يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نقل واسع النطاق للخلايا العصبية القشرية الحديثة للفأر عن طريق الحقن تحت العنكبوتية ل AAV2

1.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68235

⸱

مايو 23, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology, Russian Academy of Sciences, 2Faculty of Biology and Biotechnology, National Research University High School of Economics

في هذه المقالة

ملخص

تم وصف تقنية جديدة لإيصال الفيروس المرتبط بالغدة على نطاق واسع والذي يستخدم تسريب الفيروس تحت العنكبوتية. لا تضمن هذه الطريقة نقلا واسع النطاق للخلايا العصبية القشرية الحديثة للفأر في الطبقات السطحية فحسب ، بل تؤدي أيضا إلى التعبير الانتقائي عن الجين المعدل في الخلايا العصبية الهرمية من الطبقة الخامسة ، حتى عند استخدام محفز غير انتقائي

الملخص

تعد الفيروسات المؤتلفة المرتبطة بالغدة أداة مرنة وقوية لإيصال والتعبير عن الجينات المختلفة ذات الأهمية في العديد من مجالات علم الأحياء التجريبي ، لا سيما في علم الأعصاب. الطريقة الأكثر شيوعا لدفع التعبير عن الجين المعدل المطلوب في منطقة معينة من الدماغ هي حقن ناقل AAV مباشرة في حمة الدماغ. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة لا تسمح بنقل الخلايا العصبية على نطاق واسع المطلوب لبعض التجارب في الجسم الحي . في هذه المقالة ، نقدم تقنية جديدة للتعبير الجيني على نطاق واسع في القشرة المخية الحديثة للفأر بناء على التسريب الفيروسي في الفضاء تحت العنكبوتية في الدماغ. لا تضمن طريقة وضع العلامات العصبية هذه نقلا واسع النطاق للخلايا العصبية في طبقات القشرة القشرية السطحية للفأر البالغ فحسب ، بل تؤدي أيضا إلى التعبير عن الجين المعدل في مجموعة كبيرة من الخلايا العصبية الهرمية من الطبقة الخامسة ذات الخصوصية العالية حتى عند استخدام محفز قوي غير انتقائي مثل CAG. علاوة على ذلك ، نظرا لأن نقل الخلايا يحدث على مسافة كبيرة من موقع الحقن ، يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الحفاظ على أنسجة المخ للتسجيلات البصرية أو الفيزيولوجية الكهربية اللاحقة للنشاط العصبي.

المقدمة

يتكون دماغ الثدييات من العديد من الخلايا المثبطة والمثيرة والمعدلة المترابطة في دوائر بواسطة تريليونات من نقاط الاشتباكالعصبي 1. يتمثل أحد التحديات الرئيسية لعلم الأعصاب في فك تشفير دور أنواع الخلايا المتميزة في تنظيم ووظيفة دوائر الدماغ والسلوك. يتطلب التلاعب بالخلايا المحددة وراثيا داخل الدماغ طرقا لإدخال الجينات المعدلة وراثيا والتعبير عنها. تعد أنظمة توصيل الجينات القائمة على الفيروس إلى حد بعيد الطريقة الأكثر فعالية وبساطة لتوصيل الجينات إلى الجهاز العصبي المركزي2. تعتمد أنظمة توصيل الفيروسات على تكرار الفيروسات (الفيروسات الغدية والفيروسات المرتبطة بالغدة (AAVs) وفيروسات العدسات والفيروسات القهقرية) التي لديها القدرة على توصيل المعلومات الجينية إلى الخلية المضيفة2،3.

أصبحت النواقل القائمة على AAV الآن واحدة من أكثر الأدوات استخداما لإيصال الجينات المعدلة وراثيا المرغوبة إلى الخلايا داخل الدماغ ، سواء لأغراض أبحاث علم الأعصاب الأساسية أو لتطوير العلاج الجيني للأمراض العصبية. عند مقارنتها بالفيروسات الأخرى ، تمتلك AAVs المعيبة في النسخ المتماثل العديد من الميزات التي تجعلها ناقلات مثالية لهذه الأغراض. والجدير بالذكر أن نواقل AAV تنقل بكفاءة الخلايا غير المنقسمة (المتمايزة نهائيا) مثل الخلايا العصبية والخلايا الدبقية ، مما يؤدي إلى مستويات عالية من التعبير الجينات المعدلة وراثيا في الجسم الحي2. يمكن إنتاج المتجهات بسهولة بعيار وظيفي عال مناسب للاستخدام في الجسم الحي 3،4،5. الأهم من ذلك ، أن توصيل الجينات بوساطة الفيروس المرتبط بالغدة في الجسم الحي لا ينتج عنه تغيرات نسيجية مرضية وسمية مرتبطة بالنواقل6. على عكس نواقل الفيروسات الغدية ، فإن الإدارة في الجسم الحي لنواقل AAV في النماذج الحيوانية عادة لا تثير استجابات مناعية للمضيف ضد الخلايا المنقولة ، مما يتيح التعبير المستقر للجينات المعدلة داخل حمة الدماغ لفترات طويلة من الزمن2،7،8.

سبب آخر لشعبية نواقل AAV هو المجموعة الواسعة من الأنماط المصلية AAV ذات المناطق المدارية الفريدة للأنسجة والخلية9،10،11،12،13،14. تؤدي بروتينات القفيصة المميزة التي يتم التعبير عنها بواسطة أنماط مصلية مختلفة من AAV إلى استخدام مستقبلات مختلفة لسطح الخلية لدخول الخلية ، وبالتالي ، مناطق الاستدارات المحددة10،14.

يتم تحديد استحاء AAV ليس فقط من خلال بروتينات القفيصة ولكن من خلال العديد من العوامل الأخرى14. لقد ثبت أن الأنماط المصلية AAV 1 و 2 و 6 و 7 و 8 و 9 نقلت كل من الخلايا العصبية والخلايا النجمية في الثقافة الأولية15،16 ، لكنها أظهرت انتحاء عصبيا قويا بعد حقن الدماغ داخل المتني17،18. يمكن أن تؤثر الطريقة المستخدمة في تحضير نواقل AAV أيضا على استحاء الخلايا العصبية ، حتى بالنسبة لنفس النمط المصلي. على سبيل المثال ، امتلك AAV8 المنقى CsCl استحاءا نجليا قويا بعد حقن الدماغ داخل المتني ، في حين أن AAV8 المنقى باليوديكسانول ، الذي تم حقنه في ظل ظروف متطابقة ، قام بتحويل الخلايا العصبيةفقط 19. قد يتأثر الانتحاء AAV أيضا بالجرعة المحقونة والحجم14. على سبيل المثال ، أدى العيار العالي rAAV2 / 1 إلى نقل كل من الخلايا العصبية المثيرة والمثبطة القشرية بكفاءة ، لكن استخدام العيارات المنخفضة كشف عن تفضيل قوي لنقل الخلايا العصبية المثبطة القشرية20.

وبالتالي ، لا يمكن تحقيق خصوصية قوية من نوع الخلية بناء على النمط المصلي للقفيصة فقط. يمكن استخدام محفزات محددة من نوع الخلية للتغلب على الانتوائية الطبيعية الواسعة لقفيصة AAV. على سبيل المثال ، يتم استخدام المشبك البشري I لاستهداف الخلايا العصبية21 ، ويمكن لمحفز CaMKII أن يقود التعبير الجيني المعدل في الخلايا العصبية المثيرة الجلوتاماتيرجيك ذات الخصوصيةالعالية 20 ، ويستهدف محفز ppHcrt الخلايا العصبية التي تعبر عن هيبوكريتين (HCRT) في منطقة ما تحت المهاد الجانبية22 ، ويستهدف محفز PRSx8 الخلايا العصبية النورادرينالية والأدرينالية التي تعبر عن الدوبامين بيتا هيدروكسيلاز23 ، ويمكن لمحفز GFAP أن يقود التعبير الخاص بالخلاياالنجمية 24. ومع ذلك ، فإن بعض المحفزات الخاصة بالخلايا لديها نشاط نسخ ضعيف ولا يمكنها دفع مستويات كافية من التعبير الجينيالمعدل 25. علاوة على ذلك ، غالبا ما لا تحتفظ المحفزات القصيرة التي تتناسب مع النواقل الفيروسية AAV بخصوصية نوع الخلية1،26. على سبيل المثال ، لقد ثبت أن بناء CaMKII ينقل أيضا الخلايا العصبية المثبطة12.

إلى جانب خصوصية نوع الخلية (الانتحاء) ، هناك ميزة أخرى مهمة ل AAVs وهي كفاءة التحويل. الأنماط المصلية المختلفة AAV لها خصائص انتشار مختلفة. تنتشر AAV2 وأربعة نواقل فيروسية بسهولة أقل من خلال حمة الدماغ ، وبالتالي ، تتوسط في النقل على مساحة أصغر17،27. لوحظ نقل الخلايا العصبية الأكثر انتشارا مع الأنماط المصلية AAV 1 و 9 و rh.1011،17،18،19،28.

الطريقة الأكثر شيوعا لدفع التعبير عن الجين المعدل المطلوب في منطقة معينة من الدماغ هي حقن ناقل AAV مباشرة في منطقة الدماغ محل الاهتمام (الحمة)3. بعد الحقن داخل المتني ، حتى الأنماط المصلية AAV ذات الانتشار الأكثر فعالية عبر الدماغ عادة ما تنقل منطقة محلية فقط حول موقع الحقن 12. علاوة على ذلك ، فإن الحقن داخل المتني هو إجراء جراحي ويؤدي إلى تلف الأنسجة المجاورة لمنطقة الاهتمام. وبالتالي ، فإن طريقة حقن الفيروسات هذه غير مناسبة لبعض المهام التجريبية. على سبيل المثال ، يعد وضع العلامات المكثفة للخلايا أمرا مرغوبا فيه للغاية في التجارب التي تهدف إلى دراسة وظائف الخلايا العصبية القشرية في التي تتحرك بحرية ، بما في ذلك استخدام الفحص المجهري ذو الفوتون الواحد أو الفوتونين29،30،31،32.

هنا ، نصف تقنية جديدة لحقن الفيروس المرتبط بالغدة تستخدم تسريب الفيروس تحت العنكبوتية لتوفير نقل واسع النطاق للخلايا العصبية القشرية الحديثة في الفئران البالغة والحفاظ على أنسجة المخ للتسجيلات البصرية أو الفيزيولوجية الكهربية اللاحقة للنشاط العصبي. لم تضمن هذه الطريقة نقلا واسع النطاق للخلايا العصبية في طبقات القشرة الحديثة السطحية فحسب ، بل أدت أيضا إلى التعبير عن الجين المعدل في عدد كبير من الخلايا العصبية الهرمية من الطبقة الخامسة ذات الخصوصية العالية حتى عند استخدام محفز قوي غير انتقائي مثل CAG.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أجريت التجارب على C57Black / 6 فئران بالغة ، تتراوح أعمارهم بين 2-4 أشهر ، من كلا الجنسين (مركز تربية بوشينو ، فرع معهد شيمياكين-أوفتشينيكوف للكيمياء العضوية الحيوية في RAS). تم إيواء الفئران في فيفاريوم يتم التحكم في درجة حرارته (22 درجة مئوية ± 2 درجة مئوية ، 12 ساعة دورة ضوء / ظلام ، أضواء مضاءة في الساعة 08.00 ساعة) مع الطعام والماء المخصص. تم إجراء جميع الإجراءات التجريبية وفقا لإرشادات ARRIVE والتوجيه 2010/63 / EU للتجارب على. تمت الموافقة على بروتوكول الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات التابعة ل IHNA RAS (البروتوكول N1 اعتبارا من 01.02.2022). تم بذل كل جهد ممكن لتقليل معاناة وضمان موثوقية النتائج.

1. التحضير للجراحة

  1. تعقيم جميع الأدوات الجراحية قبل بدء الجراحة. نظف منطقة الجراحة باستخدام 70٪ من الإيثانول.
  2. تحقق من مستوى الأيزوفلوران في نظام التخدير واملأه إذا لزم الأمر. ضع منشفة ورقية نظيفة في الجزء السفلي من غرفة الحث.
  3. ضع وسادة تدفئة على الإطار التجسيمي. غطي الوسادة بمنشفة ورقية نظيفة.
  4. قم بإعداد زجاجة تحتوي على مبيض بنسبة 2٪ لجمع أطراف الماصات الدقيقة والأنابيب ومسحات القطن وغيرها من العناصر التي تتلامس مع الفيروس.
  5. قم بإزالة كمية من AAV من الفريزر -80 درجة مئوية وضعها على الثلج لتذوب.

2. تحضير الحقنة

  1. قم بتنظيف حقنة هاميلتون الدقيقة سعة 5 ميكرولتر بإبرة RN غير حادة 33G. استنشق ثم استغني عن 70٪ من الإيثانول. كرر 3 مرات مع الإيثانول الطازج. شطف المحقنة بالماء المقطر لإزالة الإيثانول الزائد. كرر 3 مرات.
  2. أخرج المكبس واملأ البرميل بزيت الفازلين من خلال الحافة باستخدام حقنة الأنسولين. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء في المحقنة الدقيقة.
    ملاحظة: الهواء المحبوس قابل للانضغاط ويؤثر على دقة الحقنة ودقتها.
  3. ضع المكبس مرة أخرى في المحقنة الدقيقة وقم بتوزيع قطرة من الزيت. ضع المحقنة في الحاقن التجسيمي بحيث يكون المقياس مرئيا لمراقبة حجم المحلول الذي تم توزيعه.

3. تحضير الفئران للجراحة

  1. وزن الفأر. ضع الفأر في غرفة تحريض التخدير المتصلة بالأيزوفلوران. قم بتشغيل مبخر الأيزوفلوران المضبوط على 5٪ واضبط معدل التدفق على 250 مل / دقيقة. يتم تحقيق عمق كاف للتخدير في غضون 5 إلى 7 دقائق.
  2. للتحقق من المستوى الجراحي للتخدير ، تحقق من عدم وجود منعكس الخفق والانسحاب أثناء قرصة مؤلمة في المخلب الخلفي ، وعدم وجود وميض عند ملامسة العين.
  3. قم بتبديل صمام تدفق مبخر المرذاذ من غرفة الحث إلى القناع التجسيمي. قلل الأيزوفلوران إلى 1.8٪ -2.0٪ واضبط معدل التدفق وفقا لوزن الفأر (70-90 مل / دقيقة للفئران التي يتراوح وزنها بين 25 إلى 35 جم).
  4. أخرج الماوس من حجرة الحث وضعه في الجهاز التجسيمي فوق وسادة التدفئة (37 درجة مئوية) لمنع انخفاض حرارة الجسم أثناء التخدير الجراحي. ضع الأسنان الأمامية في شريط الأسنان ثم قم بتركيب قناع.
  5. ضع بعناية على قضبان الأذن. يسمح وضع الرأس الصحيح في الجهاز التجسيمي بالحركة الرأسية ولكن ليس الجانبية للرأس. تأكد من أن وضع لا يسبب ضيقا. راقب عمق التخدير وتنفس ودرجة حرارة الجسم بعناية طوال العملية.
  6. حلق الرأس من العينين إلى خلف الأذنين. نظف سطح الرأس المحلوق عن طريق المسح ب 70٪ من الإيثانول ، متبوعا بالمسح بمحلول كحول 5٪ من اليود.
  7. ضع جل العيون لمنع جفاف العين. ضع محلول ليدوكائين 4٪ موضعيا وديكساميثازون (0.02 مل عند 4 مجم / مل) تحت الجلد لمنع الألم المرتبط بالجراحة وتقليل الاستجابة الالتهابية المحتملة.
  8. باستخدام شفرة مشرط ومقص معقم ، قم بعمل شق بطول 4-5 مم على طول خط الوسط للرأس لفتح فروة الرأس. ابدأ بشق صغير بين الأذنين ثم قم بتوسيعه باستخدام المقص لتجنب تلف الجمجمة.
  9. امسح سطح الجمجمة بكمية صغيرة من بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3٪ لتصور المعالم التجسيمية: بريجما ولامدا. أوقف التفاعل باستخدام محلول ملحي كلوريد الصوديوم 0.9٪ على الفور. اكشط الأنسجة الموجودة أعلى الجمجمة باستخدام مكشطة العظام.
  10. قم بتركيب الحاقن الآلي المعد مسبقا مع حقنة هاميلتون على الذراع التجسيم. قم بتوجيه مصدر ضوء جراحي إلى الجمجمة المكشوفة وركز المجهر على البريجما.
  11. بالنظر من خلال المجهر ، قم بمعالجة ذراع الجهاز التجسيمي لتوسيط الجزء العلوي من الإبرة مباشرة فوق البرجما.
  12. باستخدام طرف الإبرة ، قم بمحاذاة البريغما واللامدا أفقيا ثم حرك الذراع للخلف إلى بريجما وسجل الإحداثيات. استخدم إحداثيات بريجما وإحداثيات الأطلس للمنطقة ذات الأهمية لحساب الإحداثيات النسبية للمنطقة المستهدفة.
  13. انقل الإبرة إلى المنطقة المستهدفة. اخفض الإبرة عند الإحداثيات الجديدة وحدد هذا الموضع. حدد موقع الحقن المجهري الفيروسي على مقربة من المنطقة المستهدفة مع مراعاة انتشار الفيروس.
    ملاحظة: سيؤدي ذلك إلى تجنب إتلاف الأنسجة في المنطقة ذات الاهتمام. استخدمنا الإحداثيات التالية لمنطقة الاهتمام: AP-3.4 ، ML -2.0 ، وللحقن المجهري الفيروسي: AP-2.0 ، ML -1.4. الإحداثيات المذكورة أعلاه هي الأمثل إذا كانت الخلايا العصبية في القشرة البصرية الأولية ستصاب.
  14. إذا أمكن ، تجنب المناطق ذات الأوعية الدموية الكبيرة. تحت المجهر الجراحي ، يجب أن تظهر الإضاءة الساطعة والباردة ، والغمر في محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪ ، الأوعية الدموية الكبيرة في الجمجمة وعلى سطح الدماغ.

