مقالة منهجية

نموذج الفأر لمرض الكبد الدهني المرتبط بخلل التمثيل الغذائي مع التليف

DOI:

10.3791/68294

⸱

يوليو 18, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Brooklyn College, City University of New York

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نموذج الفأر لمرض الكبد الدهني المرتبط بخلل التمثيل الغذائي (MASLD) مع ضعف التمثيل الغذائي ، وتغيرات التعبير الجيني الكبدي ، والتغيرات النسيجية المرضية للكبد التي تشبه MASLD البشري ، بما في ذلك التليف الذي يتطور إلى مرحلة التليف المتقدم 3. يمكن استخدام هذا النموذج في دراسات الفيزيولوجيا المرضية MASLD وفي الدراسات قبل السريرية للعلاجات الجديدة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تليف الكبد هو أهم مؤشر على النتائج السلبية في مرض الكبد الدهني المرتبط بالخلل الأيضي (MASLD). في الدراسات قبل السريرية ل MASLD ، تعد الفئران هي نموذج المرض الأكثر استخداما. ومع ذلك ، في هذه النماذج ، يصعب إحداث تليف الكبد. يصف هذا البروتوكول نموذجا للفأر من MASLD حيث يتم تغذية فئران Ay المصابة بنظام غذائي غني بالدهون والفركتوز ، والذي يشبه النظام الغذائي العادي في الولايات المتحدة. تصاب الفئران بتنسج دهني كبدي وإصابة والتهاب وتليف. يتطور التليف من التليف حول الخلايا ، المرحلة 1 من التليف بعد 16 أسبوعا ، إلى التليف في المرحلة 3 بعد 12 شهرا. تصاب هذه الفئران أيضا بالسمنة وفرط شحوم الدم وعدم تحمل الجلوكوز وفرط الأنسولين في الدم. يكرر نموذج المرض هذا علم الأنسجة المرضية في الكبد ، وتغيرات التعبير الجيني الكبدي ، والخلل الأيضي للمرض البشري. يتضمن هذا البروتوكول طريقتين لتحديد التليف: التلوين النسيجي للكولاجين بواسطة بيكرو سيريوس الأحمر ، والقياس الكمي لمحتوى الكبد من هيدروكسي برولين. يمكن استخدام هذه الطرق لدراسة الفيزيولوجيا المرضية MASLD والدراسات قبل السريرية للعلاجات المحتملة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مرض الكبد الدهني المرتبط بضعف التمثيل الغذائي (MASLD) هو أكثر أمراض الكبد شيوعا ، حيث ينتشر من 31٪ إلى 40٪ في الولايات المتحدة و 42٪ في جميع أنحاء العالم1،2،3،4. يمكن للمرضى الذين يعانون من MASLD أن يصابوا بالتهاب الكبد الدهني المرتبط بخلل التمثيل الغذائي (MASH) ، والذي كان يسمى سابقا التهاب الكبد الدهني غير الكحولي (NASH) ، وتليف الكبد ، وسرطان الخلايا الكبدية5،6. يزيد MASLD من خطر الإصابة بسرطان الخلايا الكبدية ، وبعد الزيادة الأخيرة في انتشار MASLD ، أصبح أكثر أمراض الكبد شيوعا لدى المرضى الذين يصابون بسرطان الخلايا الكبدية7،8. في MASLD ، التليف هو المؤشر الأساسي للتطور إلى تليف الكبد والنتائج السريرية السلبية ، بما في ذلك المراضة المرتبطة بالكبد (عدم التعويض الكبدي أو فشل الكبد أو سرطان الكبد) والوفيات المرتبطةبالكبد 6،9،10،11. وفقا لذلك ، تشجع إدارة الغذاء والدواء على تطوير علاجات تركز على MASH / NASH مع التليف ، بالإضافة إلى استخدام النماذج الحيوانية المناسبة12.

في الدراسات قبل السريرية للأدوية وفي الدراسات الميكانيكية ل MASLD ، يتم استخدام نماذج الفئران بشكل شائع13. تم وصف الآلاف من نماذج الفئران من MASLD ، مما يشير إلى عدم وجود توافق في الآراء على النموذج الأمثل13،14. يواجه إنشاء النماذج المثلى العديد من التحديات. على الرغم من أنه من السهل نسبيا إحداث السمنة والتنكس الدهني لدى الفئران عن طريق إطعامها أنظمة غذائية غنية بالدهون ، إلا أن تليف الكبد أكثر صعوبة في إحداث13،14،15،16. في نماذج MASLD مدفوعة بالأنظمة الغذائية المسببة للسمنة ، يتطور التليف ببطء17 على الرغم من أن هذا التقدم البطيء قد يحاكي المرض البشريبشكل أفضل 18 ، إلا أنه يزيد من مدة وتكلفة الدراسات التي أجريت على. الأنظمة الغذائية التي تحتوي على نسبة عالية من الكوليسترول (على سبيل المثال ، 2٪) تعزز تطور التليف. ومع ذلك ، فإنها تقلل أيضا من التوليف الذاتي للكوليسترول ، وهو عكس الزيادة الموصوفة في المرض البشري15،16. تستخدم بعض نماذج MASLD الفئران الطافرة أو المعدلة وراثيا. ومع ذلك ، قد يكون لديهم محاذير: تصاب الفئران OB / ob بالسمنة ، والتنكس الدهني ، ومقاومة الأنسولين ، لكنها تفتقر إلى اللبتين ، وهو وسيط للتليف. تصاب الفئران الفارغة PTEN بالتهاب التنكس الدهني ولكنها لا تطور مقاومة الأنسولين15،17. لذلك ، غالبا ما تتطلب نماذج الفئران من MASLD فترات دراسة طويلة ، أو أنظمة غذائية تحتوي على نسبة عالية من الكوليسترول ، أو التلاعب الجيني لتطوير تليف كبير14. لمعالجة بعض هذه المشاكل ، قمنا بتطوير نموذج فأر تصاب فيه ب MASLD مع التليف الذي يتطور من حول الخلايا / التمعوج (المرحلة 1) إلى التليف الجسر (المرحلة 3) 19.

الهدف من هذه المقالة هو وصف هذا النموذج من MASLD مع تليف الكبد وطريقتين لتحديد التليف: تلطيخ الكولاجين النسيجي بواسطة أحمر البيكرو سيريوس والقياس الكمي لمحتوى هيدروكسي برولين في الكبد.

كان الأساس المنطقي لتطوير هذا النموذج هو أن النماذج الحيوانية الأكثر فائدة هي تلك التي تكرر المرض البشري بشكل أفضل ، سواء في دوافع المرض أو في التغيرات في علم الأنسجة المرضية والتعبير الجيني. لذلك ، استخدمنا نظاما غذائيا يشبه النظام الغذائي العادي في الولايات المتحدة ، بما في ذلك كميات عالية من الدهون والفركتوز19،20. قمنا بإطعام هذا النظام الغذائي للفئران التي تحمل طفرة Agouti الصفراء (Ay) ، والتي تم استخدامها على نطاق واسع كنماذج للسمنة21. تعبر هذه الفئران في كل مكان عن بروتين agouti ، وهو مضاد لمستقبلات الميلانوكورتين ، بما في ذلك MC4R ، مما يسبب فرط البلع وتكرار زيادة تناول الطعام الشائع في السمنة البشرية21،22،23. يلخص هذا النموذج التعديلات التي تحدد MASH ، بما في ذلك التنكس الدهني ، وإصابة الخلايا الكبدية ، والالتهاب ، والتليف ، والخلل الوظيفي الأيضي.

المزايا الرئيسية لهذا النموذج هي الخصائص التي تجعله مشابها للمرض البشري. يستخدم النموذج نظاما غذائيا من النوع الغربي ، والذي تم تصميمه ليشبه النظام الغذائي الأمريكي النموذجي وقد ثبت أنه النظام الغذائي الأكثر فعالية في تكرار النمط الظاهري للإنسان MASLD14،20. تصاب الفئران بتغيرات نسيجية مرضية في الكبد مشابهة لتلك الموصوفة في كبد البشر مع MASH19،24. تصاب الفئران بخلل في التمثيل الغذائي ، وهو معيار أساسي لتشخيص MASLD5. تظهر أكباد الفئران المصابة ب MASH تغيرات في التعبير الجيني تلخص تلك الموجودة في البشر مع MASH / NASH19. قارنت دراسة حديثة 39 نموذجا من الفئران من MASLD لتشابهها مع المرض البشري. وشملت الفئران بالضربة القاضية MC4R ، والتي تشترك في نفس آلية فرط البلع وتلقت نفس النظام الغذائي مثل النموذج الذي وصفناه14. احتل هذا النموذج المرتبة الخامسة (من أصل 39) لتشابهه مع MASLD البشري كما تم تقييمه بواسطة النمط الظاهري ، وعلم أمراض الكبد ، وعلم النسخ14.

المزايا الإضافية لهذا النموذج هي: الفئران الآي متوفرة تجاريا من مختبر جاكسون ، وهي متوفرة في سلالة C57BL / 6J ، والتي تستخدم بشكل شائع في دراسات التمثيل الغذائي21،25 ؛ يمكن التعرف بسهولة على الفئران الطافرة من خلال لون معطف شعرها ؛ يمكن دمج النموذج مع نماذج الكسب أو فقدان الوظيفة لدراسة دور جينات معينة في تطوير MASLD. وأخيرا ، لا يستخدم النموذج نقص المغذيات (نقص الكولين أو الميثيونين) ، أو المكونات الغذائية غير العادية (حمض الكوليك ، والإيثيونين) ، أو محتوى عال بشكل غير عادي من العناصر الغذائية المحددة (الدهون المتحولة) ، أو السموم الكبدية (رابع كلوريد الكربون) ، وهي ليست أسبابا شائعة ل MASLD وقد لا تكرر المرض البشري13،14،17.

هذه الطريقة مناسبة للتحقيق في الآليات التي تساهم في تطوير وتطور MASLD وكذلك لتقييم التدخلات لعلاجه أو الوقاية منه. هذا النموذج مفيد بشكل خاص لأن لا تصاب فقط بالتهاب الكبد الدهني وخلل التمثيل الغذائي ولكن أيضا تصاب بالتليف الذي يتطور إلى المرحلة 3. قد لا يكون النموذج مناسبا لدراسة الآليات التي تؤثر على سلوك التغذية (على سبيل المثال ، ناهضات GLP1R) ، لأن هذه الفئران تعاني من فرط الأبل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتبع هذا البروتوكول إرشادات رعاية لكلية بروكلين. بروتوكول IACUC رقم 318.

