مقالة منهجية

استكشاف الأحداث الخلوية المتسلسلة للبلعمة الناجمة عن Godanti Bhasma في خلايا الثدييات

DOI:

10.3791/68321

⸱

يوليو 11, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Shobhit Institute of Engineering & Technology

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه الدراسة المعالجة البلعمية لجزيئات جودانتي باسما (GB) في خلايا الثدييات ، وتميز امتصاصها الخلوي ، وديناميكيات الفجوة ، والتحمض ، والتدهور. لا تعزز هذه النتائج فهمنا لآليات البلعمة الأساسية فحسب ، بل تؤسس أيضا GB كنظام نموذجي واعد لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البلعمة هي آلية خلوية حيوية تبتلع الخلايا من خلالها وتتحلل الجزيئات الغريبة أو مسببات الأمراض أو الحطام ، وتلعب دورا رئيسيا في الدفاع المناعي والحفاظ على توازن الأنسجة. ترتبط الاضطرابات في هذه العملية بأمراض مختلفة. لاستكشاف الأحداث المعقدة التي ينطوي عليها مسار البلعمة ، من الضروري الجسيمات الذكية المتقدمة وتقنيات المراقبة الفعالة. جودانتي باسما (GB) ، وهو دواء هندي تقليدي يتكون من جزيئات كبريتات الكالسيوم النشطة بيولوجيا ، يتم استيعابه بسرعة عن طريق البلعمة في خلايا الثدييات ، مما يؤدي إلى تفريغ سيتوبلازمي كبير. تم تقييم المراحل الرئيسية للبلعمة الناجمة عن GBهنا باستخدام قياس التدفق الخلوي (FC) ، وتصوير الخلايا الحية ، وتقنيات تلطيخ محددة. أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي تكوين هياكل تشبه الكوب البلعمي المرتبطة باستيعاب الجسيمات. أتاح تصوير الخلايا الحية المراقبة في الوقت الفعلي لعمليات البلعمة ، بما في ذلك امتصاص الجسيمات ، وتكوين الفجوة ، وتدهور المواد المبتلعة ، ودوران الفراغ. تم استخدام التلوين باللون الأحمر المحايد والبرتقالي الأكريدين لتقييم التحمض الفراغي. ومن المثير للاهتمام ، أن العلاج بمثبط اللايزوزومات BFA1 في الخلايا المعالجة ب GB لم يؤد إلى التفريغ ، كما يتضح من عدم امتصاص اللون الأحمر المحايد ، مع التأكيد على ضرورة وجود بيئة حمضية لحدوث الفراغ. تؤكد هذه النتائج على إمكانات البلعمة الناجمة عن GBكنموذج لتوضيح الأحداث الخلوية المتسلسلة التي تنطوي عليها هذه العملية ، وهو أمر بالغ الأهمية لفهم تفاعلات المضيف والممرض ، والاتجار داخل الخلايا ، وتطوير استراتيجيات علاجية مبتكرة للاضطرابات المتعلقة بالبلعمة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البلعمة هي عملية خلوية أساسية تقوم بها الخلايا البلعمية المهنية المقيمة في الأنسجة ، مثل البلاعم والخلايا المتغصنة ، وكذلك الخلايا البلعمية غير المهنية ، مثل الخلايا الظهارية والخلايا الليفية ، التي تبتلع وتتحلل الجزيئات الغريبة. تستوعب هذه الخلايا وتقضي على الجزيئات الغريبة أو مسببات الأمراض أو الحطام الخلوي ، مما يساهم بشكل كبير في الدفاع المناعي وتوازن الأنسجة1. تبدأ هذه العملية بالتعرف على مسببات الأمراض أو الحطام أو الجسيمات من خلال مستقبلات التعرف على الأنماط (PRRs) ، مثل المستقبلات الشبيهة بالحصيلة (TLRs) ، والتي ترتبط بالأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض (PAMPs)2. يؤدي هذا التعرف إلى تكوين كوب بلعمي ، حيث تمتد نتوءات غشاء البلازما حول الجسيم المستهدف3. تلعب خيوط الأكتين دورا مهما في هذه الخطوة ، حيث تقود إعادة تشكيل الغشاء اللازمة لابتلاع الجسيمات4. بمجرد أن يتم إحاطة الجسيم في البلعمة ، يتم تشكيل حويصلة مرتبطة بالغشاء. يخضع البلعمة للنضج ، الذي يتميز بالاندماج مع الجسيمات الداخلية المبكرة ، ثم المتأخرة ، يليه دمج الجسيمات الحالة التي تحتوي على إنزيمات تحللمائي 5. يتم تنشيط هذه الإنزيمات ، مثل الكاثيبسين والليزوزيم والنوكليازات ، عن طريق التحمض داخل البلعمة ، والذي يحققه فراغ ATPase (V-ATPase) ، مما يؤدي إلى خفض الرقم الهيدروجيني إلى 4.5-5.5. تنتهي العملية المتدهورة بإفراز الخلايا من بقايا الخلية. يمكن أن تؤدي الاختلالات الوظيفية في هذه العملية الديناميكية والمعقدة إلى تحديات مناعية كبيرة6،7،8.

