق نشاف Chr من الدرجة 3 مم (46 سم & مرات ؛ 57 سم)Cytiva3030-917ورق Whatmann
الخالط اليدوي والمدقة البلاستيكيةKimble749540-0000محرك لاسلكي
كتلة حراريةALB6400 PCR الدقيقةالحذر من الأنسجة الخالية من الوبر بدرجة حرارة
عالية Yuhan-Kimberly41112-
النيتروجين السائل-الحذر من قضمة الصقيع والحروق
مقياس الطيف الضوئي المجهريAgilent TechnologiesEpochالبصريات القائمة على أحادي اللون
الميكروويف-تحذير من ارتفاع درجة الحرارة
milliTUBE 1 مل من ألياف AFACovarisPN 520135خزان جل صغير زجاجي
Thermo Fisher ScientificA25977تحذير من ارتفاع درجة
NuPAGE Bis-tris المواد الهلامية البروتين الصغيرة, 4 & ndash; 12٪ ، 1.0 & - ndash ؛ 1.5 مم ، 10 آبارInvitrogenNP0323BOXتحتوي على بولي أكريلاميد ، تحذير من السمية
NuPAGE Bis-tris المواد الهلامية البروتينية الصغيرة ، 4 & ndash ؛ 12٪ ، 1.0 & - ndash ؛ 1.5 مم ، 15 بئرInvitrogenNP0321BOXتحتوي على بولي أكريلاميد ، تحذير من السمية
فرشاة طلاء (Ø ؛ 1.8 مم)Hwa hong791240-Pipetman
L (P1000L)GilsonFA10006Mماصة دقيقة أحادية القناة مع قاذف معدني
Pipetman L (P200L)GilsonFA10005Mماصة دقيقة أحادية القناة مع قاذف معدني
Pipetman L ( P20L)جيلسونFA10003Mماصة دقيقة أحادية القناة مع قاذف معدني
Pipetman L (P2L)GilsonFA10001Mماصة دقيقة أحادية القناة مع قاذف معدني
مزود طاقةعلم رئيسيMP-310الحذر من الكهرباء عالية
الدوار القابل للبرمجةBiosanRS-24-Protein
LoBind   ؛ أنابيبEppendorf
30108302-Razor bladeDorco304020الفولاذ المقاوم للصدأ ، الحذر من الأسطوانة الحادة
---
ماصة مصلية (10 مل)SPL91010ماصة من البوليسترين
المصلية (25 مل)SPL91025ماصة مصلية من البوليسترين
(5 مل)SPL91005مصلية من البوليسترين
(50 مل)SPL91050غطاء البوليسترين
المفاجئ أنابيب الطرد المركزي الدقيقة منخفضة الاحتجاز (1.5 مل) وسادةمن مادة البولي بروبيلينالعلمية 3451PK
InvitrogenEI9052-مجهر
ستيريوZeissStemi 508-مجهر
ستيريو   ؛Leica
ThermoMixer  CEppendorf5382000015مع كتل بحجم 1.5 و 5 مل
ملاقط AvenTools18526بلاستيك ، نصائح مسطحة
خلاط دوامةالصناعات العلميةSI-0236-XCell
II وحدة اللطخةInvitrogenEI9051الحذر من ارتفاع درجة الحرارة
XCell & nbsp ؛ SureLock خلية صغيرةInvitrogenEI0001تحذير من ارتفاع درجة
الحرارة < قوية > المواد الكيميائية < / قوي ><قوي> الشركة < / قوي >< قوي > رقم الكتالوج < / قوي >< قوي>تعليقات / وصف < قوي>
أسيتونسيجما ألدريتش650501الصف التحليلي
أسيتونيتريلسوبيلكو1.00029.1000درجة LC-MS ، تحذير من سمية الاستنشاق وأمبولات الألبومين القياسية القابلة للاشتعال
(تحتوي على ألبومين مصل الأبقار (BSA) بنسبة 2 مجم / مل في محلول ملحي 0.9٪ و 0.05٪ أزيد الصوديوم)Thermo Scientific23209جزء من مجموعات فحص البروتين Pierce BCA (Thermo Scientific ، 23225)
الألبومين ، مصل الأبقارBioshopALB001من الدرجة التحليلية
سيجما-ألدريتش09830البيوتين الصف التحليلي
 Sigma-AldrichB4639درجة زراعة الخلايا والأنسجة
كلوريد الكالسيوم (CaCl 2< / sub>)Sigma-AldrichC5670درجة زراعة الخلايا
الركيزة الركيزة الخلفية المزمنةالغربية Biorad1705060التحليلي
DAPISigma-AldrichMBD0015درجة تحليلية
من Dithiothreitol (DTT)Thermo فيشر ScientificR0861الصف التحليلي
مصل الأبقار الجنينيةCorning35-015-CVدرجة ثقافة الخلية
حمض الفورميكSigma-AldrichF0507درجة الكاشف ، الحذر من سمية الاستنشاق
وسيط حشرةجريس جيبكو11595030درجة ثقافة الخلية
خميرة جافة فوريةلا علامة تجاريةN1019-
يودوأسيتاميدسيجما-ألدريتشI1149الحساس للضوء والدرجة التحليلية
