يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

استخدام أجهزة الاستشعار الحيوية لكامل الخلية لقياس الزئبق الأيوني في عينات المياه

641 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68257

⸱

يوليو 3, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratorio de Moléculas Individuales, Laboratorios de Investigación y Desarrollo, Facultad de Ciencias e Ingeniería, Universidad Peruana Cayetano Heredia, 2Kenniscentrum AI, Erasmushogeschool Brussel, 3Open BioLab Brussels, Erasmushogeschool Brussel

في هذه المقالة

ملخص

تقدم هذه المقالة بروتوكولات لاستخدام مستشعرين حيويين للخلية الكاملة (Mer-Blue و Mer-RFP) للكشف عن الزئبق الأيوني. وتهدف الدراسة، من خلال توفير إجراءات مفصلة لتشغيلها وتحليل المخرجات، إلى تيسير اعتماد هذه التكنولوجيات على نطاق أوسع ومواصلة تطويرها لرصد ملوثات محددة.

الملخص

تعد أجهزة الاستشعار الحيوية للخلايا الكاملة (WCBs) منصات مفيدة لاكتشاف وتوصيف العناصر التنظيمية وتطوير الهندسة الحيوية. كما أنها تحمل وعدا هائلة لمراقبة البيئة والغذاء. وفي حين استثمرت جهود كبيرة في تعزيز حساسيتها وقابليتها للنقل، فإن توحيد معالجتها وتحليل بياناتها لا يزال متخلفا نسبيا. تقدم هذه المقالة دليلا شاملا لاستخدام اثنين من WCBs التي تم تطويرها مؤخرا ، Mer-Blue و Mer-RFP ، والتي أثبتت قدرتها على اكتشاف الزئبق الأيوني عند مستويات أقل من حدود مياه الشرب لمنظمة الصحة العالمية. تشمل البروتوكولات المفصلة هنا إعداد الاستزراع الميكروبي ومعايرة المستشعر والحصول على البيانات وتحليلها. بالنسبة للمستشعر الحيوي Mer-RFP الفلوري ، يتم استخدام نظرية تخصيص جديدة للتخليق الحيوي لتحديد الفاصل الزمني لقياسات استجابة الجرعة الموثوقة والدقيقة. بالنسبة للمستشعر الحيوي Mer-Blue اللوني ، يتيح إعداد الكاميرا منخفض التكلفة إجراء قياسات صارمة في الإعدادات التي تفتقر إلى مقاييس الطيف الضوئي ومقاييس الفلور باهظة الثمن ، مما يسهل مراقبة التلوث اللامركزي. يتم وصف الإجراءات المستخدمة لاختبار عينات المياه العذبة ، وتناقش قيود هذه المستشعرات الحيوية فيما يتعلق بأنواع العينات. من خلال مشاركة تقنيات المعالجة والتحليل هذه ، نشجع مجموعات بحثية أوسع على اعتماد هذه الأجهزة البيولوجية وتحسينها لتطوير حلول مراقبة بيئية فعالة. في النهاية ، يهدف هذا البحث إلى تسهيل الاعتماد الواسع النطاق لتقنيات الاستشعار الحيوي داخل مجتمع العلوم البيئية ، مما يساهم في مراقبة أكثر فعالية وكفاءة لتلوث العناصر النزرة في مختلف النظم الإيكولوجية.

المقدمة

مع تزايد المخاوف بشأن التلوث البيئي وسلامة إمدادات المياه والغذاء ، برزت أجهزة الاستشعار الحيوية كبديل جذاب وبأسعار معقولة لطرق الكيمياء التحليلية التقليدية. المعادن الثقيلة هي ملوثات شديدة السمية أصبحت منتشرة بشكل متزايد بسبب الأنشطة البشرية1،2،3،4. ومع ذلك ، غالبا ما تكون طرق الكشف التقليدية5 مكلفة ولا يمكن الوصول إليها.

تسخر WCBs الحساسة للزئبق الخصوصية والحساسية الملحوظة لعامل النسخ MerR6،7،8. في وظيفتها الأصلية ، تنظم MerR التعبير عن البروتينات المستجيبة ، التي يمنح نشاطها لإزالة السموم مقاومة الزئبق9. وقد أعيد استخدام قدرة MerR على تنظيم التعبير الجيني بطريقة تعتمد على الزئبق لتنظيم بروتينات المراسل في أنظمة الكشف عن الزئبق10،11،12،13،14،15،16. على الرغم من الأبحاث الواعدة ، لم يتم بعد اعتماد WCBs هذه للمراقبة في العالم الحقيقي. أدت عوامل مثل الهشاشة البيولوجية ومتطلبات المناولة المتخصصة وغياب البروتوكولات الموحدة والمواد المرجعية المعتمدة إلى إعاقة التطبيق العملي17،18،19،20.

وقد استحدث نظام WCB للكشف عن الزئبق الأيوني باستخدام MerR مقترنا ببروتينين مختلفين للمراسلين. يعبر Mer-Blue عن بروتين كروموجينيك ويعمل كمستشعر حيوي لقياس الألوان ، مما يتيح الكشف المرئي أو المستند إلى الكاميرا. يسمح Mer-RFP ، وهو مستشعر حيوي فلوري ، بالمراقبة المستمرة لتراكم الإشارة. من خلال التحكم بعناية في توقيت التعرض للعينة خلال مرحلة النمو ، تم تحقيق قابلية استنساخ قوية في كلاالنظامين 15.

تقدم هذه المقالة بروتوكولات مفصلة لتشغيل كل من Mer-Blue و Mer-RFP ، جنبا إلى جنب مع تحليل شامل لمخرجات الإشارة الخاصة بهم. بالنسبة إلى Mer-RFP ، يعتمد التحليل على نظرية تم تقديمها مؤخرا لتخصيص التخليق الحيوي للبروتين21. بالنسبة إلى Mer-Blue ، يمكن رقمنة التحليل اللوني باستخدام برنامج معالجة الصور مثل ImageJ. لضمان إعدادات متسقة للحصول على الصور ، يتم تقديم إعداد كاميرا DIY منخفض التكلفة يسمى PelletCam. في كلتا الحالتين ، يتم توفير برامج آلية لتسهيل التشغيل. ومن خلال تقاسم المنهجيات التجريبية الميسرة والموحدة وتقنيات تحليل البيانات، يتم تشجيع اعتماد وحدات التحكم في الأحياء على نطاق أوسع من أجل تطوير حلول رصد موثوقة وفعالة من حيث التكلفة قائمة على أجهزة الاستشعار الحيوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير محاليل الزئبق الأيونية

  1. وزن كتلة صغيرة من مسحوق HgBr2 (عادة بين 0.1 و 0.2 جم) باستخدام قفازات واقية مناسبة وقناع لمنع الاستنشاق والتعرض للجلد.
  2. احسب كمية الماء اللازمة للحصول على محلول 4 ملي مولار عن طريق إذابة الكتلة المقاسة للمسحوق الصلب في ddH2O باستخدام الصيغة:
    figure-protocol-1
    ملاحظة: الحجم المتوقع قريب من 100 مل. يمكن استخدام صيغة مبسطة:
    figure-protocol-2
    1. بدلا من ذلك ، عند استخدام HgCl2 ، قم بتطبيق الصيغة:
      figure-protocol-3
  3. قم بتخزين محلول المرق في وعاء محكم الغلق في بيئة مبردة (4 درجات مئوية) لمنع التبخر.
  4. قم بإعداد التخفيفات التسلسلية قبل كل مقايسة معايرة بالتحليل الحجمي، بدءا من 1 مل من 2 ملي زئبق2+ وتخفيفها حتى 40 نانومتر، كما هو موضح في الجدول 1.
    ملاحظة: قد يتغير تركيز الزئبق الأيوني أثناء التخزين، ويرجع ذلك على الأرجح إلى التخفيض والتبخر التلقائي لعنصر الزئبق (Hg°). على الرغم من أن التبريد واستخدام الحاويات المحكم عالية الجودة قد يقلل من هذه التأثيرات ، تجنب استخدام المحاليل المخزنة لأكثر من 6 أسابيع - خاصة لتركيزات 250 نانومتر من الزئبق2+ أو أقل.

2. تحضير M9 متوسط

  1. قم بإذابة مساحيق الكاشف في قوارير منفصلة باستخدام ماء فائق النقاء لتحضير محاليل المخزون التالية: M9 5× ، 1 M MgSO4 ، 1 M CaCl2 ، 20٪ (وزن / حجم) جلوكوز ، و 20٪ (وزن / حجم) أحماض الكازامين.
  2. في زجاجة زجاجية سعة 500 مل أو 1 لتر ، اخلطي 50 مل من M9 5× ، 2.5 مل من 20٪ (وزن / حجم) أحماض الكازامينو ، وأضيفي الماء عالي النقاء للوصول إلى الحجم الإجمالي 246.475 مل.
  3. قم بتعقيم الخليط ومحاليل المرق المذكورة أعلاه عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  4. اترك جميع المحاليل لتبرد تماما لتجنب هطول الأمطار من CaCl2.
  5. أضف إلى الخليط المبرد: 25 ميكرولتر من 1 M CaCl2 ، و 500 ميكرولتر من 1 M MgSO4 ، و 3 مل من 20٪ (وزن / حجم) جلوكوز.
    ملاحظة: ينتج عن هذا وسط M9 غني بالتركيزات النهائية التالية: 0.24٪ (وزن / حجم) جلوكوز ، 0.2٪ (وزن / حجم) أحماض الكازامينو ، 2 ملي مولار MgSO4 ، 1 ملي كلوريد الكالسيوم2 ، 3 جم / لتر KH2PO4 ، 0.5 جم / لتر كلوريد الصوديوم ، 6.78 جم / لتر Na2HPO4 ، 1 جم / لتر NH4Cl.

3. تنشيط المستشعر الحيوي Mer-Blue / Mer-RFP

  1. استخدم الإشريكية القولونية DH5α الخلايا التي تم تحويلها باستخدام pUC-Mer-RFP أو pUC-Mer-Blue البلازميد (انظر جدول المواد).
  2. تحضير طبق بتري LB-agar يحتوي على 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين.
  3. خلايا البذور من مخزون الجلسرين المحفوظ بالتبريد على صفيحة LB-agar باستخدام طريقة الخطوط.
  4. احتضان الطبق طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
  5. في اليوم التالي ، اختر مستعمرة واحدة من صفيحة LB-agar لتلقيح ثقافة 10 مل باستخدام وسط M9 (الشكل 1 أ).
  6. احتضان المزرعة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز مستمر عند 220 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها (~ 16 ساعة) (الشكل 1 ب).

4. تجربة المعايرة بالتحليل الحجمي باستخدام Mer-RFP

  1. قياس الكثافة البصرية للثقافة البكتيرية الليلية عند 600 نانومتر (OD600).
  2. احسب حجم الاستزراع الليلي المطلوب للوصول إلى OD600 من 0.05 في حجم إجمالي قدره 10 مل من وسط M9 الطازج باستخدام الصيغة:
    figure-protocol-4
    حيث C1 هو OD600 للثقافة الليلية ، و V1 هو الحجم الذي يجب أخذه منه.
  3. جهاز طرد مركزي V1 مل من اللقاح المسبق عند 3500 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من وسط M9 القديم وأعد تعليق الحبيبات البكتيرية في 10 مل من وسط M9 الطازج (الشكل 1 ج).
  4. أضف 195 ميكرولتر من الثقافة المعلقة إلى كل بئر من صفيحة دقيقة مكونة من 96 بئر. تأكد من تحضير كل مزرعة دقيقة ثلاث نسخ لإجراء قياسات دقيقة.
  5. أضف 5 ميكرولتر من محاليل الزئبق الأيونية من 40 نانومتر إلى 40 ميكرومولار، كما هو موضح في الخطوة 1، إلى كل بئر لتحقيق تركيزات نهائية تتراوح من 1 نانومتر إلى 1 ميكرومتر (الشكل 1 دال).
  6. ضع الصفيحة الدقيقة في قارئ صفيحة دقيقة متعددة الأوضاع مع التحكم في درجة الحرارة ، واضبطها على المعلمات التالية (الشكل 1E) - درجة الحرارة: 37 درجة مئوية ، الاهتزاز: اهتزاز مستمر عند 60 دورة في الدقيقة ، الفاصل الزمني: اقرأ كل 15 دقيقة لمدة 16 ساعة ، قياس الكثافة البصرية: اقرأ عند 600 نانومتر ، قياس التألق: الإثارة عند 570 نانومتر والانبعاث عند 615 نانومتر.
  7. بعد الانتهاء من فترة الحضانة التي تبلغ 16 ساعة ، اجمع البيانات من قارئ الصفيحة الدقيقة (الشكل 1F).

5. تحليل البيانات لنتائج Mer-RFP

  1. استخدم برامج جداول البيانات المفضلة أو أدوات إدارة البيانات لتصور قيم OD600 الأولية بمرور الوقت لجميع الثقافات الفردية (الشكل 1G). التحقق من أن نهاية مرحلة التأخر وبداية الطور الثابت يحدثان في نفس الوقت تقريبا عبر جميع التكرارات داخل كل حالة من ظروف تركيز الزئبق. استبعاد أي ثقافات تنحرف بأكثر من ساعة واحدة عن متوسط التوقيت.
  2. احسب متوسطOD 600 لكل نقطة زمنية عبر جميع التكرارات داخل كل حالة من ظروف تركيز الزئبق. ولكل حالة استزراع ثلاثية، سيكون منحنى نمو OD600 وثلاثة مخرجات لكثافة الفلورسنت متاحة في نقاط زمنية مختلفة.
  3. ارسم متوسط OD600 مقابل. حان الوقت للثقافة بدون زئبق. حدد بصريا وحدد الفاصل الزمني حيث يكون معدل النمو موجبا (انظر الشكل 2). استبعاد نقاط البيانات المتبقية من جميع الثقافات.
  4. وبالنسبة لكل ثقافة، احسب معدل النمو المحدد في كل نقطة زمنية بإيجاد التغير في OD600 عن النقطة الزمنية السابقة وقسمة هذا التغيير على قيمة OD600 في تلك النقطة الزمنية، باستخدام الصيغة التالية:
    figure-protocol-5
  5. وبالمثل ، احسب معدل إنتاج التألق المحدد لكل مزرعة عن طريق إيجاد التغير في شدة التألق عن النقطة الزمنية السابقة وقسمة هذا التغيير على قيمة OD600 في تلك النقطة الزمنية ، باستخدام الصيغة:
    figure-protocol-6
  6. لكل ثقافة ، ارسم معدل النمو المحدد مقابل معدل إنتاج التألق (انظر الشكل 3). تحديد نطاق خطي ضمن النقاط الزمنية المتأخرة. استبعاد النقاط الزمنية المبكرة حتى يتم تحقيق انحدار خطي بأعلى R2 ، بناء على ما لا يقل عن 12 نقطة (حوالي 3 ساعات).
    ملاحظة: يمثل منحدر هذا الانحدار الخطي جزء التعبير ، أي نسبة إجمالي تخليق البروتين المخصص لبروتين المراسل21.
  7. بالنسبة لجميع الثقافات، استخرج الاتجاهات الخطية من نفس الفاصل الزمني تقريبا وسجل قيمة الميل لكل حالة.
    ملاحظة: قد يتطلب تحقيق أعلى قيمة R2 ممكنة عبر جميع الثقافات باستخدام نفس الفاصل الزمني محاولات متعددة. للتحليل الآلي ، يتوفر Jupyter Notebook التالي (إطار عمل Google Colab) على https://github.com/frank-britto/Mer_RFP. يعمل هذا الكمبيوتر الدفتري كقالب لتحسين استخراج الاتجاهات الخطية والمزيد من التنميط للجرعة.
  8. خذ متوسط الميل عبر التكرارات لكل تركيز من تركيزات الزئبق.
  9. ارسم متوسط قيم المنحدر مقابل تركيز الزئبق (انظر الشكل 4 أ). ملاءمة وظيفة Hill للبيانات:
    figure-protocol-7
    حيث: fRFP هو جزء التعبير عن البروتين الفلوري الأحمر، H يمثل الحد الأقصى للتعبير الممكن للدارة، [Hg2+] هو تركيز الزئبق الأيوني، kHg يرتبط بتقارب الزئبق الأيوني، n هو معامل هيل الذي يعبر عن تعاون الاستجابة للزئبق2+.

6. تجربة المعايرة بالتحليل الحجمي باستخدام المستشعر الحيوي Mer-Blue

  1. جهاز طرد مركزي ثقافة كثيفة بين عشية وضحاها تم الحصول عليها كما هو موضح في الخطوة 3 عند 3,500 × جم لمدة 10 دقائق.
  2. تخلص من وسط M9 المستهلك وأعد تعليق الحبيبات البكتيرية في وسط M9 الطازج إلى OD600 من 1.0. تأكد من الحصول على ما لا يقل عن 5 مل من الثقافة بهذه الكثافة (الشكل 1 ج).
    ملاحظة: إذا لم يكن مقياس الطيف الضوئي متاحا ، فقم بتقريب الظروف الأولية عن طريق إعادة تعليق الحبيبات البكتيرية بحجم متوسط M9 طازج يساوي ضعف الحجم الأصلي للثقافة الكثيفة.
  3. أضف 9.5 مل من متوسط M9 و 10 ميكرولتر من محلول مخزون الأمبيسلين 100 مجم / مل إلى أنابيب زراعة الزجاج المعقمة (الشكل 1H).
  4. تلقيح وسط M9 المكمل ب 500 ميكرولتر من مزرعة المستشعر الحيوي المحضرة في الخطوة 6.2 (OD600 = 1.0).
  5. أضف 10 ميكرولتر من محاليل الزئبق الأيونية المحضرة (انظر الخطوة 1) للوصول إلى التركيزات النهائية البالغة 0 نانومتر، 1 نانومتر، 2 نانومتر، 5 نانومتر، 10 نانومتر، 25 نانومتر، 50 نانومتر، 100 نانومتر، 125 نانومتر، 250 نانومتر.
  6. احتضان الثقافات عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة مع اهتزاز قوي عند 220 دورة في الدقيقة (الشكل 1I).

7. الحصول على البيانات وتحليلها لنتائج Mer-Blue

  1. انقل ما يقرب من 1.3 مل من كل ثقافة إلى أنبوب دقيق سعة 1.5 مل (الشكل 1J).
  2. قم بالطرد المركزي للأنابيب الدقيقة بأقصى سرعة لمدة 3 دقائق للحصول على كريات ضيقة. تخلص من المادة الطافية.
  3. (اختياري) للحصول على كريات أكبر ، كرر الطرد المركزي وإزالة المواد الطافية حتى ست مرات.
  4. قم بتصوير الجزء السفلي من كل أنبوب صغير ، مع التركيز على الحبيبات (الشكل 1 ك). استخدم حامل أنبوب دقيق وحامل ثلاثي القوائم أو PelletCam (انظر الخطوة 8) لضمان اتجاه, إضاءة, وإعدادات الألوان المتسقة والقابلة للتكرار عبر جميع الصور (انظر الشكل 5).
  5. حدد قيم شدة اللون لكل صورة بيليه عبر القنوات الحمراء والخضراء والزرقاء (RGB).
    1. في حالة استخدام ImageJ: قم بتحميل الصورة وانتقل إلى Image > Type > RGB Stack لإنشاء مكدس من ثلاث شرائح (قنوات حمراء وخضراء وزرقاء). استخدم أداة التحديد لرسم منطقة الاهتمام (ROI) حول منطقة الحبيبات. انتقل إلى تحليل > قياس للحصول على قيم متوسط الشدة للمنطقة المحددة في كل قناة.
    2. في حالة استخدام PelletCam: افتح ملف .csv الذي يحتوي على قيم متوسطة كثافة اللون لمنطقة تمثيلية من تسعة بكسل من صورة البيليه.
  6. احسب استجابة المستشعر الحيوي لكل عينة عن طريق حساب المسافة الإقليدية في مساحة RGB بالنسبة إلى صورة الحبيبات المرجعية البيضاء ( الإشريكية القولونية غير المحولة) ، كما هو موضح سابقا22 ، باستخدام المعادلة:
    figure-protocol-8
    هنا ، تمثل عينة R وعينة G والعينة B متوسط شدة اللون من كل قناة RGB في المنطقة المحددة لصورة الحبيبات من عينة المستشعر الحيوي ، بينما يشير R ref و Gref و Bref إلى القيم المقابلة لحبيبات مرجعية من بكتريا قولونية غير محولة.
  7. ارسم المسافات الإقليدية المحسوبة مقابل تركيزات الزئبق الأيونية المقابلة (انظر الشكل 6). قم بملاءمة وظيفة Hill للبيانات (انظر الشكل 4 ب) باستخدام المعادلة التالية:
    figure-protocol-9
    وهنا، E هي المسافة الإقليدية، ويمثل H أقصى قدر ممكن من التلوين للدارة، و[Hg2+] هو تركيز الزئبق الأيوني، و kHg يرتبط بتقارب الزئبق الأيوني، و n هو معامل هيل الذي يعبر عن تعاون الاستجابة للزئبق2+.

8. بناء PelletCam

  1. قم بتنزيل الملفات لبناء نظام متحكم دقيق مغلق لقياس اللون في الكريات البكتيرية من الموقع الإلكتروني (https://github.com/EhbAIGit/PelletCam-OPENBIOLAB-AI).
    ملاحظة: المعرفة الأساسية بالقطع بالليزر والطباعة ثلاثية الأبعاد و ESP32 و Arduino مفيدة. يتوفر دليل تمهيدي ل ESP32-CAM على (https://lastminuteengineers.com/getting-started-with-esp32-cam/?utm_content=cmp-true). يوصى بشراء ESP32-CAM مع محول MB لتسهيل البرمجة. بالنسبة للمستخدمين غير المألوفين على ESP32 ، يوصى باتباع البرنامج التعليمي https://lastminuteengineers.com/esp32-arduino-ide-tutorial/ أولا.
  2. استخدم ملف LasercutterBox.ai لقص ونقش معدد إرسال 3 مم باستخدام قاطع ليزر.
  3. قم ببناء الأجزاء من ملف ESP32SET.stl باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد. يمكن استيراد ملف .stl هذا مباشرة بواسطة جميع برامج الطابعة ثلاثية الأبعاد تقريبا ؛ على سبيل المثال ، استوديو بامبو (https://bambulab.com/en/download/studio).
  4. قم بتثبيت ESP32 (ESP32-CAM-MB 2640 WiFi Bluetooth-camera) عن طريق وضع ملفات .cpp و .h و .ino في مجلد واحد. بعد ذلك ، افتح ملف .ino باستخدام برنامج Arduino IDE وانقر فوق >تحميل. بمجرد التحميل ، سيبدأ ESP32 تلقائيا.
  5. في هذه المرحلة ، يجب أن يكون المستخدم قادرا على الاتصال بنقطة وصول WiFi المسماة >PELLET وكلمة المرور >PELLETCAM ، كما هو محدد في ملف .ino الخاص ب ESP32. سيتم عرض عنوان IP الخاص ب PelletCam في الشاشة التسلسلية ل Arduino IDE. افتح متصفح ويب وانتقل إلى العنوان: http://192.168.4.1.
    ملاحظة: سيؤدي ذلك إلى تمكين عرض الصورة أو التقاط صورة جديدة (>التقاط صورة) أو تدوير الصورة (>تدوير) أو ضبط إضاءة شريط LED (>LEDS).
  6. قم بتوصيل ESP32 Arduino بشريط LED (NeoPixel Stick - 8 × 5050 RGB LED مع برامج تشغيل مدمجة) وكابل USB 5V وفقا للمخطط الموجود في InstallationManual.pptx الملفات.
  7. استخدم مسدس الغراء للصق شريط ESP32 و LED على الدعامات المطبوعة ثلاثية الأبعاد.
  8. أدخل أنبوبا صغيرا بقاع ملون (أو حبيبات بكتيرية) في الجزء الأمامي المطبوع ثلاثي الأبعاد من PelletCam. ضع دعامة ESP32-LED على بعد 5 سم تقريبا والتقط صورة عبر صفحة الويب. إذا تم الحصول على صورة حادة ومضاءة بشكل صحيح ، فقم بلصق دعامة ESP32-LED في الجزء السفلي من الصندوق الخشبي. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فاضبط المسافة بين الأمام ودعم ESP32-LED وكرر الإجراء حتى يتم الحصول على مسافة مرضية.
  9. قم بتجميع الصندوق باستخدام شريط لاصق ولصق جميع الأجزاء مع غراء الخشب.
  10. قم بتوصيل PelletCam عبر كابل USB بمصدر طاقة USB يمكنه توصيل 1 أمبير على الأقل.
    ملاحظة: تأكد من تثبيت Python 3.9 أو إصدار أحدث.
  11. افتح موجه الأوامر أو نافذة المحطة الطرفية. انتقل إلى الدليل الذي يحتوي على ملف pellet.py . قم بتنفيذ البرنامج النصي باستخدام الأمر >python pellet.py.
  12. إذا تعذر تشغيل البرنامج النصي pellet.py ، فقد يرجع ذلك إلى فقدان مكتبات Python. قم بتثبيت المكتبات المطلوبة باستخدام الأمر >pip install pillow tkinter pathlib statistics. للحصول على إرشادات إضافية لإعداد نظامك الخاص ، راجع المستند PelletCam Example.docx.

9. قياس عينات المياه البيئية

  1. اجمع العينات من المصادر البيئية مثل الأنهار أو البرك وقم بتخزينها في حاويات محكمة الإغلاق في درجات حرارة منخفضة لتقليل التبخر. للحصول على التفاصيل، راجع قسم المناقشة.
  2. الطرد المركزي للعينات عند 3,500 × جم لمدة 10 دقائق للرسوب والرمل والحطام العضوي ، وعزل الجزء المائي.
  3. عقم العينة المصفاة باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر.
    ملاحظة: تجنب التعقيم الحراري ، لأن الزئبق متطاير وقد يتبخر أثناء العملية.
  4. (اختياري) قم بإعداد حصة محمضة منفصلة عن طريق إضافة 5٪ حمض الهيدروكلوريك للقياس المستقل باستخدام تقنيات الكيمياء التحليلية القياسية. استخدم فقط العينة غير المحمضة لمقايسات المستشعر الحيوي.
  5. امزج 5 مل من العينة البيئية المفلترة بمعقم مع 4.5 مل من وسط 2× M9 ، مما يؤدي إلى تخفيف العينة بنسبة 1: 2.
  6. قم بتلقيح خليط العينة المتوسط المخفف ب 0.5 مل من مزرعة ليلية (محضرة كما هو موضح في الخطوة 5.4). يتوافق هذا التلقيح مع تخفيف المزرعة بمقدار 20 ضعفا ، مما ينتج عنه OD600 من 0.05 لبدء الفحص.
    1. في حالة استخدام Mer-RFPTransfer 200 ميكرولتر من خليط العينة المتوسط إلى بئر صفيحة دقيقة وبدء القياسات باستخدام قارئ صفيحة دقيقة كما هو موضح في الخطوة 3.6.
    2. في حالة استخدام Mer-Blue: قم باحتضان خليط عينة متوسط سعة 10 مل عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة مع اهتزاز قوي عند 220 دورة في الدقيقة ، كما هو موضح في الخطوة 5.6.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لا يظهر كلا المستشعرين الحيويين أي تعبير أساسي يمكن اكتشافه عن بروتينات المراسل الخاصة بكل منهما في ظل ظروف خالية من الزئبق. تبدأ مزارع Mer-Blue عادة في إظهار تلوين مرئي للعين المجردة بين 6-8 ساعات بعد التلقيح عند تركيزات HgBr2 البالغة 25 نانومتر وما فوق. عند إجراؤها بشكل صحيح، تنتج تجارب المعايرة بالتحليل الحجمي باستخدام Mer-RFP أو Mer-Blue استجابات تتناسب مع دالة Hill بمعامل Hill قريب من 1، مما يشير إلى سلوك الربط غيرالتعاوني 23.

عرض Mer-RFP نطاق كشف موثوق ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

دوائر المستشعر الحيوي المستخدمة هنا متطابقة ، وتختلف فقط في بروتين المراسل. كلاهما مشفر بالكامل على بلازميدات عالية النسخ ، مما يتيح نشرها في خلايا الإشريكية القولونية من سلالات مختلفة. أثناء عملها في بكتريا قولونية ب خلايا سلالة ، لوحظت إشارة ملونة أقوى من Mer-Blue في سلالات K-12 ، وتحديدا DH5α وخلايا الإشريكية القولونية المختصةكيميائيا 15.

لاحظنا أن تحقيق ناتج موثوق به يتطلب كثافة خلوية كبيرة في وقت التعرض للزئبق الأيوني. يمكن تحقيق ذلك عن ط...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

شكر وتقدير

يتم تقديم هذا البحث بفضل دعم البرنامج الوطني للتحقيقات العلمية واستوديوهات Avanzados PROCIENCIA من خلال برنامج EF-041-2024-01 "Proyectos de Investigación aplicada" ، عقد المنح PE501086520-2024-PROCIENCIA. تم تمويل تطوير أجهزة الاستشعار الحيوية للزئبق من قبل VLIR-UOS من خلال رمز منحة مبادرة الجنوب PE2020SIN292B122. يشكر دكتوراه في الطب VLIRUOS ، DGD ، ومجلس الجامعات الفلمنكية للعلوم التطبيقية والفنون على منحة XREI في إطار مشروع Global Minds BE2017GMHVLHC106.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
3 مم خشب متعددالإرسال بسمك العديد من الموزعين
5 فولت كابل USBالعديد من الموزعين
96 بئر شفاف مسطح القاع البوليسترين معالج TC لوحات دقيقةCorning3599
مسحوق أجارHiMediaGRM026
AmpicillinGold Biotechnology، Inc.A-301-100
CaCl 2< / sub>Millipore208290
أحماض الكازامينوCalbiochem2040OP
D- (+) - جلوكوزبيت الأدوية المركزي (P) المحدودة.506250
ESP32-CAM-MB 2640 وحدة كاميرا Bluetooth WiFi USB إلى لوحة تطوير المنفذ التسلسلي تنزيل تلقائي (النوع C)العديد من الموزعين
أنابيب ثقافة الزجاجCorning9825
HgBr 2< / sub> ، Mercury (II) بروميدMerck200085
HgCl 2< / sub> ، كلوريد الزئبق (II)Merck21465
مرق لوريا (ميلر)سيجما ألدريتشL3522
M9 الحد الأدنى من الأملاحسيجما ألدريتشM6030
MgSO4< / sub>HiMediaGRM684
NeoPixel Stick - 8 × 5050 RGB LED مع برامج تشغيل متكاملةAdafruit1426
البلازميد: pUC-Mer-Blue  مجموعتنا-التسلسل الكامل متاح في https://www.mdpi.com/article/10.3390/bios14050246/s1
البلازميد: pUC-Mer-RFP  مجموعتنا-تسلسل كامل متوفر في مرشحات حقنة
https://www.mdpi.com/article/10.3390/bios14050246/s1 ، ماء ، حجم المسام 0.22 ميكرونMilliporeSLGV004SLلتعقيم العينات البيئية.

المراجع

  1. Cooke, C. A., Balcom, P. H., Biester, H., Wolfe, A. P. Over three millennia of mercury pollution in the Peruvian Andes. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (22), 8830-8834 (2009).
  2. Gautam, R. K., Sharma, S. K., Mahiya, S., Chattopadhyaya, M. C. Contamination of heavy metals in aquatic media: transport, toxicity and technologies for remediation. Heavy Metals in Water: Presence, Removal and Safety. Sharma, S. K. , Royal Society of Chemistry. Cambridge. 1-24 (2014).
  3. Chen, C. Y., et al. A critical time for mercury science to inform global policy. Environ Sci Technol. 52 (17), 9556-9561 (2018).
  4. Ali, H., Khan, E., Ilahi, I. Environmental chemistry and ecotoxicology of hazardous heavy metals: environmental persistence, toxicity, and bioaccumulation. J Chem. 2019, 6730305(2019).
  5. Gao, Y., et al. Determination and speciation of mercury in environmental and biological samples by analytical atomic spectrometry. Microchem J. 103, 1-14 (2012).
  6. Ralston, D. M., O'Halloran, T. V. Ultrasensitivity and heavy-metal selectivity of the allosterically modulated MerR transcription complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (10), 3846-3850 (1990).
  7. Brown, N. L., Stoyanov, J. V., Kidd, S. P., Hobman, J. L. The MerR family of transcriptional regulators. FEMS Microbiol Rev. 27 (2-3), 145-163 (2003).
  8. Wang, D., et al. Structural analysis of the Hg(II)-regulatory protein Tn501 MerR from Pseudomonas aeruginosa. Sci Rep. 6, 33391(2016).
  9. Nucifora, G., Chu, L., Silver, S., Misra, T. K. Mercury operon regulation by the merR gene of the organomercurial resistance system of plasmid pDU1358. J Bacteriol. 171 (8), 4241-4247 (1989).
  10. Cai, S., et al. Engineering highly sensitive whole-cell mercury biosensors based on positive feedback loops from quorum-sensing systems. Analyst. 143 (3), 630-634 (2018).
  11. Guo, M., et al. Using the promoters of MerR family proteins as "rheostats" to engineer whole-cell heavy metal biosensors with adjustable sensitivity. J Biol Eng. 13, 70(2019).
  12. Wang, D., et al. Engineered cells for selective detection and remediation of Hg2+ based on transcription factor MerR regulated cell surface displayed systems. Biochem Eng J. 150, 107289(2019).
  13. Wang, D., et al. Visual detection of Hg2+ by manipulation of pyocyanin biosynthesis through the Hg2+-dependent transcriptional activator MerR in microbial cells. J Biosci Bioeng. 129 (2), 223-228 (2020).
  14. Guo, Y., Hui, C., Liu, L., Chen, M., Huang, H. Development of a bioavailable Hg(II) sensing system based on MerR-regulated visual pigment biosynthesis. Sci Rep. 11, 13516(2021).
  15. Zevallos-Aliaga, D., et al. Highly sensitive whole-cell mercury biosensors for environmental monitoring. Biosensors. 14 (1), 246(2024).
  16. Zhang, N. -X., et al. Versatile artificial mer operons in Escherichia coli towards whole-cell biosensing and adsorption of mercury. PLoS One. 16 (5), e0252190(2021).
  17. Chen, Y., et al. Advances in bacterial whole-cell biosensors for the detection of bioavailable mercury: a review. Sci Total Environ. 868, 161709(2023).
  18. Chen, S., Chen, X., Su, H., Guo, M., Liu, H. Advances in synthetic-biology-based whole-cell biosensors: principles, genetic modules, and applications in food safety. Int J Mol Sci. 24 (7), 7989(2023).
  19. Yu, W., et al. Genetically encoded biosensors for microbial synthetic biology: From conceptual frameworks to practical applications. Biotechnol Adv. 62, 108077(2023).
  20. Zhang, L., Guo, W., Lu, Y. Advances in cell-free biosensors: principle, mechanism, and applications. Biotechnol J. 15 (6), 2000187(2020).
  21. Vaccari, N. A., Zevallos-Aliaga, D., Peeters, T., Guerra, D. G. Biosensors characterisation: Formal methods from the perspective of proteome fractions. Synth Biol. 10 (1), ysaf002(2025).
  22. Liljeruhm, J., et al. Engineering a palette of eukaryotic chromoproteins for bacterial synthetic biology. J Biol Eng. 12, 8(2018).
  23. Alon, U. An Introduction to Systems Biology. , Chapman and Hall/CRC. Boca Raton. (2019).
  24. Lineweaver, H., Burk, D. The determination of enzyme dissociation constants. J Am Chem Soc. 56 (3), 658-666 (1934).
  25. Wyatt, L., et al. Spatial, temporal, and dietary variables associated with elevated mercury exposure in Peruvian riverine communities upstream and downstream of artisanal and small-scale gold mining. Int J Environ Res Public Health. 14 (12), 1582(2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الفيديو قريباً
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.