يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

في الجسم الحي تصوير الكالسيوم للمجموعات العصبية في شبكات الخلايا العصبية الحسية الأولية في العقد ثلاثية التوائم السليمة

2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68284

⸱

أغسطس 1, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Oral & Maxillofacial Surgery, School of Dentistry, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Department of Endodontics, School of Dentistry, University of Alabama at Birmingham, 3Division of Life Sciences, College of Life Sciences and Bioengineering, Incheon National University, 4Programs in Integrated Biomedical Sciences, Translational Sciences, Biomedical Engineering, Radiological Sciences, University of Texas Health Science Center at San Antonio

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول في الجسم الحي تصوير الكالسيوم GCaMP للخلايا العصبية العقدية ثلاثية التوائم السليمة (TG). يشمل هذا الوصف جراحة التعرض ل TG ، والتصوير المجهري متحد البؤر في الجسم الحي للخلايا العصبية TG ، وتطبيق المحفزات الجسدية أثناء التصوير المجهري لخلايا TG العصبية TG ، وتحليل بيانات تصوير الكالسيوم في الجسم الحي .

الملخص

يعد تصوير الكالسيوم أداة مهمة لمراقبة آليات الإشارات التي إما تتدفق Ca2+ إلى العصارة الخلوية أو تطلق Ca2+ من مخازن Ca2+ داخل الخلايا. يسمح استخدام فئران Pirt-GCaMP3 ، التي تحتوي على مستشعر Ca2 + GCaMP3 الذي تم إدخاله في اتجاه مجرى منطقة محفز Pirt ويتم التعبير عنها في جميع الخلايا العصبية الحسية الأولية تقريبا (>95٪) ، بالمراقبة المتزامنة لنشاط >3,000 خلية عصبية عبر تصوير Ca2+ للخلايا العصبية الحسية الأولية للعقدة ثلاثية التوائم (TG). يسمح ذلك للباحثين بدراسة استجابات الشبكة العصبية للمنبهات الضارة والاستجابات الحسية الجسدية والهرمونية في الجسم الحي ، والتي سيكون من الصعب جدا اكتشافها باستخدام طرق أخرى.

على وجه التحديد ، تسمح القدرة على مراقبة منطقة TG التي تعصيب الوجه ومناطق أخرى من الرأس بشكل منفصل بمراقبة الخلايا العصبية الحسية الأولية التي يتم تنشيطها بواسطة محفزات منطقة الوجه قبل الطبقات اللاحقة من معالجة الخلايا العصبية. يمكن أيضا ملاحظة عدد الخلايا العصبية التي تولد عابرات Ca2+ واتساع العابرين Ca2+ ، والتي تشير إلى حساسيتها للطرائق الحسية المختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للمحققين قياس قطر الخلايا العصبية ، وهو مؤشر على نوع الألياف المنشطة (الألياف الميكانيكية غير الضارة مقابل الألياف الضارة ، وألياف A ، و Aδ ، و C). لذلك ، سيكون تصوير الكالسيوم Pirt-GCaMP3 ل TG أداة قوية لتشريح طرائق حسية محددة وأنواع الخلايا العصبية لدراسة آلام أصل ثلاثي التوائم (ألم الفم والوجه والقحف ، وآلام الأسنان أو / الأسنان ، والصداع ، والصداع النصفي ، وآلام المفاصل الصدغية الفكية ، وألم العصب ثلاثي التوائم) ، والحكة واللمس وأي أحاسيس جسدية أخرى ، بالإضافة إلى الاستجابات الهرمونية.

المقدمة

تعمل الخلايا العصبية الحسية الأولية على تعصيب الأنسجة مباشرة ، بما في ذلك الجلد ، وتنقل الإشارات الحسية إلى الجهاز العصبي المركزي (الحبل الشوكي أو جذع الدماغ). تعمل الخلايا العصبية العقدية ثلاثية التوائم (TG) على تعصيب الرأس وتستجيب للمنبهات الحسية ، بما في ذلك الألم من الأسنان ، والمنطقة حول الحجاج ، ومناطق الفم والوجه والقحف الوجهي ، والمفصل الصدغي الفكي1،2 ، والسحايا3،4،5. تختلف الخلايا العصبية TG في الحجم ومستوى تكوين النخاع وملامح التعبير الجيني6،7،8،9. الخلايا العصبية الأصغر هي المقبلة للألم ، في حين أن الخلايا العصبية الأكبر تستجيب عموما للمنبهات الميكانيكية غير المؤلمة10،11. يمكن أن يؤدي الخلل الوظيفي في الخلايا العصبية العقدية ثلاثية التوائم إلى توعية كل من الخلايا العصبية نفسها والخلايا العصبية الحسية للجهاز العصبي المركزي (CNS) 11،12.

