مقالة منهجية

التعديل الأنزيمي وتقييم قياس التدفق الخلوي للبروتينات المعروضة على سطح الخميرة

DOI:

10.3791/68208

⸱

مايو 30, 2025

 ,  , 
1Department of Chemical, Biological, and Materials Engineering, University of South Florida

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم بروتوكولا لاستخدام ركائز الخميرة المعروضة على سطح الخميرة لمقايسات التعديل الأنزيمي. تم عرض المنصة باستخدام تحليل نشاط إزالة الفسفرة من التيروزين فوسفاتيز SHP-2 ضد إحدى ركائزها كمقايسة تعديل إنزيمي تمثيلي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عرض سطح الخميرة هو استراتيجية ربط النمط الجيني والنمط الظاهري التي تمكن الفحص عالي الإنتاجية لوظيفة البروتين. تقليديا ، تم تطبيق عرض سطح الخميرة على تطور بروتينات ربط جديدة ، مع استخدام قياس التدفق الخلوي لتقييم وفرز مستويات قوة الارتباط. في الآونة الأخيرة ، كان هناك اهتمام متزايد بتطبيق عرض سطح الخميرة لفحص التعديل الأنزيمي لمتغيرات الركيزة ، مع تعديلات مضافة (على سبيل المثال ، الفسفرة) أو طرحها (على سبيل المثال ، تحلل البروتين) توفر نمطا ظاهريا يمكن قراءته عن طريق قياس التدفق الخلوي. يتم تطبيق هذه التعديلات بانتظام باستخدام التوطين المشترك داخل الخلايا ، ولكن القدرة على تحقيق تعديل إنزيمي خارج الخلية للركائز المعروضة يمكن أن تفتح العديد من ردود الفعل على التحقيق. هنا ، نصف تقنيات تصميم وتطبيق فحوصات الفحص للتعديل الأنزيمي خارج الخلية على الركائز المرشحة المعروضة على سطح الخميرة والتقييم اللاحق باستخدام تحليل قياس التدفق الخلوي. نحن نقدم هذه البروتوكولات في سياق الخميرة التي تزيل الفسفرة الفوسفاتيز التي تحتوي على بقايا التيروزين الفسفرة ونعلق على كيفية تكييف هذا الإطار المطبق لتطوير فحوصات الفحص لأزواج الركيزة الإنزيمية الأخرى.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبح فهم التفاعلات بين الإنزيمات وأهدافها مجالا بحثيا مثيرا للاهتمام بشكل متزايد نظرا لضرورته في التوصيف البيولوجي للمسارات التي تتحكم في التوازن الخلوي وتطور المرض1،2. الإنزيمات مسؤولة عن تحفيز العديد من التفاعلات التي تحافظ على الحياة البيولوجية ، والتحكم في المسارات الضرورية مثل التمثيل الغذائي الخلوي3،4 ، والإشارات5 ، وحتى العمليات الأساسية مثل إصلاح الجينوم6،7. نظرا لدورها في هذه العمليات ، تلعب تفاعلاتها أيضا دورا في تطور العديد من الأمراض ، حيث يمكن أن تسبب الانحرافات في نشاطها خللا شديدا في نشاط الخلية ، مما يتسبب في موت الخلايا المبرمج أو تكاثر الخلايا السرطانية الضارة2. كان لدراسة النشاط الأنزيمي تطبيقات مهمة في تطوير علاجات جديدة8،9 ، مما يتطلب فحوصات مصممة خصيصا لكل تفاعل إنزيم وركيزةمحددة 10. تم إنشاء فحوصات إنزيمية متعددة كبروتوكولات قياسية لتقييم وتوصيف هذه التفاعلات. تصنف المقايسات التي تم تطويرها لتحليل التفاعلات الأنزيمية إلى فحوصات الكشف التي تراقب الارتباط للتنشيط / التثبيط11 أو المقايسات التي تراقب تعديل الركيزة بواسطة الإنزيمات12.

أحد الأدوار الرئيسية للإنزيمات هو تنظيم سلوك الخلية. نقل الإشارة ، الاستجابة داخل الخلايا للخلية إلى مشغل خارج الخلية13 ، هو المسؤول عن بقاء الخلية ووظائفها. يتضمن تكاثر الخلايا والتمايز والعديد من العمليات الوظيفية الأخرى مسارات إشارات مع تفاعلات إنزيمية تحكمها14،15. تحفز الإنزيمات تعديلات ما بعد الترجمة ، والتي غالبا ما تعدل شبكات الإشارات الضخمة المسؤولة عن النقل الصحيح للرسائل خارجالخلية 16. فسفرة البروتين هي التعديل الأكثر شيوعا بعد الترجمة ، وهي موجودة في كل مكان في إشارات الخلية والعديد من المسارات الخلوية الأخرى. وبالتالي ، ظهرت كينازات البروتين كنسبة كبيرة من الأهداف العلاجية المحتملة نظرا لدورها التنظيمي الحاسم17. الفوسفاتيز هي الجزيئات المعدلة الطبيعية لمجمعات إشارات الخلية القائمة على الفوسفات18،19 ، ولديها القدرة على إزالة بقايا الفوسفات من البروتينات المستهدفة20. في العقد الماضي ، أصبحت الفوسفاتيز هدفا علاجيا رئيسيا لعلاج السرطان21 والأمراض الالتهابية22 بناء على مشاركتها في تنظيم مسارات الإشارات النهائية في أنواع متعددة من الخلايا. توفر كينازات البروتين والفوسفاتيز معا اتساعا من التفاعلات ، والتي يمكن دراستها من خلال تطوير بروتوكولات فحص إنزيمية محددة.

