مقالة منهجية

سير العمل باستخدام مجهر مضان وإلكتروني وشعاع أيوني متزامن مبرد للطحن المستهدف للخلايا

DOI:

10.3791/68238

⸱

أكتوبر 17, 2025

 ,  ,  , 
1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology, 2SLAC National Accelerator Laboratory, 3Department of Chemistry and Biochemistry, Brigham Young University, 4Department of Photon Science and Structural Biology, Stanford University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتيح سير العمل هذا إنتاج الصفيحة التي تستهدف الهياكل البيولوجية ذات العلامات الفلورية الصغيرة (<1 ميكرومتر في المدى المحوري) والنادرة (نسخة واحدة لكل خلية) باستخدام منصة تصوير ثلاثية متزامنة مبردة. تدمج هذه المنصة الفحص المجهري الفلوري ، وطحن الشعاع الأيوني المركز ، والفحص المجهري الإلكتروني الماسح في موضع بؤري واحد وتمكن الفحص المجهري الفلوري المتزامن أثناء الطحن.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبح طحن الشعاع الأيوني المركز بالتبريد باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (CryoFIB-SEM) هو النهج السائد لإعداد صفائح الخلايا بسمك أقل من 200 نانومتر للتصوير المقطعي الإلكتروني المبرد (CryoET). في الآونة الأخيرة ، تم دمج الفحص المجهري الفلوري في أنظمة CryoFIB-SEM لتوجيه إنتاج الصفيحة نحو الأهداف الفلورية. ومع ذلك ، في معظم التطبيقات ، تحتوي أنظمة التصوير البصري والشعاع الأيوني على مستويات بؤرية مميزة في مناطق مختلفة من غرفة التفريغ - تعمل بشكل فعال كمجهرين منفصلين. يتطلب هذا التكوين تسجيل الصورة بين الطرائق ، والتي غالبا ما تفتقر إلى الدقة اللازمة لاستهداف الهياكل الصغيرة والنادرة في الموقع بشكل موثوق. نحن نقدم سير عمل يعتمد على منصة تصوير ثلاثية متزامنة مخصصة تتيح التصوير الفلوري المتزامن وطحن الشعاع الأيوني المركز. يسمح ذلك بردود فعل مضان في الوقت الفعلي يمكن استخدامها لتحديد وقت إنهاء الطحن من أجل الحفاظ على الهياكل ذات العلامات الفلورية ذات الأهمية في الصفيحة النهائية. باستخدام هذا النهج ، استهدفنا مركز تنظيم الأنابيب الدقيقة (MTOC) في البلاعم المزججة وحققنا معدل نجاح >60٪ ، أكده التصوير المقطعي الإلكتروني المبرد اللاحق والفحص المجهري للضوء والإلكترون المرتبط.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتيح التصوير المقطعي الإلكتروني المبرد (CryoET) تصور العينات البيولوجية في حالة شبه أصلية بدقة جزيئيةكبيرة 1،2،3،4،5،6،7،8،9،10،11. ومع ذلك ، فإن سمك الخلايا حقيقية النواة - غالبا عدة ميكرونات - يتجاوز متوسط المسار الحر (~ 300 نانومتر) البالغ 300 كيلو فولت إلكترونات ، مما يحد من عمق اختراق الإلكترونات غير المتناثرة وبالتالي تقييد سمك العينة القابلة للاستخدام. لمعالجة هذا الأمر ، يمكن استخدام شعاع أيوني مركز (FIB) لاستئصال معظم الخلية المحفوظة بالتبريد في عملية تعرف باسم طحن CryoFIB ، مما ينتج عنه صفائح رقيقة بما يكفي لتصوير CryoET12،13،14،15،16.

في مهام سير العمل التي تم الإبلاغ عنها سابقا ، يتم حفظ العينات أولا في الجليد المزجج عن طريق التجميدالغاطس 17،18،19 ثم يتم تحميلها في أداة مزدوجة الحزمة مزودة بكل من CryoFIB والمجهر الإلكتروني الماسح (SEM). يمكن استخدام تصوير SEM لتحديد السمات تحت الخلوية ذات الأهمية مثل العضيات وحتى بعض الهياكل البروتينية20،21. يمكن استخدام هذه المعلومات لتوجيه عملية طحن CryoFIB ، حيث يتم استئصال العينة بطريقة تدريجية بهدف إنتاج صفيحة بسمك أقل من 200 نانومتر مناسبة ل CryoET13،14،22. ومع ذلك، فإن هذا النهج يطرح تحديين رئيسيين يعالجهما البروتوكول الحالي. أولا ، غالبا ما يكون من الضروري الحصول على CryoET من هياكل بروتينية معينة ، ولكن يمكن أن يكون SEM ضارا ، ولا يمكن تمييز معظم الهياكل البروتينية بواسطة SEM عند تصوير المواد البيولوجية غير الملوثة. كيف يمكن توجيه الطحن بدقة إلى مناطق أو مناطق تحت خلوية محددة تحتوي على جزيئات حيوية محددة بطريقة خالية من التلف؟ ثانيا ، حتى بعد إنتاج الصفائح الرقيقة و CryoET اللاحقة ، قد يكون من الصعب تحديد جزيئات حيوية معينة في عمليات إعادة البناء النهائية بسبب عدم كفاية الدقة ، ونسبة الإشارة إلى الضوضاء ، و / أو التباين المطلوب للتحديد الذي لا لبس فيه. كيف يمكن تحديد المواضع المكانية لهذه الجزيئات الحيوية في عمليات إعادة بناء ET بالتبريد؟

لمواجهة كلا التحديين ، تحول المجال بشكل متزايد إلى الفحص المجهري الفلوري. تستخدم البروتينات الفلورية المشفرة وراثيا أو الأصباغ الخارجية التي تربط البروتينات المستهدفة بشكل روتيني لتسمية جزيئات حيوية محددة ذات أهمية5،23،24. يمكن ربط الفحص المجهري الفلوري المبرد للخلايا المزججة المأخوذة بعد الطحن بالتصوير المقطعي الناتج. هذا النهج ، المعروف باسم الضوء المتسلسل المبرد والفحص المجهري الإلكتروني (CryoCLEM) ، راسخ وقد استخدم على نطاق واسع لتوطين بروتينات معينة داخل عمليات إعادة بناء CryoET5،12،23،24. تشمل التطورات الحديثة استخدام أجهزة الاستشعار الحيوية الفلورية وطرق الدقة الفائقة لتعزيز المعلومات التكميلية والدقة المكانية25،26،27،28،29.

