مقالة منهجية

تقييم العزل والتدفق الخلوي للتفاعلات المناعية العصبية في نموذج الفئران السكتة الدماغية المصغرة

DOI:

10.3791/68308

⸱

يونيو 20, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental and Translational Research Center, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, 2Department of Neurology, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم بروتوكولا لتقييم وظيفة الخلايا المناعية بعد السكتة الدماغية الإقفارية باستخدام تحليل قياس التدفق الخلوي في نموذج السكتة الدماغية المصغرة. تتيح هذه الطريقة فحصا مفصلا للتفاعلات المناعية العصبية ويمكن تكييفها لدراسة الأمراض التنكسية العصبية الأخرى ، مما يعزز فهمنا للاستجابات المناعية في أمراض السكتة الدماغية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

السكتة الدماغية هي سبب رئيسي للوفاة والإعاقة طويلة الأمد في جميع أنحاء العالم ، حيث تمثل السكتة الدماغية الإقفارية غالبية الحالات. بعد السكتة الدماغية الإقفارية ، يتم تنشيط الخلايا المناعية المقيمة والمتسللة ، مما يساهم في مزيد من تلف الخلايا العصبية. ومع ذلك ، فإن أدوار الجهاز المناعي في أمراض السكتة الدماغية الإقفارية ليست مفهومة تماما ، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى التنظيم المعقد والديناميكي للاستجابات المناعية كرد فعل على التغيرات في البيئة المكروية أثناء الالتهاب العصبي. لذلك ، من الضروري مراقبة وتحليل تنشيط الخلايا المناعية المقيمة والمتسللة بمرور الوقت بعد السكتة الدماغية الإقفارية. في هذه الدراسة ، نقدم بروتوكولا لتقييم وظيفة هذه الخلايا المناعية بعد السكتة الدماغية الإقفارية باستخدام تحليل قياس التدفق الخلوي في نموذج السكتة الدماغية المصغرة. نقوم بتشريح أنسجة المخ المحتشة في نقاط زمنية محددة ثم نفصلها إلى معلق أحادي الخلية باستخدام الطرق الميكانيكية والأنزيمية. يتم تمرير الخلايا من خلال مصفاة خلوية 70 ميكرومتر ويتم تصنيفها بكوكتيلات الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية قبل قياسها عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي. في حين تم تطوير هذا الاختبار خصيصا للتحقيق في التفاعلات المناعية العصبية بعد السكتة الدماغية الإقفارية ، إلا أنه يمكن أيضا تكييفه بسهولة لدراسة آليات المناعة العصبية في الأمراض التنكسية العصبية الأخرى ، مثل التصلب المتعدد ومرض باركنسون ومرض الزهايمر.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

السكتة الدماغية هي سبب رئيسي للوفيات والعجز طويل الأمد في جميع أنحاء العالم ، حيث تمثل السكتة الدماغية الإقفارية الغالبية العظمى من الحالات1،2،3. الهدف العام لهذه الطريقة هو تعزيز فهمنا للتفاعلات المناعية العصبية التي تحدث بعد السكتة الدماغية الإقفارية من خلال توفير نهج مكرر لتقييم تنشيط كل من الخلايا المناعية المقيمة والمتسللة في نموذج الفئران السكتة الدماغية الصغيرة4،5. يعد التفاعل المعقد بين هذه الخلايا المناعية والبيئة المكروية العصبية أمرا بالغ الأهمية لفهم الفيزيولوجيا المرضية للسكتة الدماغية الإقفارية. ومع ذلك ، فإن الآليات الدقيقة الكامنة وراء هذه التفاعلات المناعية العصبية لا تزال واضحة بشكل سيئ ، ويرجع ذلك في المقام الأول إلى الطبيعة الديناميكية والمتعددة الأوجه للاستجابات المناعية الناجمة عن الالتهاب العصبي6. تهدف هذه التقنية إلى توضيح الديناميكيات المعقدة للاستجابات المناعية في سياق الالتهاب العصبي وتأثيرها اللاحق على تلف الخلايا العصبية ونتائج التعافي.

ينبع الأساس المنطقي وراء تطوير هذه التقنية من الدور الحاسم الذي تلعبه الخلايا المناعية في تفاقم تلف الخلايا العصبية والتأثير على التعافي بعد حدث إقفاري. غالبا ما تفتقر الطرق التقليدية لدراسة هذه التفاعلات إلى الدقة اللازمة لالتقاط الفروق الدقيقة الزمانية والمكانية لتنشيط الخلايا المناعية. من خلال استخدام تحليل قياس التدفق الخلوي على معلقات خلية واحدة مشتقة من أنسجة المخ الاحتشية التشريح الدقيق ، يقدم هذا البروتوكول تقييما أكثر تفصيلا وديناميكية لملامح الخلايا المناعية بمرور الوقت7،8. يتيح هذا النهج تحديد مجموعات معينة من الخلايا المناعية وحالاتها الوظيفية ، والتي تعتبر محورية لفهم الفيزيولوجيا المرضية للسكتة الدماغية الإقفارية.

بالمقارنة مع التقنيات البديلة مثل التلوين النسيجي أو تسلسل الحمض النووي الريبي السائب ، والتي قد توفر رؤى محدودة حول المساهمات الفردية لأنواع الخلايا المناعية ، فإن طريقة قياس التدفق الخلوي هذه تقدم العديد من المزايا. على سبيل المثال ، أظهرت الدراسات السابقة أن قياس التدفق الخلوي يسمح بتحليل عالي الإنتاجية لعلامات متعددة في وقت واحد ، مما يسهل توصيفا أكثر شمولا للأنماط الظاهرية للخلايا المناعيةووظائفها 9،10،11،12،13. بالإضافة إلى ذلك ، فإن قدرة هذه الطريقة على التكيف مع مجموعة متنوعة من الحالات التنكسية العصبية - مثل التصلب المتعدد ومرض باركنسون ومرض الزهايمر - توضح تعدد استخداماتها وأهميتها في مجموعة أوسع من الأدبيات التي تتناول تفاعلات المناعة العصبية.

بالنسبة للباحثين الذين يفكرون في تطبيق هذه الطريقة ، فإن تقييم الأهداف المحددة لدراستهم أمر ضروري. هذه التقنية مناسبة بشكل خاص للتحقيقات التي تتطلب تحليلا زمنيا مفصلا للاستجابات المناعية في سياق السكتة الدماغية الإقفارية أو الأمراض التنكسية العصبية ذات الصلة. يوصى بأن يمتلك المستخدمون فهما أساسيا لقياس التدفق الخلوي وخبرة في نماذج الفئران لتنفيذ هذا البروتوكول بشكل فعال وتفسير البيانات الناتجة. من خلال توفير إطار عمل قوي لدراسة التفاعلات المناعية العصبية ، تساهم هذه الطريقة بشكل كبير في الجهود المستمرة لتحديد تعقيدات المشاركة المناعية في أمراض السكتة الدماغية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع التجارب على من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) في مستشفى بكين للصداقة ، جامعة العاصمة الطبية. نوصي بإخضاع جميع المحاليل للترشيح المعقم وأن تكون جميع الأنابيب المستخدمة معقمة.

1. تحضير الكواشف والمخزن المؤقت

  1. مزيج إنزيم الهضم: قم بإذابة الكولاجيناز IV للحصول على تركيز 0.25٪ وتخفيف DNase I للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 2 U / mL.
  2. المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشطة المغناطيسية (MACS): قم بإذابة ألبومين مصل الأبقار (BSA) وحمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) للوصول إلى تركيزات 0.5٪ و 2 ملي مولار في 1x PBS ، على التوالي.

2. نموذج السكتة الدماغية الإقفارية البؤرية

ملاحظة: تم توظيف الفئران C57BL / 6 J (8-10 أسابيع) لإنشاء نموذج سكتة دماغية إقفارية بؤرية ، كما هو موضحسابقا 14. يمكن بدلا من ذلك تخدير الفئران باستخدام محلول 1.25٪ أفيرتين بجرعة 0.2 مل لكل 10 غرام من وزن الجسم.

  1. تخدير الفئران باستخدام 3٪ أيزوفلوران ، مع الحفاظ على جرعة 1.5٪ باستخدام جهاز تخدير غازي. حافظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية طوال الإجراء بأكمله باستخدام وسادة تدفئة.
    ملاحظة: تؤكد هذه الدراسة على أهمية التحقق من تحصيل المستوى الجراحي قبل بدء الإجراء. هذه الخطوة ضرورية لضمان الوصول الأمثل إلى المنطقة المستهدفة وتقليل المضاعفات المحتملة أثناء الجراحة.
  2. قم بقص الفراء في المنطقة الواقعة بين العين اليمنى والأذن اليمنى باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية. قم بعمل شق عمودي في المنطقة المخصصة المجاورة للعينين تحت مجهر التشريح.
  3. افصل جميع الأنسجة برفق لكشف الجمجمة وتحديد الفرع البعيد للشريان الدماغي الأوسط الأيمن (MCA) ، والذي يتميز ببنية وعائية عمودية على شكل حرف "Y". استخدم مثقابا كهربائيا لاختراق الجمجمة ، مع الحرص على إزالتها بحذر.
  4. استئصال السحايا بدقة باستخدام ملقط دقيق.
  5. كشف الفرع البعيد للشريان الدماغي الأوسط الأيمن (MCA) ، ثم قم بإجراء ربط دائم للفرع البعيد من MCA الأيمن باستخدام خياطة 10-0.
  6. أعد وضع الأنسجة إلى حالتها الأصلية وأغلق شق جلد الوجه بمادة لاصقة للأنسجة.
  7. ضع الماوس في اتجاه ضعيف وقم بقص الفراء في منطقة الرقبة باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية.
  8. قم بإنشاء شق أفقي في منطقة الرقبة وافصل الغدد تحت الفك السفلي برفق.
  9. قم بتشريح غمد الشريان السباتي بعناية باستخدام ملقط دقيق ، وتحديد الشريان السباتي المشترك وفصله عن العصب المبهم.
  10. قم بربط خياطة 4-0 عبر الشريان السباتي المشترك وثبته بعقدة زلة.
  11. كرر الخطوة 10 على الشريان السباتي المشترك المقابل. انسداد الشرايين السباتية المشتركة الثنائية (CCAs) مؤقتا لمدة 7 دقائق.
  12. استبدل أنسجة الغدة تحت الفك السفلي إلى موضعها الأصلي وأغلق شق الرقبة بمادة لاصقة للأنسجة.
    ملاحظة: خضعت مجموعة العمليات الوهمية لإجراءات مماثلة لتلك الخاصة بمجموعة السكتة الدماغية ، مع استثناء فريد هو أن MCA و CCA البعيدين ظلوا غير مرتبطين.
  13. راقب الفأر طوال العملية الجراحية وبعدها ، بما في ذلك تنفسه ودرجة حرارة الجسم. احتفظ بالماوس على وسادة تسخين حتى يستيقظ تماما.

3. نضح الدماغ وتشريحه

  1. قم بإعداد حقنة سعة 50 مل وقم بإرفاق إبرة 26 جم بنهايتها. املأ المحقنة بمحلول ملحي.
  2. قم بإعطاء جرعة مضاعفة من 1.25٪ أفرتين لتحقيق التخدير العميق في الفأر.
    ملاحظة: يجب التأكد تماما من تخدير الماوس بالكامل قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
  3. ضع الفأر في اتجاه ضعيف على لوح رغوي ، مع تمديد أطرافه الأمامية والخلفية ، وتثبيتها في مكانها بإبر 26 جراما.
  4. بمجرد تخدير الفأر تماما ، أمسك جلد البطن بملقط العين وقم بعمل شق جانبي للكشف عن الكبد. استمر في القطع على جانبي الضلوع لفضح القلب.
  5. أدخل الإبرة 26 G في البطين الأيسر واقطع الأذن ، ثم اضغط على المحقنة للسماح للدم بالتدفق.
  6. استمر في عملية التروية حتى يبدو الدم الذي يخرج من الأذن صافيا.
  7. اقطع رأس الفأر فوق الحبل الشوكي مباشرة باستخدام مقص جراحي مستقيم.
  8. قم بإنشاء شق خلفي أمامي في جلد الرأس لكشف الجمجمة. قم بعمل شقين جانبيين عند تقاطع الجدران الجانبية وقاعدة الجمجمة.
  9. اقطع الجمجمة على طول الخيط السهمي وقم بعمل شق بين المدارات.
  10. استخدم الملقط لإزالة الجمجمة التي تغطي كل نصف كرة كرة ، وبالتالي تعريض الدماغ ، ونقله إلى مصفوفة دماغ فولاذية للفأر. بعد ذلك ، قم بتقسيم الدماغ إلى شرائح إكليلية متتالية بسمك 2 مم.

4. هضم الأنسجة القشرية إلى تعليق أحادي الخلية وتلوين الأجسام المضادة لقياس التدفق الخلوي

  1. أدخل 500 ميكرولتر من مزيج إنزيم الهضم في كل بئر من طبق 12 بئرا.
  2. افصل أنسجة الاحتشاء بدقة وانقلها إلى مزيج إنزيم الهضم باستخدام ملقط دقيق (الشكل 1).
  3. قم بتقطيع الأنسجة بدقة إلى أصغر القطع الممكنة باستخدام مقص للعيون واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  4. باستخدام ماصة P1000 ، قم بشفط المحلول برفق وتوزيعه 10 مرات لفصل الأنسجة إلى خلايا فردية ، ثم تمرير المحلول عبر مصفاة خلية 70 ميكرومتر. اشطف باستمرار كل من الصفيحة المكونة من 12 بئرا ومصفاة الخلية باستخدام HBSS المثلج الذي يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم.
  5. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم تخلص من المادة الطافية بعناية.
    ملاحظة: نظرا لأن الكريات المنتجة فضفاضة جدا ويمكن إزاحتها بسهولة ، يرجى الامتناع عن إزعاجها لمنع أي فقدان للخلايا.
  6. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من 1x PBS وكرر الخطوة 5. بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات في 150 ميكرولتر من 1x PBS وانقل التعليق إلى صفيحة 96 بئرا ذات قاع دائري. ثم جهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 500 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
  7. أمسك بقوة اللوحة المكونة من 96 بئرا واقلبها بسرعة للتخلص من المادة الطافية.
  8. تمييع صبغة مضان قابلية للحياة للخلية بنسبة 1: 100 في 1x PBS ، ثم أعد تعليق الحبيبات في 150 ميكرولتر حسب الحصة. احتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) ، محمية من الضوء.
  9. جهاز الطرد المركزي عند 500 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية. قم بتخفيف كوكتيل الأجسام المضادة لسطح الخلية في مخزن MACS. بدون غسل الخلايا ، أضف كوكتيل الأجسام المضادة لسطح الخلية واحتضنه لمدة 15-20 دقيقة إضافية عند 4 درجات مئوية.
  10. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات في 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS.
  11. كرر الخطوة 4.10 وانقل التعليق إلى أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مل أو أنابيب اختبار البوليسترين ذات القاع المستدير سعة 5 مل.

5. تحليل وفرز قياس التدفق الخلوي

  1. صمم لوحة قياس التدفق الخلوي متعددة الألوان وفقا لتكوين الجهاز ، باستخدام التقنيات اليدوية أو أداة التصميم عبر الإنترنت ، لتحسين اختيار الفلوروفورات المترافقة مع الأجسام المضادة وتقليل التداخل الطيفي.
    ملاحظة: يجب مراعاة العديد من الاعتبارات المحورية عند تصميم لوحة قياس التدفق الخلوي متعددة الألوان. أولا ، من الضروري التعرف على تكوين الأداة المستخدمة ، بما في ذلك الليزر والمرشحات ، قبل البدء. ثانيا ، استخدم ملصقات الفلوروفور الساطعة على الأجسام المضادة للمستضدات منخفضة الوفرة ، مع اختيار ملصقات الفلوروفور الخافتة على الأجسام المضادة التي تستهدف المستضدات عالية التعبير. أخيرا ، من الضروري تضمين صبغة صلاحية الخلية في اللوحة لاستبعاد الخلايا غير القابلة للحياة والحطام بشكل فعال من البيانات. والجدير بالذكر أنه لضمان البوابات المناسبة للوفرة المنخفضة أو المستضدات سيئة الخصائص ، يجب استخدام ضوابط التألق ناقص واحد (FMO)15. تشمل عناصر التحكم FMO جميع علامات النسب باستثناء السمة ذات الأهمية ، مما يسهل التحديد الدقيق بين الخلايا الملطخة إيجابياوسلبيا 16.
  2. اضبط إعدادات كاشفات التشتت الأمامي (FSC) والمبعثر الجانبي (SSC) للتأكد من أن الخلايا ذات الأهمية معروضة بشكل مناسب على المقياس ويمكن تغطيتها بوابات حسب الحاجة.
  3. قم بضبط FSC و SSC بدقة للتخلص من الحطام أو الضوضاء الدخيلة. التفريق بين الخلايا المضاعفة والخلايا المفردة داخل مخطط نقطي يوضح مساحة وارتفاع FSC. عزل الخلايا القابلة للحياة بناء على إشارة صبغة مضان بقاء الخلية.
    ملاحظة: قد تظهر إعدادات الأدوات المختلفة اختلافات طفيفة. على سبيل المثال ، تستخدم بعض أجهزة فرز الخلايا عرض وارتفاع FSC لتمييز الخلايا المزدوجة عن الخلايا المفردة ، بينما يستخدم البعض الآخر مساحة وارتفاع FSC لنفس الغرض.
  4. اضبط التعويض لكل قناة.
    ملاحظة: يمكن استخدام كل من العينات الخلوية وخرز التعويض المتاح تجاريا لغرض تعويض الامتداد غير المباشر للفلورسنت.
    1. قارن التحكم في التألق التلقائي (الخلايا غير الملطخة) مع عناصر التحكم الإيجابية للخلايا الملطخة لضمان تحجيم الخلايا الملطخة بشكل مناسب لكل معلمة. بالإضافة إلى ذلك ، قم بضبط التعويض عن طريق تحليل عينات الخلايا متعددة الألوان ، ومراقبة المخططات النقطية ذات 2 اللون ، وضبط إعدادات التعويض لأعلى أو لأسفل لضمان محاذاة مجموعات الخلايا إما رأسيا أو أفقيا مع بعضها البعض.
    2. استخدم إشارات CD45 و CD11b للتمييز بين الخلايا الليمفاوية (CD11b-CD45عالية) ، الخلايا الدبقية الصغيرة (CD11b + CD45int) ، الخلايا النخاعية (CD11b + CD45عالية) ، والخلايا النجمية (CD11b-CD45- GLAST +) 17،18.
    3. استخدم أنسجة المخ الزائفة كتحكم في التألق التلقائي ومرجعا لتمييز الخلايا الليمفاوية. إذا كان هدف معين قيد الفحص ، فاستخدم التحكم في FMO مع أنسجة المخ بعد السكتة الدماغية.
  5. ابدأ في جمع بيانات التحكم والعينة وتأكد من حفظها.
    ملاحظة: بالنظر إلى أن نموذج السكتة الدماغية المصغرة الموصوف هنا ينتج عنه احتشاء صغير ، فعادة ما يتم جمع عدد أقل من الخلايا من نموذج انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAO). بشكل عام ، ينتج عن جمع 5 × 105 خلايا ما يقرب من 5 × 103 خلايا دبقية صغيرة و 1 × 105 خلايا نجمية ، على التوالي.
  6. حدد وفرز مجموعات الخلايا المطلوبة إلى أنابيب اختبار البوليسترين مستديرة القاع سعة 5 مل أو أنابيب طرد مركزي مخروطية سعة 15 مل.
    ملاحظة: أضف 500 ميكرولتر من PBS واشطف الأنبوب بدقة لضمان بقاء الخلايا والمساعدة في تكوين حبيبات الخلية.

6. تحليل التعبير الجيني في مجموعات خلايا مختارة

ملاحظة: يمكن بدلا من ذلك إجراء استخراج الحمض النووي الريبي الكلي باستخدام مجموعات تجارية باتباع إرشادات الشركة المصنعة.

  1. قم بالطرد المركزي للخلايا من الخطوة 5.6 عند 500 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق ، ثم تخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من كاشف TRIzol.
    ملاحظة: عدد الخلايا التي تم فرزها أقل بكثير مقارنة بالخلايا أو الأنسجة المستنبتة. وبالتالي ، قد تساعد سرعة الطرد المركزي الأعلى في تكوين حبيبات خلية أكثر إحكاما. يمكن استخدام الخلايا التي تم الحصول عليها من هذه الخطوة للتطبيقات اللاحقة ، مثل زراعة الخلايا أو خطوط أنابيب تسلسل الحمض النووي الريبي أحادية الخلية.
  2. اسمح للعينة بالوقوف عند RT لمدة 5 دقائق لتسهيل تفكك مجمعات البروتين النووي.
  3. أضف 0.2 مل من الكلوروفورم إلى العينة وقم بتأمين الأنبوب. رج الأنابيب بقوة لمدة 15 ثانية ، ثم احتضنها لمدة دقيقتين في RT.
  4. الطرد المركزي العينات عند 10,000 جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. سيبقى الحمض النووي الريبي فقط في المرحلة المائية العليا.
  5. انقل الطور المائي العلوي بحذر إلى أنبوب نظيف ، مع الحرص على عدم إزعاج الواجهة.
    ملاحظة: يجب أن يكون حجم الطور المائي حوالي 500 ميكرولتر.
  6. قم بترسيب الحمض النووي الريبي من المرحلة المائية عن طريق إدخال 0.5 مل من الأيزوبروبانول وخلطه برفق عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات. احتضان العينات في RT لمدة 10 دقائق.
  7. الطرد المركزي للعينات عند 10,000 جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لجمع الحمض النووي الريبي.
  8. صب المادة الطافية وإزالة أي سائل متبقي تماما عن طريق الشفط.
  9. اغسل حبيبات الحمض النووي الريبي مرة واحدة باستخدام 75٪ إيثانول, إضافة ما لا يقل عن 1 مل من 75٪ الإيثانول. امزج العينة جيدا ، ثم جهاز الطرد المركزي على حرارة 7500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  10. القضاء على جميع آثار الإيثانول. جفف حبيبات الحمض النووي الريبي في الهواء لمدة 5 دقائق.
  11. قم بإذابة الحمض النووي الريبي في 10 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.
  12. تابع إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة ، نقدم بروتوكولا منقحا لتقييم وظائف الخلايا المناعية بعد السكتة الدماغية الإقفارية ، باستخدام تحليل قياس التدفق الخلوي ضمن نموذج السكتة الدماغية المصغرة. تم إحداث السكتة الدماغية المصغرة عن طريق الربط الدائم للفرع البعيد من الشريان الدماغي الأوسط الأيمن (MCA) ، وتبعه انسداد الشريان السباتي المشترك الثنائي لمدة 7 دقائق (CCAs). تنتج هذه المنهجية سكتة دماغية خفيفة تتميز بأحجام آفة صغيرة ومتسقة ومعدل وفيات منخفض بشكل ملحوظ. علاوة على ذلك ، فإن قدرة النموذج على التحقيق في التفاعلات المناعية العصبية طويلة المدى ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة ، نقدم بروتوكولا مفصلا لتقييم وظيفة الخلايا المناعية بعد السكتة الدماغية الإقفارية ، باستخدام تحليل قياس التدفق الخلوي في نموذج السكتة الدماغية المصغرة. تشمل الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول إنشاء سكتة دماغية إقفارية بؤرية عن طريق الربط الدائم للفرع البعيد من الشريان الدماغي الأوسط الأيمن (MCA) جنبا إلى جنب مع انسداد الشرايين السباتية المشتركة الثنائية لمدة سبع دقائق (CCAs). ينتج عن هذا النهج الجراحي سكتة دماغية خفيفة تتميز بأحجام آفة ثابتة ومعدلات وفيات منخفضة ، مما يجعله ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح متضاربة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 82201622) ومؤسسة العلوم الطبيعية في منغوليا الداخلية (رقم 2020MS03017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1.5 مل أنبوب الطرد المركزي الدقيقعش  615601مواد المختبر
1&مرات ؛ برنامج تلفزيونيكورنينج21-040-سمالكاشف
96 بئر صفيحة دقيقة معالجة ب TC ذات قاع دائري شفافكورنينج3799مواد المختبر
APC المضادة للماوس CD19بيوليجند152410جسم
APC / Cyanine7 المضادة للماوس CD45بيوليجند103116جسم
أفرتين (1.25٪)نانجينغ أيبي للتكنولوجيا الحيوية إم 2920الكاشف
BD FACSAria IIدينار بحريني642510معدات
بريليانت بنفسجي 421 مضاد للماوس CD4بيوليجند100437جسم
بريليانت بنفسجي 605 مضاد للفأر / بشري CD11bبيوليجند101237جسم
جيش صرب البوسنهسيجما ألدريتشأ 1933 - 1 جيكيميائي
الكولاجيناز الرابعسيجما ألدريتشC4-28-100MGانزيم
DNase Iنيو إنجلاند بيولابسطراز M0303Lانزيم
إيدتاسيجما ألدريتشEDS-100 جرامكيميائي
فالكون 5 مل أنابيب اختبار البوليسترين ذات القاع المستديركورنينج352052مواد المختبر
الصقر   15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطيةكورنينج352095مواد المختبر
فلوجو V10دينار بحرينيبرمجيات
جلاط (ACSA-1) الجسم المضاد ، PEميلتيني بيوتيك130-118-344جسم
إيزوفلورانRWD علوم الحياة510-22-10الكاشف
PE / Cyanine7 مضاد للماوس CD3بيوليجند100220جسم
PE / Dazzle 594 مضاد للماوس NK-1.1بيوليجند156518جسم
كاشف تريزولشركة ثيرمو فيشر العلمية15596026الكاشف
ماء مقطر خال من DNase / RNase فائق النقاءشركة ثيرمو فيشر العلمية10977015الكاشف
مواد لاصقة للأنسجة من Vetbond3 م1469SBمواد المختبر
زومبي أكوا Fixable طقم الجدوىبيوليجند423102صبغة الفلورسنت التفاعلية للأمين

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kleindorfer, D. O., et al. 2021 Guideline for the prevention of stroke in patients with stroke and transient ischemic attack: A guideline from the American heart association/American Stroke Association. Stroke. 52 (7), e364-e467 (2021).
  2. Pu, L., et al. Projected global trends in ischemic stroke incidence, deaths and disability-adjusted life years from 2020 to 2030. Stroke. 54 (5), 1330-1339 (2023).
  3. Cheng, Y., et al. Projections of the stroke burden at the global, regional, and national levels up to 2050 based on the global burden of disease study 2021. J Am Heart Assoc. 13 (23), e036142(2024).
  4. Ma, Y., Yang, S., He, Q., Zhang, D., Chang, J. The role of immune cells in post-stroke angiogenesis and neuronal remodeling: The known and the unknown. Front Immunol. 12, 784098(2021).
  5. Duan, M., Xu, Y., Li, Y., Feng, H., Chen, Y. Targeting brain-peripheral immune responses for secondary brain injury after ischemic and hemorrhagic stroke. J Neuroinflammation. 21 (1), 102(2024).
  6. Chen, B. R., Wu, T., Chen, T. H., Wang, Y. Neuroimmune interactions and their roles in neurodegenerative diseases. Fundam Res. 4 (2), 251-261 (2024).
  7. Zhang, Z., Lv, M., Zhou, X., Cui, Y. Roles of peripheral immune cells in the recovery of neurological function after ischemic stroke. Front Cell Neurosci. 16, 1013905(2022).
  8. Garcia-Bonilla, L., et al. Analysis of brain and blood single-cell transcriptomics in acute and subacute phases after experimental stroke. Nat Immunol. 25 (2), 357-370 (2024).
  9. Stevens, S. L., et al. The use of flow cytometry to evaluate temporal changes in inflammatory cells following focal cerebral ischemia in mice. Brain Res. 932 (1-2), 110-119 (2002).
  10. Carson, M. J., Reilly, C. R., Sutcliffe, J. G., Lo, D. Mature microglia resemble immature antigen-presenting cells. Glia. 22 (1), 72-85 (1998).
  11. Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat Protoc. 1 (4), 1947-1951 (2006).
  12. De Haas, A. H., Boddeke, H. W., Biber, K. Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS. Glia. 56 (8), 888-894 (2008).
  13. Mcdonough, A., Weinstein, J. R. Neuroimmune response in ischemic preconditioning. Neurotherapeutics. 13 (4), 748-761 (2016).
  14. Wang, S., et al. Transcriptome analysis reveals dynamic microglial-induced a1 astrocyte reactivity via c3/c3ar/NF-kappab signaling after ischemic stroke. Mol Neurobiol. 61 (12), 10246-10270 (2024).
  15. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry. 69A, 1037-1042 (2006).
  16. Siddiqui, S., Livak, F. Principles of advanced flow cytometry: A practical guide. Methods Mol Biol. 2580, 89-114 (2023).
  17. Sousa, C., et al. Single-cell transcriptomics reveals distinct inflammation-induced microglia signatures. EMBO Rep. 19 (11), e46171(2018).
  18. Martin, E., El-Behi, M., Fontaine, B., Delarasse, C. Analysis of microglia and monocyte-derived macrophages from the central nervous system by flow cytometry. J Vis Exp. 124, e55781(2017).
  19. Zhang, W., et al. Microglia-associated neuroinflammation is a potential therapeutic target for ischemic stroke. Neural Regen Res. 16 (1), 6-11 (2021).
  20. Mao, J. H., et al. Microglia polarization in ischemic stroke: Complex mechanisms and therapeutic interventions. Chin Med J (Engl). 134 (20), 2415-2417 (2021).
  21. Shui, X., et al. Microglia in ischemic stroke: Pathogenesis insights and therapeutic challenges. J Inflamm Res. 17, 3335-3352 (2024).
  22. Feng, Y., et al. Infiltration and persistence of lymphocytes during late-stage cerebral ischemia in middle cerebral artery occlusion and photothrombotic stroke models. J Neuroinflammation. 14 (1), 248(2017).
  23. Schulze, J., Gellrich, J., Kirsch, M., Dressel, A., Vogelgesang, A. Central nervous system-infiltrating t lymphocytes in stroke are activated via their TCR (T-cell receptor) but lack CD25 expression. Stroke. 52 (9), 2939-2947 (2021).
  24. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
  25. Leelatian, N., et al. Single-cell analysis of human tissues and solid tumors with mass cytometry. Cytometry B Clin Cytom. 92 (1), 68-78 (2017).
  26. Delmonte, O. M., Fleisher, T. A. Flow cytometry: Surface markers and beyond. J Allergy Clin Immunol. 143 (2), 528-537 (2019).
  27. Schmit, T., Klomp, M., Khan, M. N. The application of flow cytometry for simultaneous and multi-parametric analysis of heterogenous cell populations in basic and clinical research. Methods Mol Biol. 2223, 183-200 (2021).
  28. Dukhinova, M., Kopeikina, E., Ponomarev, E. D. Usage of multiparameter flow cytometry to study microglia and macrophage heterogeneity in the central nervous system during neuroinflammation and neurodegeneration. Methods Mol Biol. 1745, 167-177 (2018).
  29. Rui, W., et al. Myeloid gasdermin d drives early-stage T-cell immunity and peripheral inflammation in a mouse model of Alzheimer's disease. J Neuroinflammation. 21 (1), 266(2024).
  30. Rauber, S., et al. Flow cytometry identifies changes in peripheral and intrathecal lymphocyte patterns in CNS autoimmune disorders and primary CNS malignancies. J Neuroinflammation. 21 (1), 286(2024).
  31. Rayaprolu, S., et al. Flow-cytometric microglial sorting coupled with quantitative proteomics identifies moesin as a highly-abundant microglial protein with relevance to Alzheimer's disease. Mol Neurodegener. 15 (1), 28(2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة