يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحليل تنكس المستقبلات الضوئية والحفاظ عليها في نموذج الفئران لالتهاب الشبكية الصباغي

621 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68324

⸱

يوليو 22, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Neural Development and Regeneration Laboratory, Department of Neurobiology, Science and Biotechnology Graduate Program, Institute of Biology, Fluminense Federal University, 2Neural Development and Regeneration Laboratory, Department of Neurobiology, Neuroscience Graduate Program, Institute of Biology, Fluminense Federal University, 3Instituto Estadual de Hematologia Arthur de Siqueira Cavalcanti (HEMORIO)

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يحدد هذا البروتوكول التقنيات المحسنة لتحليل تنكس المستقبلات الضوئية والحفاظ عليها في نموذج الفئران لالتهاب الشبكية الصباغي ، بما في ذلك إعطاء الأدوية داخل الجسم الزجاجي ، وتقسيم ناظم التبريد ، والتألق المناعي. تضمن الطريقة سلامة الشبكية وتوفر بيانات كمية عن فعالية التدخلات العلاجية.

الملخص

تؤثر اعتلالات الشبكية على مئات الملايين من الأشخاص في جميع أنحاء العالم وهي أسباب مهمة لضعف البصر والعمى. من بين هذه الأمراض ، التهاب الشبكية الصباغي (RP) هو اضطراب وراثي في العين يتميز بالتنكس التدريجي للشبكية ، ويصيب ما يقرب من 1.5 إلى 2 مليون شخص في جميع أنحاء العالم. تشكل دراسات إثبات المفهوم في النماذج الحيوانية لضمور الشبكية الوراثي أساسا مهما للأدلة للدراسات في الآليات الفيزيولوجية المرضية للمرض وفعالية العلاج وسلامته. يستخدم الحقن داخل الجسم الزجاجي في الفئران وتقطيع ناظم التبريد على نطاق واسع للتحقيق في تأثيرات الأدوية في نماذج RP ، لأنها تتيح التوصيل الدقيق للمواد في الخلط الزجاجي وإعداد عينات نسيجية عالية الجودة لتحليل مفصل لتغيرات الشبكية. أيضا ، تم استخدام عد الخلايا من خلال التألق المناعي باستخدام الأجسام المضادة ضد ريكويرفين ، وهو بروتين يعتمد على الكالسيوم يتم التعبير عنه في المستقبلات الضوئية للشبكية ، مؤخرا لدراسة التغيرات الخلوية المرتبطة بتنكس الشبكية في نماذج RP ، لأن هذا النهج يسهل تقييم فقدان المستقبلات الضوئية والحفظ الخلوي المحتمل بعد التدخلات العلاجية. تم تحسين الحقن داخل الجسم الزجاجي لضمان سلامة العين ونتائج موثوقة ، باستخدام إبرة رفيعة لإدارة المحلول في غرفة الجسم الزجاجي. بعد فترة محددة مسبقا لتقييم تأثيرات الدواء ، يتم إجراء المعالجة النسيجية ، مع تقسيم العينات بسمك 10 ميكرومتر باستخدام ناظم التبريد ، متبوعا بوضع العلامات على التألق المناعي مع الأجسام المضادة للريكوريفين. أخيرا ، يتم إجراء عد الخلايا لتقييم ما إذا كان العلاج بالأدوية له تأثير وقائي ، كما يتضح من الحفاظ على المستقبلات الضوئية. على الرغم من أن هذه التقنيات قد تم تطبيقها على نطاق واسع لتوليد بيانات متسقة في أبحاث اعتلال الشبكية ، إلا أن التحديات لا تزال قائمة في تحقيق معالجة دقيقة للأنسجة وجودة المعالجة. يوفر هذا البروتوكول نهجا موحدا لتحسين كل خطوة ، من الحقن داخل الجسم الزجاجي إلى إعداد الأقسام النسيجية ، مما يضمن نتائج قابلة للتكرار وعالية الجودة.

المقدمة

الرؤية هي واحدة من أكثر الحواس تعقيدا في الجهاز الحسي ، وهي ضرورية لالتقاط المحفزات البصرية البيئية وترجمتها إلى إشارات كهروكيميائية ، تتم معالجتها في الدماغ لتشكيل الصور. يمكن للعوامل البيولوجية المختلفة ، مثل الشيخوخة والعيوب الوراثية والأمراض ، أن تضر بالرؤية ، مما يؤثر بشكل كبير على نوعية الحياة والأنشطة اليومية.

تتكون العين البشرية من ثلاث غرف أساسية. توفر الطبقة الخارجية ، التي تتكون من القرنية والصلبة ، الدعم الهيكلي لمقلة العين. تشمل الطبقة الوسيطة القزحية والجسم الهدبي والمشيمية ، والأخيرة مسؤولة عن إمداد المستقبلات الضوئية بالدم. أخيرا ، تتكون الطبقة الداخلية من شبكية العين ، وهي بنية مسؤولة عن معالجة محفزات الضوء وتحويل الضوء إلى إشارات كهربائية يتم إرسالها إلى الدماغ لتكوين الصورة1،2.

تتكون شبكية العين العصبية من عدة طبقات خلوية ، بما في ذلك الخلايا المتخصصة مثل المستقبلات الضوئية والخلايا ثنائية القطب والخلايا الأفقية وخلايا amacrine والخلايا العقدية. بالإضافة إلى ذلك ، تحتوي شبكية العين على خلايا دبقية مثل الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية وخلايا مولر ، بالإضافة إلى الخلايا الظهارية المصطبغة. هذا الأخير ، الموجود في الجزء غير العصبي من شبكية العين ، يلعب دورا مهما في الحفاظ على السلامة الهيكلية والحماية ودعم المستقبلات الضوئية3،4. يضم الجزء العصبي الخلايا الحسية والعصبية التي تشارك بشكل مباشر في التقاط الضوء ومعالجته5،6،7.

كونها ضرورية للرؤية ، غالبا ما تتأثر شبكية العين بالأمراض التي يمكن أن تؤدي إلى العمى. من بين هذه الحالات ، تبرز التهاب الشبكية الصباغي (RP) كواحدة من اعتلال الشبكية الوراثي الرئيسي ، مع أكثر من 80 جينا مرتبطا بمسبراته8،9. RP هو مرض غير متجانس ، وراثي في الغالب بطريقة وراثية سائدة أو متنحية ، ولكنه قد يحدث أيضا على أنه مرتبط ب X أو بسبب طفرات عفوية10.

مع انتشار عالمي يقدر بين 1 من كل 3,000 و 1 من كل 7,000 فرد ، اعتمادا على السكان والمنطقة الجغرافية11,12 ، يظهر RP عادة خلال فترة المراهقة أو أوائل مرحلة البلوغ ، مع أعراض أولية مثل انخفاض الرؤية الليلية وفقدان المجال البصري المحيطي. مع تقدم المرض ، تصبح الرؤية المركزية معرضة للخطر ، مما قد يؤدي إلى العمى التام9،13.

على الرغم من عدم وجود علاج ل RP حتى الآن ، إلا أن العلاجات المختلفة قيد التطوير أظهرت إمكانية إبطاء أو عكس تطور المرض. من بين هذه الأساليب العلاجات الجينية والخلوية والدوائية ، وكذلك الأجهزة الإلكترونية. لتعزيز فهم RP وتقييم التدخلات الجديدة ، تم استخدام نماذج الفئران لتنكس الشبكية على نطاق واسع. هذه النماذج ، التي يشار إليها غالبا باسم rd (تنكس الشبكية) ، هي أدوات قيمة لدراسة الأساس الجزيئي وعلاجات RP. من بين النماذج المختلفة المستخدمة في دراسة التهاب الشبكية الصباغي ، تقدم سلالة الفأر Pde6βrd10 / rd10 (rd10) طفرة خاطئة في الجين الذي يشفر الوحدة الفرعية β الخاصة بالقضيب من phosphodiesterase14 ، مما يدل على تنكس بطيء للمستقبلات الضوئية مشابه لما يحدث في البشر15.

تم استخدام إعطاء الأدوية داخل الجسم الزجاجي على نطاق واسع في دراسات مختلفة16،17،18. هذا البروتوكول مناسب للباحثين الذين يدرسون تأثيرات الدواء على شبكية العين ، لا سيما فيما يتعلق ببقاء الخلايا المستقبلة للضوء. وبهذه الطريقة ، فإن الهدف الأساسي من هذا البروتوكول هو تحسين توصيل الدواء عن طريق الحقن داخل الجسم الزجاجي في نموذج الفئران لالتهاب الشبكية الصباغي (RP) وتقييم بقاء المستقبلات الضوئية باستخدام التألق المناعي للريكويرفين ، وهو علامة خلية مستقبلة للضوء. يتيح الحقن داخل الجسم الزجاجي إعطاء الأدوية الموضعية ، وتقليل الآثار الجانبية الجهازية ، وزيادة التوافر البيولوجي للشبكية ، وتقليل الآثار الضارة في الأعضاء الأخرى. من ناحية أخرى ، يسمح التألق المناعي للتعافي بتحليل محدد لبقاء المستقبلات الضوئية ، مما يوفر أداة فعالة لتقييم فعالية هذه الاستراتيجية العلاجية. ومع ذلك ، فإن قابليتها للتطبيق يعتمد على عوامل مثل اختيار نموذج ودقة الحقن ومدة العلاج ، والتي يجب مراعاتها عند تكييف هذه الطريقة مع الإعدادات التجريبية الأخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يتبع المشروع وجميع البروتوكولات التي تم تنفيذها في إطاره إرشادات رعاية الصادرة عن المجلس القومي للرقابة على التجارب على وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات استخدام (CEUA - UFF) تحت الرقم 1464280219.

1.

  1. استخدم سلالة الفئران rd10 ، التي تخضع لتنكس المستقبلات الضوئية ، وسلالة C57 Black / 6 (خلفية rd10). حافظ على هذه السلالات في دورة فاتحة وظلام مدتها 12 ساعة / 12 ساعة ، مع إمكانية الوصول إلى الماء والطعام.

2. التخدير

  1. إجراء حقنة داخل الصفاق بمخدر محضر بجرعة 80 ملغ/كغ من الكيتامين و8 ملغ/كغ من الزيلازين المخفف في الماء المقطر. يعمل الكيتامين كمثبط لمستقبلات N-methyl-D-aspartate (NMDA) ، مما يوفر تأثيرات مسكنة ، بينما يعمل الزيلازين كمسكن مخدر.
  2. بالنسبة للحقن داخل الصفاق ، احسب الحجم المراد حقنه على أنه 10 ميكرولتر × الوزن (جم).
  3. كبح جماح الماوس لضمان الوصول الواضح إلى البطن. نظف الربع الأيمن السفلي من تجويف البطن بنسبة 70٪ كحول ، حيث يجب إدخال الإبرة بحيث يكون الشطبة متجهة لأعلى.
  4. لتأكيد عدم وجود رد فعل للألم ، اضغط برفق على ذيل أو مخلبه. إذا لم يكن هناك رد فعل ، فهذا يشير إلى أن مخدر بشكل صحيح.

3. الحقن داخل الجسم الزجاجي

  1. مع تخدير ، قم بتعريض العينين ، وباستخدام مجهر مجاسم مجهر بتكبير 10x ، حدد منطقة الأطراف ، وهي شريط رمادي بين القرنية والصلبة ، حيث سيتم إجراء الحقن.
  2. لإجراء الحقن ، هناك حاجة إلى مساعدة من شخص آخر. تحت المجهر المجسمة المجهري ، يتعين على شخص واحد أن يمسك ويدخل الإبرة ، بينما يضغط المساعد على مكبس المحقنة لإدخال المادة في العين.
  3. أولا ، استخدم حقنة فائقة الدقة بإبرة ثابتة (31 جم × 6 مم) لعمل ثقب في منطقة الأطراف ، مع الحرص على عدم إدخال الإبرة بعمق شديد ؛ يكفي إدخال نصف شطبة فقط.
  4. بعد ذلك ، أدخل المحقنة الدقيقة المحمولة مسبقا المعقمة باليد (المقياس 26 S بدون شطبة) ، والتي تحتوي على 1 ميكرولتر من السائل / الدواء المعني ، في الثقب الذي تصنعه حقنة الأنسولين.
  5. اطلب من المساعد الضغط على مكبس المحقنة ببطء ، مع التأكد من إدارة مستوى الصوت بالكامل على مدار 30 ثانية تقريبا.
  6. كرر العملية للعين الأخرى لنفس وسجل الوقت.
  7. إذا كان هناك أكثر من مجموعة تجريبية واحدة ، فقم بتمييز أذن لضمان التحديد المناسب لكل مجموعة.
  8. استخدم قطرة واحدة من محلول 0.01 M PBS في كل عين من عين لمنع الجفاف.
  9. بعد هذه الإجراءات ، ضع على وسادة تدفئة ، مع ضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية ، حتى تستيقظ. يمكن أن يستغرق 1-2 ساعة. راقب باستمرار أثناء التخدير ، وبمجرد الاستيقاظ ، أعدها إلى أقفاصها حتى وقت التحليل.
  10. قم بإجراء جلسة تدريبية أولية باستخدام صبغة مرئية ، مثل التريبان الأزرق ، لمساعدة المشغلين على تحسين تقنية الحقن داخل الجسم الزجاجي في الفئران.
    ملاحظة: تسهل الصبغة تصور مسار الإبرة ، مما يسمح بإجراء تعديلات دقيقة في عمق وزاوية الحقن ، مما يقلل من خطر تلف بنية العين ويزيد من سلامة الإجراء.

4. القتل الرحيم وإعداد العين

  1. بعد فترة محددة من العلاج بعد الحقن ، قم بالقتل الرحيم للحيوانات عن طريق استنشاق جرعة زائدة من الأيزوفلوران بنسبة 5٪. استمر في التعرض حتى 1 دقيقة على الأقل بعد توقف التنفس. لضمان الموت ، أمسك من مؤخرة العنق وقم بتطبيق جر قوي على الذيل حتى يتم خلع عنق الرحم.
  2. قبل إزالة العينين ، ضع علامة على القطب الصدغي. ضع العلامة أو الإبرة / الدبوس الساخن بعناية على المنطقة الزمنية للصلبة ، مع التأكد من أن العلامة مرئية ودقيقة. ستكون هذه الخطوة بمثابة نقطة مرجعية للتوجيه أثناء عملية التقسيم.
  3. بعد ذلك ، قم بتعريض العينين ، وباستخدام مشرط معقم ومقص استئصال القزحية ، قم بقص الأنسجة المحيطة لفصل الأنسجة الضامة والعضلية وفضح مقلة العين. في الفئران ، قم بتشريح عضلات العين بعناية ، لأن هذا قد يكون صعبا. لتسهيل الإجراء ، قم بعمل شق جانبي بمشرط معقم في كلا زاويي جلد العين.
  4. باستخدام ملقط منحني متوسط الطرف ، قم بإزالة العينين برفق من تجويف العين عن طريق إمساكهما بالعصب البصري وقم بتثبيت الأنسجة على الفور لمدة 5 دقائق في محلول بارافورمالدهيد (PFA) بنسبة 4٪ في درجة حرارة الغرفة (RT).
  5. بعد التثبيت في محلول PFA ، انقل العينين إلى صفيحة زجاجية باستخدام ملقط منحني متوسط الطرف. تعمل هذه اللوحة كمنصة تشريح وتضمن احتوائها على مخزن مؤقت للفوسفات بتركيز 0.1 متر ، ودرجة الحموضة 7.4.
  6. بعد ذلك ، ضع اللوحة تحت مجهر مجاسم مجهر بتكبير 10x ، وقم بعمل شق صغير فوق الطرف مباشرة (حدود القرنية) باستخدام مشرط. بعد ذلك ، قم بإجراء قطع محيطي بعد الأطراف باستخدام مقص استئصال القزحية المجهرية لفصل القرنية.
  7. قم بإزالة القرنية مع القزحية والعدسة باستخدام ملقط Dumont # 5. أخيرا ، ثبتي العينين مرة أخرى في محلول 4٪ PFA لمدة 55 دقيقة. بعد ذلك ، اغسل العينين ثلاث مرات باستخدام عازلة الفوسفات 0.1 م ، درجة الحموضة 7.4.

5. الحفظ بالتبريد والتجميد

ملاحظة: تم إجراء قسم ناجمة النسيج في الشبكية كما هو موضح سابقا مع بعض التعديلات19.

  1. حافظ على العينين بالتبريد بتدرج سكروز بنسبة 10٪ و 20٪ و 30٪ ، مخفف في محلول فوسفات 0.1 M ، درجة حموضة 7.4. اغمر العينين بالتتابع في محاليل السكروز ، بدءا من أقل تركيز (10٪) وزيادة تدريجية إلى الأعلى (30٪). تستمر كل خطوة للوقت اللازم حتى تستقر العيون في قاع الحاوية ، مما يشير إلى أنه يمكن استخدام التركيز التالي. في التركيز النهائي ، قم بتخزين العينين عند 4 درجات مئوية لمدة 12 ساعة تقريبا.
  2. في اليوم التالي ، قم بإزالة السكروز الزائد بنسبة 30٪ وضع العينين في وعاء دائري من الألومنيوم بقطر 2 سم ، مرتبة وفقا للمجموعات التجريبية.
    ملاحظة: اصنع حاوية رقائق الألومنيوم بالحجم المناسب وفقا لعدد المجموعات التجريبية.
  3. تحت مجهر مجسمة مجهر بتكبير 10x ، قم بإزالة السكروز الزائد من داخل وحول مقلة العين باستخدام ماصة أو ورق ترشيح ، مع الحرص اللازم على عدم إتلاف بنية الأنسجة.
  4. قم بتضمين العينين في وسط التجميد بدرجة حرارة القطع المثلى (OCT) ، مع الحرص على تجنب تكوين الفقاعات داخل العينين أو حولها ، واتركها لمدة 1 ساعة في RT.
  5. بعد 1 ساعة في OCT ، ضع العينين بحيث تكون النقطة المرجعية المحددة مسبقا متجهة لأعلى. ضع حاوية رقائق الألومنيوم على لوح ألومنيوم مناسب داخل صندوق صغير من الستايروفوم للتجميد.
  6. صب النيتروجين السائل بحذر على لوح الألمنيوم ، حول حاوية القصدير. تأكد من انتشار النيتروجين بالتساوي عبر السطح. هذا يعزز تجميد الأنسجة بشكل موحد. تأكد من أن النيتروجين السائل لا يتلامس بشكل مباشر مع العينين داخل حاوية القصدير. ثم تابع تقسيم العينين باستخدام ناظم البرد.

6. إعداد الشريحة

  1. انشر بولي إل ليسين (200 ميكروغرام / مل) على الشرائح الزجاجية ذات الحواف المصنفرة.
  2. انتظر لمدة 12 ساعة حتى تجف الشرائح وتكون جاهزة للاستخدام.

7. تقسيم Cryostat

  1. على جهاز التبريد ، ضع الكتلة المجمدة على المنصة.
  2. أدر العجلة اليدوية لعمل أقسام بسمك 10 ميكرومتر.
  3. اضبط موضع الكتلة للتأكد من وجود جميع العيون بشكل متساو في القطع.
  4. استمر في القطع حتى يتم تحديد العصب البصري باستخدام مجهر المجال الساطع.
  5. اجمع الأقسام الموجودة على الشرائح المعالجة مسبقا من poly-L-lysine.
  6. قم بتخزين الشرائح عند -20 درجة مئوية حتى التحليل.

8. التألق المناعي

ملاحظة: تم إجراء التألق المناعي كما هو موضح سابقا مع بعض التعديلات19،20.

  1. احتضان الشرائح التي تم الحصول عليها من القسم الموجود في ناظم البرد مع 100 ميكرولتر من 0.5٪ Triton X-100 في 0.01 M PBS لمدة 15 دقيقة في RT لاختراق غشاء بلازما الخلية.
  2. اغسل الشرائح مرتين باستخدام 0.01 M PBS لمدة 5 دقائق لكل منهما في RT لإزالة Triton X-100 الزائد.
  3. احتضان 100 ميكرولتر 1٪ ألبومين مصل بقري (BSA) في 0.01 M PBS لمدة 30 دقيقة في RT لمنع مواقع ربط الأجسام المضادة غير المحددة.
  4. بعد الحظر ، احتضان الأقسام ب 100 ميكرولتر من مضاد التعويض بتركيز 1: 1500 مخفف في BSA 1٪ لتسمية الخلايا المستقبلة للضوء ، طوال الليل عند 4 درجات مئوية (الثلاجة).
  5. في اليوم التالي ، احتضان الأقسام التي تحتوي على 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي متعدد النسيلة المضاد للأرانب 488 أو الجسم المضاد الثانوي متعدد النسيلة المضاد للأرانب 568 1: 500 المخفف في BSA 1٪ لمدة ساعتين في RT.
  6. اغسل الشرائح مرتين باستخدام 0.01 M PBS لمدة 5 دقائق لكل منهما في RT.
  7. احتضان الأقسام ب 100 ميكرولتر من DAPI 1 مجم / مل (4 '، 6-diamidino-2-phenylindole) لمدة 2-3 دقائق في RT.
  8. اغسل الشريحة مرة واحدة باستخدام 0.01 M PBS لمدة 5 دقائق في RT.
  9. أخيرا ، عالج الأقسام بوسط تركيب يحتوي على 2.5 جم من n-propyl gallate في 40 مل من الجلسرين في 0.1 M من الفوسفات عازلة الرقم الهيدروجيني 7.4. سوف تعمل ككاشف مضاد للبهتان ووسيط تركيب ، مع الحفاظ على العينات. ضع غطاء (24 مم 50 مم) فوق الشرائح ، ثم أغلق الأقسام بطلاء الأظافر. بعد ذلك ، تابع عرض العينات تحت المجهر.

9. المجهر الفلوري المجهر الضوئي

  1. للحصول على صور للخلايا المصنفة باستخدام تقنية الكيمياء المناعية ، استخدم مجهر ضوئي مضان مزود بمرشحات زرقاء وخضراء وحمراء. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتوصيل كاميرا للتصوير المجهري للشرائح. للحصول على الصور المجهرية ، استخدم جهاز كمبيوتر مزود ببرنامج LAS V3.7 (Leica) (برنامج التصوير) ، والذي يجب أن يكون مفتوحا للتصور المتزامن مع المجهر.
  2. ضع الشريحة على مرحلة المجهر. في البداية، استخدم هدف التكبير الأدنى والفلتر الأزرق.
  3. اضبط التركيز باستخدام مقابض التركيز البؤري الخشنة والناعمة حتى يتم تصور شبكية العين ذات الخلايا المصنفة باللون الأزرق (نوى الخلية) بوضوح.
  4. حدد المنطقة المطلوبة من شبكية العين للتصوير. قم بزيادة التكبير تدريجيا حتى هدف 40 ضعفا ، واضبط التركيز البؤري حسب الحاجة.
  5. بعد ضبط التركيز البؤري ، اسحب دبوس الالتفافية لنقل صورة المجهر إلى برنامج التصوير. حدد المرشحات المطلوبة (A4 (أزرق) و L5 (أخضر) و TX2 (أحمر)). اضبط المعلمات التالية: التعرض والكسب وجاما، لضمان وضوح الصورة وأقرب ما يمكن إلى ما يتم ملاحظته تحت المجهر.
  6. عند التكبير 400× ، التقط أربعة حقول بمساحة 113 × 113 ميكرومتر ، بعد التوجيه من المحيط إلى مركز شبكية العين. تأكد من أن اثنين من هذه الحقول يمثلان المنطقة المحيطية ، واثنان يمثلان المنطقة الوسطى من شبكية العين.
  7. للحصول على صور مجهرية للمجال المحيطي ، التقط صورا على بعد حوالي 50 ميكرومتر من حواف العين. بالنسبة للصور المجهرية للمجال المركزي ، حدد المناطق المجاورة الواقعة على بعد 50 ميكرومتر من العصب البصري واحصل على الصور. استخدم العينين اليمنى واليسرى للتقديرات الكمية ، مما ينتج عنه ما مجموعه ثمانية حقول تم تحليلها لكل علاج.
  8. بعد الانتهاء من جميع الصور المجهرية ، تابع القياس الكمي اليدوي للخلايا المناعية.

10. القياس الكمي للخلية

  1. افتح برنامج ImageJ v.1.54g. داخل البرنامج ، انقر فوق ملف ، ثم فتح ، وحدد الصورة المحفوظة على الكمبيوتر.
  2. مع فتح الصورة بالفعل ، انقر فوق متعدد النقاط. استخدم هذه الأداة لتحديد الخلايا عن طريق النقر بزر الماوس الأيسر على كل خلية ليتم عدها.
  3. حدد كمية الخلايا المتوضعة ، أي إيجابية ل recoverin و DAPI ، في الطبقة النووية الخارجية (ONL).
  4. عند اكتمال العد، انقر نقرا مزدوجا باستخدام زر الماوس الأيسر لرؤية العدد الإجمالي للخلايا التي تم وضع علامة عليها.
  5. بعد تحديد عدد الخلايا الإيجابية للاسترداد ، أدخل عدد الخلايا في جدول القياس الكمي في Excel وانتقل إلى الصورة المجهرية التالية.
  6. كرر جميع الخطوات للحقول الثمانية المقابلة لكل.
  7. احسب متوسط هذه الحقول الثمانية ، المقابلة لنقطة تجريبية واحدة لشبكية العين بأكملها (ن = 1). بالنسبة للرسم البياني للشبكية المحيطية ، استخدم متوسط الحقول الطرفية ، بإجمالي أربعة حقول: اثنان من العين اليسرى واثنان من العين اليمنى. يتوافق هذا المتوسط مع نقطة تجريبية واحدة للشبكية المحيطية (ن = 1). قم بإنشاء مركز الرسم البياني لشبكية العين بنفس طريقة الرسم البياني المحيطي ، مع تغيير المنطقة فقط.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

سمحت لنا تقنية التألق المناعي لوضع العلامات على المستقبلات الضوئية ، والخلايا الإيجابية للتعافي ، بمراقبة نمط التنكس للمستقبلات الضوئية في rd10 و C57Bl6 ، مع اعتبار الأخيرة صحية (الشكل 1). كما يتضح من ذلك ، فإن وضع العلامات على الخلايا الإيجابية للتعافي حصري للطبقة النووية الخارجية (ONL) حيث توجد المستقبلات الضوئية ، بما في ذلك وضع العلامات على الأجزاء الداخلية لهذه الخلايا ، سواء في rd10 أو البرية. مع تقدم التطوير ، يمكننا ملاحظة الحفاظ على تلطيخ المناعة الف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

شبكية العين هي نسيج حساس يصعب الوصول إليه. لذلك ، يجب مراعاة التقنية التي سيتم استخدامها لإجراء العلاج الدوائي الذي يستهدف هذا الأنسجة. الحقن داخل الجسم الزجاجي هو تقنية راسخة ومستخدمة على نطاق واسع لتوصيل الأدوية مباشرة إلى شبكية العين ، لا سيما في علاج أمراض العين مثل الضمور البقعيالمرتبط بالعمر 21 ، واعتلال الشبكية السكري22 ، والتهاب الشبكية الصباغي23. تمشيا مع بروتوكولنا ، استخدمت العديد من الدراسات أي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

شكر وتقدير

تم إجراء هذا العمل خلال زمالة بحثية بدعم من المجلس الوطني للتنمية العلمية والتكنولوجية (CNPq) ، مؤسسة كارلوس شاغاس فيلهو لدعم البحوث في ولاية ريو دي جانيرو (FAPERJ) ، كما تم تمويله جزئيا من قبل Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Code 001.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.3٪ Triton-X-100Sigma-AldrichT8787حل لحجب المخزن
1٪ BSASigma-AldrichA4503حل لحجب المخزن
1٪ Human BD Fc BlockBD Biosciences564220Fc Block المطلوب لحجب المخزن
مصباح LED 150 واطAmazonB07VH3CVSFمصدر ضوء LED للإشعاع الضوئي للأنسجة
1x PBS Gibco10010-023حل لمنع خطوات المخزن المؤقت والغسيل
تخزين سعة 20 جالونحاويةأمازون B001B1C4G0لعملية التشعيع
الضوئي 40 واط مصباح LED للفيضانات RGBW   ؛مصدر ضوء AmazonB08QFPJSMDRGB للإشعاع الضوئي للأنسجة
Ag85BAbcamab43019 / NAالجسم المضاد لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
ألفا العضلات الملساء أكتين DyLight 755Novus BiologicalsNBP2-345221R / NAالجسم المضاد لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
مجموعة حجب أفيدين / البيوتينAbcamab64212محلول حجب أفيدين والبيوتين
حل التثبيت BD Cytofix / CytopermBD Biosciences554714التثبيت
BOND Dewax SolutionLeica BiosystemsNC0221076محلول إزالة البارافين
حل استرجاع الحاتمة BOND 1Leica BiosystemsNC0235529استرجاع الحاتمة القائم على السترات ( ER1)
حل استرجاع الحاتمة BOND 2Leica BiosystemsNC0235530استرجاع الحاتمة القائم على درجة الحموضة 9 القائم على EDTA (ER2) نظام
الكشف عن أبحاث BONDLeica BiosystemsNC0396648كاشف تلطيخ البحث الآلي
BOND RX Research StainerLeica BiosystemsNAمنصة تلطيخ الأبحاث
الآلية BOND Wash SolutionLeica BiosystemsNC0221077المخزن المؤقت
للغسيل CD15BD Biosciences347420 / AB_400298الجسم المضاد لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientific50-0202-82 / AB_11150959الجسم المضاد لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
CD4 Alexa Fluor 488R & D SystemsFAB8165G / AB_2728839الجسم المضاد لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
CD45 Phycoerythrin (PE)Novus BiologicalsNBP2-34528PE / NAالجسم المضاد لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
CD68 iFluor 594Caprico Biotechnologies1064135 / AB_2892745الجسم المضاد لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
الحمار المضاد للماعز IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher ScientificA32814 / AB_2762838الجسم المضاد لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
الحمار المضاد للفأر IgG Alexa Fluor Plus AF647Thermo Fisher ScientificA32787 / AB_2762830للتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
الحمار المضاد للفأر IgM Alexa Fluor 488Jackson ImmunoResearch715-545-020 / AB_2340844الجسم المضاد لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
الحمار المضاد للأرانب IgG Alexa Fluor Plus AF555Thermo Fisher ScientificA32794 / AB_2762834الجسم المضاد لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
نظام تلطيخ EasyDipالوافد الجديد توريد5300KITنظام تلطيخ الشرائح
Fluoromount-GThermo Fisher Scientific00-4958-02وسائط التركيب
HoechstBiotium40046وصمة عار نووية للتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
Imaris File Converter x64 10.2.0Imaris Oxford Instrumentsمحول الملفات الحر
ImarisViewer software x64 10.2.0Imaris Oxford Instrumentsبرنامج معالجة الصور المجاني
ImmEdge PenVector LaboratoriesH-4000قلم حاجز كاره للماء
ليثيوم بوروهيدريد (1 جرام)STREM Chemicals93-0397مادة كيميائية لتعطيل الصبغة ، قم بشراء كميات صغيرة من هذه المادة الكيميائية (1 جرام)
Lumican BiotinR & D SystemsBAF2846الأجسام المضادة لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
نظارات الغطاء الصغيرVWR48393-241أغطية الشريحة الزجاجية
عموم السيتوكيراتين أليكسا فلور 750Novus BiologicalsNBP2-33200AF750 / AB_2868569الجسم المضاد لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
نظام الميكروويف PELCO BioWave ProTed Pella Inc36500-230ميكروويف علمي غير قابل للتسخين
PELCO SteadyTemp ProTed Pella Inc50062تحكم آلي بالكامل في درجة الحرارة للميكروويف العلمي
SimpleITKبرنامجمفتوح المصدر برنامج التسجيل ومعالجة القنوات
Streptavidin Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificS11227كاشف الملصقات لتصوير IBEX. انظر الجدول 1.
مجهر واسع النطاقLeica MicrosystemsNALeica Microsystems جهاز تصوير الرعد مع مصدر ضوء LED8 وبرنامج LAS X (3.7.1.21655). بالنسبة للتصوير الفلوري ، تم استخدام مرشح رباعي النطاق مخصص مع عجلة مرشح خارجية (PN: 11536075) مع مرشحين إضافيين أحادي النطاق (PN: 8118215) لتصوير سبع قنوات صبغ لكل تمريرة. خطوط إثارة المرشح وخطوط الانبعاثات هي (1) مكعب رباعي النطاق: ثنائي اللون عند 391/32 ، 479/33 ، 554/24 ، 638/31 ، لا توجد مرشحات إثارة أو انبعاث. (2) موضع عجلة المرشح الخارجي 1: 434/32 ، الموضع 2: 520/40 ، الموضع 3: 585/20 ، الموضع 4: 720/60 ، الموضع 5: المرور ؛ (3) نطاق واحد 1 &[مدش] ؛ 585/22 الإثارة ، 594 ثنائي اللون ، 625/30 انبعاث ؛ (4) أحادي النطاق 2 &[مدش] ؛ 635/20 إثارة ، 647 ثنائي اللون ، انبعاث 667/30.
منظف العدسات البصرية Zeissمنظف العدسة الموضوعيةمن AmazonB00GPVQVCO
المجهر <قوي > الأجسام المضادة < / قوي >
Ag85BAbcamab43019متعدد النسيلة أرنب IgG ، دورة 1
أكتين العضلات الملساء ألفا DyLight 755Novus BiologicalsNBP2-345221R1A4 / asm-1 ، دورة 1
CD4 Alexa Fluor 488R &;D أنظمةFAB8165Gالماعز متعدد النسيلة IgG ، الدورة 1
CD8 Alexa Fluor 647BioLegend372906C8 / 144B ، الدورة 1
CD68 iFluor 594Caprico Biotechnologies1064135KP1 ، الدورة 1
الحمار المضاد للماعز IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher ScientificA32814حمار متعدد النسيلة ، دورة 1
حمار مضاد للفأر IgG Alexa Fluor Plus AF647Thermo فيشر ScientificA32787حمار متعدد النسيلة ، دورة 1
حمار مضاد للأرانب IgG Alexa Fluor Plus AF555Thermo Fisher ScientificA32794حمار متعدد النسيلة ، دورة 1
HoechstBiotium40046ملصق نووي ، دورة 1
CD15BD Biosciences347420MMA ، دورة 2
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientific50-0202-82L26 ، دورة 2
CD45 Phycoerythrin (PE)Novus BiologicalsNBP2-34528PE2B11 + PD7 / 26 ، الدورة 2
الحمار المضاد للفأر IgM Alexa Fluor 488Jackson ImmunoResearch715-545-020حمار متعدد النسيلة ، دورة 2
Lumican BiotinR & D SystemsBAF2846Polyclonal Goat IgG ، الدورة 2
عموم السيتوكيراتين Alexa Fluor 750Novus BiologicalsNBP2-33200AF750AE-1 / AE-3 ، الدورة 2
Streptavidin Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificS11227N / A ، الدورة 2
HoechstBiotium40046الدورة 2
Solutions< / قوي>
<قوي>Blocking Buffer (الدورة 1)
Triton-X-100Sigma-AldrichT87870.3٪ من حيث الحجم
BSASigma-AldrichA45031٪ من حيث الحجم
Human BD Fc BlockBD Biosciences5642201٪ حسب الحجم
1x PBS Gibco10010-02397.7٪ من حيث الحجم
<قوي>محلول تلطيخ الأجسام المضادة الأولية # 1 (الدورة 1) < / قوي >
مانع المخزن المؤقت (الدورة 1) انظرأعلاهقم بتعبئة الحجم بعد إضافة الأجسام المضادة
HoechstBiotium400461: 5000
CD8 AF647BioLegend3729061:10
<قوي>محلول تلطيخ الأجسام المضادة الأولية # 2 (الدورة 1)< / قوي >
مانع العازلة (الدورة 1)انظر أعلاهتعبئة الحجم بعد إضافة الأجسام المضادة
CD4   ؛ AF488R& D SystemsFAB8165G1:10
Ag85BAbcamab43019 / NA1: 100
محلول تلطيخ الأجسام المضادة الثانوية # 1 (الدورة 1) < / قوي >
مانع المخزن المؤقت (الدورة 1)انظر أعلاهبتعبئة الحجم بعد إضافة الأجسام المضادة
للحمار المضادة AF Plus 488Thermo Fisher ScientificA32814 / AB_27628381:100
الحمار المضاد للأرانب AF Plus 555Thermo Fisher ScientificA32794 / AB_27628341:100
الحمار المضاد للفأر AF Plus 647Thermo Fisher ScientificA32787 / AB_27628301:50
محلول تلطيخ الأجسام المضادة الأساسي # 3 (الدورة 1) < / قوي >
مانع المخزن المؤقت (الدورة 1)انظرأعلاهتعبئة الحجم بعد الإضافة الأجسام المضادة
CD68 iF594Caprico Biotechnologies10641351:10
a-SMA DL755Novus BiologicalsNBP2-345221R / NA1:30
BSA خالية من BSA حجب المخزن المؤقت (الدورة 2)  
Triton-X-100Sigma-AldrichT87870.3٪ من حيث الحجم
Human BD Fc BlockBD Biosciences5642201٪ من حيث الحجم
1x PBS & nbsp ؛Gibco10010-02398.7٪ من حيث الحجم
<قوي>محلول تلطيخ الأجسام المضادة الأولية # 4 (الدورة 2) < / قوي >
خال من BSA مانع مانع (الدورة 2)انظر أعلاهبتعبئة الحجم بعد إضافة الأجسام المضادة
CD15BD Biosciences3474201:30
Lumican BiotinR & D SystemsBAF28461: 100
CD45 PENovus BiologicalsNBP2-34528PE1:20
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientific50-0202-821:10
Pan-Cytokeratin AF750Novus BiologicalsNBP2-33200AF7501:10
محلول تلطيخ الأجسام المضادة الثانوية # 2 (الدورة 2) < / قوي>
مخزن مؤقت للحجب الخالي من BSA (الدورة 2)انظر أعلاهقم بتعبئة الحجم بعد إضافة الأجسام المضادة
للحمار المضاد للفأر IgM AF488Jackson ImmunoResearch715-545-020 / AB_23408441:100
Strepavidin AF594Thermo Fisher ScientificS112271:200
المؤقت المؤقت المؤقت حاوية حل حل قم قم

المراجع

  1. Kels, J., et al. Anatomy and physiology of the retina: a comprehensive review. Retinal J. 21, 75-92 (2015).
  2. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
  3. Tsang, S. H., Sharma, T. Retinal degeneration and gene therapy: present and future approaches. Prog Retin Eye Res. 67, 93-120 (2018).
  4. Gasparini, S. J., Favretto, F., La Greca, C. Biology of the retina: structure, function, and dysfunction. J Biomed Sci. 19 (3), 289-300 (2019).
  5. Masland, R. Neuronal diversity in the retina. Curr Opin Neurobiol. 11 (4), 431-436 (2001).
  6. Masland, R. H. The neuronal organization of the retina. Neuron. 76 (2), 266-280 (2012).
  7. Hoon, M., et al. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
  8. Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
  9. Liu, W., et al. Retinitis pigmentosa: progress in molecular pathology and biotherapeutical strategies. Int J Mol Sci. 23 (9), 4883(2022).
  10. Hamel, C. Retinitis pigmentosa. Orphanet J Rare Dis. 1, 40(2006).
  11. Verbakel, S. K., et al. Non-syndromic retinitis pigmentosa. Prog Retin Eye Res. 66, 157-186 (2018).
  12. O'Neal, T. B., Tripathy, K., Luther, E. E. Retinitis Pigmentosa. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2025).
  13. Arango-Gonzalez, B., et al. Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration. PLoS One. 9 (11), e112142(2014).
  14. Chang, B., et al. Two mouse retinal degenerations caused by missense mutations in the beta-subunit of rod cGMP phosphodiesterase gene. Vision Res. 47 (5), 624-633 (2007).
  15. Jae, S. A., et al. Electrophysiological and histologic evaluation of the time course of retinal degeneration in the rd10 mouse model of retinitis pigmentosa. Korean J Physiol Pharmacol. 17 (3), (2013).
  16. Strettoi, E., et al. Inhibition of ceramide biosynthesis preserves photoreceptor structure and function in a mouse model of retinitis pigmentosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18706-18711 (2010).
  17. Rösch, S., Johnen, S., Mataruga, A., Müller, F., Pfarrer, C., Walter, P. Selective photoreceptor degeneration by intravitreal injection of N-methyl-N-nitrosourea. Investig Ophthalmol Vis Sci. 55 (3), 1711-1723 (2014).
  18. Kellish, P. C., et al. Intravitreal injection of a rationally designed AAV capsid library in non-human primate identifies variants with enhanced retinal transduction and neutralizing antibody evasion. Mol Ther. 31 (12), 3441-3456 (2023).
  19. Molday, L. L., Cheng, C. L., Molday, R. S. Cell-Specific Markers for the Identification of Retinal Cells and Subcellular Organelles by Immunofluorescence Microscopy. Retinal Degeneration. , Humana Press. New York. (2019).
  20. Cheng, C. L., Djajadi, H., Molday, R. S. Cell-Specific Markers for the Identification of Retinal Cells by Immunofluorescence Microscopy. Retinal Degeneration. , Humana Press. Totowa, NJ. (2012).
  21. Girgis, S., Lee, L. R. Treatment of dry age-related macular degeneration: a review. Clin Exp Ophthalmol. 51 (8), 835-852 (2023).
  22. Lee, J. Y., et al. Superoxide dismutase 3 prevents early stage diabetic retinopathy in streptozotocin-induced diabetic rat model. PLoS One. 17 (1), e0262396(2022).
  23. Isiegas, C., et al. Intravitreal injection of proinsulin-loaded microspheres delays photoreceptor cell death and vision loss in the rd10 mouse model of retinitis pigmentosa. Investig Ophthalmol Vis Sci. 57 (8), 3610-3618 (2016).
  24. Doshi, R. R., Bakri, S. J., Fung, A. E. Intravitreal injection technique. Semin Ophthalmol. 26 (3), 104-113 (2011).
  25. Kim, H. M., Woo, S. J. Ocular drug delivery to the retina: current innovations and future perspectives. Pharmaceutics. 13 (1), 108(2021).
  26. Jones, B. W., Marc, R. E., Pfeiffer, R. L. Retinal Degeneration, Remodeling and Plasticity. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , University of Utah Health Sciences Center, Salt Lake City. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK482309/"K482309 (2016).
  27. Roche, S. L., Wyse-Jackson, A. C., Byrne, A. M., Ruiz-Lopez, A. M., Cotter, T. G. Alterations to retinal architecture prior to photoreceptor loss in a mouse model of retinitis pigmentosa. Int J Dev Biol. 60, 127-139 (2016).
  28. Ladha, R., Caspers, L. E., Willermain, F., de Smet, M. D. Subretinal therapy: technological solutions to surgical and immunological challenges. Front Med. 9, 846782(2022).
  29. Varela-Fernández, R., et al. Drug delivery to the posterior segment of the eye: biopharmaceutic and pharmacokinetic considerations. Pharmaceutics. 12 (3), 269(2020).
  30. Bussing, D., et al. Pharmacokinetics of monoclonal antibody and antibody fragments in the mouse eye following intravitreal administration. J Pharm Sci. 112 (8), 2276-2284 (2023).
  31. Roberge, F. G., de Kozak, Y., Utsumi, T., Faure, J. P., Nussenblatt, R. B. Immune response to intraocular injection of retinal S-antigen in adjuvant. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 227 (1), 67-71 (1989).
  32. Ishikawa, T., Hokama, H., Katagiri, Y., Goto, H., Usui, M. Effects of intravitreal injection of tacrolimus (FK506) in experimental uveitis. Curr Eye Res. 30 (2), 93-101 (2005).
  33. Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry: the red, brown, and blue technique. Vet Pathol. 51 (1), 42-87 (2014).
  34. Gargini, C., Terzibasi, E., Mazzoni, F., Strettoi, E. Retinal organization in the retinal degeneration 10 (rd10) mutant mouse: a morphological and ERG study. J Comp Neurol. 500 (2), 222-238 (2007).
  35. Haverkamp, S., Wässle, H. Immunocytochemical analysis of the mouse retina. J Comp Neurol. 424, 1-23 (2000).
  36. Haverkamp, S., Ghosh, K. K., Hirano, A. A., Wässle, H. Immunocytochemical description of five bipolar cell types of the mouse retina. J Comp Neurol. 455, 463-476 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Cryostat Recoverin
الفيديو قريباً
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.