تم استخدام عرض سطح الخميرة كأداة لتوصيف وتقييم النشاط الأنزيمي23،24. يوفر منصة عالية الإنتاجية لفحص عمليات التعديل اللاحق للترجمة عند دمجها مع استراتيجيات عزل الشبكة الإندوبلازمية25،26. يسمح ذلك بتحديد موقع أزواج ركيزة كيناز والاحتفاظ بها في الشبكة الإندوبلازمية من خلال الارتباط بمستقبلات KDEL27 ، حيث يمكن أن تحدث فسفرة الركيزة بمعدلات متزايدة بسبب القرب بين الكينازات وأهدافها. يتم التوسط في ارتباط مستقبلات KDEL بواسطة تسلسل الاحتفاظ بالشبكة الإندوبلازمية FEHDEL الطرفية C الذي ثبت أنه يتمتع بقدرة احتفاظ أقوى من تسلسلات HDEL الأخرى25،28. ثم يتم تثبيت الركيزة الفسفرة على سطح الخميرة لتقييمها اللاحق من خلال قياس التدفقالخلوي 29. حاليا ، لا توجد بروتوكولات قابلة للتعميم تم إنشاؤها للتعديل الأنزيمي للركائز المعروضة على سطح الخميرة. نقوم بالتوسع في قدرات عرض سطح الخميرة من خلال الاستفادة من متغيرات الركيزة الفسفرية المعبر عنها خارج الخلية وتعديلها من خلال إزالة الفسفرة بواسطة الفوسفاتيز المعروف. يوفر تحليل قياس التدفق الخلوي بعد ذلك منصة لتقييم النمط الظاهري للركائز المذكورة أعلاه من خلال قياس التغيرات في وسيط الفسفرة نتيجة للحضانة مع الفوسفاتيز المعروف. يوفر هذا طريقة قابلة للتكيف للتعديل اللاحق للترجمة للبروتينات المعروضة على السطح مع توفير طريقة لتحليل التعديل الأنزيمي للتفاعلات عند استخدام منصة عرض سطح الخميرة.

نقدم تقنيات لتطوير وتطبيق مقايسة التعديل الأنزيمي التي تصف إدخال تفاعل ركيزة كيناز في منصة عرض سطح الخميرة ، والحضانة المشتركة للركيزة الفسفرية المعبر عنها مع الفوسفاتيز المؤتلف ، والتحليل اللاحق لنشاط إزالة الفسفرة من خلال قياس التدفق الخلوي. في هذا التقرير ، يتم تحقيق ذلك من خلال المشاركة في تحديد المجال السيتوبلازمي ل CD28 مع كيناز الخلايا الليمفاوية (LCK) في الشبكة الإندوبلازمية للخميرة ، متبوعا بعرض CD28 الفسفوري على سطح الخميرة وإزالة الفسفرة اللاحقة بواسطة منطقة تماثل Src 2 المحتوية على مجال الفوسفاتيز -2 (SHP-2). يستخدم الجسم المضاد للفوسفوتيروزين (في هذه الدراسة ، 4G10) ، والذي يكتشف بقايا التيروزين الفسفرية في مجموعة متنوعة من تسلسلات الببتيد ، لتحديد مستوى الفسفرة كدالة لمعالجة الفوسفاتيز. توفر العملية التفصيلية نهجا قابلا للتعميم للتحقيق في تفاعلات الإنزيم والركيزة. طريقة مستقبلية لدراسة الإنزيمات والركائز بطريقة نقية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. نمو خلايا الخميرة التي تحتوي على البلازميد وتحريض تعبير البروتين

  1. باتباع الوصفة الموضحة في الجدول 1 ، قم بإعداد الوسائط المطلوبة لنمو الخميرة غير المحتوية على البلازميد (YPD) ونمو خلايا الخميرة المحتوية على البلازميد (SD-CAA) وتحريض تعبير البروتين (SRG-CAA) بالإضافة إلى لوحات SD-CAA.
  2. قم بتحويل الحمض النووي البلازميد لعرض الخميرة الذي يحتوي على زوج ركيزة كيناز إلى خلايا خميرة EBY-100 من خلال الطريقة القائمة على كاتيونالليثيوم 30،31 ، والتي يتم اعتمادها بشكل شائع للاستخدام في مجموعات تحويل الخميرة من مجموعة متنوعة من الشركات المصنعة.
    ملاحظة: يمكن استخدام التثقيب الكهربائي32 أو غيرها من تقنيات تحويل بلازميد الخميرة المفضلة اعتمادا على بنية البلازميد التي يتم تحويلها.
  3. قم بإعداد أنبوب استزراع سعة 14 مل مع 10 مل من وسائط YPD. تلقيح خلايا EBY-100 وتنمو في حاضنة اهتزاز عند 30 درجة مئوية ، 300 دورة في الدقيقة حتى تصل المزرعة إلى كثافة بصرية (OD600nm) من 0.8-1.0 (8 × 106- 1 × 107 خلايا / مل).
    ملاحظة: يتم قياس OD600nm عن طريق تحضير 3 مل من الكوفيتات التي تحتوي على 1:10 تخفيفات من مزارع الخميرة في الوسائط الخاصة بها و 3 مل من الكوفيتات الفارغة التي تحتوي على الوسائط المستخدمة في تخفيف العينات. يتم استخدام برنامج OD600nm على مقياس الطيف الضوئي لقياس الكوفيت الفارغ أولا ، ثم كل كوفيت عينة عن طريق ضبط التخفيف المقابل المحضر لكل عينة. 1 OD600nm يتوافق مع 1 × 107 خميرة / مل.
  4. احصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي للثقافة عند 1,000 × جم لمدة 3 دقائق ، واغسلها بمحلولالغسيل الأول الموجود في مجموعة تحويل الخميرة ، أو TE (10 ملي مولار Tris-HCl و 1.0 ملي EDTA)31.
  5. قم بتكبيل الخلايا مرة أخرى عند 1,000 × جم لمدة 3 دقائق وأعد تعليقها في 1 مل من المخزن المؤقت للتحويل الموجود في مجموعة تحويل الخميرة ، أو الماء المعقم. يجب تقسيم الخلايا إلى 50 ميكرولتر ويمكن تخزينها عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  6. لتحويل البلازميد ، يتم تحضير حصة واحدة لكل بلازميد وإذابتها على الجليد ، ثم تتم إضافة 0.5-1.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد الذي يحتوي على بنية عرض الخميرة مباشرة إلى الخلايا. تمت إضافة 0.5 مل من محلول التحويل المقدم في مجموعة تحويل الخميرة ، أو 0.5 مل من محلول بولي إيثيلين جلايكول معقم بنسبة 50٪ ومحلول LiOAc0.1 M 31. امزج خليط الخلايا والحمض النووي البلازميد ومحلول التحويل جيدا عن طريق سحب العينات.
  7. احتضان خليط التحويل بشكل ثابت لمدة 30-60 دقيقة عند 30 درجة مئوية ، خليط الدوامة على فترات 15 دقيقة. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 1,000 × جم لمدة 3 دقائق.
  8. قم بإعداد أنبوب استزراع سعة 14 مل مع 4.5 مل من وسائط SD-CAA. أعد تعليق الخلايا التي تحتوي على البلازميد المطلوب في 500 ميكرولتر من SD-CAA وتلقيح 4.5 مل المحضر.
  9. مع الحرص على عدم اختراق الأجار ، قم بتوزيع 50 ميكرولتر من 5 مل من الثقافة الملقحة على لوحة SD-CAA واحتضانها بشكل ثابت عند 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة لتحديد كفاءة التحول.
  10. احتضان 5 مل من ثقافة خلايا SD-CAA في حاضنة اهتزاز عند 30 درجة مئوية ، 300 دورة في الدقيقة لمدة 18 ساعة على الأقل. مراقبة الكثافة البصرية (OD600nm) بعد 16 ساعة و 20 ساعة. بمجرد أن تنمو العينة إلى كثافة بصرية كافية لا تتجاوز 6 ، قم بالطرد المركزي للثقافة لمدة 3 دقائق عند 2,500 × جم. تخلص من المادة الطافية دون إزعاج حبيبات الخميرة.
  11. أعد تعليق حبيبات الخميرة في SRG-CAA إلى ODنهائي 600 نانومتر أقل من 1 (<1 ×10 7 خميرة / مل).
  12. احتضان استزراع الخميرة في حاضنة اهتزاز عند 30 درجة مئوية ، 300 دورة في الدقيقة لمدة 8 ساعات على الأقل ولكن ليس أكثر من 24 ساعة.
    ملاحظة: يمكن أن يختلف تحريض تعبير البروتين في خلايا الخميرة في أي مكان من 20-37 درجة مئوية. 30 درجة مئوية مناسبة لتخليق أزواج كيناز / الركيزة29،33 ولكن يمكن تعديلها إذا لزم الأمر للبروتينات المحددة التي تتم دراستها.
  13. قم بقياس OD600 نانومتر لتحديد كثافة الخلية.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول في هذه المرحلة عن طريق تخزين مزارع الخميرة عند 4 درجات مئوية.

2. البيوتينيل للجسم المضاد 4G10 المضاد للفوسفوتيروزين

  1. أعد تعليق قارورة 2 مجم من PEG4-NHS-Biotin إلى تركيز نهائي يبلغ 5 ملي مولار عن طريق إضافة 680 ميكرولتر من PBS المعقم.
    ملاحظة: يجب أن يتم إعادة تعليق PEG4-NHS-Biotin طازجا مباشرة قبل إجراء تفاعل البيوتينيل. تحلل NHS في محلول مائي. يعد استخدام PBS والقوارير المعقمة أمرا مهما لإعداد الكواشف للتخزين طويل الأجل ولاستخدامها في المقايسات القائمة على الخلايا للتخفيف من أي آثار محتملة للملوثات على صلاحية الكاشف أو المقايسات الحساسة التي يتم إجراؤها.
  2. بناء على تركيز الجسم المضاد 4G10 ، أضف 100 ميكروغرام من الجسم المضاد إلى قارورة معقمة سعة 1.7 مل.
  3. أضف 1 ميكرولتر من 5 ملي مولار PEG4-NHS-Biotin المحضر من الخطوة 2.1 إلى القارورة التي تحتوي على 100 ميكروغرام من الجسم المضاد 4G10 لتحقيق نسبة مولية من البيوتين إلى الجسم المضاد 7.5: 1. ماصة الخليط برفق لتجانس التفاعل.
  4. احتضان التفاعل في درجة حرارة الغرفة مع دوران مستمر لمدة 2 ساعة على الأقل.
  5. اتبع بروتوكول الشركة المصنعة لأعمدة تحلية الدوران 0.5 مل لتبادل المخزن المؤقت من 4G10 البيوتينيل (B-4G10) إلى PBS.
    ملاحظة: تستخدم أعمدة تحلية المياه ذات الحد الأقصى للوزن الجزيئي (MWCO) البالغ 7 كيلو دالتون بشكل شائع لبيوتينيل الأجسام المضادة للسماح بإزالة البيوتين غير المتفاعل والجزيئات الصغيرة الأخرى مع الاحتفاظ بالجسم المضاد الأكبر.
  6. تمييع الجسم المضاد B-4G10 إلى تركيز نهائي قدره 1 ميكرومتر في PBSA (PBS مع 1 جم / لتر من زلال مصل الأبقار). قم بتقسيم الجسم المضاد B-4G10 إلى أحجام أصغر لمنع دورات التجميد / الذوبان المتكررة.
    ملاحظة: يمكن تخزين الأجسام المضادة البيوتينيل عند 4 درجات مئوية للاستخدام اليومي لمدة تصل إلى 3 أشهر دون فقدان الكفاءة الكبيرة. قم بتخزين باقي الكميات غير المستخدمة عند -20 درجة مئوية لمدة أقصاها 2 سنوات.