في السياق الفسيولوجي الطبيعي في الظروف غير المرضية ، يعد إطلاق الخلايا العصبية في الجسم الحي ضروريا للألم ، ولكن حتى العقدين الماضيين ، اقتصرت أدوات دراسة العقد الحسية السليمة في الجسم الحي على مراقبة عدد قليل نسبيا من الخلايا العصبية في كل مرة13. نظرا لتركيزات الكالسيوم السيتوبلازمية المنخفضة عادة ، وتدفق الكالسيوم أثناء إمكانات العمل ، واستخدام الكالسيوم كإشارة سيتوبلازمية ، فإن ديناميكيات الكالسيوم هي بدائل قوية لمراقبة إمكانات العمل أو النشاط الخلوي في الجسم الحي باستخدام مؤشرات الفلورسنت الحساسة للكالسيوم. الأساس المنطقي لهذه الطريقة هو أن الفحص المجهري الفلوري يمكنه مراقبة هذه المؤشرات في وقت واحد في مئات إلى آلاف الخلايا العصبية في وقت واحد في العقد الحسية المحيطية للفئران13،14،15،16،17،18،19،20،21،22،23،24 و الفئران25،26. هذه ميزة قوية على الطرق التي يمكنها مراقبة عدد محدود من الخلايا العصبية في الجسم الحي.

الهدف من هذه الطريقة هو الملاحظة المباشرة لديناميكيات السيتوبلازمية Ca2+ في الجسم الحي في TG استجابة للمنبهات الميكانيكية ودرجة الحرارة والكيميائية والهرمونية في نماذج آلام الصداع19،23،24. يمكن استخدام هذه الطريقة كمكمل للألم أو الاختبارات الحسية الجسدية الأخرى في منطقة الفم والوجه. في الجسم الحي تم استخدام التصوير ثلاثي التوائم Ca2+ لتوصيف الترميز الحراري والحسي19،22 ، ودراسة فئات المستقبلات الميكانيكية27 ، واكتشاف فئة جديدة من الخلايا العصبية الحساسة للميكانيكا28 ، ومراقبة الاستجابات ثلاثية التوائم للضغوط الميكانيكية الطبيعية على السحايا29 ، ودراسة تأثيرات الهرمونات على حساسية الألم24 ، وتمييز نماذج آلام الفم والوجه30، ودراسة المساهمين في الألم الناجم عن انسحابالكحول 23.

تسمح الفئران Pirt-GCaMP3 بمراقبة النشاط العصبي في الجسم الحي لأنها تحتوي على مستشعر Ca2 + GCaMP3 الذي تم إدخاله في منطقة المحفز لجين Pirt ، والتي يتم التعبير عنها بشكل كبير في جميع الخلايا العصبية الحسية الأولية (>95٪) 12،18. توضح هذه الورقة تقنية لإجراء التعرض الجراحي في الجسم الحي TG وجمع وتحليل بيانات الفحص المجهري لمؤشر الكالسيوم للجانب الأيمن TG لفئران Pirt-GCaMP3 باستخدام الفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر متحد البؤر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يتم تنفيذ جميع الإجراءات الموضحة هنا بموجب بروتوكولات معتمدة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها. الجراحة هي عدم البقاء على قيد الحياة. يجب تنفيذ القسمين 1 و 2 من هذا الإجراء فور البدء. يمكن تنفيذ القسم 3 في وقت لاحق.

1. تأمين وجراحة الفأر لتصوير TG على الجانب الأيمن

ملاحظة: تحتاج الفئران Pirt-GCaMP3 C57BL / 6J18 إلى حجم جسم بالغ (عادة 8 أسابيع أو أكبر) ، بغض النظر عن الجنس. التصوير الثنائي TG ممكن. الأوقات المدرجة هنا هي تقديرات من قبل فني متمرس. إذا كان النزيف أكثر من المعتاد، فقد يستغرق الأمر عدة دقائق أطول لكل وقت معين.

  1. تحضير محلول ملحي معقم يحتوي على 40 ملغم/مل من الكيتامين و6 ملغم/مل زيلازين. قم بإعداد حجم كاف للجراحة والقتل الرحيم بعد التصوير (9 ميكرولتر كحد أدنى لكل جرام من وزن جسم الفأر).
    ملاحظة: تم استخدام العديد من أنواع التخدير أثناء التصوير في الجسم الحي . تحذير: الكيتامين ضار إذا تم حقنه أو ابتلاعه أو ملامسته للعينين. تعامل معها بعناية.
  2. تعقيم جميع الأدوات الجراحية في معقم الخرز. اغسل الأدوات بنسبة 70٪ من الإيثانول.
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، قم بتعقيم الأدوات مسبقا.
  3. حقن 2.25 ميكرولتر من الكيتامين / الزيلازين لكل جرام من وزن الجسم (90 مجم / كجم و 13.5 مجم / كجم من الكيتامين والزيلازين ، على التوالي) في الفئران Pirt-GCaMP3 قبل 15-25 دقيقة من الجراحة. لا تتجاوز 120 ملغم/كغ من الكيتامين.
  4. بعد 15-25 دقيقة من حقن التخدير (الخطوة 1.3) ، اضغط على المخلب الخلفي بالملقط للتأكد من أن الفأر على مستوى التخدير الجراحي.
    ملاحظة: يجب أن تكون القرصة شديدة بما يكفي لإحداث نطق في الماوس الواعي ، ولكن ليس شديدا بما يكفي لإحداث إصابة. من المهم عدم ترك الماوس في هذه الخطوة لفترة أطول من اللازم لتجنب انخفاض درجة حرارة الجسم. من المفيد الحفاظ على دفء القفص ، إن أمكن.
  5. ضع الماوس على وسادة تسخين لضمان الحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية وضع رأس الماوس في قناع تجسيمي (الشكل 1 أ ، ب) ، مع إمالة الرأس بزاوية 15 درجة تقريبا إلى اليسار (الشكل 1 ب).
    ملاحظة: يتم وصف القناع التجسيمي الذي يعمل على تثبيت الرأس ويوفر طريقا لإدارة الأيزوفلوران هنا. إذا كان الإجراء لا يستخدم الأيزوفلوران أو لم يتم استخدام قناع تجسيمي ، فيجب استخدام طريقة أخرى لتثبيت الرأس لمنع الحركة.
  6. ضع مرهم العين على العينين لمنع الجفاف والتهيج ، لأن التهيج يحفز نشاط العصب ثلاثي التوائم.
  7. احلق الجانب الأيمن من رأس الماوس.
    ملاحظة: تستغرق هذه الخطوة 90 ثانية. قد يقوم المحقق بإزالة لفترة وجيزة من وسادة التدفئة للحلاقة.
  8. قم بعمل شق مستطيل 9 مم × 5 مم بين الأذن اليمنى والعين اليمنى (الشكل 2 أ). أوقف النزيف باستخدام مسحة مرقئ أو مناديل معملية.
    ملاحظة: تستغرق هذه الخطوة 2 دقيقة. قد يستخدم المحقق ملقطا مرقئا أو ضام لإبقاء الشق مفتوحا. هذا إجراء غير قابل للبقاء على قيد الحياة ، مما يعني أن التنظيف الإضافي غير ضروري. ومع ذلك ، قد يقوم المحقق بمسح موقع الجراحة باستخدام بوفيدون اليود. يتم إعطاء أكبر حجم شق مسموح به. إذا كان الجراح ماهرا بما فيه الكفاية ، يفضل إجراء شق أصغر على شق أكبر لتقليل تلف الأنسجة. يعصب TG هذا النسيج ويمكن أن يتضرر.
  9. قطع الأنسجة (السمحاق) على سطح الجمجمة فقط في باطن العين (الشكل 2 ب).
  10. باستخدام مثقاب الأسنان والشق المستدق TNT bur 31p ، قم بحفر ثقب حوالي 9 مم × 5 مم في الجمجمة الظهرية المتمركزة في موقع الشق (الشكل 2 ج). ضع البر برفق قدر الإمكان على سطح الجمجمة.
    ملاحظة: تستغرق هذه الخطوة حوالي 2 دقيقة. إذا كان الجراح ماهرا بما فيه الكفاية ، يفضل وجود ثقب أصغر على ثقب أكبر.
  11. قم بإمالة الرأس حتى يصبح TG مرئيا بوضوح (الشكل 2C). إذا كان هناك نزيف على TG ، فقم بشفط الدم أو إزالة الدم عن طريق فتل بمسحة مرقئ أو منديل مختبري. تأكد من أن TG مرئي بوضوح دون إزالة أي نسيج قشري (الشكل 2 ج).
    ملاحظة: نقوم بتصوير TG بشكل روتيني لمدة 3-6 ساعات أو أكثر دون علامات الضيق في الخلايا العصبية ، ولكن يمكن للباحث اختيار وضع غطاء أو غطاء آخر لمنع TG من الجفاف.
  12. انقل ووسادة التدفئة إلى مرحلة المجهر وضع أنف الفأر في مخروط الأنف التجسيمي. قم بتوصيل خطوط الأكسجين / الأيزوفلوران بحيث يتلقى الفأر تخديرا مستمرا للأيزوفلوران (الشكل 3 أ).
    ملاحظة: تستغرق هذه الخطوة 3 دقائق. يتطلب الأيزوفلوران المستمر خزانات أكسجين وأنابيب توصيل الغاز ومبخر تخدير. من الممكن أيضا الحفاظ على التخدير طوال العملية عن طريق الحقن الدورية للتخدير.
  13. ضع الإطار التجسيمي بحيث يكون هدف المجهر 9 مم فوق فتحة الجمجمة مباشرة (الشكل 3 ب).
    ملاحظة: تعتمد المسافة الدقيقة على الهدف والمجهر والماوس.
  14. أدخل مقياس حرارة المستقيم. قم بتوصيل سلك الطاقة بمقياس حرارة المستقيم ووسادة التدفئة. قم بتوصيل قناع التخدير بالأيزوفلوران في خط الأكسجين باستخدام 1٪ إيزوفلوران.

2. تصوير TG

ملاحظة: أستخدم الإعداد الأخضر (FITC) 495 نانومتر، والبث 519 نانومتر، والطول الموجي للكشف 500-580 نانومتر، وجهاز التصوير GaAsP-Pmt1، وكاشف GaAsP-PMT، أو استخدم الإعدادات الموصى بها للمجهر. انظر الجدول 1 للحصول على ملخص لإعدادات البرامج.

  1. استخدم هدف 5x / 0.25 M27 ، وبرنامج الشركة المصنعة للمجهر ، ومجهر المسح الضوئي بالليزر العمودي متحد البؤر. حدد موقع سطح TG بالمجهر.
    ملاحظة: يعتمد الاختيار الموضوعي على المجهر وتفضيل المحقق.
  2. اضبط الهدف ومخروط الأنف لجعل سطح TG مسطحا قدر الإمكان والحصول على أكبر مساحة سطح ممكنة في المستوى البؤري.
    ملاحظة: يوفر TG المسطح صورة أكثر وضوحا ، ويتسبب في قيام البرامج بتكوين أفلام أكثر وضوحا ، وصور المزيد من الخلايا العصبية ، ويبسط ويحسن دقة التحليل مقارنة ب TG الأكثر إمالة.
  3. حافظ على الفأر تحت التخدير عن طريق وضع 1-1.5٪ إيزوفلوران على تدفق الأكسجين من خلال قناع التخدير.
    ملاحظة: يجب مراقبة عن كثب طوال الإجراء عن طريق الضغط على المخلب الخلفي كل 20-30 دقيقة للتأكد من بقاء تحت التخدير. تعتمد النسبة المئوية للأيزوفلوران المطلوبة للحفاظ على التخدير على الفأر الفردي. إذا تحرك أثناء القرص الاختباري ، فيجب زيادة الأيزوفلوران. إذا أصبح التنفس ضحلا ، فيجب تقليل الأيزوفلوران. تنبيه: الأيزوفلوران ضار إذا تم استنشاقه وقد يسبب الدوخة أو النعاس. تجنب الاستنشاق وتأكد من أن منطقة العمل بها تهوية كافية.
  4. قم بتحميل بروتوكول المسح الضوئي عالي السرعة بالمجهر: حجم فوكسل 4.160 ميكرومتر × 4.160 ميكرومتر × 14 ميكرومتر ، 512 × 512 بكسل ، 10 شرائح بصرية Z-stack ، 1.02 وحدة جيدة التهوية (AU) / 33 ميكرومتر ، 15٪ 488 نانومتر طاقة ليزر / 75 ميجاوات ، وقت البكسل 1.52 ميكرو ثانية ، وقت الخط 0.91 مللي ثانية ، وقت الإطار 465 مللي ثانية ، سرعة مسح LSM 8 ، مسح ثنائي الاتجاه ، كاشف GaAsP-PMT كسب 550 فولت ، المكاسب الرقمية 1.
    ملاحظة: قد تختلف الإعدادات المثلى بين المجاهر.
  5. امسح TG على دفعات قصيرة من 6-8 دورات. قم بإنشاء إسقاطات متعامدة لعمليات المسح الضوئي (مسح ضوئي واحد يصنع إطار فيلم واحد) لإنشاء فيلم والتحقق من وضوح الصورة واتساقها بين الإطارات. إذا لزم الأمر، اضبط موضع الإطار المجسم وسمك القسم البصري وكرر هذه الخطوة حتى يتم إنشاء فيلم واضح ومتسق.
    ملاحظة: يجب تكرار هذه الخطوة إذا تحرك رأس الماوس أو قام المحقق بإعادة وضع الماوس أو ضبط المستوى البؤري.
  6. قم بتحميل بروتوكول المسح الضوئي عالي الدقة بالمجهر: حجم فوكسل 0.520 ميكرومتر × 0.520 ميكرومتر × 14 ميكرومتر ، 4096 × 4096 بكسل ، 6 شرائح بصرية Z-stack ، 1.02 وحدة جيدة التهوية (AU) / 33 ميكرومتر ، 20٪ 488 نانومتر طاقة ليزر / 100 ميجاوات ، وقت البكسل 0.52 ميكرو ثانية ، وقت الخط 4.95 مللي ثانية ، وقت الإطار 20.26 ثانية ، سرعة مسح LSM 6 ، مسح ثنائي الاتجاه ، كاشف GaAsP-PMT كسب 550 فولت ، كسب رقمي 1.
    ملاحظة: تعتمد الإعدادات المثلى على المجهر. إذا تم تمييز الخلايا ب td-Tomato ، فاضبط المجهر لمسح القناة الحمراء 592 نانومتر إثارة / انبعاث 614 نانومتر ، والكشف عن الطول الموجي 600-700 نانومتر بالإضافة إلى القناة الخضراء.
  7. قم بإنشاء صورة عالية الدقة ل TG.
    ملاحظة: يمكن أن تكون هذه الصورة مفيدة لحساب الخلايا العصبية ، أو قياس قطر الخلايا العصبية الخافتة ، أو توفير صورة مفصلة لتمييز ما إذا كانت نفس الخلايا العصبية تستجيب لمنبازين مختلفين أو استجابت خليتين عصبيتين مختلفتين.
  8. قم بتحميل بروتوكول المسح الضوئي عالي السرعة بالمجهر (انظر الخطوة 2.4).
  9. سجل النشاط التلقائي لمدة 80 دورة (حوالي 10 دقائق). قم بإنشاء فيلم عرض متعامد وتحقق من أن الصور واضحة ومتسقة بما يكفي لتحليلها.
    ملاحظة: ينتج عن هذا إطارات كافية لتحليل النشاط التلقائي. يمكن تقليل العدد أو زيادته اعتمادا على مدى أهمية النشاط التلقائي لتجربة معينة.
  10. لتطبيق التحفيز ، اضبط المجهر على مسح 15-20 دورة.
    ملاحظة: كن حذرا عند تطبيق المحفزات حتى لا تحرك رأس الماوس. يمكن أن يؤدي تحريك TG حتى الميكرونات أثناء التحفيز إلى تعطيل التصوير. يسمح المسح للدورات بإنشاء خط أساس ، وتحفيز ، ومراقبة الخلايا العصبية بعد إزالة المنبه.
  11. انتظر حتى تكتمل الدورات من 1 إلى 5 لإنشاء خط أساس. تطبيق التحفيز أثناء المسح 6-10. انتظر 5 دقائق على الأقل بعد كل محفز لتجنب إزالة حساسية الخلايا العصبية.
    ملاحظة: يتطلب كل حافز مسحا منفصلا من 15 إلى 20 دورة. قم بتطبيق التحفيز الميكانيكي أولا ، متبوعا بالتحفيز البارد والحرارة والكيميائي. تطبيق التحفيز منخفض التردد (على سبيل المثال ، القوة الميكانيكية المنخفضة ، درجة الحرارة القريبة من درجة حرارة الغرفة) قبل التحفيز عالي التردد (القوة الميكانيكية العالية ، درجة الحرارة بعيدا عن درجة حرارة الغرفة). احرص على عدم تحريك TG عند تطبيق التحفيز. إذا كان من الممكن سماع عمليات المسح بوضوح ، فيمكن تطبيق التحفيز مباشرة بعد الفحص 5. ومع ذلك ، فإن أي طريقة توفر توقيتا ثابتا للتحفيز ستنجح. انظر المناقشة حول ترتيب التحفيز.
  12. بالنسبة إلى فون فراي في المنطقة التي يعصبها الجزء V2 من TG ، أمسك الفتيل وقم بتطبيقه بشكل متكرر على المنطقة المماثلة أسفل العين وفوق الفم مباشرة بعد الفحص 5 إلى مباشرة بعد المسح 10.
  13. بالنسبة إلى فون فراي في المنطقة التي يعصبها الجزء V3 من TG ، أمسك الفتيل وقم بتطبيقه بشكل متكرر على المنطقة المماثلة أسفل الأذن مباشرة من مباشرة بعد نهاية الفحص 5 حتى مباشرة بعد نهاية الفحص 10.
  14. بالنسبة للمنبهات الباردة والحرارية ، قم بتبريد أو تسخين دورق الماء إلى أقل قليلا (للبرد) أو أعلى (للتدفئة) درجة الحرارة المطلوبة ثم ابدأ في المسح باستخدام ماصة نقل البلاستيك. ضع المنبه باستخدام ماصة النقل مباشرة بعد المسح 5 على المنطقة المماثلة أسفل العين مباشرة ، أو فوق الفم (ل V2) ، أو أسفل الأذن مباشرة (ل V3).
    ملاحظة: تأكد من أن درجة الحرارة في حدود 1 درجة مئوية من درجة الحرارة المطلوبة للمسح الضوئي 5. لتجنب إزالة حساسية الخلايا العصبية ، لا تقم بتطبيق المنبه إذا كانت درجة حرارة الدورق غير صحيحة. بدلا من ذلك ، قم بتبريد الماء أو تسخينه مرة أخرى وحاول مرة أخرى.
  15. في نهاية التجارب ، قم بحقن 50 ملي مولار من كلوريد البوتاسيوم تحت الجلد في مناطق V2 أو V3 بدءا من الدورة 6 لتنشيط وتحديد جميع الخلايا العصبية المستجيبة.
  16. بعد إعطاء جميع المحفزات وتسجيلها ، قم بالقتل الرحيم للحيوان عن طريق جرعة زائدة من الكيتامين / الزيلازين (200 مجم لكل كيلوغرام من الكيتامين ، أو 30 مجم لكل كيلوغرام من الزيلازين ، أو 5 ميكرولتر لكل غرام من المحلول المحضر في الخطوة 1.1) ، ثم قطع الرأس.