لتقييم العملية الخلوية المعقدة للبلعمة بدقة ، هناك حاجة إلى طرق محسنة وسهلة لمراقبة الأحداث الخلوية الرئيسية للبلعمة. تقليديا ، تتضمن طريقة مراقبة القياس الكمي للبلعمة تقنيات مثل تثبيت الخلايا البلعمية على فترات زمنية محددة مسبقا للتصور المجهري ، وقياس استيعاب الأهداف المسماة بالصبغة من خلال التصوير أو قياس التدفق الخلوي أو حساب عدد الخلايا المستهدفة المتبقية بعد مدة محددة من البلعمة ، ومع ذلك ، فإن هذه الطرق لا تلتقط التقلبات الدقيقة بالدقيقة التي تحدث أثناء عملية البلعمة9. علاوة على ذلك ، قد لا تعكس الطرق التي تعتمد على مؤشرات غير مباشرة مثل امتصاص الصبغة بدقة أحداث البلعمة الفعلية بسبب نقل الصبغة السلبيالمحتمل 10.

أحدثت التطورات الحديثة في تصوير الخلايا الحية وقياس التدفق الخلوي وتقنيات التلوين ثورة في قدرتنا على مراقبة البلعمة بدقة زمانية مكانية عالية. يتيح تصوير الخلايا الحية ، على سبيل المثال ، المراقبة المستمرة للعمليات الديناميكية مع تتبع الأحداث المتسلسلة11. يستخدم قياس التدفق الخلوي على نطاق واسع لتحليل خلايا الثدييات والكشف عن المؤشرات الحيوية في الأبحاث السريرية12. ومع ذلك ، فإن طرق FC التقليدية غير مجهزة لتقييم الخصائص المورفولوجية والمكانية للخلايا الفردية12. يعمل قياس التدفق الخلوي للتصوير (IFC) كبديل قوي يتيح جمع المعلومات التفصيلية من الخلايا المفردة. تجمع مؤسسة التمويل الدولية بين القدرات التحليلية لقياس التدفق الخلوي والتصوير عالي الدقة ، مما يسمح بتحليل الخلية المفردة بالتفاصيل المورفولوجية والمكانية. تستخدم الجسيمات المختلفة ، بما في ذلك حبات اللاتكس الفلورية ، والزيموسان APC ، والجسيمات النانوية الاصطناعية ، بشكل شائع لدراسة البلعمة ، مما يوفر رؤى حول مشاركة المستقبلات ، وتكوين البلعمة ، والاستجابات المناعية12.

على عكس التقنيات الكيميائية الحيوية التقليدية ، التي تعتمد عادة على تحليل نقطة النهاية ، يوفر تصوير الخلايا الحية مراقبة مستمرة وديناميكية للعمليات الخلوية. توفر هذه الطريقة دقة زمانية مكانية عالية والقدرة على مراقبة الأحداث المتسلسلة في البلعمة. نتيجة لذلك ، فهي أداة قوية لدراسة العملية المعقدة للبلعمة ، مما يسمح برؤى أكثر دقة وتفصيلا حول السلوكيات والآليات الخلوية13.

بالإضافة إلى التقدم في أنظمة التصوير ، هناك حاجة إلى جزيئات البلعمة الذكية التي يمكنها تسليط الضوء بوضوح على أحداث البلعمة ، لا سيما خطوات التحلل التي تحدث داخل البلعمة. غالبا ما تستخدم دراسات البلعمة جزيئات مثل حبات اللاتكس ، والزيموسان ، والبكتيريا ، والخلايا المبرمجة ، والجسيمات النانوية الاصطناعية لاستكشاف آليات مثل اشتباك المستقبلات ، وتكوين البلعمة ، والاستجابات المناعية. في حين أن هذه الجسيمات توفر رؤى قيمة ، إلا أن لها قيودا في تتبع عملية التحلل الكاملة أو التقييم المباشر لنضج البلعمة. على سبيل المثال ، حبات اللاتكس غير قابلة للتحلل البيولوجي ولا يمكنها إثبات التحلل ، بينما غالبا ما تتطلب الزيموزان والبكتيريا ملصقات معقدة وقد لا تنتج ملفات تعريف تحللمتسقة 14،15.

أظهرت دراستنا السابقة فائدة GB، وهي تركيبة أيورفيدا تقليدية تتكون أساسا من كبريتات الكالسيوم، كجسيم مثالي لدراسة نضوج البلعمةوتدهورها 16. يذوب GB بمرور الوقت داخل البيئة الحمضية للبلعمة ، مما يسمح بتصور واضح لتدهور الجسيمات. علاوة على ذلك ، فإن قدرة GB على تحفيز تكوين فجوة قوية تسهل التحقيق في المراحل المتميزة لنضج البلعمة ، من التكوين المبكر إلى التحمض والحل النهائي. على عكس الجسيمات الأخرى ، يلغي GB الحاجة إلى وضع العلامات الخارجية ، مما يوفر نظاما مستداما ذاتيا لدراسة دورة الحياة الكاملة للبلعمة ، مما يجعله نموذجا مثاليا لفهم ديناميكيات البلعمة والاضطرابات المرتبطةبها 16.

تقدم هذه الدراسة بروتوكولا موحدا وقابلا للتكرار مصمما لتقييم البلعمة الناجمة عن الجسيمات وتكوين الفجوة باستخدام Godanti Bhasma (GB) في كل من خطوط الخلايا البلعمية المهنية (RAW 264.7) وغير المهنية (HeLa و 3T3-L1). الهدف العام من هذه الطريقة هو توفير منصة قوية لدراسة آليات الامتصاص الخلوي ، والتكوين الحيوي الفراغي ، ومعالجة الجسيمات داخل الخلايا عبر أنواع الخلايا المختلفة. تم تعليق GB في DMEM بتركيز 10 مجم / مل ، ولضمان التوحيد ، سمح للجزيئات الأكبر حجما بالاستقرار بينما تم جمع الجزء العلوي للاستخدام التجريبي. بالنسبة لمقايسات قياس التدفق الخلوي ، تم زرع الخلايا بكثافة 2 × 105 خلايا لكل بئر في ألواح مكونة من 12 بئرا ، وأضيف 300 ميكرولتر من تعليق العمل GB إلى كل بئر. بالنسبة للتحليلات القائمة على التصوير ، تم زرع 5,000-10,000 خلية لكل بئر في ألواح 96 بئرا أو على شرائح الغرفة. تؤسس هذه الطريقة GB كنموذج موثوق به للتحقيق في تكوين الفجوة واستيعاب الجسيمات في أنواع الخلايا المتنوعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. زراعة الخلايا والبذر

  1. تحضير وسط DMEM كامل مكمل بنسبة 10٪ FBS معطل للحرارة والمضادات الحيوية (100 ميكروغرام / مل بنسلين ، 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين). تعقيم جميع الكواشف والمعدات قبل الاستخدام.
  2. استزراع خلايا 3T3-L1 و HeLa و RAW 264.7 في قوارير2 مقاس 25 سم وأطباق استزراع 35 مم باستخدام DMEM. حافظ على المزارع عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 واستبدل الوسط كل 48 ساعة.
  3. للزراعة الفرعية ، اغسل الخلايا 2x باستخدام PBS ، ثم افصل الخلايا الملتصقة باستخدام 500 ميكرولتر من Trypsin-EDTA واحتضانها لمدة 5 دقائق. أضف 1 مل من DMEM لتحييد محلول Trypsin-EDTA ، والماصة لإنشاء تعليق أحادي الخلية ، واضبط الحجم إلى 10 مل باستخدام DMEM الجديد. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من الوسط الطازج.
  4. امزج 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 0.4٪ تريبان بلو (1: 1) ، عد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس كثافة الدم ، واحسب الكثافة على أنها خلايا / مل = متوسط عدد × 104 × 2.
  5. بالنسبة للألواح المكونة من 96 بئرا: قم بتوزيع 100 ميكرولتر من معلق الخلية (الذي يحتوي على 10,000 خلية) في كل بئر. بالنسبة لشرائح التجويف ، قم بزرع 50 ميكرولتر من معلق الخلية (الذي يحتوي على 5000 خلية) في تجاويف ، تاركا التجويف الأوسط فارغا. أضف 50 ميكرولتر من DMEM إلى كل من التجاويف المصنفة.
  6. احتضان الألواح والشرائح عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة للسماح بالتصاق الخلية واستقرارها. افحص الخلايا تحت المجهر المقلوب بتكبير 20 ضعفا لتقييم التشكل والالتقاء والتلوث قبل متابعة التجارب.

2. تحضير محلول / كوكتيل مخزون GB لزراعة الخلايا

  1. شراء GB ووزن 100 مجم من المسحوق بدقة. المسحوق في 10 مل من DMEM المكمل بمصل الأبقار الجنينية 10٪ (FBS) و 1٪ بنسلين ستربتومايسين.
  2. قم بتدوير التعليق واتركه يقف لمدة 1 دقيقة للسماح للجزيئات الكبيرة بالاستقرار. ثم انقل الجزء العلوي من 5 مل من التعليق إلى أنبوب طرد مركزي معقم.
  3. قم بتعيين معلق GB المحضر سعة 5 مل كحل مخزون لتجارب زراعة الخلايا اللاحقة. قم بدوامة التعليق جيدا لضمان تشتت الجسيمات بشكل متساو قبل إضافتها إلى الخلايا.

3. تحليل قياس التدفق الخلوي

  1. حصاد خلايا RAW 264.7 أو HeLa أو 3T3-L1 عن طريق التربسين ، وتحييد باستخدام DMEM كامل ، وجهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، وإعادة تعليقه في 1 مل من الوسط الطازج ، وخلط 10 ميكرولتر مع 0.4٪ تريبان بلو (1: 1) ، وعد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس كثافة الدم ، وحساب الكثافة واضبطها على 2 × 105 خلايا / مل.
  2. بذرة 2 × 105 خلايا لكل بئر في صفيحة من 12 بئرا وزراعتها لمدة 24 ساعة. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  3. عالج الخلايا بتعليق GB (300 ميكرولتر لكل بئر) لفترات مختلفة: 30 دقيقة و 1 ساعة و 12 ساعة. بعد العلاج ، اغسل الخلايا 5 مرات باستخدام PBS لإزالة الجزيئات الزائدة.
  4. قم بتربسين الخلايا كما في الخطوة 1.3 واغسلها جيدا باستخدام PBS. قم بتحميل التعليق المجهز في منفذ العينة لمقياس التدفق الخلوي. قم بتشغيل البرنامج وحدد إعدادات الاستحواذ المناسبة. اختر وضع المجال الساطع للتصوير.
  5. ابدأ الحصول على البيانات بالنقر فوق تشغيل في البرنامج. احصل على بيانات لما لا يقل عن 10,000 حدث حيث يلتقط النظام صورا للخلايا الفردية التي تمر عبر خلية التدفق.
  6. استخدم مخططات مبعثرة المساحة مقابل نسبة العرض إلى الارتفاع لبوابة خلايا واحدة سليمة. يساعد هذا في استبعاد المجموعات المزدوجة والمجموعات. عرض الصور المقابلة في مكتبة الصور. اجمع صور الخلايا الفردية من مكتبة صور البرنامج لدراسة التغيرات المورفولوجية الناجمة عن العلاج.
  7. لتحليل الجسيمات ، قم بالبذور 2 × 105 خلايا لكل بئر في ألواح ذات 12 بئرا وزراعتها لمدة 24 ساعة. عالج الخلايا بتعليق GB (300 ميكرولتر لكل بئر) لفترات مختلفة: 1 ساعة و 7 ساعات و 14 ساعة و 24 ساعة.
  8. بعد العلاج ، رج لوحة الثقافة برفق لمدة 1 دقيقة واجمع وسائط الثقافة في أنابيب سعة 1.5 مل. اغسل الخلايا 5 مرات باستخدام PBS لإزالة أي جزيئات خارج الخلية.
  9. أضف 500 ميكرولتر من محلول RIPA (20 ملي مولار Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني 7.5 ؛ 150 ملي كلوريد الصوديوم ؛ 0.1٪ تريتون X-100 ؛ 1٪ ديوكسيكولات الصوديوم) لتحلل الخلايا تماما.
  10. قم بتشغيل وسط الاستزراع وعينات الخلايا المحللة التي تحتوي على جزيئات بشكل منفصل من خلال مقياس التدفق الخلوي. قم بتحميل العينات في منفذ العينة الخاص بالنظام. قم بتشغيل البرنامج وحدد إعدادات الاستحواذ المناسبة. اختر وضع المجال الساطع لتحليل الجسيمات.
  11. ابدأ الحصول على البيانات بالنقر فوق تشغيل في البرنامج. احصل على بيانات لما لا يقل عن 20,000 حدث حيث يلتقط النظام صورا للجسيمات الفردية التي تمر عبر خلية التدفق.
  12. استخدم مخططات مبعثرة المساحة مقابل نسبة العرض إلى الارتفاع لبوابة جميع الجسيمات. استخدم أدوات مخطط المبعثر لتحليل عدد الجسيمات.

4. الفحص المجهري بفاصل زمني

  1. زراعة خلايا 3T3-L1 (3.0 × 104) في طبق 35 مم مع 2 مل من DMEM عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 حتى تصل إلى 70٪ التقاء.
  2. امزج 300 ميكرولتر من تعليق GB جيدا في وسط الثقافة الطازج الدافئ مسبقا سعة 2 مل ثم ضع طبق الثقافة مع الخلايا وGB ، في مرحلة مجهر التصوير.
  3. حدد الهدف 10x. قم بتشغيل إضاءة المجال الساطع باستخدام الزر Bright. انقر على الفيلم زر للدخول إلى وضع اللقطات المتتابعة. اضبط وقت الفاصل الزمني على 5 دقائق. ابدأ التسجيل بالنقر فوق الزر Rec .
  4. التقط الصور كل 5 دقائق لمدة 16 ساعة إلى 24 ساعة، مما يضمن التصوير المستمر في ظل الظروف القياسية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون.
  5. استخدم برنامج ImageJ لتجميع الصور الملتقطة في فيديو بفاصل زمني. تسمح هذه التقنية بالتمايز بين مراحل مختلفة من البلعمة ، من الاستيعاب إلى التحلل الكامل للجزيئات.

5. تلطيخ أحمر محايد

  1. بعد 24 ساعة من نمو الخلايا في ألواح 96 بئرا وشرائح تجويف ، قم بخلط مخزون تعليق جسيمات GB جيدا وأضف 30 ميكرولتر من التعليق إلى كل بئر أو تجويف.
  2. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة للحث على تكوين الفجوة. استخدم الآبار أو التجاويف غير المعالجة كعناصر تحكم سلبية.
  3. للحصول على تلطيخ أحمر محايد (NR) ، قم بإعداد محلول 0.5 مجم / مل NR في DMEM الخالي من المصل ، وقم بتصفيته من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر.
  4. لتصوير الفجوات في ألواح 96 بئرا وشريحة تجويف: قم بإزالة الوسائط ، وأضف 60 ميكرولتر من صبغة NR ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. اغسل 3x باستخدام PBS لإزالة الصبغة الزائدة ثم تابع التصوير المجهري.
  5. افحص الفجوات تحت المجهر باستخدام هدف 20x ، لتقييم الحجم والتشكل وعدد الفجوات.

6. العلاج بالبافيلومايسين A1 لتكوين الفجوة وتثبيط التحمض

  1. تحضير محلول مخزون من Bafilomycin A1 (BFA1) بتركيز 100 ميكروغرام / مل (160.5 نانومتر) عن طريق إذابة 100 ميكروغرام من BFA في 50 ميكرولتر من DMSO ، متبوعا بالتخفيف في 950 ميكرولتر من DMEM. قم بتخفيف 1 ميكرولتر من هذا المخزون في 1.6 مل من DMEM للحصول على محلول عملي يبلغ 0.1 نانومتر.
  2. تخلط جيدا وتضاف 100 ميكرولتر من محلول BFA العامل إلى الآبار التي تحتوي على خلايا في ألواح 96 بئرا. أضف أيضا 30 ميكرولتر من تعليق جسيمات GB لتقييم تثبيط تكوين الفجوة والبلعمة.
  3. لتثبيط تحمض البلعمة ، أضف 100 ميكرولتر من محلول BFA العامل إلى الآبار ذات الفجوات المشكلة مسبقا (المعالجة سابقا بجزيئات GB). احتضان جميع الآبار عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة.
  4. أضف 60 ميكرولتر من صبغة Neutral Red (NR) إلى كل بئر ، واحتضن لمدة 15 دقيقة إضافية ، وقم بتحليل تكوين الفجوة وتحمضها.

7. تلطيخ برتقالي أكريدين (AO)

  1. عالج الخلايا المزروعة في شرائح التجويف ب 50 ميكرولتر من GB واحتضانها طوال الليل في ظل الظروف التجريبية القياسية.
  2. بعد العلاج ، احتضان الخلايا بمحلول برتقالي أكريدين (1 مجم / مل) لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية لتمكين التلوين الانتقائي للفجوات والعضيات الحويصلية الحمضية.
  3. اغسل الخلايا 3 مرات بمحلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) لإزالة الصبغة غير المرتبطة وتقليل مضان الخلفية.
  4. قم بتحليل الشرائح بسرعة باستخدام مجهر مضان مجهز بهدف 20x ونطاق مرشح إثارة أزرق من 450-492 نانومتر ، لتقييم التشكل الخلوي وامتصاص الأكريدين البرتقالي ، مما سيوفر رؤى حول ديناميكيات الفراغ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تسلط الدراسة الضوء على الاستجابات الخلوية الرئيسية لجزيئات GB في خلايا الثدييات. استخدمنا مقياس تدفق التصوير الخلوي للتحقيق في استيعاب جزيئات GB في خلايا 3T3-L1 (الشكل 1). تعرضت الخلايا للجزيئات لفترات تتراوح من 30 دقيقة إلى 12 ساعة. بعد 30 دقيقة ، لاحظنا الجسيمات على سطح الخلية (الشكل 1 ب) ، وبدأ غشاء الخلية في الانحناء إلى الداخل في مواقع التعلق ، مما يشير إلى بدء الاستيعاب (الشكل 1 ج). يتشكل امتداد غشاء دائري ، من المحتمل أن يكون...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعمل البلعمة كآلية دفاع مناعية حاسمة ، مما يتيح الابتلاع والقضاء اللاحق على الجسيمات ومسببات الأمراض والخلايا المبرمجة. لفهم عمليات تكوين البلعمة ونضجها ، تعد الجسيمات الذكية المتوافقة حيويا جنبا إلى جنب مع تقنيات التصوير المتقدمة ضرورية لدراسة الأحداث الديناميكية مثل تقدم الفراغ وتحمض وتدهور المواد المبتلعة18،19. استخدمنا GB ، وهو جسيم نموذجي متوافق حيويا ، لنظام فحص البلعمة. كشف تحليل المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) أن جسيمات GB...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا البحث من قبل منحة البحث الأساسية لمجلس أبحاث العلوم والهندسة (SERB) (CRG / 2022 / 009045) ، وزارة العلوم والتكنولوجيا ، حكومة الهند.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
25 سم2 قوارير ثقافةNEST, الهند707001
لوحات 96 و 6 آبارTarsons India Pvt. Ltd. ، كولكاتا ، الهند ؛ ثيرمو ساينتيك ، الهند980040; 140675
أكريدين برتقالSRL, الهند82407
المضادات الحيوية ومحلول التربسين-EDTAهاي ميديا ، الهند628242; 655111
خطوط الخلايا- HeLa و 3T3-L1 و RAW-264.7المركز الوطني لعلوم الخلايا (NCCS) ، بيون ، ماهاراسترا
أطباق ثقافة (35 ملم)  SPL Lifesciences ، الهند101350
دولبيكو s وسط النسر المعدل (DMEM)MP Biomedicles ، الهند1033126
مصل الأبقار الجنينية (FBS)هاي ميديا ، الهند651257
مقياس التدفق الخلويميليبور ، الولايات المتحدة الأمريكيةأمنيسمقاييس تدفق الخلايا لتصوير Amnis ،
مجهر الفلورسنتمختبر DiGi ، الهندالموديل: DiGi 110 Infinity
جودانتي بهاسماباتانجالي أيورفيد240002
صبغة حمراء محايدةCDH, الهند593630
مجهر الفاصل الزمنيNanoEnTek Inc.  سيول ، كوريا.جوليمحلل الخلايا الفلورية الذكية JuLi,
مجهر الفاصل الزمنيليدز مايكرو إيما. المملكة المتحدةS.No. LIM225552358A58EA PRIME مجهر مقلوب

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. B. Phagocytosis and comparative innate immunity: learning on the fly. Nat Rev Immunol. 8 (2), 131-141 (2008).
  2. Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nat Rev Immunol. 12 (7), 492-502 (2012).
  3. Gordon, S. Phagocytosis: An immunobiologic process. Immunity. 44 (3), 463-475 (2016).
  4. Flannagan, R. S., Jaumouillé, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu Rev Pathol Mech Dis. 7, 61-98 (2012).
  5. Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: Going through the acid test. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (10), 781-795 (2008).
  6. Segal, A. W. How neutrophils kill microbes. Annu Rev Immunol. 23, 197-223 (2005).
  7. Huynh, K. K., Grinstein, S. Regulation of vacuolar pH and its modulation by some microbial species. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (3), 452-462 (2007).
  8. Méresse, S., Gorvel, J. P., Chavrier, P. The rab7 GTPase resides on a vesicular compartment connected to lysosomes. J Cell Sci. 112 (21), 3195-3204 (1999).
  9. Caponegro, M. D., Thompson, K. K., Tayyab, M., Tsirka, S. E. A Rigorous Quantitative Approach to Analyzing Phagocytosis Assays. Bio Protoc. 10 (15), e3698(2020).
  10. de Neergaard, T., Sundwall, M., Wrighton, S., Nordenfelt, P. High-Sensitivity Assessment of Phagocytosis by Persistent Association-Based Normalization. J Immunol. 206 (1), 214-224 (2021).
  11. Chu, C. C., et al. High-resolution quantification of discrete phagocytic events by live cell time-lapse high-content microscopy imaging. J Cell Sci. 133 (5), jcs237883(2020).
  12. Park, Y., et al. Imaging Flow Cytometry Protocols for Examining Phagocytosis of Microplastics and Bioparticles by Immune Cells of Aquatic Animals. Front Immunol. 11, 203(2020).
  13. Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage phagocytosis. Biochem Pharmacol. 116, 107-119 (2016).
  14. Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes. Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).
  15. Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. Pathways of antigen processing. Annu Rev Immunol. 31, 443-473 (2013).
  16. Das, S. K., et al. Godanti bhasma (anhydrous CaSO4) induces massive cytoplasmic vacuolation in mammalian cells: A model for phagocytosis assay. Methods. 230, 158-168 (2024).
  17. Huss, M., et al. Proton translocation by V-ATPase: molecular mechanism and target for inhibition by Bafilomycin A1. J Bioenerg Biomembr. 34, 243-250 (2002).
  18. Méndez-Alejandre, A., Raymond, B. B. A., Trost, M., Marín-Rubio, J. L. Bi-functional particles for real-time phagosome acidification and proteolysis multiplex assay in macrophages. Front Immunol. 14, 1204223(2023).
  19. Lancaster, C. E., et al. Phagosome resolution regenerates lysosomes and maintains the degradative capacity in phagocytes. J Cell Biol. 220 (9), e202005072(2021).
  20. Krendel, M., Gauthier, N. C. Building the phagocytic cup on an actin scaffold. Curr Opin Cell Biol. 77, 102112(2022).
  21. Barger, S. R., et al. Membrane-cytoskeletal crosstalk mediated by myosin-I regulates adhesion turnover during phagocytosis. Nat Commun. 10 (1), 1249(2019).
  22. Ghosh, M., et al. Quantitative determination of phagocytosis using pH-sensitive fluorescent bioparticles. J Vis Exp. (125), e56093(2017).
  23. Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G. Visualizing the Early Stages of Phagocytosis. J Vis Exp. (120), e54646(2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة