مقالة منهجية

توليد الثقافات وحيدة النسيلة من ذبابة الفاكهة السوداء JW18 المصابة بالوولباخيا

1.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68207

⸱

يونيو 27, 2025

 , 
1Institute of Environmental Sciences, Faculty of Biology, Jagiellonian University, 2Doctoral School of Exact and Natural Sciences, Jagiellonian University, 3Department of Evolution, Ecology and Behaviour, Institute of Infection, Veterinary and Ecological Sciences, University of Liverpool

في هذه المقالة

ملخص

خطوط الخلايا مفيدة في الدراسات التي أجريت على الكائنات داخل الخلايا التي لا يمكن زراعتها خارج الخلايا المضيفة. على الرغم من أن الخطوط المصابة ب Wolbachia قد مكنت من العديد من الاكتشافات ، إلا أن عدم التجانس داخل هذه الخطوط يمكن أن يؤدي إلى نتائج تجريبية متغيرة. نقدم بروتوكولا لتوليد استنساخ أحادي الخلية وثقافات مستمرة من خلايا JW18 المصابة ب Wolbachia.

الملخص

خطوط الخلايا هي نماذج تستخدم على نطاق واسع في البحوث البيولوجية. وهي مفيدة بشكل خاص في دراسات البكتيريا داخل الخلايا التي لا يمكن نشرها بكفاءة خارج الكائنات الحية المضيفة. Wolbachia ، وهو متعايش داخل الخلايا للعديد من اللافقاريات ، يؤدي إلى تأثيرات تكاثرية قوية ومضادة للفيروسات في مضيفيها من الحشرات. تم استخدام خلايا الحشرات المصابة بالولباخيا على نطاق واسع لدراسة الأنماط الظاهرية ل Wolbachia. ومع ذلك ، غالبا ما تتكون خطوط الخلايا هذه من مجموعات مختلطة من الخلايا ذات أنماط ظاهرية مختلفة واستجابات للعلاجات التجريبية. على وجه الخصوص ، تم الإبلاغ عن أن خطوط الخلايا المصابة ب Wolbachia تظهر معدلات نمو متغيرة وانتشار متغير لعدوى Wolbachia من ممر إلى آخر. لعلاج ذلك ، قمنا بإنشاء خطوط خلايا وحيدة النسيلة من ذبابة الفاكهة السوداء المشتق من خط خلايا JW18 المشتق من ذبابة الفاكهة المصابة ب Wolbachia. تم إنشاء هذه الخطوط النسيلة في نقاط زمنية مختلفة وتظهر حالات مختلفة لعدوى Wolbachia. يشير هذا التباين إلى أن أي علاج يتم تطبيقه على مجموعة JW18 الأبوية يمكن أن يؤدي إلى اختيار مجموعات سكانية فرعية بدلا من التأثير على فسيولوجيا الثقافة بأكملها. هنا ، نقدم بروتوكولا لتوليد المستنسخة أحادية الخلية والثقافات النسيلة المستمرة من خلايا الحشرات المصابة ب Wolbachia ، مما يتيح تجارب أكثر تحكما وقابلية للتكرار.

المقدمة

ذبابة الفاكهة الخلايا السوداء تستخدم على نطاق واسع في الدراسات الجينية وأبحاث الأمراض وكمنصة لفحص الأدوية عاليةالإنتاجية 1. كما أنها مفيدة في دراسة واحدة من أكثر الميكروبات داخل الخلايا انتشارا على هذا الكوكب: Wolbachia. Wolbachia هي بكتيريا ملزمة داخل الخلايا سالبة الجرام توجد في 40-70٪ من أنواع الحشرات2،3،4 ، حيث تنتشر الأم وتحفز التلاعب الإنجابي5،6،7،8. يمكن أن توفر Wolbachia أيضا للمضيفين المصابين الحماية المضادة للفيروسات9،10،11،12،13،14،15 والتي يتم استغلالها جنبا إلى جنب مع التلاعب الإنجابي للسيطرة على انتقال الفيروس المفصلي من البعوض إلى البشر16،17. في أنظمة مختلفة ، ثبت أن Wolbachia تتحكم في موت الخلايا المبرمج18 ، وتوفر العناصر الغذائية الأساسية19 ، وتغير التعبير الجيني والبروتيني20،21،22،23،24،25.

ظهرت خطوط الخلايا كنموذج لدراسة Wolbachia بسبب بيولوجيتها البسيطة وملاءمتها وقدرتها على التكاثر بكميات كبيرة. أثبتت خطوط الخلايا فائدتها في التكيف المسبق مع Wolbachia مع التعايش مع المضيفين الجدد26 والسماح ل Wolbachia بتجميع الطفرات27،28. تم استخدامها للكشف عن المركبات المضادة ل Wolbachia ، والتي يمكن أن تكون مفيدة في علاج أمراض الفيلاريا29 ودراسة تفاعل ترجمة Wolbachia المضيف30. على الرغم من أن خطوط الخلايا لا غنى عنها في الدراسات التي أجريت على تعايش Wolbachia 29،30،31 ، إلا أن الآليات الكامنة وراء معظم الأنماط الظاهرية ل Wolbachia لا تزال غير معروفة. يشير هذا إلى أنه لا يزال من الممكن تحسين نظام نموذج زراعة الخلايا.

تشتق خطوط خلايا الحشرات المصابة بالولباخيا من أجنة الحشرات واليرقات. كان Aa23 ، المشتق من أجنة الزاعجة البيضاء ، أول خط مستقر مصاب بالولباخيا 32 ، واستخدم لاحقا في العديد من الدراسات حول تعايش Wolbachia 33،34،35. كان خط خلايا JW18 أحد الخطوط الأولى المصابة ب Wolbachia بشكل طبيعي والتي تم إنشاؤها من D. melanogaster29،36. هذا الخط ، المشتق من 1 ساعة إلى 15 ساعة من الأجنة منالذباب المصاب ب Mel ، كان أيضا مصدرا ل Wolbachia لخطوط خلايا ذبابة الفاكهة الأخرى: 1182-4H و S2R + 37. نظرا لأن الأجنة تحتوي على نسبة عالية من الخلايا متعددة القدرات ، فمن خلال التكيف مع النمو في البلاستيك ، يمكن أن تكتسب خصائص جديدة ، تختلف أحيانا بالنسبة لسلالات الخلايا الفردية. قد يفسر هذا عدم تجانس أشكال الخلايا وترددات عدوى Wolbachia التي لوحظت في هذه الخلايا في أي وقت وعلى مدى الأجيال29.