3. إزالة الفسفرة من الركائز المعبر عنها على سطح خلية الخميرة

  1. قم بإعداد حل المخزن المؤقت للعمل 2x كما هو موضح سابقا في الأدبيات34.
    ملاحظة: يوصى ب 2x لتسهيل قياس المكونات المطلوبة.
  2. قم بإعداد مخزن العمل المؤقت للعينات في قارورة سعة 1.7 مل عن طريق تخفيف محلول العازلة 2x المحضر في الخطوة 3.1 1: 2 في الماء منزوع الأيونات.
    ملاحظة: سيكون إجمالي حجم التفاعل لكل عينة 20 ميكرولتر ، وستتطلب كل عينة ما بين 10 ميكرولتر و 18 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعمل. قم بإعداد مخزن مؤقت كاف لجميع العينات أو الضوابط.
  3. بعد تحضير العينة الموصى به الموضح في الجدول 2 ، قم بتسمية قوارير سعة 1.7 مل مع اسم التحكم أو العينة المقابلة.
  4. استنادا إلى OD600nm المقاس في الخطوة 1.9 ، احسب حجم الثقافة اللازمة لاستعادة مليوني (2 × 106) خلية خميرة من ثقافة الخميرة المقابلة لكل عينة.
  5. أضف حجم زراعة الخميرة المحسوبة في الخطوة السابقة في قارورة 1.7 مل لكل عينة.
  6. جهاز الطرد المركزي القارورة لمدة 1 دقيقة عند 4,500 × جم. قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة دقيقة وتخلص منها كنفايات خطرة بيولوجيا.
  7. أعد تعليق الخلايا المحببة في 1 مل من PBSA وكرر الخطوة 3.6.
    ملاحظة: من المهم إزالة أكبر قدر ممكن من المواد الطافية دون إزعاج الخلايا المحببة.
  8. بناء على تركيز مخزونه ، احسب حجم SHP-2 البشري المؤتلف المطلوب للحصول على تركيز نهائي يبلغ 1,000 نانومتر في حجم تفاعل إجمالي يبلغ 20 ميكرولتر.
    ملاحظة: يجب أن يتم اقتباس SHP-2 المؤتلف بكميات صغيرة بحيث لا يمر أي بروتين مستخدم في كل اختبار بأكثر من دورتين من دورات التجميد والذوبان. يجب التخلص من أي بقايا SHP-2 من الاقتباس بعد إعداد جميع العينات للفحص.
    يمكن أن تختلف تركيزات مخزون الإنزيمات المؤتلفة اعتمادا على رقم الدفعة. عادة ما يتم صياغة SHP-2 المؤتلف بتركيز مخزون 0.2-0.4 مجم / مل. بالنسبة لتركيز المخزون 0.324 مجم / مل SHP-2 ، فإن هذا يتوافق مع تركيز مخزون يبلغ 4.696 ميكرومتر (SHP-2 له وزن جزيئي يبلغ 69 كيلو دالتون). ينتج عن 4.26 ميكرولتر من مخزون SHP-2 في تفاعل 20 ميكرولتر تركيز تفاعل نهائي يبلغ 1,000 نانومتر SHP-2.
  9. أضف 7.7 مجم من DTT إلى 10 مل من الماء منزوع الأيونات المحضر في شكل مخروطي سعة 15 مل لإنشاء محلول DTT سعة 5 ملم. إذا كانت قيود المعدات تجعل من الصعب وزن المليغرام ، أضف 0.77 جم من DTT إلى 10 مل من الماء منزوع الأيونات ، ثم قم بإجراء تخفيف 100x لإنشاء محلول DTT 5 ملي متر المستخدم في الفحص.
    ملاحظة: يمكن تحضير محلول DTT في محاليل مخزون عالي التركيز لتخفيفها إلى 5 ملي مولار إذا لم يكن من الممكن قياس كميات مقياس مليغرام باستخدام المعدات المتاحة. يحتاج محلول DTT إلى التحضير لإعادة تعليق الخلية السابقة الطازجة في عازلة العمل نظرا لميله إلى التحلل المائي ، مما يجعله غير مستقر على مدى فترات طويلة عند تخفيفه في الماء.
  10. أعد تعليق الخلايا المحببة في مخزن العمل المعد في الخطوة 3.2 بحيث يكون حجم التفاعل النهائي في كل عينة أو عنصر تحكم 20 ميكرولتر.
    ملاحظة: يجب حساب كمية المخزن المؤقت للعمل المضاف بناء على كمية DTT (2 ميكرولتر) و SHP-2 (المحسوبة في الخطوة 3.8) التي ستكون في كل عينة.
  11. أضف 2 ميكرولتر من محلول DTT 5 ملي المحضر في الخطوة 3.9 إلى كل عينة أو عنصر تحكم للحصول على تركيز تفاعل نهائي يبلغ 0.5 ملي مولار DTT.
  12. أضف حجم SHP-2 المحسوب في الخطوة 3.8 إلى كل عينة للحصول على حجم نهائي قدره 20 ميكرولتر واخلطه برفق باستخدام ماصة دقيقة.
  13. لف أغطية قارورة العينة في بارافيلم لمنع التسرب أو التلوث المتبادل.
  14. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين على دوار بسرعة ثابتة.
  15. قم بإزالة العينات من الدوار وأوقف التفاعل بإضافة 1 مل من PBSA إلى كل عينة.
  16. كرر الخطوة 3.6.