4. حقن الفيروسات

  1. خذ بردا معقما للأسنان (قطره 0.5 - 0.8 مم). عند عرض سطح الجمجمة من خلال المجهر الجراحي ، قم بحفر حج صغير للقحف يدويا (يدويا) أو باستخدام مثقاب مجهري. احرص على عدم الضغط المفرط على الجمجمة.
  2. حرك الذراع بعيدا عن الطريق لمنع تلف إبرة المحقنة الدقيقة أثناء حفر حج القحف (الثقب). ضع 0.9٪ من محلول كلوريد الصوديوم الملحي وتوقف مؤقتا بشكل متقطع لتجنب تسخين العظام وإتلاف الأم الجافة. استخدم الهواء المضغوط لتفجير غبار العظام.
    ملاحظة: الأنواع التالية من أزيز الأسنان المصنوعة من الكربيد مناسبة: على شكل كمثرى (يفضل) ، أسطوانة مستديرة ، ومستديرة.
    1. عند ترقق العظم بالبر ، تأكد من أن التخفيف موحد عبر المحيط بأكمله. سيسهل ذلك إزالة العظم دون الإضرار بالأم الجافية. للقيام بذلك ، استخدم البر بطرف دائري في البداية ثم البر بطرف مسطح. حافظ على البر عموديا على العظم. خلاف ذلك ، سيكون أحد الجانبين أرق من الآخر.
      ملاحظة: بالإضافة إلى ذلك ، كلما كان حجم البر أصغر وأصغر حج القحف الذي تم إجراؤه ، كلما كان التلاعب أكثر تعقيدا. يوصى بإجراء حج القحف بقطر أصغر (0.5-0.6 مم) عند استخدام للعمل في الجسم الحي . إذا كنت تخطط لاستخدام دماغ في العمل خارج الجسم الحي ، فإن قطر حج القحف الأكبر مقبول لتبسيط الإجراء.
  3. عندما يكون العظم الرقيق ناعما وشفافا ، توقف عن الحفر. عندما تتشكل مسافة بادئة كبيرة بما فيه الكفاية في العظم ، أوقف الدوران بشكل متكرر وراقب سمك العظم. يشير ظهور تشققات في العظام إلى أن التخفيف كاف.
  4. استحم الحفرة بمحلول ملحي معقم ثم قم بإزالة المحلول الملحي الزائد بقطعة قطن. قم بإزالة الطبقة المتبقية من العظم باستخدام إبرة 27G بطرف على شكل خطاف و / أو باستخدام ملاقط رفيعة الرؤوس. تجنب إتلاف الجافية.
  5. قم بتغطية سطح الجمجمة بقطعة معقمة من المناديل الورقية المبللة بالمحلول الملحي. ضع قطعة من الفيلم النظيف والشفاف على سطح جمجمة الفأر فوق الورق.
  6. حرك الذراع التجسيمية للخلف وضع إبرة المحقنة الدقيقة في مكانها فوق الفيلم مباشرة. قم بتوزيع الزيت الزائد حتى يصل إلى حجم 2 ميكرولتر.
    ملاحظة: قد يختلف الحجم النهائي للزيت وفقا لحجم المحقنة الدقيقة. استخدمنا حقنة صغيرة سعة 5 ميكرولتر 75-RN Hamilton.
  7. ماصة حجم من الفيروس يساوي الحجم المحقون + 2 ميكرولتر على قطعة من الفيلم الشفاف.
  8. بالنظر من خلال المجهر الجراحي ، اخفض الذراع لأسفل حتى يصبح طرف الإبرة في وسط قطرة الفيروس. قم بتحميل الفيروس في المحقنة الدقيقة باستخدام حاقن آلي. تخلص من طرف الماصة الدقيقة والفيلم الشفاف في الزجاجة مع مبيض بنسبة 2٪.
  9. قم بإزالة الورق المبلل بالمحلول الملحي من سطح الجمجمة وجفف الجمجمة بقطعة قطن. استخدم الذراع التجسيمية لوضع الإبرة فوق موقع الإدخال.
  10. قم بتوزيع قطرة من الفيروس للتأكد من عدم انسداد الإبرة. اصنع شقا صغيرا في الجافية باستخدام إبرة 30 جم بطرف على شكل خطاف.
    ملاحظة: من المهم عمل أصغر شق ممكن في الأم الجافية ، مما يسمح للإبرة بالدخول دون ترك فجوة بين الإبرة وأم الجافية ، والتي يمكن أن يتسرب منها الفيروس.
  11. اخفض إبرة المحقنة إلى الجافية وقم بإجراء الحسابات المناسبة للعمق. قم بتقدير العمق القشري للإدخال بالنسبة للنقطة التي لمست فيها الإبرة سطح القشرة لأول مرة.
  12. أدخل طرف الإبرة ببطء في القشرة على عمق 300 ميكرومتر. انتظر 2-3 دقائق للسماح للجافية بالالتصاق بالإبرة ، ثم اسحب الإبرة ببطء إلى عمق 200 ميكرومتر. انتظر 2-3 دقائق أخرى للسماح لأنسجة المخ بالاستقرار. ينتج عن هذا قيام الإبرة بسحب الجافية لأعلى ، مما يخلق مساحة تحت الجافية لانتشار الفيروس.
    ملاحظة: لتقليل تلف القشرة القشرية ، استخدم إبرة 33 جم أو إبر G أقل. ضع في اعتبارك أنه كلما كان القطر الداخلي للطرف أصغر ، زادت فرصة انسداد التدفق العكسي للأنسجة. من المهم استخدام إبرة حادة بدلا من المشطوفة لأن الإبرة الحادة تطرد قطرة أكثر تحكما من المحلول الفيروسي.
    1. إذا لم تمر الإبرة عبر الأم الجافية عند خفضها إلى 150-200 ميكرومتر وبدلا من ذلك ثنيها ، فتوقف عن الخفض. ارفع الإبرة وقم بعمل شق أكبر قليلا في الأم الجافية ، ثم حاول خفض الإبرة مرة أخرى.
    2. إذا بدأ السائل النخاعي في التسرب بنشاط من الشق أثناء خفض الإبرة ، انتظر حتى يتوقف عن التسرب. خلاف ذلك ، من الصعب التحكم في الإبرة التي تمر عبر الجافية. امسح السائل الدماغي النخاعي الزائد بطرف الأنسجة. بمجرد توقف السائل عن التدفق ، ارفع الإبرة وحاول مرة أخرى.
  13. ابدأ في حقن المعلق الفيروسي بمعدل 0.06 ميكرولتر / دقيقة أثناء مراقبة الحجم الذي يتم توزيعه. حقن 1 ميكرولتر من الفيروس. حقن الفيروس على عمق واحد حتى لا تكسر الختم بين الإبرة وأنسجة القشرة.
    1. استكشاف الأخطاء وإصلاحها: في بداية الحقن ، قد يحدث ارتجاع الفيروس إلى سطح الدماغ. توقف عن الحقن ، وانتظر 2-3 دقائق ، ثم استمر في حقن الفيروس. كرر هذه الإجراءات (الخطوات) حتى يتوقف التدفق العكسي للفيروس. سوف تلتصق الفيروسات والسوائل الدماغية الشوكية بالإبرة وتمنع التدفق العكسي.
    2. طريقة أخرى لوقف التدفق العكسي للفيروس ، ضع كمية صغيرة من الاغاروز على سطح القشرة. سوف يمنع نبض القشرة وسيساعد أيضا على إغلاق الإبرة. لكن تأكد من عدم انسداد الماصة بواسطة الاغاروز.
    3. نظرا لأن الإبرة قد لا تمر بالكامل عبر الأم الجافية عند خفضها ، ولكن جزئيا فقط ، فقد لا يتناسب جانب واحد من الإبرة بإحكام مع الجافية ، مما قد يتسبب في ارتجاع الفيروس. في هذه الحالة ، اسحب الإبرة ببطء من الأنسجة وحاول خفضها مرة أخرى.
  14. بمجرد اكتمال التسريب ، احتفظ بالإبرة في الموقع المستهدف لمدة 10 دقائق إضافية. هذا يسمح للفيروس بالتشتت بعيدا عن موقع الحقن. اسحب الإبرة من الدماغ ببطء لمنع الفيروس من التدفق مرة أخرى من مجرى الإبرة.
  15. بمجرد اكتمال سحب الإبرة ، تأكد من عدم انسدادها عن طريق توزيع قطرة صغيرة من الفيروس. أغلق شق الجلد باستخدام 5-0 خيوط قابلة للامتصاص أو غير قابلة للامتصاص.

5. رعاية ما بعد الجراحة

  1. بعد إغلاق الشق ، ضع مرهما مضادا للبكتيريا موضعيا. حقن مزيج من المحلول الملحي (5 مل / كجم) و 5٪ جلوكوز (5 مل / كجم) تحت الجلد لمنع الجفاف وتسهيل الشفاء بعد التخدير. حقن الكيتوبروفين في العضل (2.5 مجم / كجم) لتقليل الألم.
  2. ضع في قفص جديد فوق وسادة تدفئة وراقبه حتى يتعافى من التخدير. بعد أن يتفاعل الفأر ، ضع في قفص منزله.

6. علم الأنسجة

  1. في موعد لا يتجاوز 21 يوما بعد حقن الفيروس ، قم بتخدير الفئران بعمق بالأيزوفلوران كما هو موضح في الخطوة 3.
  2. قم بعمل شق خط الوسط (10-15 مم) على طول منطقة الصدر باستخدام مقص ضيق وفضح تجويف الصدر. افصل الحجاب الحاجز بعناية وافتح الصدر باستخدام المقص.
  3. أدخل إبرة 22G 1 1/2 في البطين الأيسر وقم بعمل شق في الأذين الأيمن بالمقص. النفخ مع 50 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات المبرد مسبقا 100 ملي مولار (PBS) ، متبوعا ب 100 مل من الفورمالين المبرد مسبقا بنسبة 10٪.
  4. استخرج بعناية دماغ الفأر بالكامل. للقيام بذلك ، قم بعمل شق سهمي على طول وسط فروة الرأس باستخدام المقص. بعد ذلك ، قم بإزالة عظم الجمجمة قطعة قطعة باستخدام كماشة عظمية ذات أطراف مسطحة تبدأ من تقاطع الغرز السهمية واللامدويد والعمل إلى الأمام إلى عظم الأنف. عندما يتعرض الدماغ ، اقطع البصيلات الشمية ، وخفف الدماغ بملعقة منحنية ، وقم بإسقاطه في أنبوب سعة 50 مل يحتوي على 10٪ فورمالين مؤقت.
  5. إصلاح الدماغ بين عشية وضحاها. قم بتركيب أنسجة المخ على منصة معدنية من Vibratome باستخدام لاصق الأنسجة. قطع المقاطع الأمامية بسمك 50 ميكرومتر باستخدام شفرات من الصلب الكربوني.

7. تلغيم المناعة

  1. اليوم 1
    1. اغسل شرائح الدماغ 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها باستخدام 1x PBS يحتوي على 0.3٪ Triton X-100 (PBS-T). احتضان الأقسام في PBS-T لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    2. قم بحظر الارتباط غير المحدد لمدة ساعة واحدة في RT باستخدام مخزن مؤقت مانع يتكون من 5٪ مصل الماعز العادي (NGS) و 0.3٪ Triton X-100 في 1x PBS.
    3. احتضان الأقسام طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية ضد البارفالبومين أو الكالبيندين المخفف 1: 500 في المخزن المؤقت للحجب (5٪ NGS و 0.3٪ Triton X-100 في 1x PBS).
  2. اليوم 2
    1. اغسل الأقسام 3 مرات لمدة 10 دقائق في PBS-T. احتضن في الظلام لمدة ساعتين في RT مع الأجسام المضادة الثانوية (الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي الممتز ، Alexa Fluor 546) المخفف 1: 500 في المخزن المؤقت للحجب (5٪ NGS و 0.3٪ Triton X-100 في 1x PBS).
    2. اغسل الأقسام 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها في 1x PBS. انقل شرائح الدماغ إلى شرائح زجاجية باستخدام فرشاة ناعمة.
    3. أضف على الفور 0.1 مل من وسيط التثبيت المضاد للبهتان إلى كل قسم. غطي الشرائح بغطاء مقاس 22 مم × 50 مم.
    4. قم بتكوين المجهر متحد البؤر على تكبير 20x أو 60x (A/1.4، زيت). استخدم ليزر بطول موجي 488 نانومتر و 594 نانومتر للحصول على صور متعددة القنوات لمناطق الدماغ ذات الأهمية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في سلسلة تجريبية من التجارب ، استخدمنا طريقة الحقن التقليدية داخل القشرة لنقل الخلايا العصبية الهرمية للطبقة الخامسة في القشرة المخية الحديثة للفأر بواسطة AAV2 التي تحمل جين رودوبسين سريع القناة (oChIEF) المدمجة مع بروتين الفلورسنت EGFP تحت محفز CaMKII. تمشيا مع السمة المميزة ل AAV212 ، حصلنا على مساحة صغيرة نسبيا من العدوى ، لا يتجاوز عرضها 1 مم (الشكل 1 أ). ومع ذلك ، في بعض التجارب ، لاحظنا انتشارا كبيرا بشكل غير عادي ل AAV2 ، وفي بعض الحالات يغطي القشرة ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

لقد طورنا طريقة جديدة لنقل الخلايا العصبية القشرية الحديثة للفأر عن طريق حقن معلق من الجسيمات الفيروسية AAV2 في الفضاء تحت العنكبوتية في الدماغ. يوفر هذا توزيعا واسع النطاق للفيروس ، أكبر بأربعة أضعاف تقريبا من حجم الأنسجة المصاب عندما يتم حقن نفس الكمية من الفيروس مباشرة في حمة الدماغ.

يعد حقن نواقل الفيروس مباشرة في السائل الدماغي النخاعي (CSF) عبر طرق مختلفة (على سبيل المثال ، داخل المخ البطيني أو داخل القراب أو داخل القص) استراتيجية شائعة لتوصيل الجينات عل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم تنفيذ العمل بدعم مالي من مؤسسة العلوم الروسية ، بمنحة 20-15-00398P.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوية>معدات< / قوية>
10 & حقنة إحكام الغاز L موديل 1701 RN (حقنة دقيقة هاميلتون 5 uL 75 RN)شركة هاميلتونالجزء / المرجع # 7634-01 ، هاميلتون أو رقم القط. HAM7634-01 ، ميرك
إبرة 33 G RN ، نمط النقطة 3شركة هاميلتونالجزء / المرجع # 7803-05 ، هاميلتون
مجهر مجهرنيكون أو ميكروميدنموذج MC-4 ZOOM
مجهر متحد البؤر بالليزر القائم على سيرناThorLabs
مصدر الضوء الباردRWDنموذج 76312
لايكا VT1000 S الميكروتوم الاهتزازيلايكا بيوسيستمز76001-014
نظام تخدير منخفض التدفق مع مجموعة بدايةمؤسسة كينت العلمية13-005-111 (نموذج SomnoSuite)
ماصة ميكانيكية 0.1 – 2.5 & إل إيبندورف للأبحاث بلسإيبندورف3123000012
ماصة ميكانيكية 10 &ndash ؛ 100 & إل إيبندورف للأبحاث بلسإيبندورف3123000047
ماكينة حلاقة الفئرانRWDنموذج CP-5200
Microdrill مع لقم الثقب (0.5 مم، مستديرة)RWD78001, 78040
أو أداة تجسيمية رقمية Desctop ، قناع تخدير الماوس ، قضبان أذن الماوس (60 درجة)RWDطرازات 68027 ، 68665 ، 68306
ضاغط هواءبامبيب بي 8
ماصة يدوية أحادية القناة 0.5-10 µ ؛ Lرين17008649
أداة تجسيميك للحيوانات الصغيرةكوبفنموذج 962
حاقن تجسيميStoelting10-000-004
<أدوات قوية>جراحية (أدوات) < / قوية>
30 جرام إبرة أسنان (Ni-pro)شركة Biodent المحدودةلشق الجافية
مكشطة العظامأدوات العلوم الجميلة10075-16
كماشة العظامأدوات العلوم الجميلة16025-14لإزالة عظم الجمجمة
ملعقة منحنيةمصنع موزايسك للمستلزمات الطبيةلإزالة الدماغ من قبو الجمجمة
بر الأسناندريندل + زويلينجلبضع القحف. شكل: كمثرى على شكل / اسطوانة نهاية مستديرة / دائرية. قطر الطرف: قطر 0.55-0.8 مم
حامل الإبرة (حامل الإبرة الصغيرة هالسي)أدوات العلوم الجميلة12500-12
خياطة جراحية من مادة البولي بروبلين أو خياطة جراحية فيكريل (5-0 ، قابلة للامتصاص)منتجات والتر (إيثيكون)S139044 (W9442)
مقبض مشرط (# 3) مع شفرات مشرط (# 11)أدوات العلوم الجميلة10003-12, 10011-00
مقص (مقص ضيق للغاية)أدوات العلوم الجميلة14088-10لقص الجلد
مقص (مقص ناعم)أدوات العلوم الجميلة14094-11لقطع خياطة
خياطة جراحية PROLENE (بولي بروبتين)إيثيكون (جونسون آند جونسون)
ملاقط (ملقط # 5)أدوات العلوم الجميلة11252-20
ملاقط (ملقط إينوكس مصقول)أدوات العلوم الجميلة11210-20
<قوي> يمكن التخلص منها< / قوي>
1 مل حقنة الأنسولينموقعلتحميل زيت الفازلين في حقنة دقيقة، لإعطاء الأدوية
لوحة زراعة الخلاياSPL علوم الحياة
مسحات القطن
غطاء النظاراتفيشر العلمية12-545 [إ]
إبرة حقنة الأنسولين (27 جم)موقعلإزالة الحطام من ثقب (بضع القحف)
مناديل خالية من الوبر CLEANWIPERنت لينك
شرائح المجهرفيشر العلمية12-550-15
مناشف ورقيةلوسكان
بارافيلممختبر الإحصائياتSTLPM996
قفازات جراحية معقمةديرماجريب
مرشح حقنة معقمة (0.2 μ m)كورنينج431229
<قوية> أدوية/مواد كيميائية (كواشف)
10٪ فورمالين مخزن مؤقت أو 4٪ بارافورمالديهايدالكيماويات العلمية الحراريةJ61899. حزب العداله
محلول كحول اليود (5٪))تجديد
مرهم مضاد حيوي بانيوسين (باسيتراسين + نيومايسين)ساندوزعامل مضاد للبكتيريا للاستخدام الخارجي
أكوا بولي ماونتعلوم متعددة18606-20
كاربومر جل للعين فيديسيك (جل العيون)باوش + لومب (سانتين)
الكربوكسيل المجهري الفلوري المعدل (أحمر)ثيرمو فيشر العلميإف -8801
ديكساميثازون (4 مجم / مل)إيلارا (KRKA)الجلوكوكورتيكويد الاصطناعي
H2O المقطر
الإيثانول (70٪)
فليكسوبروفين 2.5٪ (كيتوبروفين)فيكمضادات الالتهاب غير الستيرويدية (NSAIDs)
محلول الجلوكوز 5٪سولوفارم
الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) الممتص ، أليكسا فلور 546ثيرمو فيشر العلميأ -11010
إيزوفلورانكاريزو
محلول الليدوكائين (2٪ / 4٪)سولوفارم
مصل الماعز العادي (NGS)أبكامأب7481
محلول ملحي مخزن من الفوسفات (PBS)الخدمة البيئية
الأجسام المضادة للأرنب المضادة للبارفلبومينميرك ميليبورAB15736
الأرنب المؤتلف أحادي النسيلة المضاد للجسم المضاد للكالبيندينأبكامأب108404
محلول ملحي (0.9٪ كلوريد الصوديوم في H2O)سولوفارم
تريتون X-100سيجما ألدريتش50-178-1844
زيت الفازلينجينيل