1. نموذج الفأر من MASLD مع التليف

  1. تربية الفئران لإنتاج ذرية آي. قم بإعداد أزواج تكاثر مع فئران آي (B6. Cg-Ay / J). سجل تاريخ ميلاد الجراء.
  2. تأكد من أن الفضلات تحتوي على أعداد مماثلة من الجراء لتعزيز التغذية والنمو الكافيين والمتساوي. اهدف إلى الحصول على خمسة إلى ستة صغار لكل قمامة ، حيث إنه متوسط حجم القمامة لفئران C57BL / 6J. يمكن القتل الرحيم أو القتل الرحيم للجراء الإضافية ، ويفضل أن تكون من الجنس غير المطلوب.
    ملاحظة: قد يؤدي استخدام ذكور Ay والإناث البرية (C57BL / 6J Jax 0000664) إلى تحسين كفاءة التكاثر نظرا لأنه من السهل الحصول على إناث الفئران C57BL / 6J من النوع البري وقد تكون مربية أفضل من إناث الفئران الآي.
  3. قم بإعداد أقفاص للتجارب كما هو موضح أدناه.
    1. تعرف على فئران آي من خلال لون معطفها الأصفر. قم بتعيين تعريف فريد لكل فأرة وقم بوضع علامة على الفئران أو وضع علامة عليها.
      ملاحظة: يمنح أليل agouti الأصفر (Ay) لجين agouti لون معطف أصفر. الأليل شبه مهيمنة في الزيجوت المتغايرة. يسبب تماثل الزيجوت الفتك الجنيني. لذلك ، فإن الفئران ذات لون المعطف الأصفر متغايرة الزيجوت بالنسبة لجين Ay.
    2. فطام الفئران عندما يبلغ عمرها 21 يوما. قم بتجميع الفئران التي سيتم إيواؤها في نفس القفص أثناء الدراسة. ضع ثلاثة أو أربعة فئران آي لكل قفص ، وفقا لوزن الجسم المتوقع والإرشادات المؤسسية.
    3. تغذية الطعام القياسي والماء. الفئران المنزلية في درجة حرارة قياسية (20-23 درجة مئوية) والرطوبة النسبية (40٪ إلى 60٪) مع ضوء 12 ساعة ، دورة مظلمة 12 ساعة.
  4. قم بإطعام فئران آي بالنظام الغذائي الغني بالدهون والفركتوز (حمية عالية الدهون والفركتوز ، HFFD) بدءا من عمر 8 أسابيع كما هو موضح أدناه.
    1. زود الفئران آي بالنظام الغذائي الغربي الغني بالدهون والسكروز (السعرات الحرارية المعدلة للنظام الغذائي الغربي Inotiv TD.88137) إعلان الئازاد.
    2. تحضير محلول يحتوي على الفركتوز (23 جم / لتر) والجلوكوز (19 جم / لتر) في مياه الشرب. عقم المحلول عن طريق الترشيح من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر وتخزينه في زجاجات معقمة. بمجرد فتحه ، احتفظ بالمحلول في الثلاجة.
    3. تزويد الفئران بالمحلول الذي يحتوي على الفركتوز والجلوكوز للشرب في زجاجات شرب معقمة. استبدل المحلول والزجاجات أسبوعيا على الأقل ، وتحقق من نمو الكائنات الحية الدقيقة.
    4. استخدم فراش القفص بدون قيمة غذائية (مثل رقائق الخشب).
  5. تغذية الفئران التحكم في النظام الغذائي منخفض الدهون والفركتوز كما هو موضح أدناه.
    ملاحظة: يعتمد نوع الفئران الضابطة التي سيتم استخدامها على تصميم الدراسة: إذا تم استخدام فئران Ay-HFFD لتقييم تأثير الأدوية ، فيمكن أن تكون الفئران الضابطة عبارة عن فئران Ay-HFFD المعالجة بدواء وهمي. إذا تم استخدام النموذج لدراسة تأثير التعديل الجيني على تطور التليف ، فيمكن استخدام فئران Ay-HFFD بدون التعديل الجيني كضوابط. إذا كانت عناصر التحكم بدون MASH مطلوبة، فاتبع الخطوات الموضحة هنا.
    1. استخدم الفئران البرية التي هي رفقاء في فئران آي. يمكن التعرف عليها من خلال لون معطفها الأسود.
    2. قم بإطعام الفئران نظاما غذائيا للتحكم (نظام غذائي منخفض الدهون Inotiv TD.08485 ؛ يشار إليه باسم حمية قليلة الدسم والفركتوز ، LFFD) بدءا من نفس العمر. زود الفئران بمياه الشرب العادية.
  6. راقب تطور السمنة عن طريق وزن الفئران أسبوعيا عن طريق وضع المستيقظة في وعاء قطران على ميزان مختبر وتسجيل وزنها.
  7. تأكد من أن الفئران لديها ما يكفي من الطعام ومحلول الشرب في جميع الأوقات. مراقبة وتسجيل استهلاك الطعام ومحلول الشرب لتقدير السعرات الحرارية ، إذا رغبت في ذلك.
  8. اجمع الأنسجة كما هو موضح أدناه.
    1. قم بجمع الأنسجة بعد 16 أسبوعا من نظام HFFD الغذائي. القتل الرحيم للفأر عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون (أو طرق أخرى معتمدة من قبل IACUC في المؤسسة).
      ملاحظة: بعد 16 أسبوعا ، عادة ما يكون لدى الفئران التي تتغذى على نظام HFFD الغذائي تليف في المرحلة 1. سيؤدي إطالة الوقت إلى زيادة التليف ، والتقدم إلى المرحلة 3 بعد 9 إلى 12 شهرا.
    2. وزن الماوس وتسجيل الوزن19.
    3. جمع الدم إذا لزم الأمر. للقيام بذلك ، قم بسحب الدم من الوريد الأجوف السفلي باستخدام حقنة 1 مل وإبرة 27G بعد فتح البطن وقبل تشريح الكبد (أو استخدم أي طريقة أخرى معتمدة من قبل IACUC).
    4. تشريح الكبد عن طريق فتح البطن بشق خط الوسط ، وإمساك الكبد من نقيره بالملقط ، وقطع الأربطة التي تربط الكبد بالحجاب الحاجز وخلف الصفاق بالمقص. وزن الكبد وتسجيل الوزن.
    5. اشطف الكبد بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات المثلج (PBS). قم بتصوير الكبد وقم بتضمين مسطرة أو كائن آخر كمرجع للحجم في الصورة. ضع الكبد في طبق بتري يوضع على الثلج.
    6. قم بتشريح العينات (حوالي 100 إلى 150 مجم لكل عينة) من عدة فصوص ، بما في ذلك الفص المتوسط والفص الأيسر والفص الأيمن. تأكد من أن سمك العينات لا يزيد عن 4 مم لتسهيل التثبيت. ضعها في محلول مثبت (الفورمالين 10٪ أو الفورمالديهايد 4٪) لمدة 24 ساعة وقم بمعالجتها للتحليل النسيجي المرضي (انظر أدناه).
    7. تشريح عينات إضافية من عدة فصوص. ضعها في أنابيب (1.5 أو 2 مل) ، وقم بتجميدها عن طريق غمرها في النيتروجين السائل ، وقم بتخزينها عند -80 درجة مئوية. سيتم استخدام هذه العينات لقياس محتوى هيدروكسي برولين.
    8. اجمع عينات من الأعضاء الأخرى إذا رغبت في ذلك (الأنسجة الدهنية والعضلات وما إلى ذلك)

2. تلطيخ الكولاجين الكيميائي النسيجي والقياس الكمي المورفومتري

ملاحظة: يجب أن تتم الخطوات التي تتطلب استخدام مواد كيميائية خطرة و / أو متطايرة في غطاء الدخان. يجب معالجة جميع الشرائح بالتوازي باستخدام أطباق تلطيخ وحاملات شرائح.

  1. تحضير أقسام الكبد كما هو موضح أدناه.
    1. قم بإصلاح أنسجة الكبد عن طريق الاحتفاظ بها في الفورمالين (أو الفورمالديهايد) لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة. استخدم حجما مثبتا أكبر بمقدار 20 ضعفا من حجم الأنسجة. بعد ذلك ، انقل الأنسجة إلى 70٪ من الإيثانول. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا في هذه المرحلة.
      ملاحظة: يمكن وضع الأنسجة في أشرطة الأنسجة التي توضع بعد ذلك في حاوية بها مثبت أو ، بدلا من ذلك ، في حاويات أو أنابيب فردية.
    2. تضمين المناديل في البارافين. يتم ذلك عادة بواسطة منشأة أو خدمة أساسية لعلم الأنسجة المرضية.
    3. احصل على أقسام بسمك 0.5 ميكرومتر مثبتة على شرائح (الشرائح غير المشحونة كافية). اترك الأقسام تجف عن طريق تعريضها للهواء في درجة حرارة الغرفة. عادة ما تقوم المنشأة أو الخدمة الأساسية لعلم الأنسجة المرضية بذلك. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا في هذه المرحلة.
  2. إزالة البارافينات وإعادة ترطيب الأقسام كما هو موضح أدناه.
    1. قم بإزالة الأقسام عن طريق غمرها في تغييرين من محلول إزالة البارافينزينج / المقاصة (الزيلين أو السيتريسولف) ، لمدة 5-15 دقيقة في كل منهما.
    2. أعد الترطيب عن طريق غمر الشرائح على التوالي في 100٪ إيثانول ، 95٪ إيثانول ، 70٪ إيثانول ، وماء ، لمدة 5 دقائق في كل منهما.
  3. أقسام البقع باللون الأحمر picro-sirius كما هو موضح أدناه.
    1. اغمر الأقسام في محلول أحمر سيريوس (أحمر مباشر 80) 1 جم / لتر في حمض البيكريك 1.3٪ لمدة ساعة واحدة. لا تلطخ لفترة أطول ، لأن اللون الأحمر المباشر قد يلطخ هياكل أخرى غير الكولاجين (مثل النوى). أضف اللون الأخضر السريع (1 جم / لتر) إلى محلول التلوين إذا كان التلوين المضاد مطلوبا26. بدلا من ذلك ، تلطيخ النوى باستخدام هيماتوكسيلينWeigert 27.
    2. أعد محلول picro-sirius الأحمر إلى وعاء زجاجي أو بلاستيكي مغلق أو داكن للتخزين. يمكن إعادة استخدام المحلول عدة مرات (لمدة 20 عاماعلى الأقل 27).
  4. اغمر العينات في الإيثانول (100٪) لمدة 5 دقائق لتجفيفها. كرر مع تغيير ثان للإيثانول.
  5. اغمر في محلول المقاصة (الزيلين أو السيتريسولف) حتى يتم إزالتها بشكل فردي للتركيب.
  6. قم بإزالة شريحة واحدة في كل مرة من محلول المقاصة وقم بإزالة السوائل الزائدة عن طريق النشاف على المناشف الورقية. أضف وسيط التركيب (حوالي 50 إلى 100 ميكرولتر). قم بتغطية القسم بغطاء واضغط برفق على الغطاء لأسفل لإزالة فقاعات الهواء. دع الهواء يجف.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا في هذه المرحلة.
  7. راقب الأقسام باستخدام مجهر ضوئي مع إضاءة المجال الساطع والأهداف من 4x إلى 20x - يظهر الكولاجين باللون الأحمر على خلفية صفراء برتقالية فاتحة. صور مجالات الاهتمام بكاميرا ملونة ، وفقا لتعليمات الكاميرا.
  8. قم بإجراء التصوير باستخدام الفحص المجهري الضوئي المستقطب كما هو موضح أدناه.
    1. قم بتعطيم مرشحات المستقطب والمحلل وضبطهما بشكل متعامد للتأكد من أن الكولاجين مرئي وأن إشارة الخلفية ضئيلة. يظهر الكولاجين باللون الأبيض أو الأصفر أو البرتقالي على خلفية داكنة. في الأقسام التي تحتوي على القليل من التليف أو معدوم، سيكون الكولاجين في جدران الأوعية الدموية مرئيا. احتفظ بالإعدادات، بما في ذلك شدة الإضاءة، كما هي لجميع العينات المراد مقارنتها.
    2. صور باستخدام كاميرا أحادية اللون أو وضع أحادي اللون في كاميرا ملونة. استخدم هدف تكبير 4x. التقط صورا متعددة لكل قسم. تجنب المناطق القريبة من النقير إذا كانت تحتوي على أوعية دموية كبيرة. استخدم نفس الإعدادات لمقارنة جميع الصور.
  9. قم بإجراء القياس الكمي المورفومتري باستخدام Photoshop (البديل أ) كما هو موضح أدناه.
    1. حدد المنطقة البيضاء في الصور ، والتي تتوافق مع الكولاجين. في Photoshop، انقر فوق Select > Color range، ثم قمباختيار Highlights، واضبط المعلمات Fuzziness وRange لتحديد وحدات البكسل ذات اللون الأبيض، المقابلة للكولاجين. بعد ذلك ، حدد نافذة > الرسم البياني > العرض الموسع وسجل عدد وحدات البكسل المحددة ، كما هو موضح بجوار المعلمة بكسل. استخدم نفس المعلمات لجميع الصور المراد مقارنتها.
    2. تحديد المساحة الإجمالية للصورة. في Photoshop، انقر فوق Select > All، ثم سجل العدد الإجمالي لوحدات البكسل كما تم القيام به سابقا.
    3. احسب النسبة المئوية لمساحة الصورة المقابلة للكولاجين بقسمة عدد وحدات البكسل البيضاء على عدد وحدات البكسل الإجمالية. عادة ما يتم التعبير عن القيم كنسب مئوية للمساحة.
  10. قم بإجراء القياس الكمي المورفومتري باستخدام ImageJ (البديل ب) كما هو موضح أدناه.
    1. حدد المناطق البيضاء في الصور التي تتوافق مع الكولاجين. افتح أداة Threshold بالنقر فوق Image > Adjust > Threshold (أو اضغط على Shift + T). اضبط نطاق الحد لضمان تمييز المناطق الملطخة بالكولاجين فقط (المناطق البيضاء) باللون الأحمر (على سبيل المثال، الحد الأدنى 64؛ الحد الأقصى: 255) وانقر فوق تطبيق. سيؤدي ذلك إلى ثنائية الصورة ، وتحويل منطقة الكولاجين إلى الأسود والخلفية إلى الأبيض.
    2. قم بقياس إجمالي مساحة الصورة بالنقر فوق تحليل > تعيين القياسات. تحقق من المنطقة وعرض التسمية. انقر فوق موافق. انقر فوق تحليل > قياس (أو اضغط على M على لوحة المفاتيح). ستعرض نافذة النتائج إجمالي مساحة الصورة.
    3. لقياس مساحة الكولاجين والنسبة المئوية، أولا، قم بتمكين الحد إلى الحد بالنقر فوق تحليل > تعيين القياسات. تحقق من المنطقة ، وكسر المنطقة (ستحسب ImageJ نسبة اللاكولاجين تلقائيا) ، والحد إلى العتبة ، وعرض التسمية. انقر فوق موافق. ثم انقر فوق تحليل > القياس (أو اضغط على M). ستظهر نافذة النتائج: منطقة الكولاجين (عدد البكسل المطلق) وجزء المنطقة (الكولاجين٪ من الصورة الإجمالية).
    4. احفظ النتائج عن طريق تحديد حفظ باسم أو انسخها إلى الحافظة ولصقها في جدول بيانات.

3. القياس الكمي للكبد هيدروكسي برولين

ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات التي تتطلب استخدام قواعد وأحماض قوية باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة.

  1. وزن عينات الكبد المحضرة في الخطوة 1.8.7 وسجل الأوزان. ضع حصص الأنسجة في أنبوب مناسب للتجانس. أضف الماء منزوع الأيونات باستخدام نسبة الماء إلى الأنسجة البالغة 900 ميكرولتر من الماء لكل 100 مجم من الأنسجة.
  2. تجانس عن طريق ضرب الخرزة أو أي طريقة أخرى وفقا لتعليمات الشركة المصنعة حتى يتجانس النسيج تماما ، كما تم تقييمه من خلال الملاحظة البصرية. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا في هذه المرحلة ، ويمكن تخزين المتجانسات عند -20 درجة مئوية.
  3. قم بإجراء ترسيب البروتين كما هو موضح أدناه. تتم الخطوات التالية في درجة حرارة الغرفة ، إلا عند تحديد درجة حرارة مختلفة.
    1. نقل ما يقرب من 500 ميكرولتر إلى 1000 ميكرولتر من أنابيب الطرد المركزي إلى 1.5 مل. انقل نفس وحدة التخزين لجميع العينات.
    2. أضف حمض ثلاثي كلورو أسيتيك للحصول على تركيز نهائي قدره 12٪ (على سبيل المثال ، أضف 120 ميكرولتر من حمض ثلاثي كلورو أسيتيك إلى 880 ميكرولتر من المتجانس)28. دوامة لفترة وجيزة للخلط.
    3. احتضان العينات في حمام ثلج / مائي لمدة 30 دقيقة. جهاز طرد مركزي عند 6,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. راسب يحتوي على أشكال البروتين. إزالة المادة الطافية عن طريق الشفط. احتفظ بالأنابيب على الجليد.
    4. أضف 1 مل من الإيثانول المثلج (100٪) لغسل الحبيبات. قم بتعليق الحبيبات عن طريق الصوتنة (أو أي طريقة أخرى) وتحقق بصريا من تعليق المادة. جهاز طرد مركزي عند 6,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق وإزالة المادة الطافية عن طريق الشفط. استخدم إعدادات الصوتنة وفقا لتعليمات المعدات (على سبيل المثال ، باستخدام سونيفايزر برانسون SFX 150 بقطر 3.2 مم ، وسعة 70٪ لمدة 10 ثوان فعالة لمعظم العينات). كرر الغسيل 2x.
    5. اترك الحبيبات تجف في الهواء لمدة 10 دقائق ، أو أكثر إذا لزم الأمر.
  4. قم بإجراء التحلل المائي للبروتين كما هو موضح أدناه.
    1. أضف 800 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك 6 نيوتن إلى الأنابيب التي تحتوي على راسب البروتين. قم بتعليق الحبيبات عن طريق الصوتنة (أو طريقة أخرى) ، باستخدام نفس الإعدادات كما في الخطوة 3.3.4.
    2. نقل تعليق البروتين إلى أنابيب زجاجية أو قوارير ذات أغطية لولبية ؛ أغلق بإحكام. احتضان الأنابيب في الفرن على حرارة 110 درجة مئوية لمدة 22 ± 2 ساعة29.
    3. أنابيب الطرد المركزي عند 16,000 × جم لمدة 10 دقائق ؛ سوف تشكل الجسيمات حبيبات. يتطلب هذا عادة نقل التحلل المائي من القوارير الزجاجية إلى أنابيب الطرد المركزي قبل الطرد المركزي.
    4. انقل المادة الطافية التي تحتوي على هيدروكسي برولين إلى أنابيب سعة 1.5 مل. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا في هذه المرحلة. يمكن تخزين التحلل المائي عند 4 درجات مئوية.
  5. قم بإعداد منحنى قياسي لتركيز هيدروكسي برولين. بالنسبة لعينات الكبد المصابة بالتليف من المرحلة 1 إلى 3 ، باستخدام كميات الأنسجة المشار إليها في هذا البروتوكول ، تكون التركيزات القياسية التي تصل إلى 125 ميكروغرام / مل كافية (على سبيل المثال ، التخفيفات التسلسلية 125 و 62.5 و 31.3 و 15.6 و 7.81 و 3.91 و 1.95 و 0 ميكروغرام / مل). قم بإعداد المعايير عن طريق تخفيف هيدروكسي برولين في حمض الهيدروكلوريك 6 نيوتن.
  6. نقل 40 ميكرولتر من كل عينة وقياسية إلى 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي المسماة. أضف 10 ميكرولتر من 10 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم إلى كل منها ودوامة لفترة وجيزة للخلط.
  7. إجراء أكسدة هيدروكسي برولين كما هو موضح أدناه.
    1. قم بإعداد عازلة الأسيتات والسترات التي تحتوي على حمض الأسيتيك 1.2٪ حجم / حجم ، وحمض الستريك 46 جم / لتر ، وخازيت أسيتات الصوديوم ثلاثي الهيدرات 120 جم / لتر ، وهيدروكسيد الصوديوم 34 جم / لتر في الماء منزوع الأيونات ، واضبط درجة الحموضة العازلة على 6.5.