4. وضع العلامات على الخلايا وتحليل قياس التدفق الخلوي للركائز منزوعة الفسفرة

  1. أعد تعليق العينات من الخطوة 3.16 في مزيج 20 ميكرولتر من الكواشف الأولية المقابلة لها كما هو موضح في الجدول 2. احتضان العينات لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: تم حساب جميع تركيزات الكاشف المستخدمة على أنها زائدة فيما يتعلق بعدد البروتينات المعبر عنها على سطح خلايا الخميرة. يفترض الحساب التعبير عن 10,000 بروتين / خلية من جميع الخميرة 2 × 106 في عينة35 ، عندما يكون ذلك بشكل روتيني ~ 50٪ فقط. يوضح الجدول 3 نسبة كاشف الملصقات الزائدة لكل من الكواشف المعبر عنها في الجدول 2 ، محسوبة على النحو التالي:
    figure-protocol-1
  2. عينات أجهزة الطرد المركزي عند 4,500 × جم لمدة دقيقة واحدة والتخلص من المادة الطافية كنفايات خطرة بيولوجيا.
  3. اغسل الخلايا مرة واحدة عن طريق إعادة تعليقها في 1 مل من PBSA. كرر الخطوة 4.2.
  4. أعد تعليق العينات في مزيج 20 ميكرولتر من الكواشف الثانوية المقابلة لها كما هو موضح في الجدول 2. احتضان العينات لمدة 15 دقيقة في حالة عدم وجود ضوء.
  5. كرر الخطوة 4.2.
  6. كرر الخطوة 4.3.
  7. أعد تعليق العينات المغسولة في 300-500 ميكرولتر من PBSA وانقلها إلى أنابيب البوليسترين سعة 5 مل لتحليلها على الفور باستخدام مقياس التدفق الخلوي المناسب.
    ملاحظة: إذا كانت هناك حاجة إلى نقل العينات ، فاحتفظ بها على الثلج الرطب. لا ينصح بذلك, ولكن يمكن تخزين العينات عند 4 درجات مئوية لمدة أقصاها 2 ساعة ككريات رطبة.
  8. بعد إجراء بدء التشغيل اللازم وإعداد مقياس الخلوي لتجربة جديدة ، انقر فوق الزر " تجربة جديدة " داخل قائمة "ملف" ، وقم بتسمية التجربة ، وانقر فوق "حفظ " لضمان حفظ البيانات التي تم الحصول عليها في مسار الملف المطلوب.
  9. حدد أيقونة المخطط النقطي داخل شريط الأدوات العلوي لإنشاء مخططين نقطيين أو أكثر لكل نموذج يتم تشغيله. بالنسبة لأحد المخططات النقطية، حدد اسم المحور X لعرض قناة FSC-A واسم المحور Y لعرض قناة SSC-A. يوضح هذا المخطط منطقة التشتت الجانبي مقابل التشتت الأمامي - المنطقة ويستخدم لبوابة خلايا الخميرة لمزيد من التحليل.
  10. في مخطط نقطي آخر ، حدد اسم المحور X لعرض القناة التي يتألق فيها الكاشف الثانوي الذي يستهدف الجسم المضاد لعلامة اللوحة الأولية المضادة للحاتمة. حدد اسم المحور Y لعرض القناة التي يتألق فيها الكاشف الثانوي للستربتافيدين. ستظهر هذه المخطط فقط الأحداث المسورة من الجانب مقابل مخطط التشتت الأمامي كخلايا خميرة وتستخدم لعرض فسفرة التيروزين على المحور Y وتعبير سطح الركيزة على المحور X.
    ملاحظة: الكاشف الثانوي الذي يستهدف الأجسام المضادة لعلامة الحافة الأولية في قناة FITC (AF-488) وكاشف الستربتافيدين الثانوي يتألق في قناة AF-647 في هذا المثال. قد تختلف القنوات المستخدمة اعتمادا على الكواشف الأولية والثانوية المستخدمة أثناء وضع العلامات.
  11. ضع كل أنبوب عينة في حامل أنبوب مقياس الخلوي وحدد تشغيل لمقياس الخلوي لبدء تحميل العينة والحصول على البيانات. اضبط الأحداث المراد عرضها والأحداث المراد تسجيلها ووقت التسجيل وعينة معدل التدفق حسب الضرورة.
  12. حدد بوابة تحيط بخلايا الخميرة السليمة في مخطط SSC-A مقابل FSC-A الذي تم إنشاؤه في الخطوة 4.9. يوضح الشكل 1 تمثيلا وصفيا لاستراتيجية البوابات المراد تطبيقها.
    ملاحظة: في مخطط SSC-A مقابل FSC-A ، يعد 100,000 حدث لعرضه ، و 50,000 حدث لتسجيله داخل بوابة الخميرة المحددة دليلا جيدا لتصور وجمع البيانات الكافية لمزيد من التحليل. يمكن تطبيق استراتيجيات بوابات أكثر صرامة لاختيار الخميرة المفردة بناء على مخطط ارتفاع التشتت الأمامي مقابل منطقة التشتت الأمامية كما تم الإبلاغ عنهمؤخرا 36. تتوافق استراتيجية البوابات الموضحة في الشكل 1 مع نهج أقل صرامة ، بما في ذلك الخميرة المفردة وبعض الخميرة المزدوجة من خلال بوابات مبعثرة.
  13. سجل مضان جميع عينات التحكم باستخدام محلل قياس التدفق الخلوي. يتم جمع عينات التحكم بشكل روتيني أولا للمساعدة في تحديد استراتيجية البوابات ، كما هو موضح أدناه في الخطوة 4.14.
  14. حدد استراتيجية بوابات لقطعة الأرض الخاصة بك التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.10 قبل تحليل العينات المعالجة. يوضح الشكل 1 تمثيلا وصفيا لاستراتيجية البوابات المراد تطبيقها.
  15. سجل مضان العينات منزوعة الفسفرة باستخدام مقياس التدفق الخلوي واستراتيجية البوابات المحددة في الخطوتين 4.12 و 4.14.
  16. تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي التي تم الحصول عليها باستخدام برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي.
  17. قم بتقييم إزالة الفسفرة عن طريق قياس ومقارنة متوسط المحور Y للخلايا التي تعبر عن البروتين على سطحها والفسفرة الأساسية التي توفرها الخلايا غير المعروضة بين العينات والضوابط. احسب النسبة المئوية لفرق الفسفرة المتوسطة على النحو التالي:
    figure-protocol-2

