تحضير الأنسجة السليمة للتحليل المجهري لطبقة خلايا السويداء في بذور نبات الأرابيدوبسيس النامية والناضجة

نظرا لأن النباتات كائنات لاطئة ، فإن إنبات البذور هو حدث حاسم يحدد مصيرها. يتم تنظيم قرار الإنبات بشكل صارم من خلال العوامل الداخلية والبيئية ، مثل مستويات سكون البذور الأولية ، ودرجة الحرارة ، وشدة الضوء والطول الموجي ، وتركيز النيتروجين^{1،2،3،4،5،6}. البذور لها هياكل معقدة تتكون من أنواع متعددة من^{الأنسجة 7}. في بذور نبات الأرابيدوبسيس الجافة ، يحيط بالجنين ، الذي يتطور إلى شتلة ، بطبقة واحدة من السويداء والطبقات الخارجية ، الخصة. يتكون الخصية من طبقات متعددة من الخلايا الميتة ، بينما يظل الجنين والسويداء على قيد الحياة حتى في البذور الجافة. ينظر إلى السويداء بشكل شائع على أنه نسيج تخزين يوفر العناصر الغذائية لنمو الجنين ، وجنبا إلى جنب مع الخصية ، يمنح مقاومة ميكانيكية لنتوء الجذور^{8،9،10،11،12،13}.

أظهرت العديد من الدراسات الحديثة أن السويداء يلعب دورا أساسيا في تنظيم إنبات البذور الأمثل^{14،15،16،17}. على سبيل المثال ، يكتشف المستقبل الضوئي فيتوكروم B (PHYB) في خلايا السويداء إما الضوء الأحمر (R) أو الأحمر البعيد (FR) ، مما ينظم استجابات الإنبات¹⁵. يعمل السويداء أيضا كنسيج لاستشعار درجة الحرارة ، مما يثبط استجابات الإنبات تحت درجات حرارة عالية¹⁶. تعد مراقبة جودة السويداء أمرا بالغ الأهمية لإنبات البذور الأمثل ، لا سيما في البذور المخزنة على المدى الطويل¹⁷.

يعد تصوير الخلايا الحية ضروريا الآن لتوضيح الوظائف الفسيولوجية للذذناء. يسمح التحليل المجهري لخلايا السويداء السليمة التي تعبر عن البروتينات الموسومة بالفلورسنت بالتحقيق في الآليات الجزيئية التي ينظم السويداء من خلالها إنبات البذور. ومع ذلك ، فإن تحضير خلايا السويداء السليمة للمراقبة المجهرية يمثل تحديا ، لا سيما في بذور نبات الأرابيدوبسيس . يبلغ قطر البذور حوالي 0.4 مم ، والسويداء عبارة عن طبقة أحادية الخلية تقع بين الجنين والخصية ، مما يجعل التلاعب الدقيق أمرا صعبا. وبالتالي ، على الرغم من أدوارها الفسيولوجية المهمة ، نادرا ما لوحظ السويداء باستخدام تصوير الخلايا الحية.

تقدم هذه المقالة بروتوكولا للتحضير السريع لعينات طبقة خلايا السويداء السليمة المناسبة لتصوير الخلايا الحية في كل من البذور النامية والناضجة.

في هذه الدراسة ، تم وضع إجراءين مختلفين لإعداد عينات طبقة خلايا السويداء الحية: أحدهما لتطوير البذور والآخر للبذور الناضجة. مطلوب طرق مختلفة قليلا اعتمادا على صلابة الخصة. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير عينات السويداء السليمة من البذور النامية

1. مجموعة من السيليكات
   1. ازرع نباتات نبات الأرابيدوبسيس على التربة أو الصوف الصخري حتى تتفتح.
   2. ضع علامة على الزهور المفتوحة بالكامل بخيوط ملونة (0 أيام بعد الإزهار ، 0 DAF).
      ملاحظة: تجنب استخدام الخيوط الخضراء أو الصفراء أو البنية لتمييز الزهور ، حيث يصعب تمييز هذه الألوان عن النباتات والسيليك النامية أو الناضجة.
   3. اقطع السيليك النامية الملحوظة عند العنق (المشار إليه في الشكل 1 (1)) واجمعها في أنابيب سعة 1.5 مل.
      ملاحظة: تطوير السيليقات من 12-16 DAF مناسب للتحضير باستخدام هذا البروتوكول.
2. تشريح البذور النامية
   ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات التالية على ورق الترشيح المبلل لحماية العينات من الجفاف. يجب أن تتم التلاعب تحت مجهر ستيريو.
   1. افصل صماما (موضح في الشكل 1 (2)) من الريبلوخ (المشار إليه في الشكل 1 (1)) باستخدام ملقطين: أحدهما بأطراف سميكة للإمساك والآخر بأطراف حادة للتمزق).
   2. التقط البذور النامية برفق من السيليك باستخدام ملقط مع إغلاق الأطراف لتجنب إتلاف البذور (الشكل 1 (2)).
   3. أمسك البذرة بالملقط دون تحطيم البذرة ، اصنع ندبة بحجم 0.2 مم تقريبا على الخصية والسويداء المحيطة بالجنين باستخدام إبرة حقن (27 جم ، 0.40 مم × 19 مم) (الشكل 1 (3)).
      ملاحظة: الموقع الأمثل لعمل الندبة هو عند تقاطع الفلقات والجذع.
   4. ادفع الجنين للخارج عن طريق قرص البذرة بالملقط (الشكل 1 (4)). لا تسحق غلاف البذور الفارغ ، الذي يتكون من الخصية والسويداء ، وحاول الحفاظ على شكله الدائري.
   5. أدخل إبرة الحقن في غلاف البذور الفارغ عند الندبة ، واثقبها من الداخل إلى الخارج (الشكل 1 (5)).
   6. حافظ على الإبرة في مكانها ، وخدش سطح الخصية باستخدام ملقط مع إغلاق الأطراف ، وقم بقص جانب واحد من غلاف البذور الفارغ للسماح لها بالفتح (الشكل 1 (6)).
   7. افتح مغلف البذور الفارغ في ورقة باستخدام ملقط بأطراف حادة (الشكل 1 (7)). يجب الآن عزل العينة كصفيحة ثنائية الطبقة تتكون من طبقات السويداء والخصية (الشكل 1 (8)).
      ملاحظة: إذا كانت العينة تميل إلى الالتفاف عند استخدام الماء كوسيط تركيب في الخطوة 3 أدناه، فقم بتقسيم عينة شكل الورقة إلى قطعتين. يمكن أيضا معالجة البذور التي يتم حصادها من السيليك عند حوالي 18 DAF (في هذه المرحلة ، تكون الخصية بنية اللون ولكنها لم تجف تماما بعد) باستخدام هذا البروتوكول ، على الرغم من أنه يجب شرب البذور لعدة دقائق قبل التحضير.

2. تحضير عينات السويداء السليمة من البذور الناضجة

1. شرب البذور الناضجة
   1. أضف 1 مل من الماء المقطر المزدوج إلى أنبوب سعة 1.5 مل يحتوي على بذور نبات الأرابيدوبسيس الجافة.
   2. احتفظ بالبذور مشببة لمدة 40 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة (الشكل 2 (1)).
      ملاحظة: يصعب تندب البذور والبذور الجافة في غضون 40 دقيقة من الشرب في الخصية والسويداء وإزالة الجنين من داخل البذرة دون إتلاف غلاف البذور الفارغ في الخطوتين 2.2.1 و 2.2.2 ، في حين أن وقت الشرب الأطول يسهل التلاعب.
   3. استخدم ماصة دقيقة سعة 1000 ميكرولتر لنقل البذور المشببة على ورق ترشيح مبلل.
2. تشريح البذور الناضجة
   ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات التالية على ورق الترشيح المبلل لحماية العينات من الجفاف. يجب إجراء التلاعب تحت مجهر مجسم.
   1. أمسك البذرة بالملقط دون تحطيم البذرة ، اصنع ندبة بحجم 0.2 مم تقريبا على الخصية والسويداء المحيطة بالجنين باستخدام إبرة حقن (الشكل 2 (2)).
   2. ادفع الجنين للخارج عن طريق قرص البذرة بالملقط (الشكل 2 (3)). لا تسحق غلاف البذور الفارغ ، والذي يتضمن الخصية والسويداء. حاول الحفاظ على شكله الدائري.
   3. قم بقص الجانبين العلوي والسفلي من غلاف البذور الفارغ بإبرة حقن لتشكيله على شكل أسطوانة (الشكل 2 (4)).
   4. قم بقص غلاف البذور الفارغ الأسطواني الشكل على طول محوره المركزي لفصله إلى قطعتين (الشكل 2 (5)). يجب عزل العينات على شكل صفائح ثنائية الطبقة تتكون من طبقة السويداء وطبقة الخصية (الشكل 2 (6)).

3. المراقبة المجهرية

1. ضع عينات السويداء في شكل صفيحة على شريحة زجاجية وقم بتثبيتها في الماء أو البيرفلوروديكالين (PFD).
   ملاحظة: إذا بقيت فقاعات الهواء بين العينة والغطاء ، فإن البيرفلوروديكالين (PFD) ، الذي تم الإبلاغ عنه مفيد بشكل خاص لتصوير العينات التي تحتوي على جيوب هوائية ، مثل الأوراق^18،19 ، سيكون مفيدا. من المعروف أن PFD يحتوي على أقل توتر سطحي ، مما يسمح له بملء الفراغات الهوائية بسهولة على سطح العينة. ومع ذلك ، بالنسبة للتصوير بفاصل زمني ، يوصى باستخدام الماء كوسيط تركيب ، حيث يجب أن يكون محتوى الماء في البذور الناضجة وفيرا للحفاظ على السيولة الخلوية.
2. ضع غطاء برفق فوق العينة. تأكد من أن طبقة السويداء تواجه الغطاء.
   ملاحظة: يمكن استخدام طلاء الأظافر أو الشحوم لإغلاق حواف الغطاء لمنع جفاف العينة ووسط التركيب.

باستخدام البروتوكول الموضح في الشكل 1 ، تم تحضير عينات السويداء من البذور النامية التي تم حصادها من السيليكات في 14 DAF (في هذه المرحلة ، لا تزال الخصية خضراء). لوحظ وجود العديد من خلايا السويداء عبر مساحة كبيرة وهياكلها داخل الخلايا (الشكل 3 أ). في هذه التجربة ، تم استخدام البذور التي تعبر عن PHYB المدمجة مع GFP في الطرف C (PHYB-GFP). من المعروف أن PHYB ينتقل إلى النواة عند تنشيطه بواسطة الضوء الأحمر ويشكل بقعا موجبة ل PHYB ، تعرف باسم الأجسام الضوئية (PBs) ، والتي تشارك في إنبات البذور4،20،21،22. تم حصاد العينات من النباتات المزروعة في ظل ظروف الضوء الأبيض المستمر عند 22 درجة مئوية. كما هو موضح في الشكل 3 ب ، تم اكتشاف PBs داخل النواة في خلايا السويداء. تتوافق هذه النتيجة مع دراسة سابقة تظهر أن PHYB في السويداء ينظم إنبات البذور الأمثل15. بالإضافة إلى ذلك ، تم إجراء تصوير بفاصل زمني للخلايا الحية للتأكد من أن خلايا السويداء المعزولة احتفظت بالنشاط البيولوجي حتى بعد تحضير العينة من خلال مراقبة قابلية الانعكاس الضوئي للنباتات FR / R (الشكل 3 ج). تم تحضير عينات السويداء من البذور النامية التي تم حصادها من السيليك في حوالي 17-18 DAF. تم اكتشاف PBs داخل النواة عند التشريح ، بينما اختفت تماما بعد التشعيع بالضوء الأحمر البعيد. بعد ذلك ، تسبب تشعيع الضوء الأحمر مرة أخرى في تحفيز PBs. تم الكشف عن هذه القابلية الضوئية للانعكاس الضوئي للشيخورام مرتين ، مما يشير إلى أن خلايا السويداء المعزولة بواسطة هذا البروتوكول احتفظت بالنشاط البيولوجي لمدة 4.5 ساعة على الأقل بعد التشريح (الشكل 3 ج).

بعد ذلك ، تم تحضير عينات السويداء من البذور الناضجة (حيث تكون الخصية بنية اللون) ، كما هو موضح في الشكل 2. في هذه التجربة ، لوحظت حركة الميتوكوندريا باستخدام البذور التي تعبر عن GFP المستهدف للميتوكوندريا (mtGFP) 23 ، والذي تم تخزينه في مجفف في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة عام تقريبا بعد الحصاد. تم الإبلاغ عن أن الميتوكوندريا في الجنين تتحرك بنشاط وتغير مورفولوجيا ديناميكيا بعد الشرب والانتقال إلى ظروف الإنبات24. تم إجراء التصوير بفاصل زمني فلوري للميتوكوندريا في خلايا السويداء السليمة بعد 3 ساعات من شرب البذور ، وتم الكشف عن حركة الميتوكوندريا (الفيلم التكميلي 1). تحركت الميتوكوندريا في السويداء على الفور داخل العصارة الخلوية بعد فترة قصيرة من الشرب عند 22 درجة مئوية. بعد يوم واحد من شرب البذور عند 22 درجة مئوية ، لوحظت الميتوكوندريا التي تتحرك بشكل ديناميكي (الشكل 4 والفيلم التكميلي 2).

الشكل 1: تحضير عينة السويداء من البذور النامية. الخطوة 1: يتم فصل الصمام من الريبلوم. الخطوة 2: يتم جمع البذور النامية. الخطوة 3: يتم إنشاء ندبة على الخصية والسويداء باستخدام إبرة حقن. الخطوة 4: تتم إزالة الجنين عن طريق قرص البذرة بالملقط. الخطوة 5: يتم إدخال إبرة الحقن من خلال غلاف البذور الفارغ من الداخل إلى الخارج. الخطوة 6: يتم خدش سطح الخصية باستخدام ملقط. الخطوة 7: يتم فتح مغلف البذور الفارغ في شكل ورقة باستخدام الملقط. الخطوة 8: يتم تحضير عينة ورقة السويداء النهائية للمراقبة المجهرية. يتم تنفيذ جميع الخطوات على ورق ترشيح مبلل تحت مجهر استريو. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تحضير عينة السويداء من البذور الناضجة. الخطوة 1: تشرب البذور الجافة في الماء لأكثر من 40 دقيقة في أنبوب سعة 1.5 مل. الخطوة 2: يتم إنشاء ندبة على الخصية والسويداء باستخدام إبرة الحقن. الخطوة 3: تتم إزالة الجنين عن طريق قرص البذرة بالملقط. الخطوة 4: يتم قطع الجانبين العلوي والسفلي من غلاف البذور الفارغ لتشكيله على شكل أسطوانة. الخطوة 5: يتم قطع غلاف البذور الفارغ الأسطواني على طول محوره المركزي. الخطوة 6: يتم تحضير عينة ورقة السويداء النهائية للمراقبة المجهرية. يتم تنفيذ جميع الخطوات على ورق ترشيح مبلل تحت مجهر استريو. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: التصوير الفلوري لطبقة خلية السويداء السليمة باستخدام البذور النامية. تم تحضير عينات طبقة خلايا السويداء السليمة من بذور تطوير 14 يوما بعد الإزهار (DAF) (A ، B) و 17-18 DAF siliques (C). تم إجراء التصوير المجهري باستخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر المجهز بعدسة موضوعية غمر بالزيت Plan-Apochromat 63× وليزر الضوء الأبيض. (أ) تظهر صورة متحد البؤر للذذاء تحت تباين التداخل التفاضلي (DIC) مساحات كبيرة بها العديد من خلايا السويداء السليمة. شريط المقياس: 20 ميكرومتر. (ب) يتم عرض صور متحد البؤر للذذاء الذي يعبر عن PHYB-GFP ، مع PHYB-GFP باللون الأخضر والتألق الذاتي للكلوروفيل في سماوي. يشار إلى الأجسام الضوئية (PBs) في النواة برؤوس سهام بيضاء. قضبان المقياس: 10 ميكرومتر ؛ شريط مقياس الصورة الموسع: 2.5 ميكرومتر. تم فصل إشارة GFP عن التألق الذاتي لفجوات تخزين البروتين (PSVs) باستخدام الفحص المجهري الفلوري (FLIM). تم الحصول على عمر التألق باستخدام TauScan وفصلها باستخدام وظيفة TauSeparation. كان متوسط عمر التألق ل GFP 2.2 ns. كان مضان GFP متحمسا عند 488 نانومتر وتم جمعه بين 500-530 نانومتر ، بينما كان التألق الذاتي للكلوروفيل متحمسا عند 405 نانومتر وتم جمعه بين 688-729 نانومتر. (ج) يتم تقديم صور متحد البؤر للذذاء الذي يعبر عن PHYB-GFP تحت الضوء الأبيض المستمر (cWL) أو الضوء الأحمر البعيد المستمر (cFR) أو الضوء الأحمر المستمر (cR). يظهر PHYB-GFP باللون الأخضر ، ويظهر التألق الذاتي PSV باللون الأرجواني. قضبان المقياس: 10 ميكرومتر ؛ شريط مقياس الصورة الموسع: 2.5 ميكرومتر. شدة الضوء: WL ، 46.5 ميكرومول / م2 / ثانية ؛ FR ، 35.2 ميكرومول / م2 / ثانية ؛ R ، 18.6 ميكرولتر / م2 / ثانية. تم إثارة التألق الذاتي PSV عند 561 نانومتر وتم جمعه بين 565-621 نانومتر. تم فصل إشارة GFP باستخدام نفس الطريقة الموضحة أعلاه. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: تصوير الخلايا الحية الفلورية لطبقة خلية السويداء السليمة باستخدام البذور الناضجة. تم إجراء التصوير المجهري باستخدام نفس الطريقة الموضحة في الشكل 3. (أ) تظهر صورة متحدة البؤر لطبقة خلية السويداء السليمة بأكملها ، تم الحصول عليها من الفيلم التكميلي 2. يتم تصنيف الميتوكوندريا باللون الأخضر ، ويتم تصنيف التألق الذاتي PSV باللون الأرجواني. شريط المقياس: 10 ميكرومتر. (ب) تظهر سلسلة اللقطات المتتابعة من الصور المكبرة من المساحة المربعة المتقطعة في اللوحة (A) حركة الميتوكوندريا ، المشار إليها برؤوس الأسهم البيضاء. شريط المقياس: 5 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الفيلم التكميلي 1: يتم عرض مقطع فيديو بفاصل زمني ل mtGFP في طبقة خلية السويداء لبذرة ناضجة بعد 3 ساعات من التشرب. تم التقاط إطار واحد كل 10 ثوان ، ومعدل إطارات الفيديو هو 10 إطارات / ثانية. شريط المقياس: 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الفيلم التكميلي 2: يظهر مقطع فيديو بفاصل زمني ل mtGFP في طبقة خلية السويداء لبذرة ناضجة بعد يوم واحد من التشرب. تم التقاط إطار واحد كل 10 ثوان ، ومعدل إطارات الفيديو هو 10 إطارات / ثانية. شريط المقياس: 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.