يثير التنوع الخلوي داخل مزرعة JW18 مخاوف ، حيث أظهرت الدراسات التي أجريت على خطوط خلايا البعوض ، مثل Aag2 ، أن خطوط الخلايا أحادية النسيلة والأبوية قد تستجيب بشكل مختلف للعلاجات بسبب الاختلافات في خصائص الخلية38. وبالتالي ، فإن إعطاء العلاجات لمجموعة من الخلايا المختلطة يمكن أن يؤدي إلى نتائج مضللة. لدراسة استجابة مجموعة الخلايا المتجانسة للعلاج (وليس الاختيار لأنواع الخلايا الفردية) ، قمنا بإنشاء ثقافات وحيدة النسيلة من خط خلايا JW18 الأبوي. لم تكن هناك محاولات سابقة لتوليد ثقافات وحيدة النسيلة من هذه الخلايا. يتضمن البروتوكول عزل الخلايا المفردة من خط خلايا JW18 الأبوية ، متبوعا بصيانتها ونقلها إلى قوارير لإنشاء ثقافات نسيلة مستمرة. لقد تحققنا من حالة عدوى Wolbachia للخطوط الفردية ، وأظهرنا أنها تختلف في هذه الخاصية الرئيسية. تعتبر مزارع الخلايا المتجانسة أمرا بالغ الأهمية في ضمان دقة وقابلية استنساخ التجارب المستقبلية.

البروتوكول

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الأعمال مع الخلايا الحية ووسائطها في خزانة السلامة البيولوجية لتجنب التلوث.

1. إعداد وسائل الإعلام

  1. قم بإعداد وسط الاستزراع الطازج عن طريق استكمال وسط Shield و Sang Insect مع 10٪ مصل بقري الجنين (FBS).
  2. الوسائط المستهلكة والمكيفة
    1. قم بزراعة خلايا JW18 في قارورة مقاس 25 سم2 تحتوي على وسط Shield و Sang Insect الطازج المكمل بنسبة 10٪ FBS عند 25 درجة مئوية. احتضان حتى تصل الخلايا إلى التقاء (~ 1 أسبوع).
    2. قم بتصفية وسط زراعة الخلايا المستهلكة البالغ من العمر أسبوع واحد المستخدم لزراعة الخلايا ، لإزالة Wolbachia ، وبقايا الخلايا ، والملوثات الأخرى: استخدم مرشحا معقما 5 ميكرومتر ثم مرشحا معقما 0.2 ميكرومتر مثبتا على حقنة سعة 50 مل.
    3. قم بإعداد الوسط المكيف عن طريق استكمال الوسط الطازج بنسبة 20٪ من الوسط المستهلك. تحضير وسط مكيف كاف للوحة واحدة 96 بئر (~ 30 مل) ؛ باستخدام الماصة المصلية، امزج 6 مل من الوسط المستهلك المصفى مع 24 مل من وسط الدرع الطازج ووسط سانغ إنسايت المكمل بنسبة 10٪ FBS.

2. تحضير اللوحة المكونة من 96 بئر

  1. تحضير تعليق الخلية JW18
    1. اكشط الخلايا من قارورة ملتقية عمرها أسبوع واحد باستخدام مكشطة خلوية وأعد تعليقها باستخدام ماصة مصلية.
    2. عد الخلايا باستخدام غرفة Neubauer وقم بتخفيفها بوسط مكيف لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 2 × 103 خلايا / مل.
  2. إضافة وسيط مكيف إلى الطبق
    1. انقل الوسط المكيف المحضر إلى خزان الكاشف.
    2. باستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 100 ميكرولتر من الوسط المكيف إلى كل بئر من الصفيحة المكونة من 96 بئرا، باستثناء البئر A1.
  3. التخفيف التسلسلي لتعليق الخلية
    1. أضف 200 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى البئر A1.
    2. باستخدام ماصة أحادية القناة، انقل 100 ميكرولتر من البئر A1 إلى البئر B1 واخلطها برفق (تجنب الفقاعات) كما في الشكل 1A.
    3. كرر التخفيف التسلسلي لأسفل العمود 1 ، وتخلص من 100 ميكرولتر الأخيرة من البئر الأخير.
  4. التخفيف عبر اللوحة
    1. أضف 100 ميكرولتر من الوسط المكيف إلى كل بئر في العمود الأول ، إلى الحجم الإجمالي 200 ميكرولتر.
    2. باستخدام الماصة متعددة القنوات، انقل 100 ميكرولتر من العمود الأول إلى الثاني. تخلط بلطف.
    3. كرر هذه العملية لجميع الأعمدة (1-12) عبر اللوحة (الشكل 1 أ).
    4. بعد إعادة التعليق ، تخلص من 100 ميكرولتر من العمود الأخير. في هذه المرحلة ، يحتوي كل بئر على 100 ميكرولتر من تعليق الخلية.
    5. أضف 100 ميكرولتر إضافي من وسط الاستزراع إلى جميع الآبار ، ليصل الحجم النهائي في كل بئر إلى 200 ميكرولتر.

3. تحديد الخلايا المفردة

  1. قم بتغطية اللوحة وأغلقها ب Parafilm وقم بتسميتها بشكل مناسب.
  2. راقب اللوحة تحت المجهر ، وتحقق من كل بئر بعناية بحثا عن خلايا مفردة (الشكل 1 ب). تأكد من مسح الآبار والحواف بدقة للتأكد من وجود خلية واحدة فقط.
    ملاحظة: هذه واحدة من أهم الخطوات في البروتوكول.
  3. سجل عدد البئر للخلايا المفردة على خريطة لوحة 96 بئرا (على الورق).
    ملاحظة: من المرجح أن توجد خلايا مفردة في الآبار باتجاه يمين وأسفل اللوحة.
  4. بمجرد تحديد الخلايا المفردة وتمييزها ، قم بتخزين اللوحة في حاضنة عند 25 درجة مئوية. راقب الخلايا كل يومين.