3. بروتوكول التحليل

  1. افتح ملف الإسقاط المتعامد باستخدام خيار السحب والإفلات . حدد نوع الصورة من صورة | النوع | لون RGB. اختياري: استخدم المكون الإضافي StackReg31 ضمن الإضافات | الجرار | StackReg لتصحيح القطع الأثرية للحركة والمحاذاة.
    ملاحظة: يمكن للمحقق اختيار نوع الصورة بناء على التفضيل. يبسط RGB إنشاء الصور الملونة للنشر.
  2. افتح مدير العائد على الاستثمار باستخدام التحليل | أدوات | مدير العائد على الاستثمار.
  3. حدد الخلايا العصبية النشطة عن طريق رسم عائد استثمار باستخدام أداة Ellipse أو Rectangle في شريط الأدوات ثم ضعها في ملف ROI بالنقر فوق الزر "إضافة " في نافذة مدير ROI أو بالضغط على المفتاح "t".
    ملاحظة: احفظ ملفات عائد الاستثمار بشكل متكرر. يمكن استعادة عائد الاستثمار عن طريق سحب ملف ROI وإفلاته في ImageJ والنقر فوق المربع إظهار الكل في أسفل نافذة مدير العائد على الاستثمار. يؤدي حفظ ملف .zip عائد الاستثمار إلى تبسيط التحليل مقارنة بحفظ عائد الاستثمار كتراكب. يجب استبعاد الخلايا العصبية التي تتقلب خلال فترة خط الأساس على أنها نشطة تلقائيا ، بدلا من الاستجابة للتحفيز.
  4. في التحليل | إعدادات القياس، حدد متوسط القيمة الرمادية (اختياري، ولكن موصى به: قم بإلغاء تحديد جميع المربعات الأخرى ضمن إعدادات القياس).
  5. استخدم نافذة عائد الاستثمار في المزيد | متعدد القياس لقياس الكثافة.
    ملاحظة: في بعض الأحيان ، تكون الخلايا العصبية المجاورة قريبة جدا من رسم عائد استثمار منفصل. يمكن تضمين هذه الخلايا العصبية في عدد الخلايا العصبية النشطة ولكن لا يمكن تضمينها في قياسات الشدة العابرة.
  6. ينشئ Multi-Measure ملف CSV في نافذة جديدة بعنوان "النتائج". احفظ ملف CSV بالنقر فوق ملف | حفظ باسم. افتح ملف .csv باستخدام برنامج جداول البيانات واحفظ الملف كجدول بيانات.
    ملاحظة: راجع الملف التكميلي 1 للحصول على قالب تحليل.
  7. احسب الكثافة العابرة Ca2+ ك ΔF / F0 = (Ft- F0) / F0 ، حيث Ft هي شدة البكسل في عائد الاستثمار في النقطة الزمنية للفائدة و F0 هي شدة خط الأساس التي يحددها متوسط شدة 2-4 إطارات تسبق Ca2 + عابر للنشاط التلقائي أو أول 1-5 إطارات للعابرين Ca2+ الناجم عن التحفيز. استبعاد جميع الخلايا العصبية التي تولد قمم Ca2+ قبل التحفيز ولا تحلل النشاط بعد التحفيز.
  8. بالنسبة لتحليل الشدة العابرة Ca2+ ، قم بأخذ عينات عشوائية تقريبا من نفس العدد من الخلايا العصبية من كل عقدة لمنع العقد التي تولد أكبر عدد من الخلايا العصبية المستجيبة من السيطرة على التحليل. استبعاد القمم مع ΔF / F0 < 0.15.
    ملاحظة: هناك طرق بديلة منشورة لتحليل وتضمين واستبعاد الخلايا العصبية15،16،19،22،32،33،34،35.
  9. قم بقياس قطر الخلايا العصبية عن طريق حساب متوسط طول الخط المرسوم في ImageJ على طول الأقطار الأطول والأقصر باستخدام أداة Line في شريط الأدوات.
    ملاحظة: يمكن للمحقق أيضا قياس المساحة والمعلمات الإهليلجية لعائد الاستثمار لتقدير القطر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تصوير أعداد كبيرة من الخلايا العصبية وفروع ثلاثية التوائم محددة عن طريق المسح متحد البؤر للعقدة ثلاثية التوائم Pirt-GCaMP
بعد التعرض الجراحي ل TG في فئران Pirt-GCaMP3 ، يسمح الفحص المجهري متحد البؤر بتصوير أكثر من >3,000 خلية عصبية في وقت واحد (الشكل 4). يوفر هذا ميزة قوية لمراقبة الآلاف من الخلايا العصبية TG في وقت واحد في سياقها الفسيولوجي الطبيعي. يمكن مراقبة العابرين العفويين من Ca2+ في حالة عدم وجود تحفيز (الشكل 4 أ

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تؤثر اضطرابات الألم في المفصل الصدغي الفكي والتهاب دواعم السن القمي على ما يقرب من 5٪ 36 و 30-70٪ 37،38 من عامة السكان ، على التوالي. تكتشف الخلايا العصبية الحسية الأولية المحفزات الضارة في الجلد والغشاء المخاطي للفم والأسنان والمناطق المحيطة بالحجاج ، وتساهم لدونتها في الألم المستمر. يمكن استخدام زراعة الخلايا والاستخلاصات لدراسة الخلايا العصبية ولكن يتم إزالتها من سياقها الفسيولوجي الطبيعي. يسمح تصوير ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للمنح الصحية R01NS0128574 و R01DE031477 (إلى YSK) ، وجائزة Rising STAR من نظام جامعة تكساس (YSK).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الحقن المخفوق (الزيليزين)كوفيتروس ، أكورن33197
فلورار 5x / 0.25 M27 obejctiveكال زايس420130-9900-000
أدوات تطبيق برأس قطنيماكيسون24-106-1 ثانية
مرقئ منحنيأدوات العلوم الجميلة13007-12
تحكم في درجة حرارة التيار المستمرFHC40-90-8 د
وسادة تسخين تحكم في درجة الحرارة DCFHC40-90-2-05
ملقط Dumont المغلفة بالسيراميكأدوات العلوم الجميلة11252-50
وحدة التحكم في درجة الحرارة FHC DCFHC40-90-8 د
فلوريسو (إيزوفلوران)MWI صحة ، مجموعة بيرامال501017
فريدمان بيرسون رونجرزأدوات العلوم الجميلة16221-14
جل فومشركه فايزر09-0353-01
إيمج جيالمعاهد الوطنية للصحةإيج153
كيتاسيت (كيتامين)زويتيسكيت-00002R2
موديل 923-B حامل رأس تخدير غاز الماوس (فأر بالغ)أدوات كوبف923-ب
شريط المرحلة الأخضر المضيءJSITON / أمازونB803YW8ZWL
M35 نظام قبضة مختبر كهربائي مدمجشركة بوفالو لتصنيع الأسنان ، وشركةم 35
Matrx VIP 3000 Isoflurane Vaporizerمنتصف الماركة91305430
مقص تشريح دقيقروبوزآر إس-5882
مقص زنبركي تشريح دقيقأدوات العلوم الجميلة15023-10
مقص زنبركي تشريح دقيقروبوزآر إس -5677
مسبار ثرمستور المستقيم الصغيرFHC40-90-5D-02
مقص التشغيلروبوزآر إس-6812
فئران Pirt-GCaMP3 C57 / BL / 6Jجامعة جونز هوبكنزغير متاحيمكن تصوير أي من الجنسين بشكل جيد. يجب ألا يقل عمر الفئران عن 8 أسابيع بسبب ضعف أو تقطع تعبير مروج Pirt في الفئران الأصغر سنا.
كلوريد البوتاسيومفيشر العلميةBP366-500
إطار تجسيميكوبف موديل 923-B923-ب
قناع Sterotactic (نشط) للفئران < 30 جرام مع أنابيبRWD علوم الحياة68663
شق مستدق TNT بر (31P)شركة بوفالو لتصنيع الأسنان ، وشركة31P-GOLD
الفئران td-Tomato C57BL / 6Jمختبر جاكسون7909
لوحة علوية ، 6 بوصة × 10 بوصةنيوبورت290-طن
ماصة نقل ، 3 ملكول بارمرUX-06226-23
الفئران TrpV1-Cre C57BL / 6Jمختبر جاكسون17769
مجهر متحد البؤر Zeiss LSM 800كال زايسال إس إم 800
برنامج Zeiss Zen 2.6 Blue Editionكال زايسزن (الطبعة الزرقاء) 2.6

المراجع

  1. Kuramoto, E., et al. Three-dimensional topography of rat trigeminal ganglion neurons using a combination of retrograde labeling and tissue-clearing techniques. J Comp Neurol. 532 (2), e25584(2024).
  2. Chung, M. K., Wang, S., Oh, S. L., Kim, Y. S. Acute and chronic pain from facial skin and oral mucosa: Unique neurobiology and challenging treatment. Int J Mol Sci. 22 (11), 5810(2021).
  3. Levy, D., Burstein, R., Kainz, V., Jakubowski, M., Strassman, A. M. Mast cell degranulation activates a pain pathway underlying migraine headache. Pain. 130 (1-2), 166-176 (2007).
  4. Moskowitz, M. A., Macfarlane, R. Neurovascular and molecular mechanisms in migraine headaches. Cerebrovasc Brain Metab Rev. 5 (3), 159-177 (1993).
  5. Strassman, A. M., Raymond, S. A., Burstein, R. Sensitization of meningeal sensory neurons and the origin of headaches. Nature. 384 (6609), 560-564 (1996).
  6. Avraham, O., et al. Profiling sensory neuron microenvironment after peripheral and central axon injury reveals key pathways for neural repair. Elife. 10, e68457(2021).
  7. Bhuiyan, S. A., et al. Harmonized cross-species cell atlases of trigeminal and dorsal root ganglia. Sci Adv. 10 (25), eadj9173(2024).
  8. Chu, Y., et al. Single-cell transcriptomic profile of satellite glial cells in trigeminal ganglion. Front Mol Neurosci. 16, 1117065(2023).
  9. Mapps, A. A., et al. Diversity of satellite glia in sympathetic and sensory ganglia. Cell Rep. 38 (5), 110328(2022).
  10. Basbaum, A. I., Woolf, C. J. Pain. Curr Biol. 9 (12), R429-R431 (1999).
  11. Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139 (2), 267-284 (2009).
  12. Kim, Y. S., et al. Central terminal sensitization of trpv1 by descending serotonergic facilitation modulates chronic pain. Neuron. 81 (4), 873-887 (2014).
  13. Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. Calcium imaging for analgesic drug discovery. Neurobiol Pain. 11, 100083(2022).
  14. Chen, Z., et al. Adjacent intact nociceptive neurons drive the acute outburst of pain following peripheral axotomy. Sci Rep. 9 (1), 7651(2019).
  15. Chisholm, K. I., Khovanov, N., Lopes, D. M., La Russa, F., Mcmahon, S. B. Large scale in vivo recording of sensory neuron activity with GCaMP6. eNeuro. 5 (1), (2018).
  16. Emery, E. C., et al. In vivo characterization of distinct modality-specific subsets of somatosensory neurons using GCaMP. Sci Adv. 2 (11), e1600990(2016).
  17. Ishida, H., et al. In vivo calcium imaging visualizes incision-induced primary afferent sensitization and its amelioration by capsaicin pretreatment. J Neurosci. 41 (41), 8494-8507 (2021).
  18. Kim, Y. S., et al. Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
  19. Leijon, S. C. M., et al. Oral thermosensing by murine trigeminal neurons: Modulation by capsaicin, menthol and mustard oil. J Physiol. 597 (7), 2045-2061 (2019).
  20. Macdonald, D. I., et al. Silent cold-sensing neurons contribute to cold allodynia in neuropathic pain. Brain. 144 (6), 1711-1726 (2021).
  21. Wang, F., et al. Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold. Cell Rep. 23 (7), 2001-2013 (2018).
  22. Yarmolinsky, D. A., et al. Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system. Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).
  23. Son, H., et al. Mast-cell-specific receptor mediates alcohol-withdrawal-associated headache in male mice. Neuron. 112 (1), 113-123.e4 (2024).
  24. Son, H., Zhang, Y., Shannonhouse, J., Gomez, R., Kim, Y. S. PACAP38/mast-cell-specific receptor axis mediates repetitive stress-induced headache in mice. J Headache Pain. 25 (1), 87(2024).
  25. Hartung, J. E., Gold, M. S. GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons. Cell Calcium. 89, 102225(2020).
  26. Kucharczyk, M. W., et al. The impact of bone cancer on the peripheral encoding of mechanical pressure stimuli. Pain. 161 (8), 1894-1905 (2020).
  27. Moayedi, Y., et al. The cellular basis of mechanosensation in mammalian tongue. Cell Rep. 42 (2), 112087(2023).
  28. Ghitani, N., et al. Specialized mechanosensory nociceptors mediating rapid responses to hair pull. Neuron. 95 (4), 944-954.e4 (2017).
  29. Blaeser, A. S., et al. Trigeminal afferents sense locomotion-related meningeal deformations. Cell Rep. 41 (7), 111648(2022).
  30. Son, H., et al. Elucidation of neuronal activity in mouse models of temporomandibular joint injury and inflammation by in vivo GCaMP Ca2+ imaging of intact trigeminal ganglion neurons. Pain. 165 (12), 2794-2803 (2024).
  31. Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  32. Barretto, R. P., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).
  33. Sekiguchi, K. J., et al. Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice. Nat Commun. 7, 11450(2016).
  34. Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nat Commun. 6, 8171(2015).
  35. Ran, C., Hoon, M. A., Chen, X. The coding of cutaneous temperature in the spinal cord. Nat Neurosci. 19 (9), 1201-1209 (2016).
  36. National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine 2020. Temporomandibular disorders: Priorities for research and care. Yost, O., Liverman, C. T., English, R., Mackey, S., Bond, E. C. , The National Academic Press. Washington, DC. (2020).
  37. Eriksen, H. M. Endodontology--epidemiologic considerations. Endod Dent Traumatol. 7 (5), 189-195 (1991).
  38. Sidaravicius, B., Aleksejuniene, J., Eriksen, H. M. Endodontic treatment and prevalence of apical periodontitis in an adult population of vilnius, lithuania. Endod Dent Traumatol. 15 (5), 210-215 (1999).
  39. Luiz, A. P., et al. Cold sensing by Nav1.8-positive and Nav1.8-negative sensory neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (9), 3811-3816 (2019).
  40. Shannonhouse, J., Gomez, R., Son, H., Zhang, Y., Kim, Y. S. In vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia. J Vis Exp. (192), e64826(2023).
  41. Shannonhouse, J., et al. Meclizine and metabotropic glutamate receptor agonists attenuate severe pain and Ca2+ activity of primary sensory neurons in chemotherapy-induced peripheral neuropathy. J Neurosci. 42 (31), 6020-6037 (2022).
  42. Zheng, Q., et al. Synchronized cluster firing, a distinct form of sensory neuron activation, drives spontaneous pain. Neuron. 110 (2), 209-220.e6 (2022).
  43. Mahadevan, A. S., et al. Cytonet: Spatiotemporal network analysis of cell communities. PLoS Comput Biol. 18 (6), e1009846(2022).
  44. Chen, C., et al. Long-term imaging of dorsal root ganglia in awake behaving mice. Nat Commun. 10 (1), 3087(2019).
  45. Yoshihara, K., et al. Astrocytic Ca2+ responses in the spinal dorsal horn by noxious stimuli to the skin. J Pharmacol Sci. 137 (1), 101-104 (2018).
  46. Madisen, L., et al. Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance. Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).
  47. Li, J., et al. Engineering of nemo as calcium indicators with large dynamics and high sensitivity. Nat Methods. 20 (6), 918-924 (2023).
  48. Wu, J., et al. Kilohertz two-photon fluorescence microscopy imaging of neural activity in vivo. Nat Methods. 17 (3), 287-290 (2020).
  49. Tan, C. H., Mcnaughton, P. A. The TRPM2 ion channel is required for sensitivity to warmth. Nature. 536 (7617), 460-463 (2016).
  50. Akemann, W., Mutoh, H., Perron, A., Rossier, J., Knöpfel, T. Imaging brain electric signals with genetically targeted voltage-sensitive fluorescent proteins. Nat Methods. 7 (8), 643-649 (2010).
  51. Gong, Y., et al. High-speed recording of neural spikes in awake mice and flies with a fluorescent voltage sensor. Science. 350 (6266), 1361-1366 (2015).
  52. Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision. Nat Methods. 7 (5), 399-405 (2010).
  53. Zhang, Y., et al. Imaging sensory transmission and neuronal plasticity in primary sensory neurons with genetically-encoded voltage indicator, ASAP4.4-kv. bioRxiv. , (2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

العقدة الثلاثية التوأمالتصوير الحيفئران GCaMP3التصوير البؤريالأنماط الحسيةتحفيز فون فرايالعوابر الكالسيومية
في الجسم الحي تصوير الكالسيوم للمجموعات العصبية في شبكات الخلايا العصبية الحسية الأولية في العقد ثلاثية التوائم السليمة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.