مقالة منهجية

تقنية خزعة الملتحمة والتألق المناعي المباشر لتشخيص الفقاع الغشائي المخاطي

DOI:

10.3791/68303

⸱

يونيو 17, 2025

 ,  , 
1Prof. Krothapalli Ravindranath Ophthalmic Research Biorepository, LV Prasad Eye Institute, 2Brien Holden Centre for Eye Research (BHERC), LV Prasad Eye Institute

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم بروتوكولا لحصاد ومعالجة خزعة الملتحمة لتحديد الفقاع الغشائي المخاطي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يظهر الفقاع الغشائي المخاطي للعين (MMP) على شكل التهاب الملتحمة المزمن الذي ، إذا ترك دون علاج ، يمكن أن يسبب العمى. يمنع التشخيص في الوقت المناسب والعلاج المثبط للمناعة تطور المرض. تلطيخ التألق المناعي المباشر (DIF) لخزعة الملتحمة لترسب المركب المناعي في الغشاء القاعدي هو تشخيص MMP. يعتمد معدل إيجابية الخزعة على خصائص الخزعة والجانبية والشيخوخة ونشاط المرض. تصف ورقة الطرق الحالية تقنية حصاد خزعة الملتحمة واستخدام خراطيش متوسطة مملوءة بدرجة حرارة القطع المثلى لنقل العينات وتحضير الكتلة. يتم إجراء الخزعة من منطقة غير متندبة أو غير متورطة أو أقل انخراطا نسبيا من الملتحمة في كلتا العينين. يبلغ حجم الخزعة المعتاد 4-5 مم وعرضه 2-3 مم ، ويجب أن يحتوي على نسيج تحت الملتحمة الأساسي الصغير حتى لا يتم تفويت الغشاء القاعدي. نوصي بإجراء تلطيخ شيف الحمضي الدوري لتأكيد وجود الغشاء القاعدي. باستخدام بروتوكول محدد ، يتم تلطيخ عمليات القطع بالتبريد من الخزعات بالأجسام المضادة المترافقة بالفلورسنت IgG و IgM و IgA والعوامل التكميلية C3c و C4c. تظهر الخزعة الإيجابية التألق الأخضر الإيجابي في الغشاء القاعدي ، وحتى لو كان أحد الأجسام المضادة إيجابيا ، فهو إيجابي MMP. الخزعة السلبية لا تستبعد الفقاع. ومع ذلك ، فإن الإيجابية تؤكد MMP وتميزها عن التهاب الملتحمة السيكاتري الناجم عن الأدوية أو الكاذب.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الفقاع الغشائي المخاطي (MMP) هو مرض ملتحمة مزمن من مسببات المناعة الذاتية ويؤثر على الأغشية المخاطية في الجسم1،2. التهاب الملتحمة المزمن له مسببات مختلفة ، ويعد التمايز بين MMP عن SJS ، والساركويد ، والأورام الحرشفية العينية ، والكاذب الفحمي ضروري لأن الأول يتطلب تثبيط المناعة الجهازي3،4. علاوة على ذلك ، MMP هو مرض يحتمل أن يسبب العمى حيث غالبا ما يظهر المرضى في وقت متأخر ويتم تشخيصهم بشكل خاطئ في البداية1،2،5. يمكن رؤية إصابة العين فقط دون تورط جهازي في 27.4٪ من مرضى MMPالعيني 6. يتطلب تشخيص MMP خزعة الملتحمة لإظهار وجود أجسام مضادة ذاتية في الغشاء القاعدي2،5. التألق المناعي المباشر (DIF) هو أداة تشخيصية محورية لتحديد أمراض المناعة الذاتية التي تصيب الملتحمة ، مثل MMP. يساعد DIF في الكشف عن الترسب في الموقع للغلوبولين المناعي والمكونات التكميلية في منطقة الغشاء القاعدي (BMZ) ، وهي سمة من سمات MMP. تتراوح معدلات إيجابية DIF من 30٪ إلى 80٪ 1،5. ومع ذلك ، يمكن أن يكون لدى بعض المرضى خزعة سلبية ، خاصة أولئك الذين يعانون من MMP للعين فقط ، ولكن يتم التعامل مع التوثيق السريري لتطور المرض بشكل مشابه لحالات MMP العينية الإيجابية7،8. ومن ثم ، أكد Dart et al. على الحاجة إلى معايير تشخيصية منفصلة ل MMP8 للعين فقط.

الأسباب المقترحة لانخفاض معدل الإيجابية عبر الدراسات هي المرض المتقدم مع تندب سطح العين الواسع ، وعدم كفاية معالجة الأنسجة أو تقنيات التلوين ، ومتغير المرض السلبيللخزعة 8،9،10،11. كشف تحليل بأثر رجعي للخزعات من 27 مريضا يشتبه في إصابتهم ب MMP العيني عن معدل إيجابية 30٪ فقط ، و 63.7٪ لديهم إصابة العينفقط 12. يتطلب DIF بروتوكولا محددا. ليس كل مختبر تشخيصي متناغما مع ذلك. هناك اختلافات فيما يتعلق بموقع الخزعة ، سواء لإجراء خزعة من إحدى العينين أو كلتيهما ، ومحاليل نقلالعينات 13 ، 14 ، 15. في تحليل بأثر رجعي لخزعات الملتحمة في مركزنا ، كان معدل إيجابية DIF 54.1٪ ، مع المزيد من الإيجابيات عند أخذ الخزعة بشكل ثنائي (59٪ مقابل 45٪)8. على الرغم من أن الخزعة أمر بالغ الأهمية ، إلا أن العلامات السريرية والاستقطاء التدريجي لسطح العين يساعد في تحديد تشخيص MMP. من الأسهل تشخيص متى يكون هناك موقع خارج العين ، مثل الفم أو الجلد ، تم الإبلاغ عنه في 40٪ و 18٪ من المرضى ، على التوالي5.

هناك اختلافات في الأدبيات الحالية ، ويمكن أن يكون البروتوكول المقدم هنا بمثابة دليل مرجعي مع التعديلات التي تم إدخالها لتقليل الحاجة إلى وسيط نقل فريد14. يتم نقل الخزعات في وسط درجة حرارة القطع المثلى (OCT) ويتم تجميدها في نفس خرطوشة النقل في مختبر علم الأمراض ، مما يلغي الحاجة إلى وسيط نقل إضافي. توضح الورقة الحالية منهجية تلطيخ DIF لأنسجة الملتحمة ، وحصاد الأنسجة ، وبروتوكول نقل العينات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتبع البروتوكول إرشادات لجنة أخلاقيات البحث البشري التابعة للجنة أخلاقيات البحث البشري في معهد LV Prasad للعيون.

1. تقنية خزعة الملتحمة

  1. تخطيط الخزعة من كلتا عيني المريض المشتبه في إصابته بالفقاع تحت التخدير الموضعي أو الموضعي والمجهر التشغيلي.
  2. خذ موافقة مستنيرة من المريض وسرد الآثار الجانبية المحتملة للنزيف والتندب والحاجة إلى بدء الستيرويدات الموضعية بعد الجراحة.
  3. ضع 1-2 قطرات من 0.5٪ بروباراكايين في كلتا العينين وانتظر 5 دقائق قبل بدء الإجراء.
  4. تأكد من أن المريض لا يشعر بالألم عند لمس الملتحمة بالملقط الدقيق. إذا كان المريض لا يزال يشعر بالألم بعد تطبيق بروباراكايين الموضعي ، فقم بحقن 0.2 مل من ليدوكائين تحت الملتحمة 2٪ مع حقنة توبركولين سعة 1 مل.
  5. ضع منظارا في العين اليمنى أو اليسرى ، أيهما يتم اختياره أولا.
  6. افحص سطح العين بحثا عن مناطق التندب والتقرن. حدد منطقة الخزعة غير المصابة وغير المتندبة أو الكيراتينية.
    ملاحظة: في هذه الدراسة ، يفضل الملتحمة البصلية العلوية بعيدا عن الأطراف كموقع خزعة ، تليها الملتحمة البصلية السفلية.
  7. استخدم ملقط ليم لرفع الصلبة عن الملتحمة والاستئصال خطيا بمقص Westcott ، بطول 4-5 مم وعرض 2-3 مم.
  8. انقل الخزعة بأكملها على الفور إلى وسط القطع الأمثل (OCT).
    ملاحظة: يمكن للمرء نقل الخزعات في محلول ملحي عادي أو وسط نقل ميشيل.
  9. خذ خرطوشة وقالب مناديل بلاستيكية مع وجود بئر في المنتصف ، ونظفه بالمحلول الملحي وجففه بالهواء.
  10. املأ الخرطوشة بوسيط OCT بشكل منفصل للعين اليمنى واليسرى. اغمر نسيج الملتحمة المستأصل في وسط OCT وأرسله إلى علم الأمراض.
  11. كرر الخطوات المماثلة للجانب المقابل أيضا.

2. نقل الأنسجة

  1. قم بتضمين عينات الخزعة من الملتحمة في وسط OCT للحفاظ على بنية الأنسجة والمستضدة إذا تم استلامها في وسط نقل ميشيل أو محلول ملحي عادي.
  2. قم بتجميد العينات المضمنة باستخدام النيتروجين السائل أو الثلج الجاف وتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية طوال الليل.

3. التحضير وتقطيع الأنسجة

  1. قسم الأنسجة المجمدة إلى شرائح 4-6 ميكرومتر (7 في العدد) باستخدام ناظم البرد عند -20 درجة مئوية إلى -25 درجة مئوية.
  2. قم بتركيب الأقسام على شرائح مجهر مطلية بالبولي ليسين مشحونة إيجابيا لضمان الالتصاق وتخزينها عند -80 درجة مئوية حتى تلطيخ بورق الألمنيوم.

4. تلطيخ الفلورسنت المناعي

  1. قم بإذابة الجليد في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10 دقائق وثبته في الأسيتون البارد (100٪) لمدة 10 دقائق للحفاظ على المستضدات ومنع تلف الأنسجة.
  2. اشطفها ب 1x PBS ثلاث مرات ، في كل مرة لمدة 5 دقائق لإزالة الزائد من OCT المتوسطة والأسيتون.
  3. ضع الأجسام المضادة المترافقة المضادة ل IgG ، ومضاد ل IgA ، ومضاد ل IgM ، ومضاد ل C3 المخفف (Fibrinogen-1: 10 [التحكم الإيجابي] ، IgG-1: 10 ، IgA-1: 10 ، IgM-1: 10 ، C3-1: 5 ، C4-1: 10) على الشرائح.
    ملاحظة: يتم تخفيف الأجسام المضادة في 1x PBS.
  4. بالنسبة للضوابط السلبية ، تخطي تطبيق الأجسام المضادة المترافقة واتبع الخطوات المتبقية المذكورة أدناه.
  5. اتبع إرشادات الشركة المصنعة لتخفيف الأجسام المضادة وتوحيدها باستخدام الضوابط الإيجابية والسلبية المعروفة.
  6. احتضان الشرائح في غرفة رطبة عند 37 درجة مئوية لمدة 45-60 دقيقة.
  7. اغسل الشرائح باستخدام PBS (3× لمدة 5 دقائق لكل منهما) لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.
  8. بقعة مضادة مع وسيط تركيب يحتوي على DAPI (4 '، 6 -diamidino-2-phenylidole) للتصور النووي.
  9. ضع غطاء فوق الشرائح واتركها تلتج لمدة 20 دقيقة.
  10. افحص الشرائح باستخدام مجهر مضان مزود بمرشحات مناسبة للفلوروفورات المستخدمة (مرشح أخضر للإثارة لمدة 488 نانومتر).
  11. قم بتوثيق النتائج باستخدام الصور المجهرية الرقمية.

5. حمض دوري سريع - تلطيخ شيف

  1. تحضير الحمض الدوري Schiff (PAS)
    1. قم بإذابة 1 جم من الفوشين الأساسي في 100 مل من الماء المقطر الساخن.
    2. أضف 10 مل من حمض الهيدروكلوريك و 2 جم من ثاني كبريتيت البوتاسيوم لإزالة لون الصبغة.
    3. بعد التبريد ، أضف 0.5 جم من الفحم المنشط ، وحرك ، وقم بتصفية المحلول للحصول على كاشف شيف الحمضي الدوري الشفاف. تخزينها في زجاجة داكنة.
      ملاحظة: لاختبار كاشف شيف ، اسكب 10 مل من 37٪ فورمالين في زجاج ساعة وأضف بضع قطرات من كاشف شيف ليتم اختبارها. سوف يتحول كاشف شيف الجيد بسرعة إلى اللون الأحمر الأرجواني. سيؤدي تدهور كاشف شيف إلى تأخر رد الفعل ، وسيكون المنتج أزرق أرجواني غامق.
  2. تقنية تلطيخ PAS
    1. رطب الشرائح في الماء.
    2. يتأكسد في محلول حمضي دوري 0.5٪ لمدة 5 دقائق.
    3. اشطفه بالماء المقطر.
    4. ضعه في كاشف شيف لمدة 15 دقيقة (تبدو الأقسام وردية فاتحة خلال هذه الخطوة)
    5. يغسل بماء الصنبور الفاتر لمدة 5 دقائق (يتحول لون الأقسام إلى اللون الوردي الداكن).
    6. Counterstain في الهيماتوكسيلين من ماير لمدة 1 دقيقة.
    7. يغسل بماء الصنبور لمدة 5 دقائق.
    8. قم بتجفيف الشرائح في المحاليل التالية: مرة واحدة في 80٪ كحول إيثيلي لمدة دقيقة واحدة ، مرتين في الكحول الإيثيلي بنسبة 90٪ لمدة دقيقة واحدة ، مرتين في الكحول الإيثيلي بنسبة 100٪ لمدة دقيقة واحدة.
    9. جفف الشرائح ثلاث مرات في الزيلين لمدة 1 دقيقة لكل منها.
    10. ضع غطاء فوق الشرائح باستخدام وسيط تركيب اصطناعي (على سبيل المثال ، حامل DPX)
    11. راقب نتائج PAS تحت مجهر المجال الساطع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتطلب تفسير DIF تأكيدا لوجود الغشاء القاعدي في أقسام الأنسجة (الشكل 1). في الشرائح الملطخة ب PAS ، سيظهر الغشاء القاعدي كغشاء وردي فاتح يقع في المنطقة القاعدية لظهارة الملتحمة (الشكل 1 ج). يجب أيضا التعليق على استمرارية الغشاء القاعدي وهندسته. سينظر إلى إيجابية DIF على أنها BM أخضر فاتح (الشكل 1 ب) ، مما يشير إلى ترسب IgM (الشكل 2 أ) أو IgA (الشكل 2 ب) أو IgG (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستخدم تقنية خزعة الملتحمة الموضحة هنا وسيط OCT كوسيط نقل ، مما يلغي الحاجة إلى وسيط نقل إضافي وتجنب التعامل مع الخزعة لنقلها إلى وسط OCT للاستئصال بالتبريد. يتم تجميد قالب خرطوشة بلاستيكي مملوء بالوسيط والخزعة مباشرة لعمل كتل الأنسجة ثم يتم تقسيمها. تتمثل مزايا OCT في أنه يتجمد بسرعة مع الحد الأدنى من الضرر الناتج عن تكوين البلورات ويغلف عينات الأنسجة. الخطوة الأكثر أهمية في التألق المناعي المباشر هي نقل العينات. يجب عدم إرسال خزعة الملتحمة بالفورمالين. ومع ذلك ، قامت إحدى الدراسات بتقي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر مؤسسة حيدر أباد لأبحاث العيون ، الهند على دعم هذه الدراسة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 N حمض الهيدروكلوريك   ؛Finar  الكيماوية المحدودة  7647-01-0
الأسيتون Qualigensس33517
الزلالداكوإف 0117
فوشين أساسيQualigensس39402
ج3 جالنظم الحيوية التشخيصية إف 003
ج4 جالنظم الحيوية التشخيصية إف 005
خرطوشعلوم متعددة25376-500
الفحم المنشط سيغماسي -5260
Cryostat Leica CM1860UV 
شفرات التبريد   ؛Leica 818
دابيAbcam أب104139
الفيبرينوجين النظم الحيوية التشخيصية إف 006
مجهر مضانأوليمبوسسي اكس 43
ملقط جوجا الجراحيةJS1528A
غرفة الرطوبة النظم الحيوية التشخيصية إس إم 365
IgAالنظم الحيوية التشخيصية إف 007
إي جيالنظم الحيوية التشخيصية إف 008
إيجي إمالنظم الحيوية التشخيصية إف 009
IHC الشرائح الزجاجية اللاصقة  تومو  33140455
ملقط ليمسباق الدراجات النارية إس -7223
متوسط tansport ميشيلفيشر سينيتكس   ؛NC0253304
زجاج غطاء مجهريالنجمة الزرقاءhttps://www.bluestarslides.com
أكتوبر متوسطة  Cryomatrix 6769006
برنامج تلفزيوني  داكوماركة DM831
حمض دوري   ؛سيغما375810-25 جرام
ثاني كبريتيت البوتاسيومسيغماP2522-500G
بروباراكايين 0.5٪صنواي برايفت  G / 1118A
مقص ويستكوتPillig Gurgical Intruments 423480

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jain, N., Jakati, S., Shanbhag, S. S., Basu, S. Direct immunofluorescence findings and factors affecting conjunctival biopsy positivity in ocular mucous membrane pemphigoid. Cornea. 43 (2), 159-165 (2024).
  2. Vazirani, J., et al. Chronic cicatrizing conjunctivitis: a review of the differential diagnosis and an algorithmic approach to management. Indian J Ophthalmol. 68 (11), 2349-2355 (2020).
  3. Singh, S., et al. Drug-induced cicatrizing conjunctivitis: a case series with review of etiopathogenesis, diagnosis and management. Ocul Surf. 24, 83-92 (2022).
  4. Bocanegra-Oyola, N., et al. Clinical characteristics of ocular mucous membrane pemphigoid: a systematic review and meta-analysis. Ocul Immunol Inflamm. 32 (10), 2388-2404 (2024).
  5. Coco, G., et al. Conjunctival biopsy site in mucous membrane pemphigoid. Am J Ophthalmol. 216, 1-6 (2020).
  6. Ong, H. S., et al. Mucous membrane pemphigoid with ocular involvement: the clinical phenotype and its relationship to direct immunofluorescence findings. Ophthalmology. 125 (4), 496-504 (2018).
  7. Anesi, S. D., et al. Reliability of conjunctival biopsy for diagnosis of ocular mucous membrane pemphigoid: redetermination of the standard for diagnosis and outcomes of previously biopsy-negative patients. Ocul Immunol Inflamm. 29 (6), 1106-1113 (2021).
  8. Dart, J., et al. Autoantibody detection for diagnosis in direct immunofluorescence-negative mucous membrane pemphigoid: ocular and other sites compared. Ophthalmology. 128 (3), 372-382 (2021).
  9. Leonard, J. N., et al. Immunofluorescent studies in ocular cicatricial pemphigoid. Br J Dermatol. 118 (2), 209-217 (1988).
  10. Mehra, T., et al. Diagnostic relevance of direct immunofluorescence in ocular mucous membrane pemphigoid. JDDG. 13 (12), 1268-1274 (2015).
  11. Shimanovich, I., Nitz, J. M., Zillikens, D. Multiple and repeated sampling increases the sensitivity of direct immunofluorescence testing for the diagnosis of mucous membrane pemphigoid. J Am Acad Dermatol. 77 (4), 700-705 (2017).
  12. Goldich, Y., et al. Characteristics of patients with ocular cicatricial pemphigoid referred to major tertiary hospital. Can J Ophthalmol. 50 (2), 137-142 (2015).
  13. Mudhar, H. S. Biopsies of cicatricial conjunctivitis cases reveal highly variable sampling practice among ophthalmologists: time for national and international standardisation. Br J Ophthalmol. 100 (6), 736-744 (2016).
  14. Vodegel, R. M., et al. Enhanced diagnostic immunofluorescence using biopsies transported in saline. BMC Dermatol. 4, 1-7 (2004).
  15. Jonkman, M. F., De Groot, A. C., Slegers, T. P., De Jong, M. C., Pas, H. H. Immune diagnosis of pure ocular mucous membrane pemphigoid: indirect immunofluorescence versus immunoblot. Eur J Dermatol. 19 (5), 456-460 (2009).
  16. Shimanovich, I., Nitz, J. M., Witte, M., Zillikens, D., Rose, C. Immunohistochemical diagnosis of mucous membrane pemphigoid. J Oral Pathol Med. 47 (6), 613-619 (2018).
  17. Philip, A. M., Stephenson, A., Al-Dabbagh, A., Ramezani, K., Fernandez-Santos, C. C., Foster, C. S. Ocular cicatricial pemphigoid with IgM-positive biopsy. Cornea. 42 (12), 1503-1505 (2023).
  18. Williams, G. P., et al. Conjunctival neutrophils predict progressive scarring in ocular mucous membrane pemphigoid. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5457-5469 (2016).
  19. Levian, B., Hussaini, S. S., Woodley, D. T., Kasperkiewicz, M. Pseudopemphigoid: a systematic review. JAAD Int. 17, 170-171 (2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PAS Cryostat

مقالات ذات صلة