4. صيانة ونقل الخلايا

  1. مراقبة الخلايا
    ملاحظة: تستغرق خلايا JW18 عادة 3 أيام لبدء الانقسام من خلية واحدة ، وقد تنمو المجموعات النسيلة بمعدلات مختلفة (الشكل 2).
    1. راقب الآبار كل 2-3 أيام بحثا عن التلوث البكتيري وللتأكد من عدم جفاف الوسط. إذا بدا أن الآبار تجف ، فقم بتغطيتها بوسط جديد حسب الحاجة.
  2. توسيع الخلية
    1. بمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء في الصفيحة المكونة من 96 بئرا ، انقلها إلى صفيحة مكونة من 24 بئرا (الشكل 1 د).
    2. بعد ذلك ، انقل الخلايا إلى صفيحة مكونة من 6 آبار وأخيرا إلى قارورة (الشكل 1E ، F).
      ملاحظة: يزيد هذا التوسع التدريجي من احتمالية إنشاء خط خلوي نسيلي مستمر.
  3. تجميد الخلايا
    1. بمجرد إنشاء ثقافة نسيلي ، قم بتجميد جزء من الخلايا لاستخدامه في المستقبل.
      1. اكشط الخلايا من القارورة باستخدام مكشطة الخلية وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 250 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      2. قم بإعداد وسط تجميد 2x (Shield and Sang Insect Medium مكمل بنسبة 20٪ FBS و 10٪ DMSO).
      3. بعد الطرد المركزي ، تخلص من جزء من المادة الطافية ، تاركا نصف الحجم النهائي المطلوب. أضف حجما متساويا من وسط التجميد 2x إلى المادة الطافية المتبقية وأعد تعليق الحبيبات برفق باستخدام ماصة.
      4. Aliquot 1 مل من المعلق في كل 1.5 مل cryovial وضع القوارير على الجليد. قم بتخزين القوارير في درجة حرارة -80 درجة مئوية طوال الليل ، ثم انقلها إلى خزان نيتروجين سائل في اليوم التالي للتخزين طويل الأجل.

5. PCR لتأكيد حالة Wolbachia

  1. استخراج الحمض النووي من عينات الزراعة أحادية النسيلة باستخدام طريقة الفينول كلوروفورم39.
    1. ضع 1 مل من الخلايا المتقاربة المكشطة والمعلقة في وسط في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل وقم بطرد الخلايا عند 290 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية (وسط زراعة الخلايا) وضع الأنبوب على الجليد.
    2. أضف 250 ميكرولتر من المحلول A ، والذي يتكون من 0.1 M Tris HCl (الرقم الهيدروجيني 9.0) ، و 0.1 M EDTA ، و 1٪ SDS. أعد تعليق الخلايا واحتضانها عند 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في كتلة تسخين.
    3. بعد الحضانة ، أضف 35 ميكرولتر من أسيتات البوتاسيوم 8 M ، ورج الأنبوب برفق (تجنب الدوامة) ، واحتضن على الجليد لمدة 30 دقيقة أخرى.
    4. تدور عند 13,000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، وانقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد ، وأضف حجما متساويا من الفينول كلوروفورم. يرج جيدا ويدور مرة أخرى ، وكرر هذه الخطوة مرة واحدة.
    5. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد ، ثم أضف 150 ميكرولتر من الأيزوبروبانول ، ورجها ، وقم بالدوران عند 10,000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية بعناية ، واغسل الحبيبات ب 1 مل من 70٪ إيثانول ، وقم بالدوران عند 13,000 دورة في الدقيقة.
    6. بعد تجفيف الحبيبات لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، أعد تعليقها في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE. حدد كمية الحمض النووي وخزنه عند -20 درجة مئوية.
  2. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي باستخدام الحمض النووي المستخرج من عينات الزراعة أحادية النسيلة للكشف عن Wolbachia باستخدام مزيج DreamTaq Green PCR الرئيسي. استخدم بادئات wsp 81F و wsp 691R40 لبادئات Wolbachia و ذبابة الفاكهة rpl32 41 لمراقبة جودة الحمض النووي.
    1. أضف 7.5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي ، و 0.5 ميكرولتر من كل برايمر عند 10 ميكرومتر ، و 1 ميكرولتر من الحمض النووي المخفف 1:50 ، و 5.5 ميكرولتر من الماء من الدرجة الجزيئية للحصول على 15 ميكرولتر من خليط التفاعل.
    2. استخدم برنامج PCR التالي: 94 درجة مئوية لمدة 4 دقائق ، 30 دورة × (94 درجة مئوية لمدة 40 ثانية ، 55 درجة مئوية لمدة 40 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية) ، 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل ، احفظ العينات عند 4 درجات مئوية.
  3. قم بإجراء الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز في هلام الاغاروز بنسبة 2٪ في عازلة TAE عند 90 فولت مع منتجات PCR التي تم الحصول عليها لتصور العصابات. أضف سلم الحمض النووي جنبا إلى جنب لتحديد نطاقات wsp (632 نقطة أساس) و rpl32 (194 نقطة أساس).