المراجع

  1. Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57 (5), 634-660 (2008).
  2. Sena-Esteves, M., Gao, G. Introducing Genes into Mammalian Cells: Viral Vectors. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (8), (2020).
  3. Kootstra, N. A., Verma, I. M. Gene Therapy with Viral Vectors. Ann Rev Pharmacol Toxicol. 43 (1), 413-439 (2003).
  4. Paterna, J. C., Feldon, J., Büeler, H. Transduction profiles of recombinant adeno-associated virus vectors derived from serotypes 2 and 5 in the nigrostriatal system of rats. J Virol. 78 (13), 6808-6817 (2004).
  5. Monahan, P. E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus vectors for gene therapy: more pros than cons. Mol Med Today. 6 (11), 433-440 (2000).
  6. Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21 (4), 583-593 (2008).
  7. Jooss, K., Chirmule, N. Immunity to adenovirus and adeno-associated viral vectors: implications for gene therapy. Gene Ther. 10 (11), 955-963 (2003).
  8. Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L. 3rd, Strohl, W. R. Adeno-Associated Virus (AAV) as a Vector for Gene Therapy. BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
  9. Gao, G., Vandenberghe, L., Wilson, J. New Recombinant Serotypes of AAV Vectors. Curr Gene Ther. 5 (3), 285-297 (2005).
  10. Büning, H., Perabo, L., Coutelle, O., Quadt-Humme, S., Hallek, M. Recent developments in adeno-associated virus vector technology. J Gene Med. 10 (7), 717-733 (2008).
  11. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PloS One. 8 (9), e76310-e76310 (2013).
  12. Watakabe, A., et al. Comparative analyses of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 8 and 9 in marmoset, mouse and macaque cerebral cortex. Neurosci Res. 93, 144-157 (2015).
  13. de Solis, C. A., et al. Adeno-associated viral serotypes differentially transduce inhibitory neurons within the rat amygdala. Brain Res. 1672, 148-162 (2017).
  14. Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. Controlling AAV Tropism in the Nervous System with Natural and Engineered Capsids. Meth Mol Biol. 1382, 133-149 (2016).
  15. Howard, D. B., Powers, K., Wang, Y., Harvey, B. K. Tropism and toxicity of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 6, 7, 8, and 9 in rat neurons and glia in vitro. Virology. 372 (1), 24-34 (2008).
  16. Royo, N. C., et al. Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity. Brain Res. 1190, 15-22 (2008).
  17. Burger, C., et al. Recombinant AAV Viral Vectors Pseudotyped with Viral Capsids from Serotypes 1, 2, and 5 Display Differential Efficiency and Cell Tropism after Delivery to Different Regions of the Central Nervous System. Mol Ther. 10 (2), 302-317 (2004).
  18. Cearley, C. N., Wolfe, J. H. Transduction characteristics of adeno-associated virus vectors expressing cap serotypes 7, 8, 9, and Rh10 in the mouse brain. Mol Ther. 13 (3), 528-537 (2006).
  19. Klein, R. L., Dayton, R. D., Tatom, J. B., Henderson, K. M., Henning, P. P. AAV8, 9, Rh10, Rh43 vector gene transfer in the rat brain: effects of serotype, promoter and purification method. Mol Ther. 16 (1), 89-96 (2008).
  20. Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors. Neuroscience. 161 (2), 441-450 (2009).
  21. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
  22. Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).
  23. Abbott, S. B. G., et al. Photostimulation of retrotrapezoid nucleus phox2b-expressing neurons in vivo produces long-lasting activation of breathing in rats. J Neurosci. 29 (18), 5806-5819 (2009).
  24. Lawlor, P. A., Bland, R. J., Mouravlev, A., Young, D., During, M. J. Efficient gene delivery and selective transduction of glial cells in the mammalian brain by AAV serotypes isolated from nonhuman primates. Mol Ther. 17 (10), 1692-1702 (2009).
  25. Adamantidis, A. R., Zhang, F., de Lecea, L., Deisseroth, K. Optogenetics: Opsins and Optical Interfaces in Neuroscience. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (8), (2014).
  26. Zhang, F., et al. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nat Protoc. 5 (3), 439-456 (2010).
  27. Passini, M. A., Watson, D. J., Wolfe, J. H. Gene Delivery to the Mouse Brain with Adeno-Associated Virus. Methods Mol Biol. 246, 225-236 (2004).
  28. Davidson, B. L., et al. Recombinant adeno-associated virus type 2, 4, and 5 vectors: Transduction of variant cell types and regions in the mammalian central nervous system. Proc Natl Acad Sci. 97 (7), 3428-3432 (2000).
  29. Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning. Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).
  30. Harris, K. D., Shepherd, G. M. G. The neocortical circuit: themes and variations. Nat Neurosci. 18 (2), 170-181 (2015).
  31. Carrillo-Reid, L., Yang, W., Kang Miller, J., Peterka, D. S., Yuste, R. Imaging and Optically Manipulating Neuronal Ensembles. Ann Rev Biophy. 46 (1), 271-293 (2017).
  32. Smirnov, I. V., et al. Plasticity of Response Properties of Mouse Visual Cortex Neurons Induced by Optogenetic Tetanization In Vivo. Curr Issues Mol Biol. 46 (4), 3294-3312 (2024).
  33. Snyder, B. R., et al. Comparison of Adeno-Associated Viral Vector Serotypes for Spinal Cord and Motor Neuron Gene Delivery. Human Gene Ther. 22 (9), 1129-1135 (2011).
  34. Schuster, D. J., et al. Biodistribution of adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) vector after intrathecal and intravenous delivery in mouse. Front Neuroanat. 8, 42(2014).
  35. Bedbrook, C. N., Deverman, B. E., Gradinaru, V. Viral Strategies for Targeting the Central and Peripheral Nervous Systems. Ann Rev Neurosci. 41 (1), 323-348 (2018).
  36. Lo, W. D., et al. Adeno-Associated Virus-Mediated Gene Transfer to the Brain: Duration and Modulation of Expression. Human Gene Ther. 10 (2), 201-213 (1999).
  37. Gray, S. J., Nagabhushan Kalburgi, S., McCown, T. J., Ju de Samulski, R. Global CNS gene delivery and evasion of anti-AAV-neutralizing antibodies by intrathecal AAV administration in non-human primates. Gene Ther. 20 (4), 450-459 (2013).
  38. Del Bigio, M. R. Ependymal cells: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119 (1), 55-73 (2009).
  39. Daci, R., Flotte, T. R. Delivery of Adeno-Associated Virus Vectors to the Central Nervous System for Correction of Single Gene Disorders. Int J Mol Sci. 25 (2), 1050(2024).
  40. Dasgupta, K., Jeong, J. Developmental biology of the meninges. Genesis. 57 (5), e23288-e23288 (2019).
  41. Mestre, H., Mori, Y., Nedergaard, M. The Brain's Glymphatic System: Current Controversies. Trends Neurosci. 43 (7), 458-466 (2020).
  42. Donsante, A., et al. Intracerebroventricular delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the adult rat brain. Gene Ther. 23 (5), 401-407 (2016).
  43. Hordeaux, J., et al. Long-term neurologic and cardiac correction by intrathecal gene therapy in Pompe disease. Acta Neuropathol Comm. 5 (1), 66(2017).
  44. Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nat Biotechnol. 34 (2), 204-209 (2016).
  45. Zhang, H., et al. Several rAAV vectors efficiently cross the blood-brain barrier and transduce neurons and astrocytes in the neonatal mouse central nervous system. Mol Ther. 19 (8), 1440-1448 (2011).
  46. Radhiyanti, P. T., Konno, A., Matsuzaki, Y., Hirai, H. Comparative study of neuron-specific promoters in mouse brain transduced by intravenously administered AAV-PHP.eB. Neurosci Lett. 756, 135956(2021).
  47. Li, X., et al. Skin suturing and cortical surface viral infusion improves imaging of neuronal ensemble activity with head-mounted miniature microscopes. J Neurosci Meth. 291, 238-248 (2017).
  48. Scala, F., et al. Layer 4 of mouse neocortex differs in cell types and circuit organization between sensory areas. Nat Comm. 10 (1), 4174(2019).
  49. Thomson, A. M. Neocortical layer 6, a review. Front Neuroanat. 4, 13(2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

AAV2
نقل واسع النطاق للخلايا العصبية القشرية الحديثة للفأر عن طريق الحقن تحت العنكبوتية ل AAV2
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.