    2. تحضير محلول 12.7 جم / لتر من الكلورامين T في الماء: n-propanol: عازلة الأسيتات والسترات (1: 1: 8 v: v: v). أولا ، قم بإذابة الكلورامين T في الماء عن طريق الخلط ، ثم أضف n-propanol ، واخلطه ، ثم أضف عازلة الأسيتات والسترات واخلطها.
    3. أضف 450 ميكرولتر من محلول الكلورامين إلى الأنابيب مع العينات والمعايير. تخلط عن طريق الدوامة. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة30.
  8. تحضير كاشف إيرليش ب 1 م 4- (ثنائي ميثيل أمينو) بنزالديهايد في حمض البيركلوريك: البروبانول 1: 2 (حجم / حجم). أضف 500 ميكرولتر من كاشف إيرليش إلى العينات والمعايير. تخلط عن طريق الدوامة.
  9. احتضن عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في كتلة تسخين أو حمام مائي أو حاضنة. عندما تنتهي الحضانة ، اترك العينات والمعايير تبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
  10. قم بقياس امتصاص العينات والمعايير بطول موجي 550 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
  11. ارسم الامتصاص مقابل الكميات القياسية واستخدم انحدارا خطيا لعمل منحنى قياسي. استخدم المعلمات من المنحنى القياسي لحساب تركيز هيدروكسي برولين في العينات.
  12. احسب كمية الهيدروكسي برولين في عينات الكبد بناء على الحجم الكلي للتحلل المائي (الخطوة 3.4) وقم بتطبيعها بواسطة كتلة الأنسجة المقابلة لحجم التجانس المستخدم في ترسيب البروتين (الخطوة 3.3.1). التعبير عن النتائج على أنها نغ من هيدروكسي برولين لكل ملغ من الأنسجة. بدلا من ذلك ، يمكن قياس تركيز البروتين في المتجانسات والتعبير عن النتائج ككتلة هيدروكسي برولين لكل كتلة من البروتين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تكتسب الفئران التي تغذت على HFFD وزنا أكبر من الفئران البرية التي تغذى على LFFD وتتطور بالسمنة (الشكل 1 أ). يكتسبون الوزن بسرعة أكبر خلال الأسابيع الأربعة الأولى من تغذية HFFD ، ويكتسبون ما يقرب من 3-4 جم / أسبوع. بعد 8 أسابيع ، يكتسبون وزنا بمعدل مشابه لفئران التحكم (حوالي 0.6 جم / أسبوع)19. بعد 16 أسبوعا ، تزن فئران Ay التي تغذت على HFFD حوالي 45 جم إلى 50 جراما (متوسط ثلاث تجارب منفصلة) وتزن حوالي 40٪ إلى 80٪ أكثر من الفئران البرية...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول نموذج فأر MASLD مع تليف الكبد الذي يكرر المرض في البشر5،6. تصاب الفئران بتضيق دهني في الكبد ، كما هو موضح في التنكس الدهني الحويصلي الجزئي والكبير المختلط في الأنسجة وارتفاع محتوى ثلاثي الجلسرين الكبدي19. تصاب الفئران أيضا بالسمنة ، وفرط شحوم الدم ، وعدم تحمل الجلوكوز ، وقد تم الإبلاغ عن إصابتها بارتفاع ضغط الدم ، والذي ، بالاقتران مع تنكس دهني في الكبد ، يتوافق مع معايير تشخيص MASLD في ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة K22CA178098 و R03DK101863 و R15DK131627 وصناديق بدء التشغيل من كلية بروكلين (إلى JMC).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4-(ثنائي ميثيلامينو)بنزالديهايدسيغما-ألدرتشD2004
حمض الخليكمختلفNA
حمية السعرات الحرارية المعدلة النظام الغربيإينتيفTD.88137النظام الغذائي يحتوي على دهون (42٪ سعرات حرارية) وسكروز (34٪ مع الأسبوع). يقدم موردون آخرون أنظمة غذائية بنفس التركيبة
B6. Cg-Ay/Jمختبر جاكسون000021سلالة لديها طفرة أجوتي الصفراء القاتلة وخلفية C57BL6/J. حاليا، مختبر جاكسون يحافظ على السلالة البكاء.
C57BL/6Jمختبر جاكسون000664
الطرد المركزيمختلفNAمع دوار لأنابيب 1.5 مل، مبردة، قادرة على الوصول إلى 16,000 xg.
الطرد المركزيمختلفNA
كلورامين-تي هيدراتسيغما-ألدرتش857319
حمض الستريكمختلفNA
دايركت ريد 80سيغما365548-5G
الإيثانولمختبرات ديكون2701
محلول الفورمالين، مخزن محايدسيغماHT501128
الفركتوزسيغما-ألدرتشF0127
الجلوكوزسيغما-ألدرتشG8270
معدات معالجة الأنسجةNANAيمكن إجراء التضمين والتقسيم في مختبر الباحثين أو المنشأة الخارجية
الهومونينازرمختلفNAمضارب الخرز فعالة لمعالجة عدة عينات. يمكن استخدام طرق توحيد أخرى
حمض الهيدروكلوريكمختلفNA
هيدروكسي برولينسيغماH5534
نظام منخفض للتحكم في الدهونإينتيفTD.08485نظام تحكم في النظام الغذائي، منخفض الدهون (13٪ سعرة حرارية) وسكروز (12٪ مع الأسبوع)
مجهر مجهز للمجهر الضوئي المستقطبمختلفNA
ن-بروبانولمختلفNA
حمض البركلوريكمختلفNA
وسيط التثبيت على بيرمونتفيشر ساينتيفكSP15-100
حمض البيكريك، محلول مائي مشبع، طيففيشر18612375