CryoCLEM هي إحدى الطرق للتغلب على التحدي الثاني المحدد أعلاه ، مما يسمح بتحديد موقع بروتينات معينة داخل الصفيحة. ومع ذلك ، فإن CryoCLEM لا يفعل شيئا للمستخدم إذا كانت الصفيحة النهائية لا تحتوي على البروتينات ذات الأهمية. لحسن الحظ ، يمكن أيضا استخدام الفحص المجهري الفلوري لتوجيه الطحن إلى المناطق ذات الأهمية. في حين أن طحن FIB الموجه بالفلورسنت هو تطور أحدث من CryoCLEM ، فقد ظهرت تدفقات العمل الأولية منذ حوالي عقدمن الزمان 12 ، فقد وجد اعتمادا سريعا وواسع النطاق. اعتمدت البروتوكولات المبكرة على المجاهر الضوئية الخارجية للحصول على مجموعات بيانات مضان ثنائية الأبعاد أو ثلاثية الأبعاد ، والتي تم تسجيلها بعد ذلك في صور SEM والشعاع الأيوني بعد نقل العينة إلى CryoFIB-SEM. في الآونة الأخيرة ، تم دمج المجاهر الفلورية مباشرة في غرف التفريغ CryoFIB-SEM. يقلل هذا التكامل من تلوث الجليد أثناء عمليات النقل ويتيح تصوير الصفيحة النهائية بسهولة أكبر. تم الآن تطوير العديد من المنصات للجمع بين الفحص المجهري الفلوري و CryoFIB-SEM للطحن الموجه بالفلورة. لقد استهدفت هذه بنجاح العضيات ومجمعات البروتين الكبيرة5،23،24. ومع ذلك ، مع استثناءات قليلة30 ، ينتج المسار البصري مستوى بؤريا منفصلا في منطقة فيزيائية مختلفة من غرفة التفريغ عن FIB-SEM. نتيجة لذلك ، لا يزال التسجيل الدقيق بين الصور الفلورية والأيونية مطلوبا لتوجيه الطحن ، تماما كما هو مطلوب مع استخدام المجاهر الضوئية المستقلة.

عملية التسجيل هذه عرضة لعدم الدقة بسبب ثلاثة عوامل رئيسية: عدم تطابق معامل الانكسار (الذي يسبب تحولات بؤرية واضحة) 31،32 ، وحركة العينة أثناء الطحن ، وخطأ التوطين. علاوة على ذلك ، عادة ما يتم مساعدة التسجيل من خلال الائتمانات الفلورية بحجم الميكرون المرئية في كل من الطرائق الأيونية والبصرية وتستخدم كأزواج نقاط محاذاة لحساب التحولات بين الصور الأيونية والبصرية. ومع ذلك ، يمكن لهذه الخرزات أن تحجب أو تتنافس مع إشارة التألق من العينة ، كما أن توطينها ومحاذاة عبر الصور البصرية والأيونية بطيئة ومكثفة للمستخدم. معا ، أعاقت هذه القيود الاستهداف الروتيني للميزات الصغيرة والنادرة. في حين أنه من الصعب تحديد حد دقيق للهياكل التي يمكن الحفاظ عليها حاليا في الصفائح الرقيقة ، فإن الأساليب القائمة على التسجيل تعتبر بشكل عام غير فعالة لالتقاط الأهداف ذات الأبعاد المحورية أقل من ميكرونواحد 33.

هنا ، نبلغ عن استخدام نظام تصوير ثلاثي متزامن يدمج FIB و SEM والفحص المجهري الفلوري في موضع بؤري واحد34،35. يسمح هذا التكوين بطحن موجه بالتألق بشكل أبسط وأكثر دقة مقارنة بعمليات التكامل غير المتزامنة عن طريق إزالة الحاجة إلى تسجيل الصور الضوئية والأيونية. في ظل الظروف المثالية للخلفية المنخفضة والإشارة العالية ، يمكن تحقيق دقة التوجيه في حدود 10 نانومتر36. كما يسمح بالحصول على بيانات الفحص المجهري الفلوري المبرد متعدد الألوان طوال عملية الطحن ، بما في ذلك من الصفيحة الرقيقة النهائية ، مما يتيح التحليل الارتباطي وتوطين الأهداف المحدودة للحيود الفرعي35. لتحقيق ذلك ، نستخدم مجموعة أدوات تحويل الصورة المخصصة لمحاذاة صور التألق هذه بدقة مع الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال منخفض التكبير لتحديد مكان جمع CryoET ، وتبسيط جمع البيانات وضمان التقاط الهدف في عمليات إعادة البناء المقطعية النهائية.

لتوجيه الطحن ، نستغل قدرة النظام على مراقبة التغيرات في شدة التألق في الوقت الفعلي. بدلا من محاولة محاذاة الصور البصرية والأيونية للعثور على هدفنا ، يراقب المستخدم ببساطة إشارة الفلورسنت من العينة. مع تقدم الطحن ، يتصرف التألق بطريقة مميزة للغاية: يصبح أولا أكثر إشراقا مع إزالة فيلم دعم الكربون بين هدف المجهر والعينة المسماة بالفلورسنت ، ثم ينخفض تدريجيا مع طحن المواد الفلورية الذاتية الخارجة عن التركيز ، وأخيرا ، ينخفض بشكل حاد مع إزالة الهيكل المسمى نفسه جزئيا. تحدد هذه الإشارة في الوقت الفعلي بدقة مكان وجود المرء في عملية الطحن ومتى يتوقف عن الطحن ، مما يضمن الاحتفاظ بالهدف محل الاهتمام داخل الصفيحةالنهائية 37. في البروتوكول التفصيلي ، سنناقش أيضا نهجا أكثر تقدما يستخدم التذبذبات في سطوع التألق بسبب تأثيرات قياس التداخل لتوجيه الطحن إلى الأجسام التي يبلغ طولها <300 نانومتر في المدى المحوري.

نوضح فائدة المنصة من خلال استهداف مركز تنظيم الأنابيب الدقيقة (MTOC) 38. MTOC هي عضية مهمة تشارك في انقسام الخلايا وتمايزها. في خلايا الثدييات ، يكشف الفحص المجهري الفلوري للتوبولين المسمى عن MTOC كثقل فلوري واحد يبلغ قطره حوالي 1 ميكرومتر في الخلايا الحية. تم استخدام هذا النهج لتوطين MTOC بنجاح بدقة عالية للصفائح الرقيقة للخلايا المزججة. تم الكشف عن التنظيم التفصيلي للأنابيب الدقيقة في MTOC وتفاعلاتها مع العضيات الأخرى في عمليات إعادة البناء المقطعية اللاحقة. يتيح سير العمل هذا الفحص المجهري الفلوري عالي الدقة و CryoFIB-SEM بدون تسجيل ، مما يقلل من مدخلات المستخدم ويوسع الوصول إلى الهياكل الخلوية التي كانت في السابق صغيرة للغاية لالتقاطها بقوة مع الأساليب غير المتزامنة.

التعاريف ووصف الصك
تم وصف المجهر البصري المتكامل بالتفصيل في Boltje et al.35 ، ويمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول استخدام المجهر المتكامل في البروتوكول34 المنشور مؤخرا. تم دمج الهدف من الأسفل ومجهز بقدرات تحديد المواقع x و y و z لتمكين المحاذاة مع نقطة متزامنة FIB-SEM. تعمل حاليا بهدف 100x و 0.85 NA مع مصحح غطاء. يتم إجراء التصوير البصري من خلال غطاء زجاجي ، والذي يحمي الهدف من المواد المتناثرة والتشعيع من كل من FIB و SEM. يتم توفير إضاءة المجال العريض من خلال مجموعة من مصابيح LED التي تمتد عبر أطوال موجية مرئية متعددة. يتم الكشف عن التألق باستخدام كاشف sCMOS. هناك ثلاثة أوضاع مرحلية محددة: التحميل: موضع المرحلة حيث يتم تحميل العينة. الطلاء: موضع المرحلة للطلاء عبر نظام حقن الغاز ؛ 3-Beam: موضع المرحلة الذي يمكن من خلاله محاذاة جميع المجاهر الثلاثة (FIB و SEM والبصرية).

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: النظام ثلاثي الاتفاق المستخدم هنا هو مكون تصوير مضان مبرد مخصص مدمج في نظام FIB-SEM ثنائي الشعاع متاح تجاريا. يمكن تكييف مبدأ وترتيب العمليات بشكل عام مع التطبيقات الثلاثية المتزامنة في المستقبل.

1. الإعداد

  1. تبريد النظام إلى درجة حرارة مبردة. راقب درجة الحرارة باستخدام مستشعرين: أحدهما موجود في مرحلة العينة والآخر داخل الغرفة. حافظ على مرحلة العينة أكثر دفئا بمقدار 20 درجة مئوية من الغرفة (على سبيل المثال ، المرحلة عند ~ -170 درجة مئوية ، الغرفة عند ~ -190 درجة مئوية) لتقليل تراكم الجليد على العينة. تستغرق عملية التبريد عادة حوالي 1.5 ساعة.

2. تحميل العينة

  1. استخدم النيتروجين السائل لتبريد محطة النقل يدويا بمجرد أن تقترب درجة حرارة النظام من درجة الحرارة المبردة (حوالي -167.5 درجة مئوية). يتم عرض درجة حرارة النظام في الزاوية العلوية اليسرى من برنامج الفحص المجهري الضوئي.
  2. قم بتحميل شبكة تلقائية مقطوعة واحدة في علبة العينة المصممة لنظام الفحص المجهري للضوء المبرد. يتكون الكاسيت من غطاء لاصق وفاصل ، مع وضع Autogrid بينهما. أغلق الكاسيت عن طريق إحكام ربط المسمار الدائري، ثم أدخله في الفتحة الموجودة على محطة النقل34.
  3. قم بتوصيل محطة النقل بالنظام واستخدم كاميرا الغرفة الداخلية لتوجيه علبة العينة إلى مرحلة العينة.

3. نظام حقن الغاز (GIS) لطلاء العينة

  1. افتح برنامج التحكم المجهري الضوئي وانقل مرحلة العينة من وضع التحميل إلى وضع الطلاء .
  2. أدخل إبرة GIS باستخدام برنامج التحكم FIB-SEM بالنقر فوق أيقونة ندفة الثلج. تحت التحكم في نظم المعلومات الجغرافية ، اختر الخيار إدخال إبرة GIS.
  3. السماح بترسيب نظم المعلومات الجغرافية لمدة 30 ثانية عن طريق فتح تدفق الغاز.
    ملاحظة: يختلف هذا من 20 ثانية إلى 1 دقيقة بناء على نوع العينة. الهدف من هذه الخطوة هو حماية العينة بشكل كاف أثناء إجراء طحن FIB اللاحق.
  4. سحب إبرة نظم المعلومات الجغرافية ، انقل مرحلة العينة مرة أخرى إلى موضع التحميل المحدد مسبقا.

4. محاذاة نظام ثلاثي الشعاع

ملاحظة: هذا القسم مقتبس من Wang39.