الميثانولكارلو إربا41484من الدرجة التحليلية
عازلة عينة Novex Tris-glycine SDSInvitrogenLC2676درجة تحليلية
NuPAGE MOPS SDS قيد التشغيل عازلة (20X)InvitrogenNP0001الصف التحليلي
PageRuler سلم البروتين PrestainedThermo Fisher Scientific26616الصف التحليلي
Phenylmethanesulfonyl fluoride   ؛Thermo Fisher Scientific36978الدرجة التحليلية
Sigma-AldrichP4417درجة تحليلية
بيرس 16٪ فورمالديهايد (وزن / حجم)Thermo Fisher Scientific28908الحساسة للضوء
Thermo Scientific23225تحليلية
كاشف بيرس BCA A (يحتوي على كربونات الصوديوم وبيكربونات الصوديوم وحمض البيسينجونيك وطرطرات الصوديوم في 0.1 مولار من هيدروكسيد الصوديوم)Thermo Scientific23228جزء من مجموعات فحص البروتين Pierce BCA (Thermo Scientific ، 23225)
كاشف بيرس BCA B (يحتوي على 4٪ كبريتات نحاسية)1859078 علمي حراريجزء من مجموعات فحص البروتين Pierce BCA (Thermo Scientific ، 23225)
حمض البروبيونيكسيجما ألدريتشمجموعة
كوكتيل مثبطات البروتيازكالبيوكيم539134درجة زراعة الخلايا والأنسجة
SlowFade Gold Antifade MountantInvitrogenS36936
كلوريد الصوديوم الحساس للضوء (NaCl)BioneerC-9025درجة تحليلية
من الديوكسي كولات الصوديومSigma-AldrichD6750
كبريتات دوديسيل الصوديومسيجما ألدريتش71736الصوديوم من الدرجة الجزيئية
(هيدروكسيد الصوديوم)BiosesangSR2018-100-00درجة تحليلية
ماء مقطر ثلاثي-فائق النقاء (النوع 1) محلول
ملحي مخزنةتريس سيجما-ألدريتش94158من الدرجة التحليلية
Koma BiotechK0341001الدرجة التحليلية
Tris-HCl ، درجة الحموضة 8BioneerC-9006الصف التحليلي
Triton x-100Sigma-Aldrich93443درجة جزيئية
TrypsinThermo Fisher Scientific20233زراعة الخلايا
Tween 20Sigma-AldrichP9416الصف الجزيئي
اليورياسيجما-ألدريتشU5378الجزيئي & درجة زراعة الخلية
جسم جسم ستربتافيدين تقنية الفاكهة البحرية مركز الأسهم 2188 ذ pUASP_attB_V5 بابة الفاكهة كوريا مركز الأسهم ذبابة الفاكهة الفاكهة الفاكهة الذراع جهاز طرد مركزي ملعقة كيميائية للصدأ الحرارة الجهد ماصة إسفنجية الحرارية بيكربونات الأمونيوم الصف الميثانول طلاء أظافر - من النوع الشفاف (2X) محلول ملحي عازل للفوسفات من درجة تحليلية ، أطقم فحص بروتين بيرس BCA درجة من 402907 ACS III هيدروكسيد عازلة نقل تريس جلايسين درجة

المراجع

  1. Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: Proximity-based labeling of proteins in living cells. Trend Cell Biol. 26 (11), 804-817 (2016).
  2. Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by turboid. eLife. 8, e47864(2019).
  3. Qi, Y., Katagiri, F. Purification of low-abundance Arabidopsis plasma-membrane protein complexes and identification of candidate components. Plant J. 57 (5), 932-944 (2009).
  4. Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with turboid. Nat Biotechnol. 36 (9), 880-887 (2018).
  5. Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
  6. Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. J Cell Biol. 196 (6), 801-810 (2012).
  7. Quantitative Proteomics. , https://case.edu/medicine/nutrition/centers-and-collaborations/case-center-proteomics-and-bioinformatics/proteomics-and-small-molecule-mass-spectrometry-core/quantitative-proteomics (2025).
  8. Udeshi, N. D., et al. Antibodies to biotin enable large-scale detection of biotinylation sites on proteins. Nat Meth. 14 (12), 1167-1170 (2017).