ثلاثي هيدرات أسيتات الصوديوممختلفNA
هيدروكسيد الصوديوممختلفNA
سونيكاتورمختلفNAسونيكيتور مفيد لإعادة تعليق الرصاصات في الخطوة 2.5، لكنه ليس ضروريا تماما
حمض ثلاثي كلوروأسيتيكمختلفNA
نظارات VWR Micro Cover، مستطيلةVWR 48393-081
شرائح المجهر الفاخرة VWR Superfrost Plus | VWRVWR 48311-703
ماء، منزوع الأيوناتمختلفNAالماء منزوع الأيونات من نظام تنقية المياه أو من مورد.
الزيلينفيشر ساينتيفكX3Fوكيل مقاصة سيتريزولف  (فيشر 22-143-975) يباع كبديل صديق للبيئة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ciardullo, S., Carbone, M., Invernizzi, P., Perseghin, G. Exploring the landscape of steatotic liver disease in the general US population. Liver Int. 43 (11), 2425-2433 (2023).
  2. Lee, B. P., Dodge, J. L., Terrault, N. A. National prevalence estimates for steatotic liver disease and subclassifications using consensus nomenclature. Hepatology. 79 (3), 666-673 (2024).
  3. Kalligeros, M., et al. Prevalence of Steatotic Liver Disease (MASLD, MetALD, and ALD) in the United States: NHANES 2017-2020. Clin Gastroenterol Hepatol. 22 (6), 1330-1332.e4 (2024).
  4. Younossi, Z. M., Kalligeros, M., Henry, L. Epidemiology of Metabolic Dysfunction-Associated Steatotic Liver Disease. Clin Mol Hepatol. 31 ((Suppl)), S32-S50 (2024).
  5. Rinella, M. E., et al. A multisociety Delphi consensus statement on new fatty liver disease nomenclature. Hepatology. 78 (6), 1966-1986 (2023).
  6. Rinella, M. E., et al. AASLD Practice Guidance on the clinical assessment and management of nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 77 (5), 1797-1835 (2023).
  7. Friedman, S. L. Hepatic Fibrosis and Cancer: The Silent Threats of Metabolic Syndrome. Diabetes Metab J. 48 (2), 161-169 (2024).
  8. Phoolchund, A. G. S., Khakoo, S. I. MASLD and the Development of HCC: Pathogenesis and Therapeutic Challenges. Cancers. 16 (2), 259(2024).
  9. Taylor, R. S., et al. Association Between Fibrosis Stage and Outcomes of Patients With Nonalcoholic Fatty Liver Disease: A Systematic Review and Meta-Analysis. Gastroenterology. 158 (6), 1611-1625.e12 (2020).
  10. Younossi, Z. M., et al. Liver histology is associated with long-term clinical outcomes in patients with metabolic dysfunction-associated steatohepatitis. Hepatol Commun. 8 (6), e0423(2024).
  11. Dulai, P. S., et al. Increased risk of mortality by fibrosis stage in nonalcoholic fatty liver disease: Systematic review and meta-analysis. Hepatology. 65 (5), 1557-1565 (2017).
  12. Noncirrhotic Nonalcoholic Steatohepatitis With Liver Fibrosis: Developing Drugs for Treatment; Draft Guidance for Industry. The Federal Register / FIND. , Food and Drug Administration. (2018).
  13. Im, Y. R., et al. A Systematic Review of Animal Models of NAFLD Finds High-Fat, High-Fructose Diets Most Closely Resemble Human NAFLD. Hepatology. 74 (4), 1884-1901 (2021).
  14. Vacca, M., et al. An unbiased ranking of murine dietary models based on their proximity to human metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (MASLD). Nat Metab. 6 (6), 1178-1196 (2024).
  15. Ipsen, D. H., Lykkesfeldt, J., Tveden-Nyborg, P. Animal Models of Fibrosis in Nonalcoholic Steatohepatitis: Do They Reflect Human Disease. Adv Nutr. 11 (6), 1696-1711 (2020).
  16. Wang, S., Friedman, S. L. Found in translation-Fibrosis in metabolic dysfunction-associated steatohepatitis (MASH). Sci Transl Med. 15 (716), eadi0759(2023).
  17. Farrell, G., et al. Mouse Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Toward Optimization of Their Relevance to Human Nonalcoholic Steatohepatitis. Hepatology. 69 (5), 2241-2257 (2019).
  18. Santhekadur, P. K., Kumar, D. P., Sanyal, A. J. Preclinical models of non-alcoholic fatty liver disease. J. Hepatol. 68 (2), 230-237 (2018).