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يكشف تحليل قياس التدفق الخلوي من نسخة مكررة فردية لنظامنا النموذجي المحتضن لمدة ساعتين بدون (الشكل 1 أ) ومع (الشكل 1 ب) 1,000 نانومتر SHP-2 عن فرق متوسط الفسفرة بنسبة 63.6٪ ، والذي يتم تعريفه على أنه نسبة متوسط المحور Y (الفسفرة) من جميع الأحداث المعروضة على السطح مطروحا منه إشارة الفسفرة الأساسية المحددة على أنها وسيط المحور Y للأحداث غير المعروضة بين العينة المعالجة والتحكم غير المعالج كما هو موضح في المعادلة المعرفة في خطوة البروتوكول 4.12. قبل تحليل المتوسطا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسمح البروتوكول المقدم بتحليل التفاعلات الأنزيمية باستخدام العرض خارج الخلية للبروتينات على سطح الخميرة. يؤدي دمج عزل الشبكة الإندوبلازمية في البلازميد السطحي المستخدم إلى تقديم القدرة على تحليل تفاعلات محددة بين الإنزيمات والركائز المعدلة بعد الترجمة خارج الخلية بسبب التفاعلات داخل الخلايا التي يمكن تصميمها لتحدث27،29. تتضمن فحوصات التفاعل الأنزيمي التي تم إنشاؤها مسبقا باستخدام عرض سطح الخميرة التعبير عن البروتينات ذات الأهمية ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح فيما يتعلق بهذا العمل للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال جائزة NSF CAREER ل L.A.S. (CBET - 2339172) وصناديق بدء التشغيل من جامعة جنوب فلوريدا.

في الشكل 2 أ ، تم ترخيص أيقونة الأنبوب الدقيق المفتوحة والشفافة بواسطة Servier https://smart.servier.com/ بموجب CC-BY 3.0 Unported https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/. تشمل التعديلات إضافة عازلة وخلية خميرة (يسار) وإضافة جسم مضاد (وسط يمين).

تم توفير أنبوب الاختبار والحاضنة ومقياس التدفق الخلوي في الشكل 2 أ من خلال www.bioicons.com تحت الوصول المفتوح.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
زجاجات وسائط سعة 1 لتر كورنينج06-414-1D
1.7 / 2.0 مل الأنابيب الدقيقةAxygenMCT-175-C
10 & micro ؛ L SureOne Pipet Tipsفيشر Scientific02-707-438
1000 & micro ؛ L SureOne Pipet TipsFisher Scientific02-707-408
12 مل أنابيب البوليسترين المستديرةGreiner07-000-212
3 مل كوفيت بلاتيكماركة 759076D
300 & micro ؛ L SureOne Pipet TipsFisher Scientific02-707-411
5 مل ماصات مصليةفيشر Scientific13-678-11D
حمض الكازين (أحماض الكازامين)فيشر ScientificBP-1424-500
الميزان التحليلي   ؛Mettler Toledo30243397
طبق بتري البكتريولوجي  خزانات السلامةالحيوية 351008
FalconLabconcoLogic Class II ، Type A2 & nbsp; 302310102
مقياس الطيف الحيويEppendorfالحركية 6136000010
الأبقار مصل الألبومينفيشر الكواشف الحيويةBP1600-100
حامض الستريكفيشر ScientificA940-500
CytoFLEX Flow Cellmettry محلل Beckam CoulterCytoflex C09745CytExpert
DextroseFisher ScientificD16-1
DithiothreitolFisher الكواشف الحيويةBP172-5
الحمار المضاد للماعز FITCInvitrogenA16000
EDTAAlfa AesarH56165.30
Ez-Link PEG4-NHS-BiotinThermo ScientificA39259
مجموعة تحويل الخميرة المجمدة EZ II Zymo ResearchT2001
GalactoseFisher ScientificBP656-500
ثلاجة للأغراض العامةMarvel ScientificMS24RAS4RW
Goat المضادة للجسم المضاد لعلامة myc   ؛BethylA190-104A
Mictrotube الطرد المركزي Eppendorf5425 R 5406000313
حاضنة مبردة صغيرة ذات درجة حرارة منخفضةفيشر Scientific15-015-2632
الفأر المضاد للفوسفوتيروزين الأجسام المضادة 4G10BioXcellBE0194
Parafilm MBemisM PM999
محلول ملحي مخزن للفوسفات   ؛فيشر الكواشف الحيويةBP399-500
تحكم الماصة Eppendorfeasypet 3 4430000018
RaffinoseThermo ScientificJ21060-36
المؤتلف البشري النشط SHP-2 البروتينR & D Systems1894-SH
أجهزة الطرد المركزي المبردة  Eppendorf5910 R
Saccharomyces cerevisiae < / em> إجهاد عرض سطح الخميرة EBY 100ATCCMYA-4941
حاضنة شاكرEppendorfM1335-0002 نيو برونزويك إنوفا 42   ؛
مجموعة ماصات أحادية القناة Eppendorf05-403-151
كلوريد الصوديومفيشر ScientificS671-500
سترات الصوديوم ثنائي هيدراتفيشر ScientificS279-500
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة هيبتاهيدراتفيشر ScientificS373-500
فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة أحادي الهيدراتفيشر ScientificS468-500
ستربتافيدين أليكسا فلور 647InvitrogenS32357
ميزان التحميل العلويMettler Toledo
Tris hydrochlorideEMD Millipore648317-100GM
أنبوب مسدس دوارفيشر Scientific11-676-341
ورق الوزن فيشر ساينتفيك09-898-12B
قاعدة النيتروجين الخميرةBD Difco291940
أعمدة تحلية Zeba Spin  ثرمو ساینتيك89883
القاع Corningبرنامج

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lea, M. A., Weber, G. Role of enzymes in homeostasis: VIII. Inhibition of the activity of glycolytic enzymes by free fatty acids. J Biol Chem. 243 (6), 1096-1102 (1968).
  2. Mahé, M., Rios-Fuller, T. J., Karolin, A., Schneider, R. J. Genetics of enzymatic dysfunctions in metabolic disorders and cancer. Front Oncol. 13, 1230934(2023).
  3. Fernandez-de-Cossio-Diaz, J., Vazquez, A. A physical model of cell metabolism. Sci Rep. 8 (1), 8349(2018).
  4. Metallo, C. M., Vander Heiden, M. G. Understanding metabolic regulation and its influence on cell physiology. Mol Cell. 49 (3), 388-398 (2013).
  5. Mildvan, A. S. Mechanisms of signaling and related enzymes. Proteins. 29 (4), 401-416 (1997).
  6. Frosina, G. Overexpression of enzymes that repair endogenous damage to DNA. Eur J Biochem. 267 (8), 2135-2149 (2000).
  7. Schärer, O. D. Chemistry and biology of DNA repair. Angew Chem Int Ed. 42 (26), 2946-2974 (2003).
  8. de la Fuente, M., et al. Enzyme therapy: Current challenges and future perspectives. Int J Mol Sci. 22 (17), 9181(2021).
  9. Robertson, J. G. Enzymes as a special class of therapeutic target: clinical drugs and modes of action. Curr Opin Struct Biol. 17 (6), 674-679 (2007).
  10. Goddard, J. -P., Reymond, J. -L. Enzyme assays for high-throughput screening. Curr Opin Biotechnol. 15 (4), 314-322 (2004).
  11. Helm, J. S., Hu, Y., Chen, L., Gross, B., Walker, S. Identification of active-site inhibitors of MurG using a generalizable, high-throughput glycosyltransferase screen. J Am Chem Soc. 125 (37), 11168-11169 (2003).
  12. Veldhuyzen, W. F., Nguyen, Q., McMaster, G., Lawrence, D. S. A light-activated probe of intracellular protein kinase activity. J Am Chem Soc. 125 (44), 13358-13359 (2003).
  13. Torres, M., Forman, H. J. Encyclopedia of Respiratory. Laurent, G. J., Shapiro, S. D. , Academic Press. 10-18 (2006).
  14. Blume-Jensen, P., Hunter, T. Oncogenic kinase signalling. Nature. 411 (6835), 355-365 (2001).
  15. Martin, G. S. Cell signaling and cancer. Cancer Cell. 4 (3), 167-174 (2003).
  16. Lothrop, A. P., Torres, M. P., Fuchs, S. M. Deciphering post-translational modification codes. FEBS Lett. 587 (8), 1247-1257 (2013).
  17. Graves, J. D., Krebs, E. G. Protein phosphorylation and signal transduction. Pharmacol Ther. 82 (2), 111-121 (1999).
  18. Hafen, E. Kinases and phosphatases--A marriage is consummated. Science. 280 (5367), 1212-1213 (1998).
  19. Westphal, R. S., Anderson, K. A., Means, A. R., Wadzinski, B. E. A signaling complex of Ca2+-calmodulin-dependent protein kinase IV and protein phosphatase 2A. Science. 280 (5367), 1258-1261 (1998).
  20. Barford, D., Das, A. K., Egloff, M. -P. The structure and mechanism of protein phosphatases: Insights into catalysis and regulation. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 27, 133-164 (1998).
  21. Liu, Q., Qu, J., Zhao, M., Xu, Q., Sun, Y. Targeting SHP2 as a promising strategy for cancer immunotherapy. Pharmacol Res. 152, 104595(2020).
  22. Pan, J., Zhou, L., Zhang, C., Xu, Q., Sun, Y. Targeting protein phosphatases for the treatment of inflammation-related diseases: From signaling to therapy. Signal Transduct Targeted Ther. 7 (1), 177(2022).
  23. Denard, C. A., et al. YESS 2.0, a tunable platform for enzyme evolution, yields highly active TEV protease variants. ACS Synth Biol. 10 (1), 63-71 (2021).
  24. Lim, S., Glasgow, J. E., Filsinger Interrante, M., Storm, E. M., Cochran, J. R. Dual display of proteins on the yeast cell surface simplifies quantification of binding interactions and enzymatic bioconjugation reactions. Biotechnol J. 12 (5), (2017).
  25. Yi, L., et al. Engineering of TEV protease variants by yeast ER sequestration screening (YESS) of combinatorial libraries. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (18), 7229-7234 (2013).
  26. Yi, L., et al. Yeast endoplasmic reticulum sequestration screening for the engineering of proteases from libraries expressed in yeast. Methods Mol Biol. 1319, 81-93 (2015).
  27. Semenza, J. C., Hardwick, K. G., Dean, N., Pelham, H. R. ERD2, a yeast gene required for the receptor-mediated retrieval of luminal ER proteins from the secretory pathway. Cell. 61 (7), 1349-1357 (1990).
  28. Mei, M., et al. Characterization of aromatic residue-controlled protein retention in the endoplasmic reticulum of Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 292 (50), 20707-20719 (2017).
  29. Ezagui, J., Russell, B., Mairena, Y., Stern, L. A. Endoplasmic reticulum sequestration empowers phosphorylation profiling on the yeast surface. AIChE J. 68 (12), e17931(2022).
  30. Kawai, S., Murata, K. Genetic Transformation Systems in Fungi. van den Berg, M. A., Maruthachalam, K. 1, Springer International Publishing. 187-192 (2015).
  31. Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi: methods and possible underlying mechanism. Bioeng Bugs. 1 (6), 395-403 (2010).
  32. Loock, M., et al. High-efficiency transformation and expression of genomic libraries in yeast. Methods Protoc. 6 (5), 89(2023).
  33. Huang, D., Gore, P. R., Shusta, E. V. Increasing yeast secretion of heterologous proteins by regulating expression rates and post-secretory loss. Biotechnol Bioeng. 101 (6), 1264-1275 (2008).
  34. Yu, B., et al. Targeting protein tyrosine phosphatase SHP2 for the treatment of PTPN11-associated malignancies. Mol Cancer Ther. 12 (9), 1738-1748 (2013).
  35. Stern, L. A., et al. Geometry and expression enhance enrichment of functional yeast-displayed ligands via cell panning. Biotechnol Bioeng. 113 (11), 2328-2341 (2016).
  36. Pan, X., et al. Optimized single-cell gates for yeast display screening. Protein Eng Design Sel. 38, gzae018(2025).
  37. Margittai, É, et al. Production of H2O2 in the endoplasmic reticulum promotes in vivo disulfide bond formation. Antioxid Redox Signal. 16 (10), 1088-1099 (2012).
  38. Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiol Rev. 57 (2), 383-401 (1993).
  39. Ezagui, J., Stern, L. A. Tyrosine phosphorylation screening on the yeast surface by magnetic bead selection and FACS. Methods Mol Biol. 2681, 275-290 (2023).
  40. Yarnall, M. T. N., Kim, S. H., Korntner, S., Bishop, A. C. Destabilization of the SHP2 and SHP1 protein tyrosine phosphatase domains by a non-conserved “backdoor” cysteine. Biochem Biophys Rep. 32, 101370(2022).
  41. Dustin, C. M., Heppner, D. E., Lin, M. J., van der Vliet, A. Redox regulation of tyrosine kinase signalling: more than meets the eye. J Biochem. 167 (2), 151-163 (2020).
  42. Stern, L. A., Csizmar, C. M., Woldring, D. R., Wagner, C. R., Hackel, B. J. Titratable avidity reduction enhances affinity discrimination in mammalian cellular selections of yeast-displayed ligands. ACS Comb Sci. 19 (5), 315-323 (2017).
  43. Waldman, A. C., Rao, B. M., Keung, A. J. Mapping the residue specificities of epigenome enzymes by yeast surface display. Cell Chem Biol. 28 (12), 1772-1779.e4 (2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Yeast Surface DisplayProtein DephosphorylationSubstrate ScreeningPhosphorylation AnalysisSHP 2 PhosphataseExtracellular Enzyme AssayHigh Throughput ScreeningGating Strategy

مقالات ذات صلة