أظهرت هذه الدراسة أن المصل المحتوي على الطب التبتي Jiangtangle يمكن أن يحسن الخلل الوظيفي للميتوكوندريا عن طريق تعزيز مستويات ATP في الميتوكوندريا وتحلل السكر.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة بحثية
* These authors contributed equally
أظهرت هذه الدراسة أن المصل المحتوي على الطب التبتي Jiangtangle يمكن أن يحسن الخلل الوظيفي للميتوكوندريا عن طريق تعزيز مستويات ATP في الميتوكوندريا وتحلل السكر.
فشل الخلايا β الناجم عن خلل الميتوكوندريا هو السمة الأساسية لداء السكري من النوع 2 (T2DM). يمكن استخدام الطب التبتي Jiangtangle ، المكون من Berberis kansuensis و Curcumaelongae Rhizoma و Malvae Fructus و Tribuli Fructus و Thlaspi arvense L. و Phyllanthus emblica L. ، لعلاج T2DM. ومع ذلك ، فإن آثاره على وظيفة الميتوكوندريا لا تزال غير واضحة. تهدف هذه الدراسة إلى توضيح التأثيرات الدوائية للطب التبتي Jiangtangle على الميتوكوندريا. في 7 أيام بعد الإعطاء المسبق للدواء التبتي Jiangtangle ، تم الحصول على مصل الفئران عن طريق جمع الدم الشريان الأورطي البطني. تم تقسيم خلايا β جزيرة البنكرياس في الفئران (RIN-m5F) إلى مجموعات تحكم ونموذج ومجموعات مصل تحتوي على Jiangtangle. تم تحفيز النموذج ومجموعات المصل المحتوية على Jiangtangle للإصابة بوسط DMEM يحتوي على 50 ملي مولار جلوكوز لمدة 24 ساعة. عولجت المجموعة الضابطة بوسط DMEM الذي لا يحتوي على جلوكوز لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، تمت إضافة الوسط إلى مجموعات المراقبة والنموذج ، بينما تم تحضين مجموعات المصل المحتوية على Jiangtangle لمدة 24 ساعة مع وسط يحتوي على 2.5٪ و 5٪ و 10٪ مصل يحتوي على Jiangtangle. أشارت نتائج UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS إلى وجود 90 مركبا في Jiangtangle ، من بينها 6 مركبات نموذجية تدخل الدم. تم استخدام CCK 8 لقياس صلاحية الخلية ، وتم استخدام Seahorse XFe لتقييم استقلاب طاقة الميتوكوندريا وتم تقييم تأثير المصل المحتوي على Jiangtangle على نموذج ارتفاع السكر في الدم لخلايا RIN-m5F. مصل يحتوي على Jiangtangle معزز من صلاحية خلية RIN-m5F ، ومستوى ATP للميتوكوندريا ، ومستوى ATP المحلل للسكر ، وتحلل السكر الأساسي ، وتحلل السكر التعويضي ، والتعرف الضوئي على الحروف ، وتسرب البروتون ، وأقصى تنفس.
داء السكري هو مرض استقلابي مزمن منتشر على نطاق واسع في العالم. يشكل التسبب المعقد في المرض تهديدا خطيرا لصحة الإنسان ، كونه مشكلة صحية عامة رئيسية يجب حلها على وجه السرعة1. ينقسم مرض السكري بشكل أساسي إلى داء السكري من النوع 1 ، وداء السكري من النوع 2 (T2DM) ، وسكري الحمل ، وأنواع معينة من مرض السكري2. مع تغير نمط الحياة وتسريع عملية الشيخوخة ، أظهر انتشار مرض السكري اتجاها تصاعديا حادا في العقود القليلة الماضية. يوجد في الصين أكبر عدد من مرضى السكري في العالم ، حيث يعاني أكثر من 118 مليون شخص من مرض السكري ، وهو ما يمثل حوالي 22٪ من الإجمالي العالمي ، مع أكثر من 90٪ من T2DM3،4،5. في جميع المسببات المرضية المبلغ عنها ، تم الإعلان عن الخلل الوظيفي للخلايا β في الجزيرة ليكون آلية محورية أثناء عملية T2DM6،7.
الميتوكوندريا ، كونها مركز استقلاب طاقة الخلية ، هي عضيات فرعية تشارك في الوظائف الأساسية للجزيرة β الخلية8. أظهرت الدراسات الحالية أن حدوث وتطور T2DM يرتبطان ارتباطا وثيقا بنشاط الميتوكوندريا ووظيفته والإجهاد التأكسدي. فشل الخلايا β الناجم عن خلل الميتوكوندريا هو السمة الأساسية ل T2DM9. الخلايا β الموجودة في الجزر الجزرية مسؤولة عن تصنيع وإفراز الأنسولين ، وهو هرمون ضروري لتنظيم مستويات السكر في الدم. في سياق تطور T2DM ، تعمل وظيفة الميتوكوندريا غير الطبيعية ، وأنواع الأكسجين التفاعلية المدعمة ، وتفاعل الإجهاد التأكسدي على كسر التوازن الديناميكي للميتوكوندريا لخلايا β وتؤثر على إفراز واستقلابالأنسولين 10.
يتكون الطب التبتي Jiangtangle من Berberis kansuensis و Curcumaelongae Rhizoma و Malvae Fructus و Tribuli Fructus و Thlaspi arvense L. و Phyllanthus emblica L. (الشكل 1). إنه مسحوق أصفر ذو رائحة عطرة وطعم مر. يمكن استخدامه لعلاج جفاف الفم ، وكثرة التآكل ، والهزال ، والتبول ، والقدم السكرية ، وحكة الجلد ، وغيرها من الأعراض التي يسببها مرض السكري. أظهرت الأدلة السريرية الحالية أن قلويدات لحاء البرباريس يمكن أن تخفف بشكل فعال T2DM عن طريق خفض نسبة السكر في الدم ، وتحسين مقاومة الأنسولين ، وتقليل الالتهاب11. الكركمين لديه القدرة على تحسين T2DM عن طريق تقليل مستويات الجلوكوز في الدم ، وتعزيز حساسية الأنسولين ، وتعديل ملامح الدهون ، وممارسة تأثيرات مضادة للالتهابات ومضادة للأكسدة12. بالإضافة إلى ذلك ، Malave Fructus و Tribulifructus و Thlaspi arvense L. و Phyllanthus emblica L. لها أيضا نشاط مضاد لمرض السكري أو مضاد للأكسدة13،14،15. في الوقت الحاضر ، لا تزال فعالية وأساس مادي وآلية الطب التبتي Jiangtangle في علاج T2DM غير معلنة. تكوين الطب التبتي الصيني معقد ، وتستند الوقاية منه وعلاجه من الأمراض إلى نظرية تعاطي المخدرات في وجهات نظر شاملة ومنهجية. حاليا ، يمكن للكيمياء الدوائية لمصل المواد الطبية الصينية أن تفسر جزئيا مكونات الامتصاص في الدم وأصبحت وسيلة مهمة لاستكشاف الأساس المادي للأدوية التبتية16. أوضحت هذه الدراسة في البداية التأثير الوقائي للطب التبتي Jiangtangle على الميتوكوندريا في المختبر ، مع التركيز على اختبار الفرضية الجديدة القائلة بأن المصل المحتوي على Jiangtangle يمكن أن يخفف من الخلل الوظيفي للميتوكوندريا في خلايا β جزيرة البنكرياس في الفئران (RIN-m5F) تحت إجهاد الجلوكوز العالي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
وافقت اللجنة الإدارية لشركة Sichuan Scientist Biological Testing Biotechnology Co.، Ltd. على بروتوكول (رقم السجل: SYST-2024-019). تم الاحتفاظ بذكور فئران Sprague Dawley (SD) ، التي تتراوح أعمارها بين 8-10 أسابيع ووزنها 260-300 جم ، في أقفاص تهوية مستقلة في بيئة خاضعة للرقابة تبلغ 23 ± 2 درجة مئوية ورطوبة نسبية 55٪ -60٪ لهذه الدراسة. تم الحصول على هذه المحددة الخالية من مسببات الأمراض من مورد تجاري (انظر جدول المواد). خضعت جميع الفئران لفترة أسبوع واحد من التغذية التكيفية للتأقلم مع البيئة الجديدة قبل بدء التجربة ، مع وصول غير مقيد إلى الماء والغذاء.
التحضير التجريبي
تم تحضير الأدوية والكواشف المطلوبة وفقا لمخطط التدفق التجريبي (انظر جدول المواد). تم استخدام الفئران SPF SD (8-10 أسابيع ، 260-300 جم) في هذه الدراسة. تم شراء جميع من مورد تجاري (انظر جدول المواد). بعد الحجر الصحي ، تم الاحتفاظ بالحيوانات في درجة حرارة ثابتة للغرفة مع دورة فاتحة ومظلمة تبلغ 12:12 ساعة وتغذيت بنظام غذائي قياسي للقوارض والماء.
علاج وجمع الأمصال
تم إعطاء جميع الفئران التي خضعت للتغذية التكيفية الطب التبتي Jiangtangle عن طريق التزقيم لمدة 7 أيام. كانت الجرعة السريرية 0.6 جم / يوم ، والتي تم تحويلها إلى جرعة فئران قدرها 1.26 جم / كجم17. بعد 1 ساعة من آخر إعطاء ، تم تخدير الفئران بالأيزوفلوران بنسبة 3٪ -4٪ للحث و 2٪ للصيانة. ثم تم تأمين الفئران المخدرة على طاولة جراحية ، وتم تطهير موقع الجراحة باليودوفور. تم إجراء شق على طول خط الوسط للبطن لكشف الشريان الأورطي البطني. تم سحب الدم ببطء باستخدام حقنة هيبارينية من الشريان الأورطي (8 مل) ونقله إلى أنبوب طرد مركزي للطرد المركزي. تم الطرد المركزي للدم الذي تم جمعه عند 2360 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لفصل المصل. ثم تم نقل عينات المصل إلى أنابيب مبردة عند 5 مل لكل أنبوب وتخزينها في ثلاجة طبية -80 درجة مئوية (انظر جدول المواد) للتحليل اللاحق.
تحليل UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS
تحضير عينات المواد الطبية: تم وزن الطب التبتي Jiangtangle (140.0 مجم) بدقة وإذابته في 25 مل من الميثانول (انظر جدول المواد) ، متبوعا ب 30 دقيقة صوتنة عند 40 كيلو هرتز ، 300 واط. تم ترشيح المحلول الناتج من خلال غشاء 0.22 ميكرومتر للحصول على عينة الاختبار.
تحضير عينة المصل: تم خلط 100 ميكرولتر من المصل جيدا مع 400 ميكرولتر من الميثانول البارد والأسيتونيتريل (v / v ، 1: 1 ؛ انظر جدول المواد) عن طريق الدوامة. تمت معالجة الخليط عن طريق صوتنة (40 كيلو هرتز ، 300 واط) لمدة 1 ساعة في حمام جليدي. ثم تم تحضين الخليط عند -20 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، وتم طرده عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة عند 14,000 × جم. ثم تم حصاد المواد الطافية وتجفيفها تحت الفراغ لتحليل UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS.
الظروف الكروماتوغرافية: تم قياس المواد الطفية بواسطة نظام UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS (انظر جدول المواد). لفصل LC ، تم استخدام عمود ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 مم × 100 مم ، 1.8 ميكرومتر). تتكون المرحلة المتحركة من A (0.1٪ حمض الفورميك في الماء) و B (100٪ أسيتونيتريل). كان معدل التدفق 0.3 مل / دقيقة ، مع برنامج تدرج محدد من 5٪ -95٪ B (0-30 دقيقة) ، 95٪ B (30-35 دقيقة). كان حجم الحقن 5 ميكرولتر. تم الحصول على بيانات MS في وضعي ESI الإيجابي والسلبي بشكل منفصل. وضع مصدر HESI شروطا لجهد الرش ، ودرجة الحرارة الشعرية ، وتدفقات الغاز ، وما إلى ذلك. تم مسح الجهاز ضوئيا على مدى m / z 70-1050 Da ، بدقة مختلفة ل MS و MS / MS الكامل. تمت معالجة بيانات MS الأولية باستخدام MS-DIAL لمحاذاة الذروة. تم تحديد تكوين الطب التبتي Jiangtangle من خلال بيانات دقيقة عن الكتلة ومرض التصلب العصبي المتعدد / التصلب العصبي المتعدد مقابل قواعد البيانات العامة. تم الاحتفاظ فقط بالمتغيرات التي تحتوي على أكثر من 50٪ من القيم غير الصفرية في مجموعة واحدة على الأقل.
زراعة الخلايا وعلاجها
تمت زراعة خلايا RIN-m5F (انظر جدول المواد) باستخدام وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) ، و 10٪ مصل بقري جنيني ، و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين في حاضنة CO2 الخاضعة للرقابة بنسبة 5٪ (انظر جدول المواد) عند 37 درجة مئوية. تم أخذ خلايا RIN-m5F في مرحلة النمو اللوغاريتمي ، وعدادها بعد الهضم ، وتلقيحها في 96 لوحة بئر مع 1 × 105 الخلايا لكل بئر. باستخدام 10-60 ملي مولار جلوكوز ، تم إجراء تحريض الخلايا لتقليد بيئة الجلوكوز العالية ل T2DM. تم تقسيم خلايا RIN-m5F إلى مجموعات مصل تحكم ونموذج و 2.5٪ و 5٪ و 10٪ تحتوي على Jiangtangle. عولجت الخلايا في المجموعة الضابطة ب DMEM ، وتم تحفيز مجموعات أخرى ب DMEM الذي يحتوي على الجلوكوز لمدة 24 ساعة. تمت إضافة مجموعات التحكم والنموذج مع متوسط ، بينما تمت إضافة كل مجموعة مصل مع DMEM يحتوي على 2.5٪ و 5٪ و 10٪ مصل يحتوي على Jiangtangle ، وتم تحضينها لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
تحليل CCK 8
تم قياس صلاحية الخلية بواسطة CCK 8 (انظر جدول المواد). تم تلقيح خلايا RIN-m5F في ألواح 96 بئرا ومعالجتها بالجلوكوز (0 و 10 و 20 و 30 و 40 و 50 و 60 مليمتر). بعد ذلك ، تمت إضافة 100 ميكرولتر من DMEM مع مصل يحتوي على Jiangtangle إلى الآبار واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة. تضمنت كل مجموعة 6 آبار مكررة. بعد 24 ساعة من الحضانة مع الجلوكوز و 24 ساعة من الحضانة مع مصل يحتوي على Jiangtangle ، تمت إضافة 10 ميكرولتر من محلول CCK 8 وتحضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة أخرى. تم استخدام قارئ صفيحة دقيقة بطول موجي كامل (انظر جدول المواد) للكشف عن قيم الامتصاص لكل ثقب عند 450 نانومتر16.
تحليل وظيفة الميتوكوندريا
كما ذكرناسابقا 18 ، تم استخدام محلل Seahorse XFe 24 (انظر جدول المواد) لتقييم معدل إنتاج ATP في الوقت الفعلي ومعدل تحلل السكر. تم تلقيح خلايا RIN-m5F في صفيحات دقيقة من Seahorse XFe24 V24. تم زرع الخلايا في ألواح زراعة الخلايا XF24 باستخدام بروتوكول من خطوتين: تم توزيع 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر ، وتركت اللوحة دون إزعاج لمدة ساعة واحدة. ثم تم نقل اللوحة إلى حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 4 ساعات لتعزيز التعلق الأولي. بعد ذلك ، تمت إضافة 150 ميكرولتر DMEM إلى كل بئر. بعد النمذجة لمدة 24 ساعة وإعطاء الدواء لمدة 24 ساعة ، تم تحضير محلول الكشف عن طريق إضافة 1٪ جلوكوز و 1٪ بيروفات و 1٪ جلوتامين إلى وسط Seahorse XF DMEM. بعد ذلك ، تم غسل الخلايا مرتين بمحلول كشف 1 مل. لاستخدام مجموعة قياس معدل ATP في الوقت الفعلي ومجموعة فحص معدل تحلل السكر ، تم تعليق 56 ميكرولتر من oligomycin و 62 ميكرولتر من الروتينون / antimycin A وإضافتها إلى آبار خرطوشة المستشعر A و B ، على التوالي. وتم وضع لوحة زراعة الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا الخالية من ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 60 دقيقة. أخيرا ، تمت مراقبة معدل إنتاج ATP ومعدل تحلل السكر في الوقت الفعلي بواسطة نظام الحقن التلقائي. أجريت جميع التجارب عند 37 درجة مئوية ، وتم تحليل البيانات باستخدام برنامج XF Wave19.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
أظهر UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS أن الطب التبتي Jiangtangle يحتوي على مركبات مثل الفينولات والقلويدات والفلافونويد والنيوكليوسيدات والأحماض العضوية والأحماض الأمينية والتربينويدات والكومارين والجليكوسيدات والعفص والقشور والمنشطات وغيرها. (الشكل 2 ، الجدول 1). تم إعطاء الفئران SD عن طريق الفم 1.26 جم / كجم من الطب التبتي Jiangtangle مرة واحدة في اليوم. يتم تقديم نظرة عامة على استراتيجية بوابات المصل في الشكل 3. كشف الم...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
ينظر إلى T2DM بشكل عام على أنه مرض استقلابي مزمن مع بداية خفية وانتشار مرتفع ، ويرافقه العديد من المضاعفات المرتبطة بمرض السكري مثل العيون والقلب والأوعية الدموية والخلل الوظيفي الكلوي20،21،22،23. تشمل مظاهره السريرية ارتفاع نسبة السكر في الدم ، وتعدد مرات التبول ، وكثرة التآكل ، وفقدان الوزن ، وحتى العمى ، مما يهدد حياة الناس وصحتهمبشكل خطير ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.
تم دعم هذا العمل من قبل مشروع البناء الدلالي للخطة الخمسية الرابعة عشرة لجامعة الطب التبتي (2023ZYYGH05) وقسم العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة سيتشوان (2024NSFSC1845). وفي الوقت نفسه ، يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور لو يانغ ، مهندس معدات أول في المعهد المبتكر للطب الصيني و Phamacy / Academy for Interdiscipline ، على تقديم الخدمات الفنية لتقنيات Seahorse XF.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| -80 ° ثلاجة طبية سي | ميذر | MDF-86H118 | |
| 0.22 & م غشاء مائي | Jinteng | JTMF0445 | |
| 0.22 & micro ؛ غشاء مرشح صغير يسهل اختراقه من نوع إبرة | م Jinteng | JTSFM013001 | |
| Acetonitrile | علاء الدين | A104440 | |
| برنامج Agilent OpenLab | Agilent | الإصدار 2.X | |
| خزانة السلامة الحيوية | Airtech | BSC-1004 II A2 | |
| مجموعة عد الخلايا -8 | Bioground | BG0025 | |
| CelMate CO2< / sub> حاضنة | Esco Micro Pte Ltd. | CLM-240B-8 | |
| العمود الكروماتوغرافي | Agilent | SB-C18< / sub> | |
| decolorization shaker | Kylin-Bell | TS-2 | |
| Dulbecco المتوسط | المعدل Gibco | 8121587 | |
| Electrophoreses buffer | NCM Biotech | 20230801 | |
| حمض الفورميك | علاء | الدين F298778 | |
| الجلوكوز | تشنغدو Herbpurify المحدودة | P012-180-180222 | |
| برنامج GraphPad Prism | برنامج GraphPad ، LLC | الإصدار 9.5.1 | |
| جهاز طرد مركزي مبرد عالي السرعة | Thermo Fisher Scientific | Legend Micro 17R | |
| جهاز طرد مركزي منخفض السرعة | Hallon | NH5 | |
| ميثانول | علاء الدين | M116118 | |
| البنسلين ستربتومايسين | NCM Biotech | C125C5 | |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (1 & مرات ؛) | Gibco | 8120485 | |
| جرذ جزيرة البنكرياس & بيتا ؛ خلايا | ATCC | CRL-11605 | |
| ReadMax 1500 امتصاص الضوء إنزيم الطول الموجي الكامل ؛ | Flash ReadMax | 1500 | |
| Seahorse XF طقم فحص معدل تحلل السكر | Agilent | 103344-100 | |
| Seahorse XF في الوقت الحقيقي طقم قياس معدل ATP | Agilent | 103592-100 | |
| Seahorse XFe 24 محلل | Agilent | XFe24 | |
| Trypsin (0.25٪ ، 1 & times;) | محلل HyClone | J210045 | |
| UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS | خلاط دوامة حراري علمي | QE Q | |
| Kylin-Bell | XW-80A |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