6. تلطيخ الأسماك لتصور عدوى Wolbachia في خطوط الخلايا

  1. قم بإجراء تهجين الفلورسنت في الموقع (FISH) كما هو موضح في بروتوكول Stellaris FISH للخلايا الملتصقة لتلطيخ Wolbachia باستخدام مجموعة مسبار Quasar 670-tagged 16s rRNA FISH. تلطخ الأحماض النووية ب Hoechst 33342.
    ملاحظة: تم تصميم مجموعة المسبار هذه بناء على تسلسل wMel 16S rDNA وتتطابق مع مجموعة المسبار المنشورة في Schneider et al.42 (انظر الجدول التكميلي S1).
    1. تحضير الكواشف (المخزن المؤقت للتثبيت ، المخزن المؤقت للتهجين ، المخزن المؤقت للغسيل A و B ، مجموعة المسبار المخصصة المعاد تشكيلها) باتباع تعليمات الشركة المصنعة43.
    2. قم بزراعة الخلايا الملتصقة على 70٪ زجاج غطاء دائري معقم بالإيثانول مقاس 18 مم في صفيحة استزراع 24 بئرا. بمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء المطلوب ، قم بشفط وسط النمو واغسلها ب 1 مل من 1x PBS. أضف 1 مل من المخزن المؤقت للتثبيت واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. اغسل الخلايا مرتين باستخدام 1 مل من 1x PBS.
    3. تتخلل عن طريق غمر الغطاء بالخلايا في 1 مل من 70٪ من الإيثانول واحتضانه طوال الليل عند 4 درجات مئوية ؛ قم بتخزين العينات في الإيثانول عند درجة الحرارة هذه لمدة تصل إلى أسبوع واحد قبل التهجين. شفط الإيثانول وإضافة 1 مل من Wash Buffer A ؛ احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-5 دقائق.
    4. قم بإعداد غرفة مرطبة عن طريق وضع منشفة ورقية مشبعة بالماء وطبقة من البارافيلم في طبق استزراع 150 مم. ماصة 100 ميكرولتر من مخزن التهجين يحتوي على 1 ميكرولتر من مخزون مسبار 12.5 ميكرومتر على البارافيلم. اقلب زجاج الغطاء برفق ، مع وضع جانب الخلايا لأسفل على قطرة المخزن المؤقت للتهجين. قم بتغطية الغرفة وإغلاقها باستخدام Parafilm ، ثم احتضانها في الظلام عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات على الأقل (حتى 16 ساعة إذا لزم الأمر).
    5. بعد التهجين ، انقل جانب الخلايا الزجاجية للغطاء بعناية إلى بئر جديد يحتوي على 1 مل من Wash Buffer A واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. استنشق المخزن المؤقت وأضف 0.5 ميكرولتر من مخزون Hoechst 20 ملي مولار إلى 700 ميكرولتر من Wash Buffer A ؛ احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام.
    6. قم بإزالة محلول Hoechst وأضف 1 مل من Wash Buffer B ؛ احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-5 دقائق. أخيرا ، ضع قطرة صغيرة (10 ميكرولتر) من وسط التثبيت على شريحة مجهرية وقم بتركيب جانب خلايا زجاج الغطاء لأسفل على القطرة. قم بإزالة وسيط التثبيت الزائد برفق وأغلق محيط زجاج الغطاء بطلاء أظافر شفاف.
    7. قم بتخزين الشرائح عند 4 درجات مئوية وانتقل إلى التصوير في أسرع وقت ممكن.
    8. قم بمعالجة الصور باستخدام ImageJ44. قم بتقسيم القنوات وتغيير لوحة الألوان حسب الحاجة.

النتائج

لقد تخيلنا عملية إنشاء الثقافات أحادية النسيلة باستخدام الفحص المجهري الضوئي من يوم تحضير التعليق والطلاء أحادي الخلية (اليوم 0) إلى إنشاء خطوط الخلايا المستمرة (اليوم 45 أو 77 ، الشكل 2). لوحظت العلامات الأولى لانقسام الخلايا في اليوم 3 (بعد 4 أيام من الطلاء ، حيث تم إجراء الطلاء في اليوم 0) عندما كان هناك بالفعل أربع خلايا لكل بئر (الشكل 2). في اليوم 14 ، نمت المستنسخة إما كطبقة أحادية (JW18-B9 و C7 و E5) أو كرة (JW18-G4) ، والتي تعطلت أثناء المرور. في اليوم 28 ، كانت الاختلافات في النمو بين خطوط الخلايا أكثر وضوحا. كانت ثقافة JW18-C7 ملتصقة في اليوم 45 ، بينما تم إنشاء المزارع النسيلة المتبقية فقط في اليوم 77. لقد قمنا أيضا بتصور الثقافات الأربع المختلفة 30 مقطعا بعد التأسيس لالتقاط الاختلافات في أشكال الخلية (الشكل 3).

لتحديد حالة عدوى Wolbachia للمزارع أحادية النسيلة ، أجرينا تفاعل البوليميراز المتسلسل (الشكل 4) و FISH (الشكل 5). لاحظنا أن جميع الاستنساخ باستثناء واحد (JW18-C7) أنتج نطاقا لجين wsp ، مما يدل على عدوى Wolbachia . أكدت FISH نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR): احتفظت المستنسخة JW18-B9 و JW18-E5 و JW18-G4 بعدوى Wolbachia ، بينما لم يكن الاستنساخ JW18-C7 مصابا ب Wolbachia. بشكل عام ، من مجموعة مختلطة من خلايا JW18 ، تمكنا من إنشاء أربع ثقافات نسيلة ، احتفظت ثلاثة منها بعدوى Wolbachia الأصلية. يمكن الوصول إلى البيانات الأولية في Figshare: https://figshare.com/s/15fde47ca7338f31dda9.

figure-results-1
الشكل 1: سير العمل لتوليد الثقافة أحادية النسيلة. (أ) التخفيفات الأولية والثانوية في لوحة 96 بئرا. (ب) خلايا مفردة بعد التخفيف التسلسلي. (C-E) التقدم في تكاثر الخلايا ونقلها من 96 بئر إلى 24 و 6 بئر ، على التوالي. (و) المزارع المستمرة في قوارير زراعة الخلايا 25 سم2 . الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تطور الخطوط النسيلة JW18 من خلية واحدة إلى ثقافة متعددة الخلايا. صور Brightfield للخطوط النسيلة من اليوم 0 (يوم الطلاء) إلى اليوم 77 ، عندما تم إنشاء جميع الخطوط بنجاح في قارورة ثقافة خلية مقاس 25 سم2 . أشرطة المقياس = 25 ميكرومتر (اليوم 0) ، 50 ميكرومتر (اليوم 3) ، 150 ميكرومتر (اليوم 14) ، 300 ميكرومتر (الأيام 28 ، 45 ، 77). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: مورفولوجيا الخطوط النسيلة الفردية JW18. صور Brightfield للخطوط النسيلة تظهر أشكال الخلية عند المرور 30 بعد التأسيس. أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: حالة Wolbachia للثقافات النسيلة التي تم فحصها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تفاعل البوليميراز المتسلسل ل Wolbachia في خط الخلية الأبوية JW18 والخطوط النسيلة JW18-B9 و JW18-C7 و JW18-E5 و JW18-G4 عند المرور 11 بعد التأسيس. يؤكد نطاق Wolbachiawsp وجود Wolbachia ، في حين أن نطاق ذبابة فيلارpl32 هو تفاعل البوليميراز المتسلسل لمراقبة جودة الحمض النووي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: حالة Wolbachia للثقافات النسيلة التي فحصتها FISH. خط الخلية الأبوية JW18 والنسخ JW18-B9 و JW18-C7 و JW18-E5 و JW18-G4 التي تم تصورها بواسطة تلطيخ FISH عند مرور 13 بعد التأسيس. Wolbachia ملطخ بمسبار Quasar 670-tagged 16s rRNA Stellaris FISH في اللون الأرجواني ، والأحماض النووية ملطخة ب Hoechst 33342 في سماوي. أشرطة المقياس = 25 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول التكميلي S1: مجسات قليل النوكليوتيدات المصممة ضد Wolbachia wMel 16S rDNA ومقارنتها بالمجسات التي نشرها Schneider et al.42. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

المناقشة

نحدد هنا طريقة موحدة لتوليد استنساخ أحادي الخلية من خط خلايا JW18 D.melanogaster ، والتي يمكن تطبيقها على ذبابة الفاكهة الأخرى وخطوط خلايا الحشرات. يتضمن البروتوكول التخفيف التسلسلي لتعليق الخلية المحضر عبر صفيحة 96 بئرا لعزل الخلايا الفردية. ثم يتم تحضين هذه الخلايا في ظل الظروف المثلى لإنشاء ثقافات مستمرة. يتضمن البروتوكول أيضا إضافة 20٪ من الوسائط المكيفة لتعزيز بقاء الخلية وانقسام الخلية المفردة45،46.

تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في البروتوكول في التحقق من وجود خلية واحدة في كل بئر بعد التخفيف التسلسلي. تتطلب هذه الخطوة اهتماما دقيقا ، لأنها ضرورية لنجاح البروتوكول بأكمله. لتسهيل التأكيد المستقبلي لأصل الخلية الواحدة ، يوصى بالتقاط صور للآبار المختارة من زوايا مختلفة.

خطوة رئيسية أخرى تتضمن نقل الخلايا بين أطباق الاستزراع. لضمان الإنشاء الناجح للثقافة المستمرة ، يجب نقل الخلايا فقط بمجرد وصولها إلى التقاء. إذا ركود نمو الخلايا لأكثر من أسبوعين ، فإن تحديث الوسائط يمكن أن يعزز المزيد من النمو. قد يؤدي النقل المبكر للخلايا قبل التقاء إلى موت الخلايا.

في حين أن هذا البروتوكول يستغرق وقتا طويلا وكثيف العمالة أكثر من الطرق الأخرى شائعة الاستخدام ، مثل فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) 38،46 ، إلا أنه يوفر العديد من المزايا. وتشمل هذه الفعالية من حيث التكلفة ، والحد الأدنى من مخاطر تلف الخلايا ، وعدم الحاجة إلى علامات الفلورسنت ، والمعدات باهظة الثمن ، ووقت التحسين. بشكل عام ، هذا البروتوكول مناسب تماما لتوليد مجموعات خلايا حشرية متجانسة من خطوط الخلايا المستمرة.

خصائص الثقافات أحادية النسيلة

تظهر نتائجنا أن الثقافات وحيدة النسيلة تختلف من حيث سرعة إنشائها وحالة عدوى Wolbachia (الشكل 2 والشكل 4 والشكل 5). كان الاستنساخ الخالي من Wolbachia JW18-C7 هو الأسرع الذي وصل إلى التقاء في بروتوكول العزل أحادي الخلية الخاص بنا. كان من الممكن أن يكون Wolbachia غائبا دائما عن سلالة الخلية هذه ، أو كان من الممكن أن يكون قد فقد بسبب عدم القدرة على مواكبة معدل انقسام الخلية المضيفة. كان من الممكن أيضا أن يكون قد فقد بسبب كثافة الخلايا المنخفضة الأولية في بروتوكول الاستنساخ الخاص بنا. ومع ذلك ، نظرا لأن هذا لم يحدث لخطوط الخلايا النسيلة الأخرى ، فإننا نعتبر هذا غير مرجح. يمكن أن تجيب العدوى التجريبية ل JW18-C7 ب Wolbachia (جنبا إلى جنب مع المستنسخة الأخرى المعالجة بالتتراسيكلين) عما إذا كان هذا الخط مسموحا به للتعايش.

عدم التجانس الخلوي ليس فريدا من نوعه في خط خلايا JW18 وقد تم الإبلاغ عنه من قبل لخطوط الخلايا الأخرى المصابة ب Wolbachia 32،47،48،49،50،51،52. تضمنت محاولة سابقة لتحسينها نقل Wolbachia من D. simulans البيض أو خلايا Aa23 إلى C7-10 A. albopictus خط الخلية53. تم استنساخ C7-10 قبل سنوات عديدة من عمليات نقل Wolbachia 54،55 ، ولا تشكل عمليات النقل العدوى الطبيعية التي نعتزم دراستها.

يمكن أن يكون للاختلاف في حالة عدوى Wolbachia ووقت إنشاء الثقافة وحيدة النسيلة (يدل على الاختلافات في معدل انقسام الخلايا) لاستنساخ JW18 الفردية آثار عميقة على الدراسات السابقة التي تربط عيار Wolbachia ومعدل نمو خلايا الحشرات استجابة لعلاجات محددة. قد ينتج تغيير أعداد الخلايا أو كثافات التعايش أو التغيرات في التعبير الجيني عند العلاج عن اختيار أنواع الخلايا ذات الخصائص المحددة بدلا من التغييرات في حالة جميع الخلايا في مجموعة مختلطة. وبالتالي فإن إعطاء العلاجات لمجموعة من الخلايا المختلطة مع التباين في الخصائص الرئيسية قد يؤدي إلى نتائج متحيزة وغير قابلة للتكرار.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

نشكر ويليام سوليفان (جامعة كاليفورنيا ، سانتا كروز ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، ولورا سيربوس (جامعة فلوريدا الدولية ، الولايات المتحدة الأمريكية) ولويس تيكسيرا (الجامعة الكاثوليكية البرتغالية ، لشبونة ، البرتغال) على خط خلية JW18 والاقتراحات المفيدة حول كيفية التعامل معه. نحن ممتنون ل Nidhi Krishna Shrivastava (جامعة Jagiellonian ، كراكوف ، بولندا) لاقتراحات مفيدة حول البروتوكول. نشكر يوليا تشيكونوفا (جامعة جاجيلونيان ، كراكوف ، بولندا) على تدقيق المخطوطة.

تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender (Chrostek، E. (2024) https://BioRender.com/o69b306).

يتم دعم هذا العمل من قبل منحة بدء ERC (معرف اتفاقية المنحة: 101040311) الممنوحة إلى EC وزمالة الدكتوراه من كلية الدكتوراه للعلوم الدقيقة والطبيعية (جامعة Jagiellonian) الممنوحة ل NF. ومع ذلك ، فإن الآراء والآراء المعبر عنها هي آراء المؤلفين فقط ولا تعكس بالضرورة آراء الاتحاد الأوروبي أو الوكالة التنفيذية لمجلس البحوث الأوروبي. لا يمكن تحميل الاتحاد الأوروبي ولا السلطة المانحة المسؤولية عنها.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.22 & م حقنة فلتر   ؛  برنامج النقاط التجارية99722عقيم
10x الفوسفات المحلول الملحي (PBS)ثيرموفيشر العلمية70011044عقيم
غطاء زجاجي دائري 12 أو 18 مم   ؛أي علامة تجارية
15 مل أنابيب فالكونجينوبلاست601052عقيم
لوحة 24 بئرسيتو ونCC7682-7524معالجة زراعة الأنسجة
5 µ مرشح حقنة Mواتمان10462000عقيم
لوحة 6 بئرسيتو ونCC7682-7506معالجة زراعة الأنسجة
لوحة 96 بئرسيتو ونCC7682-7596معالجة زراعة الأنسجة
الاغاروزثيرموفيشر العلميةالجولة66501.30
قارورة زراعة الخلية ، 25 سم < سوب>2< / سوب>غرينر بيو ون391-3103عقيم
كاشطات الخلايا   ؛غرينر بيو ون391-3010عقيم
طلاء أظافر شفاف   ؛أي علامة تجارية
قوارير CryoPureسارستيدت72.379عقيم
DMSO ، درجة زراعة الخلاياميركD2650-100 ملعقيم
دريم تاك PCR ماستر ميكسثيرموفيشر العلميةك 1081
إيدتاميرك324503-100 جرامعقيم
مزود طاقة الرحلان الكهربائيميركملاحظة 251-2
Eppendorf  مكثف بلسميركEP5305000509يمكن استخدام مكثف الفراغ من أي علامة تجارية بدلا من ذلك. 
ايثانولميرك1009861000
نظام التصوير EVOS M5000ثيرموفيشر العلميةAMF5000يمكن استخدام المجهر المقلوب لأي علامة تجارية لمراقبة تقدم الاستنساخ. مطلوب مجهر الفلورسنت لتصور FISH. 
مصل الأبقار الجنينيةميركإف 9665معطل الحرارة
الفورمالديهايد ثيرموفيشر العلمية047377.9 لتر
فورماميد  ميركF7503-100ML
خزانات الرحلان الكهربائي الهلاميةكليفر ساينتفيكإم سميدي
تصوير جلبيوراد12009077نظام التصوير الهلامي GelDoc Go
GeneRuler 100 نقطة أساس سلم الحمض النوويثيرموفيشر العلميةسإم0243
كتلة التدفئةثيرموفيشر العلمية88870005
Herasafe 2025 خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانيةثيرموفيشر العلمية51033314يمكن استخدام خزانة السلامة البيولوجية لأي علامة تجارية طالما أنها تحافظ على بيئة معقمة في الداخل.
محلول Hoechst 33342 (20 ملم) 5 ملثيرموفيشر العلمية62249تخزينها في الظلام.
حمض الهيدروكلوريكميرك258148-2.5 لتر
Integra Biosciences Corp  PIPETBOY acu 2 مساعدات الماصةفيشر العلميةNC0085686يمكن استخدام جهاز التحكم في الماصة المصلية لأي علامة تجارية. 
إيزوبوبانولميركI9516-1L
فريزر المختبر  Liebherr  إل جي يو إكس 1500 ميدلاينأي فريزر قادر على الحفاظ على درجة حرارة ثابتة مناسب. 
خزان النيتروجين السائلثيرموفيشر العلميةCY50985
شرائح المجهرميركCLS294875X25-72EA
المياه الجزيئية
ماصة متعددة القنواتإيبندورف3125000036
نانودروببيقلابND-1000
مقياس الخلايا الدموية نيوباورميركBR717810-1EA
بارافيلم   فيلم الختم MميركHS234526B-1EA
حاضنة بلتيير المبردةميميرتIPP55plusأي حاضنة قادرة على الحفاظ على ثابت 25؟ C مناسب. لا يلزم التحكم في ثاني أكسيد الكربون 2< / sub> لخط خلية JW18 أو نسخه.
الفينول / الكلوروفورم / كحول الأيزوميل (25:24:1)ثيرموفيشر العلمية327115000
طقم ماصاتإيبندورفEP2231300008
أسيتات البوتاسيومميركP1190-500Gعقيم
كوازار  670 موسومة 16s مسبار السمكة الحمض النووي الريبي الريبي   ؛ جبرتقنيات البحث الحيويحسب الطلب ، يمكن العثور على تسلسلات المجسات في الجدول 1.  ؛
جهاز طرد مركزي دقيق مبردلابنتطراز C2500-R
rpl32 التمهيدي إلى الأمام 5'-CCGCTTCAAGGGACAGTATC-3'علم الجينوم Eurofinsمصنوع حسب الطلب بناء على المرجع المذكور في الورقة
RPL32 التمهيدي العكسي 5'-CAATCTCCTTGCGCTTCTTG-3'علم الجينوم Eurofinsمصنوع حسب الطلب بناء على المرجع المذكور في الورقة
الحزب الديمقراطي الصربيثيرموفيشر العلميةAM9823عقيم
الماصات المصليةكورنينج357771
الدروع وسانغ M3 الحشرات المتوسطةميركS8398عقيم
Stellaris RNA FISH Hybridization Buffer   تقنيات البحث الحيويSMF-HB1-10عقيم
Stellaris RNA FISH Wash Buffer A      تقنيات البحث الحيويإس إم إف-WA1-60عقيم
Stellaris RNA FISH Wash Buffer B      تقنيات البحث الحيويSMF-WB1-20عقيم
خزانات الكاشف المعقمة  ثيرموفيشر العلمية8094عقيم
المخزن المؤقت TAEميرك10617410001x  
مخزن TE المؤقت  ميرك93283عقيم
دورة حراريةسينجين للتكنولوجيا الحيويةثيرموبلوك 96يمكن استخدام التدوير الحراري لأي علامة تجارية بدلا من ذلك.
قاعدة تريسميرك10708976001عقيم
فريزر درجة حرارة منخفضة للغايةمؤسسة الرعاية الصحية الأولية MDF-DU502VH-PEأي فريزر مختبر قادر على الحفاظ على -80؟ يمكن استخدام C.
Vectashield تصاعد متوسط     مختبرات ناقلاتإتش-1000-10
wsp التمهيدي إلى الأمام 5'-TGGTCCAATAAGTGATGAGAAAC-3'علم الجينوم Eurofinsمصنوع حسب الطلب بناء على المرجع المذكور في الورقة
wsp التمهيدي العكسي 5'-AAAAATTAAACGCTACTCCA-3 'علم الجينوم Eurofinsمصنوع حسب الطلب بناء على المرجع المذكور في الورقة

المراجع

  1. Luhur, A., Klueg, K. M., Zelhof, A. C. Generating and working with Drosophila cell cultures: current challenges and opportunities. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 8 (3), e339(2019).
  2. Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. How many species are infected with Wolbachia? A statistical analysis of current data. FEMS Microbiol Lett. 281 (2), 215-220 (2008).
  3. Zug, R., Hammerstein, P. Still a host of hosts for Wolbachia: analysis of recent data suggests that 40% of terrestrial arthropod species are infected. PLoS One. 7 (6), e38544(2012).
  4. Weinert, L. A., Araujo-Jnr, E. V., Ahmed, M. Z., Welch, J. J. The incidence of bacterial endosymbionts in terrestrial arthropods. Proc R Soc B. 282 (1807), 20150249(2015).
  5. Hoffmann, A. A., Turelli, M. Unidirectional incompatibility in Drosophila simulans: inheritance, geographic variation and fitness effects. Genetics. 119 (2), 435-444 (1988).
  6. O'Neill, S. L., Giordano, R., Colbert, A. M., Karr, T. L., Robertson, H. M. 16S rRNA phylogenetic analysis of the bacterial endosymbionts associated with cytoplasmic incompatibility in insects. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (7), 2699-2702 (1992).
  7. Stouthamer, R., Breeuwer, J. A. J., Luck, R. F., Werren, J. H. Molecular identification of microorganisms associated with parthenogenesis. Nature. 361 (6407), 66-68 (1993).
  8. Rousset, F., Bouchon, D., Pintureau, B., Juchault, P., Solignac, M. Wolbachia endosymbionts responsible for various alterations of sexuality in arthropods. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 250 (1328), 91-98 (1992).
  9. Hedges, L. M., Brownlie, J. C., O'Neill, S. L., Johnson, K. N. Wolbachia and virus protection in insects. Science. 322 (5902), 702(2008).
  10. Teixeira, L., Ferreira, Á, Ashburner, M. The bacterial symbiont Wolbachia induces resistance to RNA viral infections in Drosophila melanogaster. PLoS Biol. 6 (12), e1000002(2008).
  11. Glaser, R. L., Meola, M. A. The native Wolbachia endosymbionts of Drosophila melanogaster and Culex quinquefasciatus increase host resistance to West Nile virus infection. PLoS One. 5 (8), e11977(2010).
  12. van den Hurk, A. F., et al. Impact of Wolbachia on infection with chikungunya and yellow fever viruses in the mosquito vector Aedes aegypti. PLoS Negl Trop Dis. 6 (11), e1892(2012).
  13. Aliota, M. T., et al. The wMel strain of Wolbachia reduces transmission of chikungunya virus in Aedes aegypti. PLoS Negl Trop Dis. 10 (4), e0004677(2016).
  14. Kean, J., et al. Fighting arbovirus transmission: natural and engineered control of vector competence in Aedes mosquitoes. Insects. 6 (1), 236-278 (2015).
  15. Joubert, D. A., et al. Establishment of a Wolbachia superinfection in Aedes aegypti mosquitoes as a potential approach for future resistance management. PLoS Pathog. 12 (2), e1005434(2016).
  16. Ross, P. A. Designing effective Wolbachia release programs for mosquito and arbovirus control. Acta Trop. 222, 106045(2021).
  17. Flores, H. A., O'Neill, S. L. Controlling vector-borne diseases by releasing modified mosquitoes. Nat Rev Microbiol. 16 (8), 508-518 (2018).
  18. Pannebakker, B. A., Loppin, B., Elemans, C. P. H., Humblot, L., Vavre, F. Parasitic inhibition of cell death facilitates symbiosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (1), 213-215 (2007).
  19. Hosokawa, T., Koga, R., Kikuchi, Y., Meng, X. -Y., Fukatsu, T. Wolbachia as a bacteriocyte-associated nutritional mutualist. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 769-774 (2010).
  20. Zheng, Y., et al. Differentially expressed profiles in the larval testes of Wolbachia-infected and uninfected Drosophila. BMC Genomics. 12 (1), 595(2011).
  21. Xi, Z., Gavotte, L., Xie, Y., Dobson, S. L. Genome-wide analysis of the interaction between the endosymbiotic bacterium Wolbachia and its Drosophila host. BMC Genomics. 9 (1), 1(2008).
  22. Lindsey, A. R. I., Bhattacharya, T., Hardy, R. W., Newton, I. L. G. Wolbachia and virus alter the host transcriptome at the interface of nucleotide metabolism pathways. mBio. 12 (1), e03472-e03520 (2021).
  23. Detcharoen, M., Schilling, M. P., Arthofer, W., Schlick-Steiner, B. C., Steiner, F. M. Differential gene expression in Drosophila melanogaster and D. nigrosparsa infected with the same Wolbachia strain. Sci Rep. 11 (1), 11336(2021).
  24. Gruntenko, N. E., et al. Drosophila melanogaster transcriptome response to different Wolbachia strains. Int J Mol Sci. 24 (24), 17411(2023).
  25. Frantz, S. I., Small, C. M., Cresko, W. A., Singh, N. D. Ovarian transcriptional response to Wolbachia infection in D. melanogaster in the context of between-genotype variation in gene expression. G3 (Bethesda). 13 (5), jkad047(2023).
  26. McMeniman, C. J., et al. Host adaptation of a Wolbachia strain after long-term serial passage in mosquito cell lines. Appl Environ Microbiol. 74 (22), 6963-6969 (2008).
  27. Woolfit, M., et al. Genomic evolution of the pathogenic Wolbachia strain, wMelPop. Genome Biol Evol. 5 (11), 2189-2204 (2013).
  28. Martinez, J., Sinkins, S. P. Rapid evolution of Wolbachia genomes in mosquito cell culture. bioRxiv. , (2023).
  29. Serbus, L. R., et al. A cell-based screen reveals that the albendazole metabolite, albendazole sulfone, targets Wolbachia. PLoS Pathog. 8 (9), e1002922(2012).
  30. Grobler, Y., et al. Whole genome screen reveals a novel relationship between Wolbachia levels and Drosophila host translation. PLoS Pathog. 14 (11), e1007445(2018).
  31. Rainey, S. M., et al. Wolbachia blocks viral genome replication early in infection without a transcriptional response by the endosymbiont or host small RNA pathways. PLoS Pathog. 12 (4), e1005536(2016).
  32. O'Neill, S. L., et al. In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line. Insect Mol Biol. 6 (1), 33-39 (1997).
  33. Fenollar, F., Maurin, M., Raoult, D. Wolbachia pipientis growth kinetics and susceptibilities to 13 antibiotics determined by immunofluorescence staining and real-time PCR. Antimicrob Agents Chemother. 47 (5), 1665-1671 (2003).
  34. Fallon, A. M., Witthuhn, B. A. Proteasome activity in a naïve mosquito cell line infected with Wolbachia pipientis wAlbB. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 45 (8), 460-466 (2009).
  35. Molloy, J. C., Sommer, U., Viant, M. R., Sinkins, S. P. Wolbachia modulates lipid metabolism in Aedes albopictus mosquito cells. Appl Environ Microbiol. 82 (10), 3109-3120 (2016).
  36. Andrianov, B. V., Goriacheva, I. I., Alexandrov, I. D., Gorelova, T. V. Establishment of a new continuous cell line of Drosophila melanogaster strain infected by the intracellular endosymbiotic bacterium Wolbachia pipientis under natural conditions. Russ J Genet. 46 (1), 9-12 (2010).
  37. Fattouh, N., Cazevieille, C., Landmann, F. Wolbachia endosymbionts subvert the endoplasmic reticulum to acquire host membranes without triggering ER stress. PLoS Negl Trop Dis. 13 (3), e0007218(2019).
  38. Fredericks, A. C., et al. Aedes aegypti (Aag2)-derived clonal mosquito cell lines reveal the effects of pre-existing persistent infection with the insect-specific bunyavirus Phasi Charoen-like virus on arbovirus replication. PLoS Negl Trop Dis. 13 (11), e0007346(2019).
  39. Kirby, K. S. A new method for the isolation of ribonucleic acids from mammalian tissues. Biochem J. 64 (3), 405-408 (1956).
  40. Zhou, W., Rousset, F., O'Neill, S. Phylogeny and PCR–based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 265 (1395), 509-515 (1998).
  41. Chrostek, E., et al. Wolbachia variants induce differential protection to viruses in Drosophila melanogaster: a phenotypic and phylogenomic analysis. PLoS Genet. 9 (12), e1003896(2013).
  42. Schneider, D. I., Parker, A. G., Abd-alla, A. M., Miller, W. J. High-sensitivity detection of cryptic Wolbachia in the African tsetse fly (Glossina spp). BMC Microbiol. 18 (S1), 140(2018).
  43. Stellaris RNAFISH protocol for adherent cells. , LGC Biosearch Technologies. https://biosearchassets.biosearchtech.com/assetsv6/bti_stellaris_protocol_adherent_cell.pdf (2021).
  44. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  45. Freshney, I. Cloning and selection. Culture of Animal Cells: a Manual of Basic Technique. , 207(2010).
  46. Housden, B. E., et al. Identification of potential drug targets for tuberous sclerosis complex by synthetic screens combining CRISPR-based knockouts with RNAi. Sci Signal. 8 (393), (2015).
  47. Fenollar, F., et al. Culture and phenotypic characterization of a Wolbachia pipientis isolate. J Clin Microbiol. 41 (12), 5434-5441 (2003).
  48. Dobson, S. L., Marsland, E. J., Veneti, Z., Bourtzis, K., O'Neill, S. L. Characterization of Wolbachia host cell range via the in vitro establishment of infections. Appl Environ Microbiol. 68 (2), 656-660 (2002).
  49. Frentiu, F. D., Robinson, J., Young, P. R., McGraw, E. A., O'Neill, S. L. Wolbachia-mediated resistance to dengue virus infection and death at the cellular level. PLoS One. 5 (10), e13398(2010).
  50. Voronin, D. A., Bochernikov, A. M., Baricheva, E. M., Zakharov, I. K., Kiseleva, E. V. Influence of Drosophila melanogaster genotype on biological effects of endosymbiont Wolbachia (stamm wMelPop). Tsitologiia. 51 (4), 335-345 (2009).
  51. Venard, C. M. -P., Crain, P. R., Dobson, S. L. SYTO11 staining vs FISH staining: a comparison of two methods to stain Wolbachia pipientis in cell cultures. Lett Appl Microbiol. 52 (2), 168-176 (2011).
  52. Casper-Lindley, C., et al. Rapid fluorescence-based screening for Wolbachia endosymbionts in Drosophila germ line and somatic tissues. Appl Environ Microbiol. 77 (14), 4788-4794 (2011).
  53. Khoo, C. C. H., Venard, C. M. P., Fu, Y., Mercer, D. R., Dobson, S. L. Infection, growth and maintenance of Wolbachia pipientis in clonal and non-clonal Aedes albopictus cell cultures. Bull Entomol Res. 103 (3), 251-260 (2013).
  54. Singh, K. R. P. Cell cultures derived from larvae of Aedes albopictus (Skuse) and Aedes aegypti (L.). Curr Sci. 36 (19), 506-508 (1967).
  55. Nouri, N., Fallon, A. M. Pleiotropic changes in cycloheximide-resistant insect cell clones. In Vitro Cell Dev Biol. 23 (3), 175-180 (1987).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مزارع الخلايا أحادية النسيلةعدوى الولباكيا (Wolbachia)خلايا دروزوفيلا JW18استنساخ الخلايا المفردةالخطوط الخلوية النسليةالوسط المكيفتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)تحليل التهجين الموضعي المتألق (FISH)مورفولوجيا الخلاياالمتعايش داخل الخلايا
توليد الثقافات وحيدة النسيلة من ذبابة الفاكهة السوداء JW18 المصابة بالوولباخيا
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.