  9. Ummethum, H., Hamperl, S. Proximity labeling techniques to study chromatin. Front Genet. 11, 450(2020).
  10. Han, S., Li, J., Ting, A. Y. Proximity labeling: Spatially resolved proteomic mapping for neurobiology. Curr Opin Neurobiol. 50, 17-23 (2018).
  11. Nishimasu, H., et al. Structure and function of zucchini endoribonuclease in pirna biogenesis. Nature. 491 (7423), 284-287 (2012).
  12. Zamudio, N., et al. DNA methylation restrains transposons from adopting a chromatin signature permissive for meiotic recombination. Genes Dev. 29 (12), 1256-1270 (2015).
  13. Cha, S. J., et al. Therapeutic modulation of gsto activity rescues fus-associated neurotoxicity via deglutathionylation in als disease models. Dev Cell. 57 (6), 783-798.e8 (2022).
  14. Pulver, S. R., Berni, J. The fundamentals of flying: Simple and inexpensive strategies for employing Drosophila genetics in neuroscience teaching laboratories. J Undergrad Neurosci Educ. 11 (1), A139-A148 (2012).
  15. Feizy, N., et al. In vivo identification of Drosophila rhodopsin interaction partners by biotin proximity labeling. Sci Rep. 14 (1), 1986(1986).
  16. Zhang, B., Zhang, Y., Liu, J. L. Highly effective proximate labeling in Drosophila. G3. 11 (5), jkab077(2021).
  17. Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
  18. Waring, G. L. Morphogenesis of the eggshells in Drosophila. Int Rev Cytol. 198, 67-108 (2000).
  19. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual drosophila egg chambers for live imaging. J Vis Exp. (60), e3679(2012).
  20. Nguyen, T. T. M., et al. In vivo profiling of the zucchini proximal proteome in the Drosophila ovary. Development. 150 (4), dev201220(2023).
  21. Ahmadi, S., Winter, D. Identification of poly(ethylene glycol) and poly(ethylene glycol)-based detergents using peptide search engines. Anal Chem. 90 (11), 6594-6600 (2018).
  22. Zada, A., Khan, I., Zhang, M., Cheng, Y., Hu, X. Airid-based proximity labeling for protein-protein interaction in plants. J Vis Exp. (187), e64428(2022).
  23. Fang, B., et al. Lowering sample requirements to study tyrosine kinase signaling using phosphoproteomics with the tmt calibrator approach. Proteomics. 20 (24), 2000116(2020).
  24. Park, N., et al. One-stage tip method for tmt-based proteomic analysis of a minimal amount of cells. ACS Omega. 8 (22), 19741-19751 (2023).
  25. Zhang, Y., et al. Turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks. J Vis Exp. (159), e60728(2020).
  26. Trinkle-Mulcahy, L. Recent advances in proximity-based labeling methods for interactome mapping. F1000Res. 8, Faculty Rev-135 F1000(2019).
  27. Wei, X. F., Li, S., Hu, J. L. A turboid-based proximity labelling approach for identifying the DNA-binding proteins. STAR Protoc. 4 (1), 102139(2023).
  28. Bosch, J. A., Chen, C. L., Perrimon, N. Proximity-dependent labeling methods for proteomic profiling in living cells: An update. WIREs Dev Biol. 10 (1), e392(2021).
  29. Rayaprolu, S., et al. Cell type-specific biotin labeling in vivo resolves regional neuronal and astrocyte proteomic differences in mouse brain. Nat Commun. 13, 2927(2022).
  30. Uckun, E., et al. In vivo profiling of the alk proximitome in the developing Drosophila brain. J Mol Biol. 433 (23), 167282(2021).
  31. Xiong, Z., et al. In vivo proteomic mapping through gfp-directed proximity-dependent biotin labelling in zebrafish. Elife. 10, e64631(2021).
  32. Holzer, E., Rumpf-Kienzl, C., Falk, S., Dammermann, A. A modified turboid approach identifies tissue-specific centriolar components in C. elegans. PLoS Genet. 18 (4), e1010150(2022).
  33. Artan, M., et al. Interactome analysis of Caenorhabditis elegans synapses by turboid-based proximity labeling. J Biol Chem. 297 (3), 101094(2021).
  34. Zhang, Y., et al. Turboid-based proximity labeling reveals that ubr7 is a regulator of n nlr immune receptor-mediated immunity. Nat Comm. 10 (1), 3252(2019).
  35. Baumgartner, L., et al. The Drosophila zad zinc finger protein kipferl guides rhino to pirna clusters. eLife. 11, e80067(2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

TurboID
في الجسم الحي تطبيق وضع العلامات على القرب المستندة إلى TurboID في ذبابة الفاكهة السوداء
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.