  19. St Rose, K., et al. Mouse model of NASH that replicates key features of the human disease and progresses to fibrosis stage 3. Hepatol Commun. 6 (10), 2676-2688 (2022).
  20. Hintze, K. J., Benninghoff, A. D., Cho, C. E., Ward, R. E. Modeling the Western Diet for Preclinical Investigations. Adv Nutr. 9 (3), 263-271 (2018).
  21. Kennedy, A. J., Ellacott, K. L. J., King, V. L., Hasty, A. H. Mouse models of the metabolic syndrome. Dis Model Mech. 3 (3-4), 156-166 (2010).
  22. Okumura, K., et al. Exacerbation of dietary steatohepatitis and fibrosis in obese, diabetic KK-A(y) mice. Hepatol Res. 36 (3), 217-228 (2006).
  23. Lin, X., Li, H. Obesity: Epidemiology, Pathophysiology, and Therapeutics. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 706978(2021).
  24. Brunt, E. M. Pathology of fatty liver disease. Mod Pathol. 20 Suppl 1, 40(2007).
  25. Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame. Dig Dis Sci. 61 (5), 1325-1336 (2016).
  26. Caviglia, J. M., et al. MicroRNA-21 and Dicer are dispensable for hepatic stellate cell activation and the development of liver fibrosis. Hepatology. 67 (6), 2414-2429 (2018).
  27. Kiernan, J. Histological and histochemical methods. , Scion Publishing Ltd. (2015).
  28. Rajalingam, D., Loftis, C., Xu, J. J., Kumar, T. K. S. Trichloroacetic acid-induced protein precipitation involves the reversible association of a stable partially structured intermediate. Protein Sci. 18 (5), 980-993 (2009).
  29. Davidson, I. Hydrolysis of samples for amino acid analysis. Methods Mol Biol. 211, 111-122 (2003).
  30. Reddy, G. K., Enwemeka, C. S. A simplified method for the analysis of hydroxyproline in biological tissues. Clin Biochem. 29 (3), 225-229 (1996).
  31. Junqueira, L. C., Bignolas, G., Brentani, R. R. Picrosirius staining plus polarization microscopy, a specific method for collagen detection in tissue sections. Histochem J. 11 (4), 447-455 (1979).
  32. Mark, A. L., et al. Contrasting blood pressure effects of obesity in leptin-deficient ob/ob mice and agouti yellow obese mice. J Hypertens. 17 (12 Pt 2), 1949-1953 (1999).
  33. Luo, Y., et al. Metabolic phenotype and adipose and liver features in a high-fat Western diet-induced mouse model of obesity-linked NAFLD. Am J Physiol Endocrinol Metab. 310 (6), 418(2016).
  34. Lonardo, A., Suzuki, A. Sexual Dimorphism of NAFLD in Adults. Focus on Clinical Aspects and Implications for Practice and Translational Research. J Clin Med. 9 (5), 1278(2020).
  35. Lonardo, A., Ballestri, S., Mantovani, A., Targher, G., Bril, F. Endpoints in NASH Clinical Trials: Are We Blind in One Eye. Metabolites. 14 (1), 40(2024).
  36. Giles, D. A., et al. Thermoneutral housing exacerbates nonalcoholic fatty liver disease in mice and allows for sex-independent disease modeling. Nat Med. 23 (7), 829-838 (2017).
  37. Hao, L., Khan, M. S. H., Zu, Y., Liu, J., Wang, S. Thermoneutrality Inhibits Thermogenic Markers and Exacerbates Nonalcoholic Fatty Liver Disease in Mice. Int J Mol Sci. 25 (15), 8482(2024).
  38. Horakova, O., et al. Thermoneutral housing promotes hepatic steatosis in standard diet-fed C57BL/6N mice, with a less pronounced effect on NAFLD progression upon high-fat feeding. Front Endocrinol. 14, 1205703(2023).
  39. Suzuki, A., Diehl, A. M. Nonalcoholic Steatohepatitis. Annu Rev Med. 68, 85-98 (2017).
  40. Arrese, M., et al. Insights into Nonalcoholic Fatty-Liver Disease Heterogeneity. Semin Liver Dis. 41 (4), 421-434 (2021).
  41. Wentworth, B. J., Caldwell, S. H. Pearls and pitfalls in nonalcoholic fatty liver disease: tricky results are common. Metab Target Organ Damage. 1 (1), 2(2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة