يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

يكشف RNA-Seq عن مسار تمايز الخلايا Th17 كآلية لإصابة الدماغ الناجمة عن الإشعاع

561 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68322

⸱

يونيو 20, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Institute of Radiation Medicine

في هذه المقالة

ملخص

تهدف هذه الدراسة إلى التحقيق في تنشيط مسار تمايز خلايا Th17 في الفئران المصابة بإصابات دماغية ناتجة عن الإشعاع.

الملخص

العلاج الإشعاعي هو طريقة علاجية سائدة للأورام الخبيثة في الرأس والرقبة. ومع ذلك ، فإنه يؤدي دائما إلى تلف ناتج عن الإشعاع للأنسجة الدماغية الطبيعية ، ويبلغ ذروته في إصابة الدماغ الناجمة عن الإشعاع (RBI). على الرغم من الأبحاث المكثفة حول الالتهاب العصبي الناجم عن الإشعاع ، إلا أن الارتباط بين RBI ومسار تمايز الخلايا Th17 لا يزال غير مفهوم بشكل كاف. خضعت الفئران C57BL / 6 لإعطاء واحد من تشعيع الجمجمة 30 Gy لتطوير نموذج RBI. تم تقييم الوظيفة المعرفية من خلال متاهة موريس المائية (MWM) ، واختبار المجال المفتوح ، واختبار التعرف على الأشياء الجديدة ، واختبار الروتارود. تم تحليل التغيرات النسيجية المرضية في أنسجة المخ باستخدام تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوزين (H & E). تم استخدام تلطيخ التألق المناعي لتقييم تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة (IBA-1) والخلايا النجمية (GFAP). تم إجراء تسلسل الحمض النووي الريبي لتحديد الجينات المعبر عنها تفاضليا ، بينما تم استخدام Simple Western و qPCR لفحص جزيئات الإشارات الرئيسية المشاركة في تمايز خلايا Th17. أظهرت فئران RBI عجزا معرفيا ملحوظا ، لا سيما في التعلم المكاني والاحتفاظ بالذاكرة. أشار الفحص النسيجي إلى تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية داخل القشرة والحصين للفئران المشععة. حدد تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي إثراء كبيرا لمسار تمايز الخلايا Th17 في قشرة مجموعة RBI. أكد التحقق الإضافي من خلال تحليلات Simple Western و qPCR تنظيم TGF-β و IL-6 و RORγt و IL-17 و P-STAT3 في قشرة فئران RBI. أشارت هذه النتائج إلى أن مسار تمايز الخلايا Th17 لعب دورا محوريا في التسبب في إصابات الدماغ الناجمة عن الإشعاع. قد يكون الالتهاب العصبي بوساطة خلايا Th17 آلية حاسمة وراء الخلل الوظيفي المعرفي الناجم عن الإشعاع.

المقدمة

العلاج الإشعاعي هو علاج حاسم لكل من أورام الرأس والرقبة الأولية والنقيلية ، ولكن يمكن أن تحدث إصابة الدماغ الناجمة عن الإشعاع (RBI) كمضاعفات شديدة تتميز بتلف الجهاز العصبي المركزي. يختلف معدل حدوث RBI حسب نوع الورم وطريقة العلاج ، حيث تتراوح المعدلات المبلغ عنها من 28٪ -50٪ بعد العلاج الإشعاعي التجسيمي للأورام السحائية1 ، و 1.9٪ -5٪ لسرطان البلعومالأنفي 2،3 ، و 1٪ -24٪ للأورام الدبقية منخفضة الدرجة4،5 ، و 8٪ -20٪ لنقائل الدماغ6،7. يصنف RBI إلى أنواع حادة ، متأخرة ، متأخرة ، متأخرة ، مع وجود خلل وظيفي معرفي ، وخاصة ضعف الذاكرة ، وعجز التعلم بارز في الشكل المتأخر. يؤثر الخلل الوظيفي المعرفي الناجم عن الإشعاع (RICD) ، والذي يؤثر على 50٪ -90٪ من الناجين على المدى الطويل من سرطانات الرأس والرقبة ، بشكل كبير على نوعية الحياة8 ، ومع ذلك لا يزال التسبب في المرض غير مفهوم جيدا ، ولا توجد استراتيجيات وقائية وعلاجية فعالة.

الالتهاب العصبي هو سمة مرضية رئيسية ل RBI ، مما يؤدي إلى تفاقم اضطراب الحاجز الدموي الدماغي وإعاقة تكوين الخلايا العصبية في الحصين. تم ربط خلايا Th17 ، وهي مجموعة فرعية من خلايا CD4 + T المعروفة بإنتاج السيتوكين المؤيد للالتهابات IL-179 ، بأمراض تنكسية عصبية مختلفة ، بما في ذلك التصلب المتعدد ومرض باركنسون10،11. يمكن لهذه الخلايا ، في ظل ظروف التهابية معينة ، عبور الحاجز الدموي الدماغي والمساهمة في الالتهاب العصبي12. منذ اكتشافها في عام 2005 ، حظيت خلايا Th17 بالاهتمام لدورها في كل من الاستجابات المناعية ضد مسببات الأمراض ومشاركتها في الأمراض الالتهابية ، مما يجعلها هدفا محتملا لدراسة آليات RBI والخلل الوظيفي المعرفي المرتبطبه 13.

في هذه الدراسة ، تم استخدام ذكور الفئران فقط. يهدف استبعاد الإناث إلى تجنب الآثار المربكة المحتملة الناشئة عن تقلبات الالتهاب العصبي المرتبطة بدورة الشبق ، حيث يمكن أن تختلف مستويات هرمون البروجسترون بما يصل إلى عشرة أضعاف عبر مراحل مختلفة من الدورة14. علاوة على ذلك ، تم تصميم نموذجنا التجريبي ليعكس السياق السريري للعلاج الإشعاعي لسرطان الرأس والرقبة ، حيث يكون ما يقرب من 72٪ من المرضى من الذكور15 عاما. تمشيا مع ذلك ، استخدمت غالبية الدراسات المنشورة التي تبحث في آليات إصابة الدماغ الناجمة عن الإشعاع (RBI) ذكور القوارض لإنشاء سمات مرضية أساسية16.

بينما تم استخدام نماذج مختلفة لدراسة RBI ، فإن المنهجيات التقليدية مثل التلوين النسيجي المرضي والنشاف الغربي البسيط تواجه قيودا من حيث الحساسية والإنتاجية والدقة17. قدمت التطورات الحديثة مثل تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-Seq) والبروتينات عالية الإنتاجية رؤى أكثر قوة حول الآليات الجزيئية الكامنة وراء RBI18. تسمح هذه التقنيات بفهم شامل لتغيرات التعبير الجيني وتغيرات البروتين ، مما يوفر بيانات أكثر دقة من الطرق السابقة19. Simple Western ، على وجه الخصوص ، هي تقنية جديدة وآلية تجمع بين مزايا الرحلان الكهربائي الشعري واكتشاف البروتين عن طريق التلألؤ الكيميائي ، مما يسهل تحليل الإنتاجية العالية مع الحد الأدنى من حجم العينة وزيادة قابلية التكاثر20. بالمقارنة مع النشاف الغربي التقليدي ، يلغي Simple Western الحاجة إلى نقل الغشاء ويوفر بيانات تعبير البروتين الكمية ، مما يوفر العديد من المزايا من حيث الحساسية والاستنساخ ، خاصة في اكتشاف البروتين منخفض الوفرة21،22.

تعتبر المبادئ التوجيهية العملية لاستخراج الحمض النووي الريبي وتحضيره أمرا بالغ الأهمية لنجاح التسلسل والقياس الكمي عالي الجودة. لاستخراج الحمض النووي الريبي الأمثل ، نوصي باستخدام مجموعات عزل الحمض النووي الريبي عالية الجودة والتأكد من أن التركيز في حدود 100-1000 نانوغرام / ميكرولتر ، مع رقم سلامة الحمض النووي الريبي (RIN) أعلى من 7.0 لتجنب التدهور. عند إجراء تحليل البروتين باستخدام Simple Western ، من المهم التأكد من أن عينات البروتين قد تم تشويهها بشكل صحيح وتحميلها بتركيز حوالي 1-5 ميكروغرام لكل شعيرات دموية. للتحقق من صحة qPCR ، استخدم (كدنا) عالي الجودة يتم تصنيعه من 1 ميكروغرام على الأقل من الحمض النووي الريبي ، مما يضمن ظروف نسخ عكسي متسقة. يجب تجنب المزالق الشائعة في تحضير الحمض النووي الريبي ، مثل التلوث بالحمض النووي الجيني أو تحلل الحمض النووي الريبي ، باستخدام معدات خالية من الحمض النووي الريبي وإجراء فصل الطور على الفور لمنع تدهور الحمض النووي الريبي.

من خلال دمج هذه الأساليب ، تهدف هذه الدراسة إلى التحقيق فيما إذا كان مسار تمايز الخلايا Th17 قد تم تنشيطه في نماذج الفئران من RBI وكيف يساهم في التسبب في الخلل الوظيفي المعرفي الناجم عن الإشعاع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تتوافق الإجراءات التجريبية التي يتم إجراؤها هنا بشكل صارم مع إرشادات ARRIVE (أبحاث: الإبلاغ عن تجارب In Vivo). تم الحصول على الموافقة من اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه التابعة لمعهد بيجين للطب الإشعاعي (رقم الموافقة). AF/SC-08/02; التاريخ: 25 فبراير 2024).

1. تشعيع الجمجمة للفئران

  1. استخدم ما مجموعه 10 ذكور C57BL / 6 فئران تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع في الدراسة ، مع تخصيص خمسة لمجموعة RBI وخمسة للمجموعة الضابطة ، حيث تتكون المجموعة الضابطة من فئران تحكم فارغة لم تتلق RBI. حافظ على الفئران في ظل ظروف بيئية خاضعة للرقابة ، بما في ذلك درجة الحرارة المنظمة والرطوبة ودورة الضوء / الظلام لمدة 12 ساعة. تأقلم الفئران لمدة أسبوع واحد قبل بدء التجربة.
  2. تخدير باستخدام حقن داخل الصفاق بنسبة 1٪ بنتوباربيتال الصوديوم عند 50 مجم / كجم من وزن الجسم. تأكد من التخدير المناسب عن طريق التحقق من عدم وجود استجابة انعكاسية لقرصة مخلب صلبة. ضع مرهم العيون البيطري على كلتا العينين مباشرة بعد بدء التخدير لمنع جفاف القرنية.
  3. ضع في اتجاه الانبطاح باستخدام جهاز تقييد خشبي مخصص وقم بتغطية المناطق غير المستهدفة من الجسم بلوحة واقية من الرصاص بسمك 3 مم (نقاء 99.9٪) لضمان التشعيع الموضعي.
  4. قم بموازاة مجال التشعيع 2 × 2 سم2 مع الترشيح المتأصل (1.5 مم Al + 0.25 مم Cu). قم بمحاذاة المجال مع خط الوسط الجمجمي باستخدام الشعيرات المتصالبة بالليزر المدمجة (λ = 635 نانومتر ± دقة 0.5 مم) وتحقق من تحديد المواقع في الوقت الفعلي باستخدام نظام كاميرا CMOS المدمج والإضاءة الخلفية بالأشعة تحت الحمراء. قم بتشعيع منطقة الجمجمة بجرعة واحدة من الأشعة السينية 30 Gy عند 1.325 Gy / دقيقة باستخدام نظام X-RAD 320 وفقا للمعايير التالية: 320 كيلو فولت / 12.5 مللي أمبير ، SSD = 50 سم.
  5. قم بإجراء معايرة الجرعة الأسبوعية باستخدام غرفة تأين يمكن تتبعها موضوعة في مركز متساوي. حافظ على معلمات الشعاع عند 320 كيلو فولت / 12.5 مللي أمبير مع ترشيح 3.2 مم Cu HVL لتحقيق معدل جرعة 1.325 جراي / دقيقة (± 3٪ تباين). تحقق من توحيد الحزمة يوميا (> 95٪ داخل الحقل) باستخدام فيلم Gafchromic EBT3.
  6. تطبيق ميلوكسيكام (1-2 ملغ/كغ، تحت الجلد) مرة واحدة يوميا لمدة 3 أيام للتحكم في الألم بعد الجراحة. ضع في غرفة التعافي الدافئة مسبقا وراقبها باستمرار حتى تستعيد وعيها الكامل ويمكنها الحفاظ على الراقد القصي. لا تترك دون رقابة خلال فترة التعافي.
  7. سجل وزن جسم جميع الفئران أسبوعيا طوال الدراسة. راقب الفئران لمدة 4 أسابيع ، بما في ذلك أسبوع واحد من التأقلم و 3 أسابيع بعد التشعيع.

2. تحليل سلوك

  1. قم بإجراء التجارب السلوكية بعد 3 أسابيع من RBI.
  2. متاهة المياه موريس
    1. املأ بركة دائرية (قطر: 120 سم ، ارتفاع: 50 سم) بماء غير شفاف (20-22 درجة مئوية) باستخدام الحليب المجفف لإخفاء المنصة المغمورة. ضع منصة مخفية (قطرها: 10 سم) 1 سم تحت سطح الماء في ربع ثابت.
    2. تأقلم الفئران مع غرفة الاختبار لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التجارب. ابدأ مرحلة التدريب بوضع كل فأر في الماء من واحدة من أربع نقاط بداية عشوائية زائفة (N ، S ، E ، W).
    3. اسمح للماوس بالسباحة لمدة تصل إلى 60 ثانية لتحديد موقع المنصة المخفية. إذا فشل الماوس في العثور على النظام الأساسي في غضون 60 ثانية ، فقم بتوجيهه إلى النظام الأساسي واسمحه للبقاء هناك لمدة 15 ثانية.
    4. إجراء أربع تجارب يوميا لكل فأر بفاصل زمني 15 دقيقة بين التجارب. جفف كل فأر جيدا بمنشفة دافئة بين التجارب لمنع انخفاض حرارة الجسم. استمر في التدريب لمدة 5 أيام متتالية لتقييم اكتساب التعلم.
    5. في يوم تجربة المسبار ، قم بإزالة المنصة واسمح للفأر بالسباحة بحرية لمدة 60 ثانية. سجل المعلمات مثل الوقت المستغرق في الربع المستهدف ومعابر المنصة ومسارات السباحة.
    6. تتبع وتحليل جميع التجارب باستخدام نظام تتبع الفيديو الآلي مع المجربين الذين أعمى عن تخصيص المجموعة.
  3. اختبار المجال المفتوح
    1. تأقلم الفئران مع غرفة الاختبار لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التجربة. استخدم جهازا مفتوحا (50 سم × 50 سم × 40 سم) مصنوعا من البلاستيك غير الشفاف. قم بإضاءة الساحة بشكل موحد (عادة 25-30 لوكس) لتجنب الظلال القوية وتقليل التوتر.
    2. نظف الساحة بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل اختبار كل للتخلص من إشارات الرائحة. ضع الماوس برفق في وسط الحقل المفتوح لبدء الاختبار. اسمح للماوس باستكشاف الساحة بحرية لمدة 10 دقائق.
    3. سجل النشاط الحركي والموقع باستخدام نظام تتبع آلي. حدد المنطقة المركزية على أنها 20٪ -25٪ الداخلية من المساحة الإجمالية. قم بقياس الوقت الذي تقضيه في المنطقة المركزية وإجمالي المسافة المقطوعة.
    4. بعد الجلسة ، أعد الماوس إلى قفص منزله ونظف الجهاز جيدا.
  4. اختبار التعرف على الكائنات الجديدة
    1. تأقلم الفئران مع غرفة الاختبار لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التجربة. استخدم ساحة حقل مفتوح (50 سم × 50 سم × 40 سم) مع إضاءة موحدة (20-30 لوكس). نظف الساحة جيدا باستخدام 70٪ من الإيثانول بين للتخلص من الإشارات الشمية
    2. ضع كل فأرة في الساحة الفارغة واتركها بالاستكشاف بحرية لمدة 10 دقائق. لا تضع أي أشياء خلال هذه المرحلة.
    3. بعد 24 ساعة ، ضع جسمين متطابقين (A و A ′) في زوايا متقابلة من الساحة (على الأقل 8 سم من الجدران). ضع الماوس برفق في وسط الساحة واتركه بالاستكشاف لمدة 10 دقائق.
    4. سجل تفاعل الكائن باستخدام نظام فيديو آلي. حدد استكشاف الكائن على أنه خطم الماوس على بعد 2 سم من الكائن أثناء توجيهه نحوه.
    5. أعد الماوس إلى قفص منزله بعد التجربة ونظف الساحة والأشياء.
    6. بعد فاصل استبقاء 1 ساعة ، ضع كائنا مألوفا (A) وكائنا جديدا (B) في نفس المواضع. أعد الماوس إلى الساحة واتركه بالاستكشاف لمدة 5 دقائق.
    7. سجل الوقت المستغرق في استكشاف كل كائن باستخدام نفس المعايير كما كان من قبل. احسب مؤشر الاعتراف على النحو التالي:
      مؤشر التعرف (٪) = [الوقت على كائن جديد / (وقت الرواية + الكائن المألوف)] × 100
  5. اختبار روتارود
    1. تأقلم الفئران مع غرفة الاختبار لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاختبار. استخدم جهاز روتارود آلي بقطر قضيب ~ 3 سم وارتفاع ~ 30 سم فوق القاعدة.
    2. اضبط وضع الدوران على سرعة التسارع (من 4 لفة في الدقيقة إلى 40 دورة في الدقيقة خلال 5 دقائق). نظف سطح القضيب بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل وضع كل ماوس.
    3. ضع الماوس برفق على منتصف القضيب الدوار ، متجها للأمام. ابدأ الدوران وابدأ التوقيت على الفور.
    4. سجل زمن الانتقال ليسقط تلقائيا بواسطة النظام. أمسك بالماوس بأمان عند سقوطه لتجنب الإصابة. اترك فترة راحة لا تقل عن 15 دقيقة بين التجارب لمنع التعب.
    5. قم بإجراء 3 تجارب متتالية لكل ماوس يوميا ومتوسط زمن الوصول كنتيجة نهائية. تأكد من إجراء جميع الاختبارات من قبل المجربين المكفوفين في ظل ظروف متسقة. أعد الماوس إلى قفص منزله بعد الاختبار وتطهير الجهاز جيدا.

3. القتل الرحيم للحيوان وإعداد العينة

  1. جمع عينات الأنسجة بعد 5 أسابيع من RBI.
  2. تحضير بنتوباربيتال الصوديوم (100 مجم / كجم) وحقنة معقمة. حقن البنتوباربيتال الصوديوم داخل الصفاق. انتظر حتى يتوقف الفأر عن التنفس ويتوقف ضربات القلب ، مما يؤكد الموت.
  3. قم بقطع الرأس بسرعة عند التقاطع القذالي وقم بشق خيوط الجمجمة السهمية باستخدام مقص ناعم ، ثم ارفع اللوحات الجمجمة الثنائية بعناية باستخدام ملقط منحني مع الحفاظ على سلامة السحايا قبل قطع الوصلات العصبية.
  4. انقل الدماغ السليم إلى مصفوفة مبردة مسبقا في غضون 60 ثانية للتقسيم السهمي المتوسط باستخدام شفرات حلاقة معقمة. سجل على الفور الأبعاد الأمامية الخلفية (8.2 ± 0.3 مم) ، والعرض المتوسط الوحشي (4.5 ± 0.2 مم) ، وكتلة الأنسجة (112 ± 8 مجم) باستخدام أجهزة دقيقة.
  5. تشريح الأنسجة القشرية والحصين على الجليد. قم بتجميد نصف الكرة الأيسر بالنيتروجين السائل لتسلسل الحمض النووي الريبي و qPCR و Simple Western.
  6. قم بإصلاح نصف الكرة الأيمن في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) لعلم الأنسجة. قم بتجفيف الأدمغة الثابتة في الإيثانول المتدرج من 70٪ إلى 100٪ ، مع كل خطوة تستمر لمدة 30 دقيقة.
  7. مسح الأدمغة في الزيلين لمدة 2 ساعة. تسلل إلى الأنسجة بالبارافين المنصهر عند 60 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. قم بتضمين الأدمغة التي تم تطهيرها في كتل البارافين واتركها تتصلب في درجة حرارة الغرفة. قطع المقاطع الإكليلية بسمك 5 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم.

4. تلطيخ الهيماتوكسيلين والأيوزين

  1. قم بإزالة البارافينات من أقسام الأنسجة عن طريق غمر الشرائح في الزيلين لمدة 5 دقائق ، 3 أضعاف. أعد ترطيب الأقسام من خلال سلسلة الإيثانول المتدرجة: 100٪ ، 95٪ ، 70٪ ، والماء المقطر ، لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  2. قم بتلطيخ الأقسام باستخدام Hematoxylin لمدة 5 دقائق ، اعتمادا على شدة التلوين المطلوبة. اشطف الأقسام بماء الصنبور الجاري لمدة 5 دقائق لإزالة الهيماتوكسيلين الزائد.
  3. قم بتمييز الأقسام في حمض الهيدروكلوريك بنسبة 1٪ في الإيثانول لبضع ثوان لتحقيق التباين المطلوب. اشطفها مرة أخرى بماء الصنبور الجاري لمدة 5 دقائق. تلطخ الأقسام بالإيوسين لمدة 1 دقيقة.
  4. شطف الأقسام لفترة وجيزة في الماء المقطر. قم بتجفيف الأقسام من خلال سلسلة الإيثانول المتدرجة: 70٪ و 95٪ و 100٪ لمدة 5 دقائق لكل منها.
  5. امسح الأقسام في الزيلين لمدة 5 دقائق ، 3x. قم بتركيب الأقسام بغطاء باستخدام وسيط تثبيت. احصل على صور باستخدام مجهر نيكون Eclipse Ni-U بهدف 20x.

5. التألق المناعي

  1. قم بإصلاح الأنسجة عن طريق غمر الشرائح في 4٪ PFA لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الشرائح في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لمدة 5 دقائق ، 3 مرات ، لإزالة PFA الزائد.
  2. تخلل الأنسجة عن طريق احتضان الشرائح مع 0.3٪ Triton X-100 في PBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. منع الارتباط غير المحدد عن طريق احتضان الشرائح بمصل عادي بنسبة 5٪ لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  3. احتضان بالأجسام المضادة الأولية IBA-1 و GFAP ، المخففة في المخزن المؤقت المانع عند تخفيف 1: 2000 ، بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية ، اعتمادا على مواصفات الجسم المضاد. اغسل الشرائح في PBS لمدة 5 دقائق ، 3x ، لإزالة الجسم المضاد الأساسي غير المرتبط.
  4. احتضان مع الجسم المضاد الثانوي IgG المضاد للماعز المقترن ب Alexa Fluor 488 ، المخفف في الساعة 1: 1000 لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. اغسل الشرائح في PBS لمدة 5 دقائق ، 3 مرات ، لإزالة الجسم المضاد الثانوي الزائد.
  5. قم بتركيب الشرائح بوسيط تثبيت مضاد للبهتان يحتوي على DAPI. أغلق الغطاء بطلاء أظافر شفاف.
  6. التقط صورا مضانية باستخدام نظام مجهر متحد البؤر بهدف 20x.
  7. تحديد كثافة التألق باستخدام ImageJ. قم بإجراء تحليل كمي باستخدام أداة تحليل الجسيمات من ImageJ مع عتبات حجم تتراوح من 50-200 ميكرومترمربع (الخلايا الدبقية الصغيرة) و 100-500 ميكرومتر2 (الخلايا النجمية). اطرح الخلفية باستخدام خوارزمية Rolling Ball (نصف القطر = 50 بكسل).

6. تحليل qPCR

  1. استخرج الحمض النووي الريبي الكلي من الأنسجة باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي. اتبع بروتوكول الشركة المصنعة للتجانس والتحلل وتنقية الحمض النووي الريبي.
  2. حدد كمية الحمض النووي الريبي المستخرج باستخدام مقياس الطيف الضوئي لقياس التركيز وتقييم النقاء (نسبة A260 / A280). تأكد من أن تركيز الحمض النووي الريبي مناسب لتخليق (كدنا) (100-500 نانوغرام / ميكرولتر).
  3. تقييم جودة الحمض النووي الريبي باستخدام محلل حيوي. تأكد من أن الحمض النووي الريبي لا يظهر أي تدهور (نطاقات حادة ل 18S و 28S rRNA) وله رقم سلامة الحمض النووي الريبي (RIN) أعلى من 7.
  4. قم بإعداد خليط تفاعل 20 ميكرولتر مع 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي ، ومخزن النسخ العكسي ، و oligo-dT ، و dNTPs ، ومثبط RNase ، والنسخ العكسي.
  5. احتضان عند 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة لتصنيع الحمض النووي (ك). سخنيها عند 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتعطيل النسخ العكسي.
  6. اجمع بين cDNA ، والمزيج الرئيسي ، والبرايمر الأمامي ، والبرايمر العكسي (الجدول 1) ، والماء الخالي من النوكلياز في لوحة PCR مكونة من 96 بئرا. استخدم 2 ميكرولتر من (كدنا) لكل تفاعل 20 ميكرولتر وتأكد من تركيز أولي نهائي يبلغ 200 نانومتر. أغلق اللوحة بغشاء لاصق بصري لمنع التبخر.
الجينتسلسل التمهيدي (5'-3'، إلى الأمام/الخلف)
TGF-β1CCACCTGCAAGACCATCGAC
CTGGCGAGCCTTAGTTTGGAC
TGF-β3GGACTTCGGCCACATCAAGAA
TAGGGGACGTGGGTCATCAC
IL-6CTGCAAGAGACTTCCATCCAG
AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG
RORγtTCCACTACGGGGTTATCACCT
AGTAGGCCACATTACACTGCT
IL-17ATCAGCGTGTCCAAACACTGAG
CGCCAAGGGAGTTAAGACTT
IL-17FTGCTACTGTTGATGTTGGGAC
CAGAAATGCCCTGGTTTTGGT
جابد دي إتشAGGTCGGTGTGAACGGATTTG
GGGGTCGTTGATGGCAACA

الجدول 1: بادئات تسلسل qPCR.

  1. ضع لوحة التفاعل في أداة PCR في الوقت الفعلي وقم ببرمجة التدوير الحراري. استخدم ظروف التدوير التالية: التمسخ الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، متبوعا ب 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
  2. تطبيع التعبير عن الجينات المستهدفة إلى GAPDH. احسب مستويات التعبير النسبية باستخدام طريقة ΔΔCt وقدم البيانات كتغييرات في الطي مقارنة بمجموعة التحكم.

7. تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي

  1. تخدير الفأر والقتل الرحيم باتباع بروتوكولات رعاية المؤسسية. قم بتعقيم على الفور مع PBS البارد لإزالة الدورة الدموية.
  2. تشريح الدماغ على الجليد. عزل القشرة الدماغية باستخدام أدوات التشريح المعقمة. تقليل وقت التشريح للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي.
  3. تجميد الأنسجة القشرية في النيتروجين السائل. يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية إذا لم يتم استخراج الحمض النووي الريبي على الفور.
  4. قم بتجانس القشرة المجمدة (30-50 مجم) في 1 مل من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام الخالط الآلي حتى تختفي شظايا مرئية.
  5. إجراء فصل طور الكلوروفورم. أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم ، ورجه بقوة لمدة 15 ثانية ، واحتضانه لمدة 2-3 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 12,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  6. انقل الطبقة العليا إلى أنبوب جديد ، وأضف حجما متساويا من 70٪ من الإيثانول ، واستمر في تنقية الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة قائمة على عمود السيليكا.
  7. استخدم هضم DNase على العمود لإزالة الحمض النووي الجيني أثناء تنقية الحمض النووي الريبي. اجمع إجمالي الحمض النووي الريبي في 30-50 ميكرولتر واحتفظ به على الجليد للاستخدام الفوري.
  8. استخدم مقياس الطيف الضوئي لتحديد تركيز الحمض النووي الريبي ونقائه. تأكد من نسبة A260 / A280 ~ 2.0. تحليل 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي على محلل حيوي. تأكد من أن RIN أكبر من 8.0 للتسلسل.
  9. استخدم بروتوكول تحديد poly(A) ومجموعة إعداد مكتبة مجدولة. اتبع بروتوكول الشركة المصنعة لإنشاء مكتبات 300-400 نقطة أساس. تنقية المكتبات بمجموعة تجارية.
  10. استخدم محلل حيوي لتأكيد حجم الجزء وتحديده باستخدام مكتبات التجمع بشكل متساو. قم بإجراء تسلسل مزدوج (2x ، 150 نقطة أساس) باستخدام منصة Illumina.
  11. قم بقص المحولات باستخدام Trim Abundance ، وتقييم الجودة باستخدام FastQC ، ومحاذاة القراءات مع جينوم الفأر (GRCm39) باستخدام STAR ، وتحديد التعبير الجيني باستخدام featureCounts. تحديد الجينات المعبر عنها تفاضليا باستخدام DESeq2.
  12. استخدم الإخراج من DESeq2 ، وقم بتصفية الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي بشكل كبير DEGs (قيمة p المعدلة < 0.05 و |log2FC | > 1). قم بإجراء تحليل تخصيب مسار GO و KEGG باستخدام Phyper بناء على الاختبار الهندسي الفائق. تحديد المسارات ذات قيمة P المصححة ≤ 0.05 على أنها ذات دلالة إحصائية.

8. تحليل غربي بسيط

  1. قم بتجانس القشرة الدماغية للفأر في عازلة RIPA مع مثبطات البروتياز والفوسفاتيز ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 12,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة الحطام. تحديد تركيز البروتين باستخدام مقايسة BCA.
  2. قم بتغيير طبيعة عينات البروتين عن طريق مزجها مع عازلة العينة واحتضانها عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لضمان التمسخ الكامل.
  3. قم بتحميل 3 ميكرولتر من عينات البروتين المشوهة في الشعيرات الدموية الغربية البسيطة. تأكد من تحميل العينات بشكل صحيح لمنع الفائض. ضع الشعيرات الدموية في الأداة الغربية البسيطة.
  4. احتضان البروتينات المنفصلة بأجسام مضادة أولية مخففة بنسبة 1:50 ، بما في ذلك p-STAT3 و STAT3 و RORγt و TGF-β و IL-6 و IL-17 لمدة 30 دقيقة.
  5. اغسل النظام الشعري بمحلول غسيل لمدة ثلاث غسلات مدة كل منها 5 دقائق لإزالة الأجسام المضادة الأولية غير المرتبطة. أضف الجسم المضاد الثانوي المترافق ب HRP المخفف في المخزن المؤقت المانع واحتضانه لمدة 30 دقيقة.
  6. قم بإجراء 3 غسلات لمدة 5 دقائق لكل منها مع محلول غسيل لإزالة الأجسام المضادة الثانوية الزائدة. قم بتشغيل برنامج الكشف على نظام Simple Western للكشف تلقائيا عن البروتينات باستخدام التلألؤ الكيميائي.
  7. قم بتحليل البيانات باستخدام برنامج Compass for Simple Western. حدد تعبير البروتين من خلال مقارنة مناطق الذروة النسبية في مخطط الكهرباء. تطبيع البيانات إلى بروتين GAPDH.

9. التحليل الإحصائي

  1. افتح GraphPad Prism 9.0.0. برمجيات. انقر فوق ملف > استيراد البيانات لتحميل البيانات. اعرض البيانات كوسيلة ± SD. استخدم اختبار t غير المقترن للمقارنات بين مجموعتين.
  2. تقييم الحالة الطبيعية باستخدام اختبار شابيرو ويلك. إذا تم انتهاك الحالة الطبيعية (ص < 0.05) ، قم بتطبيق اختبار Mann-Whitney U للمقارنات بين المجموعات. إذا تم استيفاء الوضع الطبيعي (ص ≥ 0.05) ، فقم بإجراء اختبار عينات مستقل لتقييم اختلافات المجموعة.
  3. الإبلاغ عن النتائج باستخدام قيم p. ضع في اعتبارك أن p < 0.05 ذات دلالة إحصائية. استخدم الترميز التالي: n.s. لغير ذي شأن، * ل p < 0.05، ** ل p < 0.005، *** ل p < 0.0005، و **** ل p < 0.0001.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الضعف الإدراكي في الفئران RBI
بعد التعرض لإشعاع الدماغ بالكامل بمقدار 30 غراي ، تمت مراقبة وزن جسم الفئران على أساس أسبوعي. تم تقييم الوظيفة المعرفيةخلال الأسبوع الرابع (الشكل 1 أ). أشارت القياسات الأولية إلى أن أوزان الجسم لمجموعات التحكم وRBI كانت متشابهة. ومع ذلك ، بين 1 و 3 أسابيع بعد التشعيع ، أظهرت مجموعة RBI انخفاضا كبيرا في وزن الجسم (الشكل 1 ب) ، مما يشير إلى أن تشعيع الدماغ بالكامل يؤثر سل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الخطوات الحاسمة في إطار البروتوكول
يتضمن هذا البروتوكول تحريض RBI في الفئران ، متبوعا بتقييمات شاملة للالتهاب العصبي ومسار تمايز الخلايا Th17 (الشكل 6). الخطوة الحاسمة هي تشعيع الجمجمة للفئران C57BL / 6 بجرعة 30 Gy ، وهو نموذج راسخ ل RBI1. تضمن معايرة الجرعة الدقيقة باستخدام غرف التأين قابلية التكرار28. تقوم المقايسات السلوكية ، بما في ذلك MWM ، بتقييم الإعاقات المعرفية29

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

شكر وتقدير

وقدم معهد بكين للطب الإشعاعي الدعم لهذا العمل

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
وحدة فصل 12-230 كيلو دالتون ، 8 × 25 خراطيش شعريةبروتينSimpleSM-W004المضاد ل SimpleWestern
المضاد ل GAPDHProteintechHRP-600041: 500 التخفيف / الجسم المضاد ل SimpleWestern
المضاد للجسم المضاد ل GFAP Abcamab72601: 2000 التخفيف / الجسم المضاد للجسم المضاد للتألق
المضاد ل IBA-1Abcamab1788461: 2000 التخفيف / الجسم المضاد للجسم المضاد للتألق المناعي
المضاد ل IL-17 A / FThermoMA5-237481:10 التخفيف / الجسم المضاد ل SimpleWestern
المضاد IL-1 & الجسم المضادCST122421:50 التخفيف / الجسم المضاد ل SimpleWestern
المضاد للجسم المضاد ل IL-6ThermoMA5-238001: 5 التخفيف / الجسم المضاد لوحدة
الكشف عن SimpleWestern المضادة للفأرالمضاد الثانويDM-002
للجسم المضاد SimpleWestern المضاد ل P-STAT3 (Try705)ThermoMA5-151931: 2 التخفيف / الجسم المضاد ل SimpleWestern
Anti-Rabbit Module ProteinDM-001الجسم المضاد الثانوي ل SimpleWestern
anti-ROR & gamma ؛ t الأجسام المضادةThermo14-6988-821: 5 التخفيف / الجسم المضاد ل SimpleWestern
المضاد للجسم المضاد STAT3Thermo7100771:20 التخفيف / الجسم المضاد ل SimpleWestern
المضاد TGF > بيتا ؛ -1،2،3 الجسم المضادThermoMA5-237951:10 التخفيف / الجسم المضاد ل SimpleWestern
BACمقايسات البروتينالحراريةA55860
EZ Standard Pack 1 12-230 kDaبروتين سيمبلPS-ST01EZ-8ل SimpleWestern
Goat Anti-Rabbit IgG H& LAbcamab1500771: 1000 التخفيف / الجسم المضاد للتألق المناعي
RNeasy KitQiagen74134استخراج الحمض النووي الريبي
SuperScript IV نظام توليف الخيط الأولThermo Fisher Scientific18091050النسخ العكسي
SYBR Green Master MixTakara Bio & nbsp ؛RR820AQ-PCR
TRIzol كاشفInvitrogen15596026استخراج الحمض النووي الريبي
للجسم المضاد المناعي الجسم ProteinSimple

المراجع

  1. Milano, M. T., et al. Radiation-induced edema after single-fraction or multifraction stereotactic radiosurgery formeningioma: a critical review. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 101 (2), 344-357 (2018).
  2. Tian, Y., et al. Radiation encephalopathy in nasopharyngeal carcinoma patients in mainland China: a systematic evaluation. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi. 24 (5), 471-473 (2002).
  3. Na, A., et al. Cerebral radiation necrosis. Asia Pac J Clin Oncol. 10 (1), 11-21 (2014).
  4. Deangelis, L. M. Brain tumors. N Engl J Med. 344 (2), 114-123 (2001).
  5. Kumar, A. J., et al. Malignant gliomas: MR imaging spectrum of radiation therapy-and chemotherapy-induced necrosis of the brain after treatment. Radiology. 217 (2), 377-384 (2000).
  6. Minniti, G., et al. Single-fraction versus multifraction (3 x 9 Gy) stereotactic radiosurgery for large (>2 cm) brain metastases: acomparative analysis of local control and risk of radiation-induced brain necrosis. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 95 (4), 1142-1148 (2016).
  7. Minniti, G., et al. Repeated stereotactic radiosurgery for patients with progressive brain metastases. J Neurooncol. 126 (1), 91-97 (2016).
  8. Turnquist, C., Harris, B. T., Harris, C. C. Radiation-induced brain injury: current concepts and therapeutic strategies targeting neuroinflammation. Neurooncol Adv. 2 (1), vdaa057(2020).
  9. Raphael, I., et al. T cell subsets and their signature cytokines in autoimmune and inflammatory diseases. Cytokine. 74 (1), 5-17 (2015).
  10. Moser, T., et al. The role of TH17 cells in multiple sclerosis: Therapeutic implications. Autoimmun Rev. 19 (10), 102647(2020).
  11. MacMahon, C. A., et al. The Pathogenesis of Parkinson's Disease: A Complex Interplay Between Astrocytes, Microglia, and T Lymphocytes. Front Neurol. 12, 666737(2021).
  12. Kebir, H., et al. Human TH17 lymphocytes promote blood-brain barrier disruption and central nervous system inflammation. Nat Med. 13 (10), 1173-1175 (2007).
  13. Omenetti, S., et al. The Intestine Harbors Functionally Distinct Homeostatic Tissue-Resident and Inflammatory Th17 Cells. Immunity. 51 (1), 77-89.e6 (2019).
  14. Mangold, C. A., et al. Sexually divergent induction of microglial-associated neuroinflammation with hippocampal aging. J Neuroinflammation. 14 (1), 141(2017).
  15. SEER Cancer Stat Facts: Head and Neck Cancer. , National Cancer Institute. https://seer.cancer.gov/statfacts/html/headneck.html (2025).
  16. Holmes-Hampton, G. P., et al. Time- and sex-dependent delayed effects of acute radiation exposure manifest via miRNA dysregulation. iScience. 27 (2), 108867(2024).
  17. Kempf, S. J., et al. The cognitive defects of neonatally irradiated mice are accompanied by changed synaptic plasticity, adult neurogenesis and neuroinflammation. Mol Neurodegener. 9, 57(2014).
  18. Zhao, J., et al. RNA-seq reveals Nup62 as a potential regulator for cell division after traumatic brain injury in mice hippocampus. PeerJ. 11, e14913(2023).
  19. Zhang, P., et al. Quantitative proteomics analysis to identify diffuse axonal injury biomarkers in rats using iTRAQ coupled LC-MS/MS. J Proteomics. 133, 93-99 (2016).
  20. Sormunen, A., et al. Comparison of Automated and Traditional Western Blotting Methods. Methods Protoc. 6 (2), 43(2023).
  21. Mishra, M., et al. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Rev Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
  22. Edouard, S., et al. Automated Western immunoblotting detection of anti-SARS-CoV-2 serum antibodies. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 40 (6), 1309-1317 (2021).
  23. Galland, F., et al. Astrocyte culture models: Molecular and function characterization of primary culture, immortalized astrocytes and C6 glioma cells. Neurochem Int. 131, 104538(2019).
  24. Wu, B., et al. The TGF-β superfamily cytokine Activin-A is induced during autoimmune neuroinflammation and drives pathogenic Th17 cell differentiation. Immunity. 54 (2), 308-323.e6 (2021).
  25. Korn, T., et al. IL-17 and Th17 Cells. Annu Rev Immunol. 27, 485-517 (2009).
  26. Kumar, R., et al. RORγt protein modifications and IL-17-mediated inflammation. Trends Immunol. 42 (11), 1037-1050 (2021).
  27. Qin, Z., et al. TCR signaling induces STAT3 phosphorylation to promote TH17 cell differentiation. J Exp Med. 221 (3), e20230683(2024).
  28. Lampert, P. W., et al. Delayed effect of radiation on the human central nervous system, 'early' and 'late' delayed reactions. Neurology. 14, 912-917 (1964).
  29. Martin, A., et al. Neurological imaging of brain damages after radiotherapy and/or chemotherapy. J Neuroradiol. 41 (1), 52-70 (2014).
  30. Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biology. 17, 13(2016).
  31. Allen, B. D., et al. Mitigation of helium irradiation-induced brain injury by microglia depletion. J Neuroinflammation. 17 (1), 159(2020).
  32. Singh, R. P., et al. Th17 cells in inflammation and autoimmunity. Autoimmun Rev. 13 (12), 1174-1181 (2014).
  33. Monje, M. L., Toda, H., Palmer, T. D. Inflammatory blockade restores adult hippocampal neurogenesis. Science. 302 (5651), 1760-1765 (2003).
  34. Pazzaglia, S., et al. Neurocognitive Decline Following Radiotherapy: Mechanisms and Therapeutic Implications. Cancers. 12 (1), 146(2020).
  35. Zhang, X., et al. DNA methylation changes and their role in radiation-induced brain injury,". Neurobiol Dis. 129, 96-104 (2019).
  36. Lee, H. J., et al. Profiling of gene expression in the brain associated with anxiety-related behaviors in the chronic phase following cranial irradiation. Sci Rep. 12 (1), 13162(2022).
  37. Cañada-García, D., Arévalo, J. C. A Simple, Reproducible Procedure for Chemiluminescent Western Blot Quantification. Bio Protoc. 13 (9), e4667(2023).
  38. Raber, J., et al. Radiation-induced cognitive impairments are associated with changes in indicators of hippocampal neurogenesis. Radiat Res. 162 (1), 39-47 (2004).
  39. Zhang, J., et al. Th17 cell-mediated neuroinflammation is involved in neurodegeneration of aβ1-42-induced Alzheimer's disease model rats. PLoS One. 8 (10), e75786(2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Simple Western qPCR
الفيديو قريباً
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.