  1. في برنامج الفحص المجهري الضوئي ، انقل مرحلة العينة من موضع التحميل إلى موضع 3 حزم محدد مسبقا.
  2. في برنامج FIB-SEM ، انقر فوق النافذة العلوية اليسرى واضبط SEM على تكبير 100x.
  3. في علامة التبويب محاذاة في برنامج الفحص المجهري الضوئي ، انقر فوق وظيفة العرض للحصول على أطلس SEM للشبكة. تستخدم صورة الأطلس هذه معلمات محددة مسبقا.
  4. حدد مساحة مربعة بها فيلم كربوني مكسور وانقر فوقها نقرا مزدوجا لنقل مرحلة العينة إلى هذا الموقع.
  5. ارجع إلى برنامج التحكم FIB-SEM واضبط SEM على تكبير أعلى للتركيز على المنطقة المربعة المحددة ، المتمركزة في مجال الرؤية.
  6. كرر الخطوتين 4.4 و4.5 حسب الحاجة حتى يتم تركيز SEM على نمط مميز، مثل الحافة الحادة لطبقة كربونية مكسورة.
  7. قم بتشغيل مجهر التألق واضبط إحداثيات x و y و z لتتناسب مع عرض SEM.
  8. طحن نمط صغير باستخدام FIB ، على سبيل المثال ، مستطيل صغير أو دائرة.
  9. تأكد من أن النمط مرئي في كل من عرض FIB والمجهر الفلوري. إذا لزم الأمر، اضبط المحاذاة باتباع الخطوات 4.3-4.7 إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: اكتملت محاذاة وتسجيل المجاهر الضوئية والأيونية.

5. التوطين المستهدف والطحن

ملاحظة: هذا القسم مقتبس من Wang39.

  1. انتقل إلى علامة التبويب "الترجمة" في برنامج الفحص المجهري الضوئي ، وقم بإعداد قنوات الفلورسنت عن طريق تنشيط ظروف الإثارة والتصفية المناسبة. قم بتعيين كل فلوروفور كقناة منفصلة وقم بتضمين قناة إضافية للضوء المرسل (أو المجال الساطع).
  2. حدد الهدف محل الاهتمام عن طريق ضبط طاقة LED ووقت التعرض لكل قناة فلورسنت. كمرجع ، عند تصوير SiR-tubulin ، استخدم تعريضا ضوئيا لمدة 1.2 ثانية مع إعداد طاقة LED ثابت يبلغ 30 ميجاوات.
    ملاحظة: قد تختلف المعلمات بين الفلوروفورات. يجب أن تظل الشدة البصرية أقل من ~ 25-50 واط / سم2 في العينة. يمكن أن تؤدي الكثافة الأكبر من ذلك إلى تسخين كبير وتفكيك العينة37،40.
  3. بمجرد الرضا عن المعلمات ، احصل على مكدس z فلورسنت مسبق الطحن يخطو عبر الاتجاه المحوري. ثم حدد الهدف على أنه عائد استثمار.
  4. قم بالتبديل إلى برنامج FIB-SEM لرسم صفيحة عند عائد الاستثمار.
  5. قم بإجراء طحن خشن لإزالة الجزء الأكبر من المواد حوالي 3 ميكرومتر أعلى وأسفل عائد الاستثمار. وفي الوقت نفسه ، احتفظ بالمجهر الفلوري أثناء الطحن لمراقبة أي انخفاض في إشارة الفلورسنت.
  6. قم بتخفيف عائد الاستثمار إلى ~ 2 ميكرومتر باستخدام وضع المقطع العرضي للتنظيف.
  7. افتح مجموعة أدوات قياس التداخل المستندة إلى Python من الجهاز لمراقبة إشارة الفلورسنت أثناء تخفيف الصفيحة (https://github.com/pdahlb/trico_softwaresuite)36.
  8. للطحن والتلميع اللاحقين ، اتبع أحد الطريقتين الموضحين أدناه في الخطوتين 5.9 أو 5.10 لتوجيه الطحن بناء على أبعاد الأهداف المحددة.
    1. المدى المحوري للهدف > 300 نانومتر
      ملاحظة: هنا سوف نستخدم نهجا شبه مدمر للطحن المباشر.
      1. في Python-GUI ، حدد الهدف محل الاهتمام في التصوير المجهري الفلوري. سيبدأ البرنامج تلقائيا في رسم السطوع كدالة للوقت مع كل إطار جديد.
      2. مراقبة شدة التألق من خلال مجموعة أدوات Python. قم بطحن العينة في وضع المقطع العرضي للتنظيف من الأسفل لإزالة أي مادة فيلم دعم متبقية إن أمكن.
        ملاحظة: عند إزالة فيلم الدعم ، يجب ملاحظة تحسين في التألق.
      3. استخدم الانخفاض السريع في شدة التألق - مما يشير إلى فقدان مادة الفلورسنت - كإشارة إلى وقت تبديل اتجاهات الطحن. على سبيل المثال ، إذا لوحظ الطحن من الأسفل إلى الأعلى ولوحظ انخفاض حاد في التألق ، فتوقف عن الطحن وانتقل إلى الطحن من أعلى إلى أسفل.
        ملاحظة: إذا تمت إزالة الهيكل بسرعة كبيرة، فقم بتقليل تيار التفريز في برنامج FIB-SEM لإبطاء إزالة الهدف.
    2. المدى المحوري للهدف ≤ 300 نانومتر
      ملاحظة: هنا ، سوف نستخدم تأثير قياس التداخل لتوجيه الطحن36.
      1. في Python-GUI ، حدد الهدف محل الاهتمام في التصوير المجهري الفلوري. سيبدأ البرنامج تلقائيا في رسم السطوع كدالة للوقت مع كل إطار جديد.
      2. ابدأ بالطحن من أعلى إلى أسفل من خلال هدف اختبار. راقب التباين الهامشي قبل الطحن مباشرة من خلال الهدف من خلال شدة التألق. يتناسب هدف التألق باستمرار مع 2D Gaussian ، مع استخدام الملاءمة للحصول على كثافة متكاملة يتم رسمها بعد ذلك.
      3. بعد طحن الهدف، قم بتركيب التذبذبات في تتبع الشدة مع دالة النموذج التالية باستخدام واجهة المستخدم الرسومية Python:
        figure-protocol-1
        حيث A هو سعة التذبذب ، λ الطول الموجي للإثارة ، ك مصطلح الترطيب الذي يمثل طول تماسك مصدر الضوء ، وعامل الطور Φ ، و d هو المسافة إلى كائن الالتقاط. من هدف الاختبار ، يمكن التنبؤ بجميع المصطلحات ضمن حدود معقولة بحيث تكون المسافة ، d ، هي المتغير الحر الوحيد المستخدم لإخبار المستخدم بمكان جسم الفلورسنت بالنسبة لطحنه. انظر Sica et al. لمزيد من التفاصيل36.
        ملاحظة: بالنسبة للأهداف اللاحقة ، ستتناسب مجموعة الأدوات مع تتبع الشدة بنفس وظيفة النموذج وتقدر مكان إيقاف الطحن من أعلى إلى أسفل. تتم جميع التركيبات في وقت واحد مع الطحن. الهدف هو إيقاف الطحن عندما يقع الهدف على عمق يساوي نصف سمك الصفيحة المطلوب تحت السطح العلوي.
      4. بعد اكتمال الطحن من أعلى إلى أسفل ، قم بإنهاء الصفيحة عن طريق الطحن من الأسفل إلى الأعلى في وضع المقطع العرضي للتنظيف حتى يتم تحقيق السماكة المطلوبة.
  9. التقط صورة مضان بعد الطحن.

6. الفحص المجهري الضوئي المترابط ومجموعة سلسلة الإمالة

  1. بعد نقل العينة إلى CryoTEM ، اجمع نظرة عامة على أطلس للشبكة عند 182x للسماح بتغطية كافية للشبكات بأكملها.
  2. عند تكبير وسيط مناسب يتراوح من 6,500x إلى 11,000x ، اجمع سلسلة من صور المونتاج للصفيحة النهائية عند إمالة 0 درجة.
  3. اقرأ صور التألق متعدد القنوات بعد الطحن وصورة العرض من الخطوة 6.2 إلى برنامج تحويل إسقاطي مخصص لتسجيل عائد الاستثمار (https://github.com/pdahlb/CLEM_software_suite.git).
  4. اختر ما مجموعه 8-10 أزواج من النقاط المرجعية لحساب تحويل الصورة الإسقاطية بدقة.
    ملاحظة: يمكن أن تكون هذه النقاط ميزات واضحة (على سبيل المثال ، حواف الصفائح ، أو التلوث الجليدي المرئي ، أو ثقوب الشبكة المفتوحة) الموجودة في كل من الفحص المجهري البصري للمجال الساطع والفحص المجهري الإلكتروني.

7. مجموعة سلسلة إمالة عالية التكبير

  1. استخدم هذه الصورة المجهرية الإلكترونية المتراكب والفلورة والإرسال كمرجع للمستخدمين لتحديد منطقة تصوير ضمن حدود حجم إطار الكاميرا لمجموعة سلسلة الإمالة عالية التكبير.
  2. حدد التكبير والمعلمات لسلسلة الإمالة بناء على السؤال البيولوجي.
    ملاحظة: بالنسبة للعرض التوضيحي ، قمنا بجمع البيانات من 54 درجة بزيادات 2 درجة بحجم بكسل 3.5 Å41،42،43.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قمنا بتسمية خلايا البلاعم المتمايزة بعلامة التوبولين SiR-tubulin قبل التجميد. باتباع البروتوكول ، حددنا MTOC على أنه ثقب فلوري واحد ~ 1 ميكرومتر تحت مجهر التألق (الشكل 1 أ). بالإضافة إلى ذلك ، لاحظنا هياكل فلورية شبيهة بالألياف تشع من MTOC باتجاه محيط الخلية ، بما يتفق مع شبكة الأنابيب الدقيقة (الشكل 1 أ). يتم عرض لقطات الطحن التدريجي بسماكات عينة مختلفة في الشكل 1 ب. والجدير بالذكر أنه عندما وصلت الصفيحة إلى سمك حوالي 800 نانومتر ، تم حل البق المفرد MTOC إلى بقعتين متجاورتين ، يبلغ قطر كل منهما حوالي 700 نانومتر. أكد التحليل اللاحق أن كل بقعة تتوافق مع مركز فردي.

سمح لنا التصوير والطحن المتزامن بمراقبة التغيرات في شدة التألق في الوقت الفعلي. والجدير بالذكر أننا لاحظنا زيادة في التألق بعد إزالة المواد غير الفلورية السائبة وفيلم الدعم الاستيعابي (الشكل 1B-D). مع ترقق الصفيحة من 2 ميكرومتر إلى 800 نانومتر ، انخفضت شدة التألق بشكل حاد ، مما يعكس الإزالة التدريجية للهياكل المصنفة. استمر هذا الانخفاض حيث تم ترقق الصفيحة بشكل أكبر إلى أقل من 200 نانومتر (الشكل 1B-D). توضح صورة التألق المترابطة وأطلس المجهر الإلكتروني أن سير العمل لدينا يتيح الاستهداف الدقيق للطحن (الشكل 2 أ). تكشف الصور المقطعية المعاد بناؤها والنماذج المجزأة أن المريكزات تتكون من ثلاثة توائم من الأنابيب الدقيقة ، بما يتفق مع التقارير السابقة42،43،44،45 (الشكل 2 أ ، ب). في الحالات التي يتم فيها الحفاظ على بقعة فلورية واحدة فقط في الصفيحة النهائية ، نلاحظ مريكز واحد في التصوير المقطعي المقابل (الشكل 2 ب).

figure-results-1
الشكل 1: سير عمل CryoFM-FIB-SEM ثلاثي التوافق من أجل التوطين الدقيق لمركز تنظيم الأنابيب الدقيقة. (أ) (يسار) الفحص المجهري للخلية الحية و (يمين) CryoFM من MTOC. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. (ب) لقطات تدريجية من CryoFM و CryoFIB للطحن المستهدف. يشار إلى عرض FM المقرب كمربعات متقطعة صفراء. يتم تمييز المريكزات على أنها أسهم صفراء. شريط المقياس = 5 ميكرومتر. (ج) شدة التألق ل MTOC أثناء طحن CryoFIB. (د) ملف تعريف خط التألق عبر MTOC مأخوذ في مراحل مختلفة أثناء طحن CryoFIB. الاختصارات: CryoFM-FIB-SEM = الفحص المجهري الفلوري المبرد مع طحن شعاع الأيونات المركز والفحص المجهري الإلكتروني المسح ؛ MTOC = مركز تنظيم الأنابيب الدقيقة ؛ عائد الاستثمار = منطقة الاهتمام. هذا الرقم مقتبس من وانغ39. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: التفاصيل الجزيئية ل MTOC التي تم الكشف عنها من خلال سير عمل CryoFM-FIB-SEM ثلاثي الاتفاق. (أ) نموذج FM و EM والتجزئة المترابطة ل MTOC. (أ) صورة FM بعد الطحن. هذه هي نفس الصورة من اللوحة الأخيرة من الشكل 1 ب التي تم تمييزها على أنها 180 نانومتر ولكن تم تدويرها لتتناسب مع إعادة بناء وتجزئة CryoET. شريط المقياس = 5 ميكرومتر ؛ (ب) منظر مكبر للمنطقة المتقطعة باللون الأصفر من (أ). (ج) إسقاط FM و TEM المترابطين للمنطقة المتقطعة باللون السماوي المشار إليه في (2). شريط المقياس = 1 ميكرومتر. (د) نموذج مجزأ لإعادة البناء المقطعي في المنطقة ذات الأهمية (أصفر ، سينتريول ؛ أخضر ، أنابيب دقيقة). شريط المقياس = 100 نانومتر. (ب) صور FM تمثيلية وشرائح مقطعية لصفائح مختلفة تقدم اتجاهات مختلفة للمريكز. FM: شريط المقياس = 5 ميكرومتر. شريحة مقطعية: شريط المقياس = 200 نانومتر. الاختصارات: CryoFM-FIB-SEM = طحن شعاع الأيونات المركز المبرد باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح ؛ MTOC = مركز تنظيم الأنابيب الدقيقة ؛ FM = الفحص المجهري الفلوري. ET = نقل الإلكترون. TEM = الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال. هذا الرقم مقتبس من وانغ39. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تسلط نتائجنا الضوء على فائدة منصة التصوير ثلاثي الصدفة ، والتي تتيح التصوير والطحن الفلوري في وقت واحد. من خلال الاستفادة من هذه التغذية الراجعة ، نوضح استراتيجيتين للطحن الموجه بالتألق - شبه مدمرة وقياس التداخل - تتجنب الحاجة إلى مناهج مرهقة وقائمة على التسجيل تواجه قيودا أساسية على الدقة المتعلقة بعدم تطابق معامل الانكسار والحركة أثناء الطحن12،33،46. علاوة على ذلك ، نظرا لأن التوجيه الدقيق يعتمد على الفحص المجهري الفلوري بدلا من SEM ، فإن الإشعاع البصري لا يؤدي إلى ضرر يمكن اكتشافه طالما تم الاحتفاظ بالشدة أقل من العتبة التي تؤدي إلى التعطير37،47. تعمل القدرات الموضحة هنا على توسيع العينات البيولوجية التي يمكن الوصول إليها لتشمل أهداف نادرة وصغيرة (<300 نانومتر في المدى المحوري) ذات الاهتمام مع تبسيط سير العمل.

تتمثل الخطوة الرئيسية في هذا البروتوكول في تحديد وقت إيقاف الطحن بناء على التغيرات في سطوع الفلورسنت لهدف الاهتمام. حاليا ، يتضمن هذا التدخل اليدوي السريع لإيقاف الطحن في الأوقات المرغوبة. أثبتت هذه الطريقة أنها كافية للأهداف الحالية التي تم استكشافها ، ولكن التعديل المستقبلي يمكن أن يدمج مجموعة أدوات Python في نظام FIB لإيقاف الطحن مباشرة. قد يكون هذا التعديل ضروريا إذا كانت هناك حاجة إلى معدلات طحن أسرع ، لأن هذا سيعطي وقتا أقل للتدخل اليدوي. بدلا من ذلك ، إذا كان من الممكن تحمل معدلات طحن أبطأ ، فسيوفر هذا مزيدا من الوقت للتدخل اليدوي إذا لزم الأمر.

بعد إنشاء الهياكل البيولوجية ذات الأهمية المحتوية على الصفائح ، يتيح برنامج تحويل الصور المخصص الخاص بنا الارتباط على مستوى CryoTEM ، باستخدام لمحات عامة عن الأطلس للصفائح لتوجيه جمع بيانات CryoET. بشكل عام ، يعد البروتوكول المقدم هنا ضروريا لتصوير الأهداف البيولوجية الصغيرة والنادرة ذات العلامات الفلورية بواسطة التصوير المقطعي الإلكتروني المبرد في عينات خلوية حقيقية النواة سميكة. مقارنة بأنظمة Cryo-FIB الحالية غير المتزامنة ، مثل Aquilos 2 مع iFLM ، يحقق سير العمل لدينا معدل نجاح أعلى في استهداف هذه الميزات.

تأتي دقة الاستهداف العالية هذه على حساب الكفاءة. نظرا لأن الطحن يدوي وليس آليا ، فإن إنتاجية توليد الصفيحة محدودة. في جلسة طحن مدتها 8 ساعات ، ننتج عادة 6-8 صفائح ، مع ما يقرب من خمسة تحتوي على هدف مثير للاهتمام. ومع ذلك ، نعتقد أنه يمكن أتمتة سير العمل هذا في المستقبل لتحسين الإنتاجية. ستتطلب الأتمتة برامج نصية مخصصة لمراقبة مناطق الطحن النشطة باستمرار في صورة FIB وتتبع شدة التألق في الوقت الفعلي لضمان الاحتفاظ بالهدف. لا تزال هناك تحديات رئيسية ، بما في ذلك إنشاء اتصال فعال بين جميع البرامج النصية المخصصة وبرنامج التحكم لكل من CryoFIB-SEM والمجهر الفلوري.

بالنظر إلى المستقبل ، هناك الكثير من العمل الذي يتعين القيام به لدمج تقنيات الفحص المجهري الفلوري المتقدمة الأخرى التي تمت مناقشتها سابقا ، بما في ذلك أجهزة الاستشعار الحيوية الفلورية ، والتصوير فائق الدقة ، والفحص المجهري متحد البؤر. ومع ذلك ، نتوقع أن تصبح الهندسة الثلاثية المتزامنة قياسية في الأدوات المستقبلية وأن يصبح التصوير الفلوري المتزامن أثناء الطحن روتينيا. إذا كان الأمر كذلك ، فقد يكون هذا البروتوكول بمثابة دليل قيم للباحثين الذين يهدفون إلى التقاط تفاصيل على نطاق جزيئي للهياكل البيولوجية الصغيرة والنادرة ، والتي على الرغم من حجمها ووفرتها ، فهي أساسية في بيولوجيا الخلية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نتوجه بالشكر لأعضاء Delmic لمساعدتهم في تطوير سير عمل التصوير. تم دعم P.D.D. جزئيا من قبل زمالة Panofsky في مختبر SLAC الوطني للمسرع كجزء من برنامج البحث والتطوير الموجه للمختبر التابع لوزارة الطاقة بموجب العقد DE-AC02-76SF00515 ومن قبل وزارة الطاقة ، مكتب العلوم ، مكتب البحوث البيولوجية والبيئية ، بموجب العقد رقم. DE-AC02-76SF00515 FWP 100883. تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال AI127401 المنح من المعاهد الوطنية للصحة إلى G.J.J. J.W. تم دعمه بمنحة 2021-234593 من مبادرة Chan Zuckerberg DAF ، وهو صندوق استشاري لمؤسسة مجتمع وادي السيليكون.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أكويلوس 2 كريو-فيبثيرموفيشر ساينتيفيكhttps://www.thermofisher.com/us/en/home/electron-microscopy/products/dualbeam-fib-sem-microscopes/aquilos-cryo-fib.html?cid=msd_ls_xseg_xmkt_sdb-aquilos_285811_na_pso_gaw_pei90m
& gad_source=1& gad_campaignid=12
764255901& gbraid=0AAAAADxi_GS
s7OvZmg4cgCUm0PjSiq9X9& gclid=
Cj0KCQjwh5vFBhCyARIsAHBx2w
xlIfYHMvqY3sSWu6oEAdUynCSf9
KRg9Jhjp7l0Dot9qTl6GyQaEo8aAiy
2EALw_wcB
صندوق الشبكة التجميدية المتوافق مع Autogridعلوم المجهر الإلكترونيhttps://www.emsdiasum.com/autogrid
-compatible-cryo-grid-box?srsltid=
AfmBOorQAd3esD8fLmnDDO2TvrNk
cj4UINXFnPSMgrpEmkWd0H7ImUq7
حلقات الشبكة الآلية ومشابك Cنانوسوفتhttps://www.nanosoftmaterials.com/product-page/100-pack-autogrid-rings-c-clips
مجموعة برمجيات CLEMمجموعة دالبرغ البحثية في ستانفورد/SLAChttps://github.com/pdahlb/CLEM_software_suite.git
دراجونفلاي 2022.1أنظمة أبحاث الكائناتhttps://dragonfly.comet.tech/
إنزلديلميك ب. ف.نظام إنزل هو جهاز مخصص غير متوفر تجاريا حاليا
IMOD 4.12جامعة كولورادوhttps://bio3d.colorado.edu/imod/
ديوار LD4 للنيتروجين السائلنانوسوفتhttps://www.nanosoftmaterials.com/product-page/ld4-liquid-dewar-4-liters
ماتلاب 2023ماث ووركسhttps://www.mathworks.com/products/matlab.html
أداة معالجة غطاء الدبوسنانوسوفتhttps://www.nanosoftmaterials.com/product-page/pin-lid-manipulator-tool
مجموعة أدوات بايثونمجموعة دالبرغ البحثية في ستانفورد/SLAChttps://github.com/pdahlb/trico_softwaresuite
Quantifoil R2/2، LF، شبكة 200، شبكة كهرومغناطيسيةعلوم المجهر الإلكترونيhttps://www.emsdiasum.com/quantifoil-r-22-lf-200-mesh-gold
EM التسلسليجامعة كولورادو بولدرhttps://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
سفينة سبيرلاب القياسية (ديوار النقل)نانوسوفتhttps://www.nanosoftmaterials.com/product-page/spearlab-standard-vessel
الملقطعلوم المجهر الإلكترونيhttps://www.emsdiasum.com/style-3sa

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Komeili, A., Li, Z., Newman, D. K., Jensen, G. J. Magnetosomes are cell membrane invaginations organized by the actin-like protein MamK. Science. 311 (5758), 242-245 (2006).
  2. Bykov, Y. S., et al. The structure of the COPI coat determined within the cell. eLife. 6, e32493(2017).
  3. Mahamid, J., et al. Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery. Science. 351 (6276), 969-972 (2016).
  4. Xue, L., et al. Visualizing translation dynamics at atomic detail inside a bacterial cell. Nature. 610 (7930), 205-211 (2022).
  5. Hampton, C. M., et al. Correlated fluorescence microscopy and cryo-electron tomography of virus-infected or transfected mammalian cells. Nat Protoc. 12 (1), 150-167 (2017).
  6. Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. Cellular electron cryotomography: Toward structural biology in situ. Annu Rev Biochem. 86 (1), 873-896 (2017).
  7. Grimm, R., et al. Electron tomography of ice-embedded prokaryotic cells. Biophys J. 74 (2), 1031-1042 (1998).
  8. Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
  9. Tamborrini, D., et al. Structure of the native myosin filament in the relaxed cardiac sarcomere. Nature. 623 (7988), 863-871 (2023).
  10. Kaplan, M., et al. Bdellovibrio predation cycle characterized at nanometre-scale resolution with cryo-electron tomography. Nat Microbiol. 8 (7), 1267-1279 (2023).
  11. Schur, F. K. M., et al. An atomic model of HIV-1 capsid-SP1 reveals structures regulating assembly and maturation. Science. 353 (6298), 506-508 (2016).
  12. Arnold, J., et al. Site-specific cryo-focused ion beam sample preparation guided by 3D correlative microscopy. Biophys J. 110 (4), 860-869 (2016).
  13. Lam, V., Villa, E. Practical approaches for cryo-FIB milling and applications for cellular cryo-electron tomography. cryoEM: Methods and Protocols. , Springer. 49-82 (2020).
  14. Rigort, A., Plitzko, J. M. Cryo-focused-ion-beam applications in structural biology. Arch Biochem Biophys. 581, 122-130 (2015).
  15. Noble, A. J., de Marco, A. Cryo-focused ion beam for in situ structural biology: State of the art, challenges, and perspectives. Curr Opin Struct Biol. 87, 102864(2024).
  16. Rigort, A., et al. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (12), 4449-4454 (2012).
  17. Iancu, C. V., et al. Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot. Nat Protoc. 1 (6), 2813-2819 (2006).
  18. Dobro, M. J., Melanson, L. A., Jensen, G. J., McDowall, A. W. Plunge freezing for electron cryomicroscopy. Methods Enzymol. 481, 63-82 (2010).
  19. Chang, Y. -W., et al. Correlated cryogenic photoactivated localization microscopy and cryo-electron tomography. Nat Methods. 11 (7), 737-739 (2014).
  20. Wu, G. -H., et al. Multi-scale 3D cryo-correlative microscopy for vitrified cells. Structure. 28 (11), 1231-1237.e3 (2020).
  21. Lin, C., Zhang, L., Zhang, Z., Jiang, Y., Li, X. Locating cellular contents during cryo-FIB milling using cellular secondary-electron imaging. J Struct Biol. 215 (3), 108005(2023).
  22. Wagner, F. R., et al. Preparing samples from whole cells using focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Nat Protoc. 15 (6), 2041-2070 (2020).
  23. Carter, S. D., Mamede, J. I., Hope, T. J., Jensen, G. J. Correlated cryogenic fluorescence microscopy and electron cryo-tomography shows that exogenous TRIM5α can form hexagonal lattices or autophagy aggregates in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (47), 29702-29711 (2020).
  24. Guo, Q., et al. In situ structure of neuronal C9orf72 poly-GA aggregates reveals proteasome recruitment. Cell. 172 (4), 696-705.e12 (2018).
  25. Perez, D., et al. Identification and demonstration of roGFP2 as an environmental sensor for cryogenic correlative light and electron microscopy. J Struct Biol. 214 (3), 107881(2022).
  26. Sartor, A. M., Dahlberg, P. D., Perez, D., Moerner, W. E. Characterization of mApple as a red fluorescent protein for cryogenic single-molecule imaging with turn-off and turn-on active control mechanisms. J Phys Chem B. 127 (12), 2690-2700 (2023).
  27. Sexton, D. L., Burgold, S., Schertel, A., Tocheva, E. I. Super-resolution confocal cryo-CLEM with cryo-FIB milling for in situ imaging of Deinococcus radiodurans. Curr Res Struct Biol. 4, 1-9 (2022).
  28. Dahlberg, P. D., Moerner, W. E. Cryogenic super-resolution fluorescence and electron microscopy correlated at the nanoscale. Annu Rev Phys Chem. 72 (1), 253-278 (2021).
  29. Perez, D., et al. Exploring transient states of PAmKate to enable improved cryogenic single-molecule imaging. J Am Chem Soc. 146 (42), 28707-28716 (2024).
  30. Li, S., et al. ELI trifocal microscope: A precise system to prepare target cryo-lamellae for in situ cryo-ET study. Nat Methods. 20 (2), 276-283 (2023).
  31. Loginov, S. V., Boltje, D. B., Hensgens, M. N. F., Hoogenboom, J. P., vander Wee, E. B. Depth-dependent scaling of axial distances in light microscopy. Optica. 11 (4), 553-568 (2024).
  32. Petrov, P. N., Moerner, W. E. Addressing systematic errors in axial distance measurements in single-emitter localization microscopy. Opt Express. 28 (13), 18616-18632 (2020).
  33. Yang, J., et al. Precise 3D localization by integrated fluorescence microscopy (iFLM) for cryo-FIB-milling and in situ cryo-ET. Microsc Microanal. 29 (Suppl. 1), 1055-1057 (2023).
  34. Perton, E., Boltje, D., Jakobi, A., Hoogenboom, J. Workflow for fluorescence-targeted lamella milling from vitrified cells with a coincident fluorescence, electron, and ion beam microscope. Bio Protoc. 15 (14), e5390(2025).
  35. Boltje, D. B., et al. A cryogenic, coincident fluorescence, electron, and ion beam microscope. eLife. 11, e82891(2022).
  36. Sica, A. V., et al. Optical interference for the guidance of cryogenic focused ion beam milling beyond the axial diffraction limit. bioRxiv. , (2024).
  37. Dahlberg, P. D., Perez, D., Hecksel, C. W., Chiu, W., Moerner, W. E. Metallic support films reduce optical heating in cryogenic correlative light and electron tomography. J Struct Biol. 214 (4), 107901(2022).
  38. Lukinavicius, G., et al. Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton. Nat Methods. 11 (7), 731-733 (2014).
  39. Wang, J. Direct visualization of cellular protein complexes in situ by fluorescence-guided cryo-FIB-SEM and cryo-ET. , California Institute of Technology. (2025).
  40. Last, M. G., Tuijtel, M. W., Voortman, L. M., Sharp, T. H. Selecting optimal support grids for super-resolution cryogenic correlated light and electron microscopy. Sci Rep. 13 (1), 8270(2023).
  41. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J Struct Biol. 152 (1), 36-51 (2005).
  42. Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. J Struct Biol. 197 (2), 102-113 (2017).
  43. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
  44. Meng, E. C., et al. UCSF ChimeraX: Tools for structure building and analysis. Protein Sci. 32 (11), e4792(2023).
  45. Heebner, J. E., et al. Deep learning-based segmentation of cryo-electron tomograms. J Vis Exp. (189), e64435(2022).
  46. Klumpe, S., et al. A modular platform for automated cryo-FIB workflows. eLife. 10, e70506(2021).
  47. Li, Y., Kang, D. -D., Dai, J. -Y., Wang, L. -W. The cage effect of electron beam irradiation damage in cryo-electron microscopy. npj Comput Mater. 10 (1), 115(2024).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Cryogenic Focused Ion BeamCryoFIB SEMFluorescence MicroscopyElectron MicroscopyTargeted Cell MillingCryogenic Electron TomographyCorrelative Light Electron MicroscopyMicrotubule Organizing CenterLamella PreparationReal Time Fluorescence Feedback

مقالات ذات صلة