مقالة منهجية

في الجسم الحي تصوير النشاط العصبي في ذبابة الفاكهة البالغة غير المخدرة

1.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68332

⸱

يونيو 20, 2025

 , 
1Department of Biology, Georgetown University, 2Interdisciplinary Program in Neuroscience, Georgetown University

في هذه المقالة

ملخص

من العوائق الكبيرة لدراسة النشاط الخلوي أثناء العمليات المعرفية مثل التعلم والذاكرة استخدام التخدير لإعداد التصوير في الجسم الحي . يضعف التخدير الذاكرة والإدراك على المدى القصير في نماذج متعددة ، بما في ذلك ذبابة الفاكهة. تقدم هذه الدراسة طريقة فريدة لتحضير ذبابة الفاكهة للبالغين للتصوير في الجسم الحي بدون تخدير.

الملخص

يعد التصوير في الجسم الحي أمرا بالغ الأهمية لدراسة علم الأعصاب في ذبابة الفاكهة لأنه يسمح بالتصور في الوقت الفعلي للنشاط العصبي والتطور واللدونة داخل الذبابة السليمة والتصرفية. توفر هذه التقنية رؤى لا تقدر بثمن حول العمليات الديناميكية ، مثل الوظيفة المشبكية واتصال الدوائر ، والتي لا يمكن التقاطها بدقة في الاستعدادات الثابتة أو خارج الجسم الحي. تتضمن معظم تقنيات تحضير الذباب للتصوير في الجسم الحي تخدير الذباب قبل التصوير الوظيفي بوقت قصير. ومع ذلك ، تظهر الأدلة الواسعة أن التخدير يؤثر على العديد من العمليات المعرفية والفسيولوجية. لهذا السبب ، يعد التصوير في الجسم الحي لذبابة الفاكهة السوداء البالغة دون استخدام التخدير أثناء تحضير نهجا صعبا ولكنه مرغوب فيه للغاية. يتضمن البروتوكول المقدم هنا شل حركة رأس الذباب المستيقظ عن طريق شفط خرطوم في أنبوب معدني صغير متصل بنظام تفريغ. أثناء تثبيت الرأس ، يتم تحضير الذبابة للتصوير الوظيفي دون الحاجة إلى التخدير. هذا البروتوكول سريع وقابل للتكرار ، مما يضمن عدم إلحاق أي ضرر بالذبابة. تكمن الميزة الرئيسية لهذه الطريقة في تجنبها لاستخدام التخدير ، وبالتالي تفسير الآثار المعقدة المحتملة للتخدير على النشاط العصبي. هذه الطريقة ميسورة التكلفة وقابلة للتكيف بدرجة كبيرة ، باستخدام أدوات غير مكلفة وقابلة للتخصيص. يسمح بالتصوير الناجح للذباب الحي ، والتقاط التغيرات السريعة في النشاط العصبي المرتبط بالعمليات المعرفية الديناميكية.

المقدمة

أحدثت التطورات الحديثة في مراسلي النشاط المشفر وراثيا ثورة في علم الأعصاب من خلال توفير رؤى محددة للغاية في الوقت الفعلي حول النشاط العصبي. هؤلاء المراسلون ، مثل مستشعرات الكالسيوم أو الجهد1،2،3،4،5،6،7،8،9 ، يسمح للباحثين بتتبع الإشارات الكهربائية والكيميائية داخل الخلايا العصبية بدقة زمنية غير مسبوقة ودقة مكانية. من خلال تمكين مراقبة الخلايا العصبية المفردة المحددة للشبكات العصبية عبر مناطق الدماغ المختلفة ، عمقت هذه الأدوات فهمنا لكيفية ارتباط أنماط إطلاق الخلايا العصبية بالعمليات المعرفية مثل التعلم أو الذاكرة أو اتخاذ القرار10،11،12،13،14.

للاستفادة من هذه المؤشرات المشفرة وراثيا ، طور الباحثون طرقا متقدمة لإعداد الكائن الحي النموذجي للتصوير في الجسم الحي . تم اكتشاف التقرير الأول عن اللدونة العصبية عن طريق التصوير الوظيفي في الجسم الحي ، والذي يشار إليه غالبا باسم "تتبع الذاكرة" ، في الفص الهوائي لنحل العسل بعد التكييف الشمي الفاتح للشهية15. ألهم هذا الاكتشاف البحث في الكائن الحي النموذجي متعدد الاستخدامات وراثيا ، ذبابة الفاكهة السوداء ، مما أدى إلى تطوير تقنيات تصوير مبتكرة في الجسم الحي 10،16،17،18.

ذبابة الفاكهة بمثابة نموذج ممتاز لفهم التعلم والذاكرة نظرا لقدرتها القوية على تكوين ذكريات شمية عبر التكييف الكلاسيكي ، حيث ترتبط الرائحة (الحافز المشروط-CS) إما بحافز مكروض أو مجزي (الحافز غير المشروط - الولايات المتحدة) 19،20،21،22. في ذبابة الفاكهة ، يتم تمثيل الروائح بشكل ضئيل في جسم الفطر (MB) 23 ، وهي منطقة دماغية حرجة للذاكرة الترابطية تتكون من ما يقرب من 2,000 خلية عصبية لخلايا كينيون (KCs) لكل نصفالكرة 24. تنتقل المعلومات الشمية من الكأس إلى فصوص MB عبر محاور KC ، والتي تتجمع معا لتشكيل الفصوص. أثناء التكييف الشمي ، يتم نقل الولايات المتحدة ، مثل الصدمة الكهربائية أو مكافأة السكر ، إلى فصوص MB من خلال الخلايا العصبية الدوبامين المميزة (DANs): الخلايا العصبية PPL1 للمنبهات المكروهة والخلايا العصبية PAM للمنبهات المجزية25،26،27،28،29،30. يعتقد أن اكتساب الذاكرة ينطوي على التنشيط المتزامن لمسارات CS و US ، مما يؤدي إلى زيادة تآزرية في AMP الدوري (cAMP) ، والذي يشفر الذاكرة31،32. تحفز هذه العملية اللدونة في نقاط الاشتباك العصبي KC→MBON ، مما يعدل وزنها المشبكي11،12،13،33،34،35،36،37. تدفع اللدونة بوساطة DAN في النهاية الخلايا العصبية لإخراج جسم الفطر (MBONs) لاستنباط إما نهج أو سلوك تجنب تجاه الرائحة المكتسبة34. يقترح النموذج الحالي أن تدفق المعلومات من KCs إلى MBONs يحول تمثيل الرائحة من هوية الرائحة في KCs إلى معلومات أكثر تجريدا في MBONs ، مثل تكافؤ الرائحة بناء على الخبرة السابقة34،38. على عكس KCs ، فإن MBONs لديها استجابات الرائحة المضبوطة على نطاق واسع. أي رائحة معينة تؤدي إلى استجابة لمعظم MBONs39. يتم تعديل ضبط رائحة MBONs عن طريق اللدونة المشبكية ويختلف اختلافا كبيرا بين الذباب الفردي ، مما يشير إلى أن MBONs يغيرون استجابتهم للروائح بناء على التجربة. هناك 34 ميجابايت ، مع تقسيم غالبية شبكة MBON على ما يبدو إلى فئتين متعارضتين تقودان أيا من نهج سلوكالتجنب 34. لهذا السبب ، تم استخدام التصوير في الجسم الحي لدراسة استرجاع الذاكرة عن طريق التسجيل في MBONs مختلفة على نطاق واسع.

تشمل الطرق المبكرة للتصوير الوظيفي في الجسم الحي إجراء عمليات جراحية لإزالة جزء من بشرة من أعلى كبسولة الرأس ، والتي تم تغطيتها بعد ذلك بقطعة صغيرة من غلاف بلاستيكي18. في حين أن هذا يمثل بداية التصوير في الجسم الحي في ذبابة الفاكهة ، فقد حدثت منذ ذلك الحين تطورات كبيرة في تقنيات تحضير الذباب وتوصيل المحفزات تحت المجهر للتحقيق في عمليات مثل التعلم والذاكرة. ومع ذلك ، حتى اليوم ، تتضمن معظم تقنيات تحضير الذباب للتصوير في الجسم الحي تخدير الذباب. تمثل هذه الممارسة تحديات ، حيث توجد أدلة واسعة - ومجالا كاملا من البحث - توضح كيف يؤثر التخدير على الذاكرة ، بالإضافة إلى العمليات المعرفية والفسيولوجية الأخرى. على سبيل المثال ، أجريت دراسة لفهم آثار التخدير المختلفة التي يشيع استخدامها في المختبر (ثاني أكسيد الكربون ، الأيزوفلوران ، سيفوفلوران ، والصدمة الباردة). ووجدوا أنه كلما طالت مدة التعرض للتخدير ، كانت هناك زيادة في وقت الشفاء ، وتغيرات في النشاط الحركي ، وانخفاض الخصوبة ، وقد تؤثر على مخازن الماء والدهون40. بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ عن أن إعطاء التخدير بالصدمة الباردة مباشرة بعد التدريب يمكن أن يعطل الذاكرة قصيرة المدىتماما 21. من هذه الدراسة الأولية ، من المعروف الآن أنه في ذبابة الفاكهة ، توجد ذاكرة غير موحدة (ذاكرة حساسة للتخدير) تتحلل في غضون 6-8 ساعات ، وشكل من أشكال الذاكرة الموحدة (الذاكرة المقاومة للتخدير) التي تتشكل تدريجيا بعد التعلم ويمكن أن تستمر حوالي 24 ساعةو 41. بناء على ذلك ، يمكن أن يؤثر التخدير على المعالجة المعرفية ونشاط الخلايا العصبية ، مما يسمح في النهاية بالتعبير السليم عن الذاكرة.

لا تقتصر آثار التخدير على الذاكرة على ذبابة الفاكهة. أظهرت العديد من الدراسات البشرية وغيرها من الدراسات التي أجريت على الثدييات نتائج مماثلة. على سبيل المثال ، وجدت دراسة مقطعية أجريت في مستشفى جامعي أن الذاكرة قصيرة المدى قد انخفضت بشكل كبير لدى المرضى بعد 24 ساعة من التخدير العام42. وجدت دراسة أخرى أجريت على الفئران أن التخدير العام قلل بقوة من ديناميكيات الارتفاع ، والمجموعات الخلوية المزخرفة ، وتغيير ديناميكيات العمود الفقري في منطقة CA1 من الحصين ، وهي منطقة دماغية مهمة تشارك في التعلم والذاكرة في الثدييات43. للتغلب على هذه الصعوبات ، فإن الهدف من هذه الدراسة هو توفير بروتوكول جديد يلغي استخدام التخدير أثناء تحضير الذباب للتصوير في الجسم الحي ، مما يترك جسم الذبابة حرا تماما. يسمح هذا النهج بتسجيلات أكثر دقة للنشاط العصبي ، ويحسن صحة الذباب لتسجيلات أطول ، ويزيل الآثار المربكة المحتملة للتخدير مقارنة بالأساليب الأخرى. تم تصميم هذا البروتوكول لتسجيل النشاط من الخلايا العصبية في ذبابة الفاكهة ، وتحديدا النظر في كيفية إظهار الخلايا العصبية اللدونة أثناء وبعد تجربة التعلم. ومع ذلك ، فإن بروتوكول التشريح متعدد الاستخدامات ويمكن تكييفه مع تطبيقات مختلفة في أبحاث التصوير الحي.

البروتوكول

تفاصيل المعدات والكواشف المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. ذباب الفاكهة المعدلة وراثيا ، ذبابة الفاكهة السوداء

  1. عبر الإناث العذارى والذباب الذكور (ترتفع عند 25 درجة مئوية في رطوبة نسبية 60٪ في دورة ضوء / ظلام مدتها 12 ساعة) تحمل تركيبات Gal4 و UAS المرغوبة ، على التوالي ، لإنتاج ذباب تعبر فيه الخلايا العصبية المحددة ذات الأهمية عن مبلغ النشاط المشفر وراثيا المطلوب.
  2. عمر ذرية الصليب أعلاه حتى يصبحوا في حدود 2-5 أيام بعد الإغلاق. يمكن استخدام كل من الذكور والإناث ، حيث أن غرف التصوير مصممة خصيصا لتناسب كلا الجنسين.

2. بناء شفاط (سير عمل لمدة 5 دقائق)

  1. قم بقص أنابيب السيليكون مقاس 6 مم إلى حوالي 8 بوصات باستخدام شفرة حلاقة. خذ طرف ماصة p200 واقطع نصفها تقريبا باستخدام شفرة حلاقة لقطعة الفم (الشكل 1 أ). أدخل الطرف المقطوع في الأنبوب. قم بقص طرف ماصة p1000 بما يكفي حتى تتمكن الذبابة من التحرك من خلاله.
  2. خذ قطعة صغيرة من القطن وقم بتغطية أنبوب السيليكون. هذا لمنع الذبابة من الشفط في فم المجريب. ضع طرف p1000 المقطوع على الأنبوب المغطى بالقطن.
  3. قم بتغطية طرف الماصة p1000 برأس ماصة p200 جديد. لتحديد الطول المناسب لقطع طرف الماصة p200، قم أولا بإزالة طرف الماصة p200 واستنشاق ذبابة في طرف الماصة p1000. أعد تركيب طرف p200. انفخ برفق واضغط على الذبابة لتحريكها بقدر ما يمكن أن تذهب إلى طرف p200.
    1. بمجرد أن لا يتمكن من التقدم أكثر ، استخدم مجهر تشريح لتحديد النقطة التي ينتهي فيها رأس الذبابة ، ويبدأ الصدر باستخدام شفرة حلاقة. قم بشفط الذبابة مرة أخرى إلى طرف الماصة p1000 وقم بقص طرف الماصة p200 في الموضع المحدد.

3. بناء شفاط خرطوم الأنابيب المعدنية (سير عمل من 5 إلى 10 دقائق)

  1. قم بقص الأنابيب المعدنية تحت الجلد بمقياس 22X إلى الحجم المطلوب (~ 10 سم) باستخدام أدوات Dremel وشفرة المنشار الماسية. قم بتلميع نهايات الأنابيب المعدنية باستخدام عجلة قطع Dremel 420 لإنشاء فتحة سلسة ونظيفة. سوف يستوعب هذا الافتتاح خرطوم الذبابة.
  2. لف الأنبوب حول أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل للحصول على الشكل المنحني المطلوب (الشكل 1 أ). يجب أن يخلق المنحنى شكلا يشبه الخطاف يسمح لجسم الذبابة بأن يكون متماشيا مع الغرفة.
  3. قم بقص قطعة (~ 7 سم) من الأنابيب المعدنية تحت الجلد بمقياس 12 تيرابايت باستخدام أدوات Dremel (يجب أن يتناسب هذا الأنبوب مع طرف ماصة سعة 2 ميكرولتر). خذ طرف ماصة سعة 2 ميكرولتر واقطع طرفه باستخدام شفرة حلاقة لتناسب الأنبوب المعدني بمقياس 22X. قم بتركيب الأنبوب المعدني الأكبر في الطرف الآخر من طرف الماصة سعة 2 ميكرولتر.
  4. امزج كمية صغيرة من الراتنج ومقوي من غراء الايبوكسي معا. ضع الخليط حيث يلتقي الأنبوب المعدني الصغير بطرف الماصة وحيث يتصل الأنبوب المعدني الأكبر بطرف الماصة. اسمح للمادة اللاصقة بالشفاء الكامل طوال الليل قبل توصيل التجميع بحامل على معالج دقيق. اضبط الزاوية حسب الضرورة.

4. بناء ماصة توصيل الصدمات والرائحة لتجارب التعلم والذاكرة تحت المجهر (سير عمل لمدة 10 دقائق)

  1. باستخدام أداة Dremel الماسية، قم بقص 1 مل في ماصة زجاجية 1/100 عند علامة 3 مل. قطع قطعة صغيرة مستطيلة الشكل من لوح الأكريليك بأبعاد 24.5 مم × 8 مم وسمك 1/8 بوصة.
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن طباعة هذه القطعة ثلاثية الأبعاد لاستيعاب شبكة الصدمات بشكل أفضل (يمكن العثور على ملفات stl و obj في الملف التكميلي 1 والملف التكميلي 2).
  2. قم بقص شبكة الصدمات النحاسية لتناسب قطعة الأكريليك المستطيلة من الخطوة السابقة. لحام سلكين كهربائيين على طرفي نقيض من الشبكة النحاسية. ضع الشبكة النحاسية في قطعة الأكريليك المستطيلة وقم بثنيها بحيث يتناسب بطن الذبابة وساقيها مع شبكة الصدمات (الشكل 1I).
  3. قم بلصق الشبكة النحاسية على البلاستيك المستطيل باستخدام قطعة من الشريط الكهربائي. باستخدام مسدس الغراء الساخن ، قم بتوصيل الماصة الزجاجية بإحكام بشبكة الصدمات ، مع التأكد من أنها مستقيمة ومتمركزة بشكل صحيح. باستخدام مقياس رقمي متعدد ، تحقق من أن الشبكة النحاسية تعمل على توصيل صدمة بشكل فعال لأرجل الذبابة.

5. تجميع المقاوم البلاتيني لذوبان الغراء (حمض الميريستيك) (سير عمل لمدة 20 دقيقة)

  1. باستخدام أدوات تقشير الأسلاك ، قم بقص 200 مم من الأسلاك إلى الطول المطلوب وقم بتجريد أحد طرفي كلا السلكين. قطع حوالي 60 مم من السلك البلاتيني (يجب أن يكون هذا الطول كافيا لإنشاء حلقة تستخدم لإذابة الغراء).
  2. باستخدام مسدس لحام ، قم بلحام أحد طرفي السلك البلاتيني بالسلك الكهربائي. قم بتمرير أنبوب الانكماش الحراري عبر السلك الكهربائي واستخدم موقد بنسن لتقليص الأنبوب على السلك لتغطية الأجزاء الملحومة.
  3. قم بقص قطعتين مقاس 20 مم من الأنبوب المطاطي 2.55 مم وقم بتمريرهما عبر السلك البلاتيني (حافظ على السلك البلاتيني مستقيما لتسهيل هذه العملية). استخدم مسدس اللحام لحام الطرف الآخر من السلك البلاتيني بالسلك الكهربائي الآخر. استخدم أنبوبا جديدا للانكماش الحراري لتغطية هذا الجزء الملحوم الجديد.
  4. قم بإزالة مكبس حقنة BD tb 1 مل وقم بتمرير الأسلاك من الخطوات السابقة عبر البرميل. يجب أن يخرج البلاتين من نهاية برميل المحقنة. يجب ألا تكون هناك أسلاك مكشوفة ، ويجب أن تغطي الأنابيب المطاطية الصغيرة السلك البلاتيني إلا حتى النهاية.
  5. باستخدام أداة تجرد الأسلاك ، قم بتجريد كمية صغيرة من كلا الطرفي الآخرين للأسلاك الكهربائية. باستخدام مسدس لحام ، قم بلحام كل سلك بسدادة موز حتى يتم توصيله بإحكام.
  6. استخدم غراء الايبوكسي للصق الجزء العلوي وقاعدة برميل المحقنة للصق الأسلاك والبرميل معا ؛ سيؤدي ذلك إلى تجنب التوتر على الأسلاك داخل المحقنة وسيضمن عمرا أطول للمقاوم. دع الغراء يعالج بين عشية وضحاها.
  7. قم بتوصيل المقاوم النهائي بمصدر طاقة التيار المستمر.

6. بناء غرفة التسجيل - (سير عمل لمدة يومين)

  1. بعد الملف التكميلي 3 ، قم بقص ورقة رقاقة سوداء بالليزر (سمك 0.0125 بوصة). يمكن تعديل حجم الفتحة الموجودة في منتصف الغرفة ليناسب حجم الذباب (الحجم الموجود في الملف يناسب الإناث والذكور بشكل عام).
  2. خذ شريحة مجهر زجاجي ستكون بمثابة قاعدة للغرفة. اخلطي الراتنج والإيبوكسي معا. خذ غرفة الأكريليك السوداء ، وباستخدام غراء الايبوكسي ، قم بإرفاق مغناطيس من النيوديميوم 3 مم × 2 مم على جميع الزوايا الأربع. يوصى بلصق مغناطيس واحد في كل مرة والاحتفاظ به بينما يعالج الغراء بمشبك ورق.
  3. ضع مغناطيسين جديدين على كل مغناطيس تم لصقه على الغرفة مسبقا. باستخدام الايبوكسي ، قم بلصق آخر مغناطيس متصل بشريحة زجاجية واستخدم مشابك الورق لتثبيته في مكانه أثناء التنظيم.
    ملاحظة: بعد تنظيم الغراء ، تكتمل الغرفة ، ويمكن إضافة المزيد من المغناطيس لضبط ارتفاع الغرفة للتجارب. يظهر الملف التكميلي 4 والملف التكميلي 5 والملف التكميلي 6 غرفة التسجيل المجمعة.

7. بروتوكول التشريح في الجسم الحي بدون تخدير - (5 - 7 دقائق سير العمل)

  1. قم بإزالة طرف الماصة p200 من الشفاطة. أدخل الشفاط في القارورة واستنشق ذبابة واحدة في طرف الماصة p1000. أعد تركيب طرف الماصة p200 مرة أخرى على الشفاطة. قم بنفخ الشفاط وحركه برفق حتى يتم تثبيت الذبابة في الجزء العلوي من طرف الماصة p200 ، رأسا على عقب.
  2. ضع حجرة التشريح على حامل المناور. قم بتوصيل المكنسة الكهربائية بأنبوب تثبيت الذباب واضبط مستوى التدفق حسب الحاجة (~ 500 مل / دقيقة). استخدم موصلا سريعا لتوصيل وفصل المكنسة الكهربائية بسهولة وسرعة (الشكل 1 أ).
  3. حرك الأنبوب المعدني المفرغ لتوسيطه في مجال الرؤية عند النظر من خلال المجهر. تأكد من وضع الغرفة بشكل صحيح بحيث توضع مباشرة فوق الأنبوب المعدني عندما تكون جاهزة للصق الذبابة. بلطف ، قم بشفط خرطوم الذبابة في حامل الفراغ (الشكل 1 أ).
  4. بمجرد أن تصبح الذبابة في الموضع الصحيح ، حرك المناور بحيث يتم محاذاة رأس الذبابة مع فتحة الغرفة.
  5. قم بتشغيل مصدر طاقة التيار المستمر. يجب ضبط التيار على يتراوح بين 0.40-0.50 أمبير. قد تتسبب التيارات العالية في ذوبان حمض الميريستيك إلى النقطة التي تصبح فيها لزوجته منخفضة جدا ، مما يزيد من خطر انتشار الغراء فوق رأس الذبابة.
  6. باستخدام مقاومة البلاتين ، قم بلصق جانبي العينين والصدر بالغرفة باستخدام حمض الميريستيك المذاب (الشكل 1 ب). لمنع الحصول على الغراء على بشرة الرأس ، استخدم أقل قدر ممكن من الغراء ، خاصة عند لصق جانبي العينين.
  7. بمجرد لصق العينين والصدر ، افصل أنبوب التفريغ واستخدم المعالج لإزالة غرفة التسجيل من أنبوب التفريغ. اقلب الغرفة رأسا على عقب واستخدم مقاومة البلاتين للصق خرطوم من الأسفل (الشكل 1 ج). يعد لصق العينين من الأسفل أمرا اختياريا ويمكن أن يساعد في الحفاظ على الذبابة في مكانها أثناء التشريح ، لكنه ليس ضروريا.
  8. بمجرد لصق كل شيء ، قم بإيقاف تشغيل مصدر طاقة التيار المستمر ، وقم بتدوير الغرفة في وضع مستقيم ، وقم بتوصيلها بالقاعدة الجانبية الزجاجية. قم بقص قطعة صغيرة من الشريط باستخدام المقص وقم بتطبيقها أمام وخلف رأس الذبابة مباشرة (الشكل 1 د).
  9. أدر الغرفة بحيث يكون الرأس مواجها للمجرب عند 90. باستخدام إبرة تشريح ، قم بعمل قطع رأسي على جانبي العينين (الشكل 1E). اقلب الغرفة بحيث يتم وضعها أفقيا. باستخدام إبرة التشريح ، اقطع البشرة (الشكل 1E).
    ملاحظة: تأكد من إمكانية رفع "نافذة" البشرة التي تم إنشاؤها للتو باستخدام إبرة التشريح. إذا رفعت دون أي مقاومة ، ضع إبرة التشريح مرة أخرى على غطاءها. لا يتم استخدام المحلول الملحي في الخطوتين 13 و 14 لمنع انكسار الضوء ، مما قد يعيق الرؤية الواضحة أثناء التخفيضات.
  10. أضف 100 ميكرولتر من المحلول الملحي إلى قمة رأس الذبابة (الشكل 1F). باستخدام ملقط حاد ، قم بإزالة النافذة بعناية (الشكل 1G). باستخدام الملقط الحاد ، قم بإزالة أي دهون متبقية أو قصبة هوائية بعناية. يجب أن يكون الدماغ جاهزا للتصوير الآن (الشكل 1H-1J).

8. تصور اللدونة الناجمة عن التعلم من خلال التكييف الشمي المكروهة (سير عمل لمدة 20 دقيقة)

  1. باستخدام مجهر متحد البؤر مزود بالليزر وهدف الغمر في الماء ، ضع الذبابة المعدة على مسرح المجهر. اختياريا ، استخدم كاميرا مزودة بعدسة ماكرو للتركيز على الطيران ، مع التأكد من أن الذبابة صحية ومتحركة.
  2. اضبط موضع شبكة الصدمات/ماصة الرائحة باستخدام معالج دقيق بحيث تجلس الذبابة على شبكة الصدمات.
    ملاحظة: يجب أن تظل الذبابة قادرة على التحرك بحرية لأن شبكة الصدمات تلامس الساقين والبطن قليلا (يجب أن تكون الذبابة قادرة على إزالة ساقيها وبطنها من الشبكة إذا تم سحبها). يجب توجيه ماصة توصيل الرائحة نحو هوائيات الذبابة.
  3. باستخدام مقبض الضبط Z الخشن ، امسح المحور Z للدماغ وحدد موقع منطقة الدماغ التي تهمك. اضبط حجم الإطار على 512 × 512 بكسل. يجب ضبط تردد المسح الضوئي على السرعة المطلوبة - بحد أدنى 2 هرتز. أخيرا ، قم بتعيين مدة التسجيل.
  4. ابدأ في تسجيل الخلايا العصبية ذات الأهمية باستخدام نظام توصيل رائحة مخصص أو تجاري ، وابدأ توصيل الرائحة "قبل التدريب" في وقت واحد (الشكل 2 ج). اضبط التسجيل على 2 دقيقة. يبدأ عرض الرائحة قبل التدريب بتسجيل الاستجابات لنبضة الرائحة الأولى 5 ثوان (CS-) متبوعة بنبضة رائحة 5 ثوان (CS +) مع فاصل محفزات 30 ثانية.
  5. بعد جمع استجابات ما قبل التدريب ، انتظر 5 دقائق قبل بدء بروتوكول التدريب في نظام توصيل الرائحة. في هذا المثال ، تم تقديم CS + فقط أثناء التدريب. يتم تقديم رائحة CS + لمدة دقيقة واحدة تبدأ في 30 ثانية بعد تشغيل نظام توصيل الرائحة. تمت برمجة محفز الصدمات لتوصيل صدمات 12 ، 90 فولت في وقت واحد أثناء تقديم الرائحة.
  6. بعد التدريب ، انتظر 5 دقائق أو 15 دقيقة قبل الحصول على ردود ما بعد التدريب. سجل استجابات ما بعد التدريب بنفس الطريقة التي تم بها تسجيل استجابات ما قبل التدريب في الخطوة 6. احفظ جميع الملفات بالتنسيق المناسب لتحليل الصور لاحقا.

9. تحليل الصور

  1. لتحليل التسجيلات ، ارسم منطقة اهتمام (ROI) حول منطقة الخلايا العصبية. يجب أن يكون هذا دقيقا قدر الإمكان للحد من تأثير مضان الخلفية.
  2. استخدم أداة القياس لاستخراج متوسط بيانات شدة التألق ضمن عائد الاستثمار لكل إطار من التسجيل. تصدير هذه البيانات كملف CSV.
  3. افتح البيانات في MATLAB ، أو أي برنامج تحليل بيانات لحساب قيم ΔF / Fo لكل أثر رائحة. اجمع البيانات للحصول على متوسط تسجيلات الذباب الفردية الإجمالية ΔF / Fo وإنشاء رسم بياني لمتوسط آثار استجابة الرائحة قبل التدريب وبعده (الشكل 2E ، F).

النتائج

هنا ، يتم استخدام التصوير في الجسم الحي لذبابة الفاكهة البالغة بدون تخدير للتحقيق في التكييف الشمي المكروهة الذي يحفز اللدونة في الخلايا العصبية لإخراج جسم الفطر (MBON γ2α'1) 12. يتم التعبير عن مؤشر الكالسيوم GCaMP6f2 ، جنبا إلى جنب مع بروتين الفلورسنت الأحمر TdTom ، في خلية عصبية إخراج MB ، والتي تعمل تشعباتها على تعصيب حجرة فصوص MB γ و α 'وتستهدف وراثيا MBON γ2α'1 باستخدام خط الانقسام Gal4 MB077C34 (الشكل 2 أ ، ب).

لمراقبة اللدونة بعد التكييف الشمي المكروه، توضع الذبابة تحت المجهر متحد البؤر، مع محاذاة بطنها وساقيها في منتصف شبكة الصدمات وتوجيه ماصة توصيل الرائحة نحو هوائي الذبابة. أولا ، تم تسجيل استجابات رائحة الكالسيوم على نبضة 5 ثوان من 4-ميثيل سيكلوهكسانول (MCH) متبوعة بنبضة 5 ثوان من 3-أوكتانول (OCT) ، مفصولة بفاصل 30 ثانية بين التحفيز. بعد خمس دقائق ، تم تدريب الذباب من خلال العرض المتزامن لنبضة OCT (CS +) لمدة دقيقة واحدة جنبا إلى جنب مع صدمات 12 ، 90 فولت. ينتج عن جدول التكييف الترابطي هذا ذاكرة سلوكية مكروهة قوية. أخيرا ، بعد 5 دقائق و 15 دقيقة من التكييف ، تم تسجيل استجابات الكالسيوم ل MCH و OCT كما هو الحال قبل التدريب. يستجيب MBON γ2α'1 بقوة عن طريق عابرات الكالسيوم لكل من MCH و OCT قبل التكييف (الشكل 2D-F). ومع ذلك ، فإن مطابقة النتائج السابقة12 ، 5 دقائق بعد تكييف استجابات الكالسيوم ل CS + (OCT) مكتئبة تماما (الشكل 2D-F). بالإضافة إلى ذلك ، تم تعزيز الاستجابات ل CS- (MCH) بشكل كبير. أظهرت خمس عشرة دقيقة بعد التدريب نتائج مماثلة ، حيث كانت استجابة الكالسيوم ل CS + منخفضة بشكل كبير وتم تعزيز CS. تشير هذه النتائج إلى أن تتبع الذاكرة الذي لوحظ في كلتا الرائحتين يستمر لمدة 15 دقيقة على الأقل (الشكل 2D-F). تم قياس هذه الاستجابات باستخدام متوسط استجابة الرائحة أثناء نبضة 5 ثوان ومقارنتها داخل الذبابة. يمكن أيضا تصور هذه التغييرات في استجابات الرائحة من خلال تمثيل اللون الزائف للتغيير في التألق GCaMP6 قبل وبعد التدريب المكروهة (الشكل 2 ه). في المقابل ، يظهر تخدير الذبابة أثناء التحضير انخفاض اللدونة لكل من CS + و CS-. لوحظ اكتئاب جزئي فقط ل CS + في المخدرة ، حيث لا تزال استجابات ما بعد التدريب موجودة. بالإضافة إلى ذلك ، لا تختلف استجابات CS بشكل كبير بعد التدريب (الشكل 2G ، H). لمراقبة ذلك بشكل أفضل ، قمنا بحساب اللدونة المستحثة كنسبة CS + / CS- وأظهرنا أن الذباب غير المخدر يظهر زيادة كبيرة في اللدونة عند مقارنتها بالحيوانات المخدرة (الشكل 2I). تشير هذه النتائج التمثيلية إلى أن هذا البروتوكول مناسب لدراسة التعلم والذاكرة تحت المجهر ويضمن صحة الذبابة أثناء التصوير من الخلايا العصبية لفترة طويلة من الزمن. هذا البروتوكول متعدد الاستخدامات بما فيه الكفاية ويمكن تطبيقه على أنواع أخرى من التصوير في الجسم الحي والخلايا العصبية الأخرى ذات الأهمية.

figure-results-1
الشكل 1: تحضير التصوير في الجسم الحي لذبابة الفاكهة دون استخدام التخدير. (أ) اللوحة العلوية: رسم تخطيطي يوضح الخطوات المتبعة في تحضير الشفاطة. اللوحة السفلية: رسم تخطيطي يوضح الغرفة المثبتة في مناور دقيق أثناء وضع الذبابة. يتم وضع خرطوم الذبابة عند فتحة أنبوب معدني متصل بفراغ بسرعة 500 مل / دقيقة باستخدام شفاطة. يتم وضع الغرفة لاحقا فوق الذبابة. (ب) يتم لصق جوانب العينين والصدر بحمض الميريستيك باستخدام مقاوم من البلاتين المصنوع خصيصا. (ج) تتم إزالة خرطوم الذبابة من الأنبوب المعدني ، ويتم قلب الغرفة للسماح بلصق خرطوم في مكانه ، وبالتالي تقليل الحركة أثناء التسجيل. (د) الغرفة متصلة بقاعدة منزلقة زجاجية. يتم تطبيق الشريط على الجزء العلوي من الغرفة ، ويغطي الهوائيات ، وعلى الجانب الخلفي لمنع تسرب المحلول الملحي. (ه) يتم إجراء قطعتين رأسيتين بجانب البشرة بالقرب من العينين المركبتين ، متبوعة بقطع ثالث عبر البشرة بالقرب من الصدر ، مما يخلق "نافذة" للدماغ. (و) يضاف ما بين 100-200 ميكرولتر من المحلول الملحي إلى رأس الذبابة في موقع الجروح. (ز) يتم رفع نافذة البشرة وسحبها وفصلها باستخدام ملقط حاد ودقيق لكشف الدماغ. (ح) تتم إزالة الدهون والأنسجة القصبية لتمكين الرؤية الواضحة لخلايا الدماغ تحت المجهر. (I) توضع الذبابة المحضرة تحت المجهر وتوضع مع محاذاة جسمها أعلى شبكة الصدمات. (ي) صورة زائفة اللون تظهر نمط التعبير عن MBON γ2α′1. تم تحديد منطقة الاهتمام بخط متقطع يحيط بالشجرة المتغصنة. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: اللدونة الناجمة عن التعلم في MBON γ2α′1 بعد التكييف الشمي المكروه. (أ) نمط التعبير لبرنامج تشغيل MB077C-splitGal4 الذي يعبر عن GCaMP. تم تشريح الأدمغة وتلطيخها بمضادات GFP ومضادة لها بمضاد NC82. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. (ب) صورة زائفة ملونة ل MBON γ2α′1 تسلط الضوء على جسم الخلية ، وعملية التمديد ، والشجرة المتغصنة. تمثل المنطقة المتغصنة المنطقة التي تم جمع استجابات الكالسيوم منها. شريط المقياس: 50 ميكرومتر (C) تخطيطي لبروتوكول التدريب المكروه. تعرض الذباب لنبضات 5 ثوان من MCH و OCT مع 30 ثانية من الهواء النظيف بينهما. بعد فاصل زمني مدته 5 دقائق ، تم تدريب الذباب على ربط OCT باثنتي عشرة صدمة كهربائية بجهد 90 فولت. تم إجراء تسجيلات استجابات الكالسيوم ل MCH و OCT بعد 5 دقائق و 15 دقيقة بعد التدريب. (د) تظهر آثار استجابة الرائحة إلى MCH (اللوحة العلوية) و OCT (اللوحة السفلية) للتدريب المسبق ، وفي 5 دقائق و 15 دقيقة بعد التدريب. تشير الأشرطة السوداء السميكة إلى توقيت ظهور الرائحة. (ه) صور ملونة زائفة للشجرة المتغصنة للتدريب المسبق MBON γ2α′1 ، و 5 دقائق و 15 دقيقة بعد التدريب ، استجابة لكل من MCH و OCT. لوحظ تقوية التألق ل CS- (MCH) ، بينما يتم إلغاء التألق ل CS + (OCT). شريط المقياس: 20 ميكرومتر (F) يتم تعزيز متوسط استجابة الرائحة ل MCH بشكل كبير في 5 دقائق و 15 دقيقة بعد التدريب ، بينما يتم قمع الاستجابات ل OCT (CS +) بشكل كبير. اختبار ويلكوكسون المزدوج غير البارامتري ، N = 12. (G) تظهر آثار استجابة الرائحة إلى MCH (اللوحة العلوية) و OCT (اللوحة السفلية) للذباب المخدر قبل التدريب و 5 دقائق بعد التدريب. تشير الأشرطة السوداء السميكة إلى توصيل الرائحة. (ح) في المخدرة ، لا يظهر متوسط استجابات الرائحة ل MCH تقويما كبيرا بعد التدريب ، وتظهر الاستجابات ل OCT قمعا جزئيا فقط مقارنة بالحيوانات غير المخدرة. (I) اللدونة التي يسببها التدريب ، محسوبة على أنها نسبة CS + / CS- ، أقل بكثير في الذباب المخدر مقارنة بتلك التي تم تحضيرها بدون تخدير. اختبار ويلكوكسون المزدوج غير البارامتري ، N = 8-12. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الملف التكميلي 1: Grid_holder (STL). STL للمكون المصمم خصيصا المستخدم لتثبيت الشبكة الكهربائية. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: Grid_holder (OBJ). ملف OBJ للمكون المصمم خصيصا المستخدم لتثبيت الشبكة الكهربائية. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 3: Chamber_LaserCut. يستخدم Adobe Illustrator للقطع بالليزر للمكون العلوي لغرف التسجيل لكل من الذباب من الذكور والإناث. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 4: Recording_chamber (STL). STL لغرفة التسجيل المصممة خصيصا. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 5: Recording_chamber (OBJ). ملف OBJ لغرفة التسجيل المصممة خصيصا. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 6: Recording_chamber_animation. فيديو MP4 يعرض رسما متحركا لغرفة التسجيل المجمعة. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

يعد فهم الدوائر العصبية وراء التعلم والذاكرة هدفا مركزيا في مجال علم الأعصاب. مجموعة الأدوات الجينية المتوفرة في ذبابة الفاكهة ، جنبا إلى جنب مع بساطة وتعدد استخدامات الاختبارات السلوكية ، تجعلها كائنا نموذجيا مثاليا لدراسة هذه العمليات. وصفت الدراسات المنشورة من مختبرات مختلفة بروتوكولات مختلفة لإعداد الذباب للتصوير الوظيفي دون استخدام التخدير44،45. ومع ذلك ، تختلف هذه البروتوكولات بشكل كبير وغالبا ما تعتمد على أدوات عالية التخصص ومصممة خصيصا مع إرشادات محدودة حول كيفية بنائها أو استخدامها. في هذا البروتوكول ، يتم تقديم طريقة لإجراء التصوير الوظيفي في الجسم الحي في الذباب تتجنب الآثار المربكة للتخدير العام. علاوة على ذلك ، يسمح هذا النهج بالتقاط النشاط العصبي في الوقت الفعلي داخل نفس الذبابة ، مما يتيح إجراء مقارنات مباشرة للاستجابات العصبية قبل وبعد التعرض لمحفزات مختلفة.

عند إكمال هذا البروتوكول ، تتضمن الخطوات الحاسمة التأكد من وضع خرطوم الذبابة بشكل صحيح في الأنبوب المفرغ. تضمن هذه الخطوة حدوث اللصق اللاحق في الأماكن الصحيحة ، والتأكد من أن الرأس في الزاوية الصحيحة لتصور الخلايا العصبية ذات الأهمية. الحد الأدنى من تطبيق الغراء ضروري للحفاظ على صحة الذباب. يعد استخدام أصغر كمية ضرورية لتأمين الذبابة في مكانها أمرا مثاليا. يسمح هذا البروتوكول أيضا ببعض التعديلات لتتناسب مع الاحتياجات المحددة ، مثل لصق جانبي العينين فقط بحيث يكون الجسم كله حرا. وبالمثل ، يمكن توصيل غرفة التروية بالجزء العلوي من غرفة التسجيل لتسهيل نضح الرنين أو توصيل الدواء. أخيرا ، يمكن وضع جهاز المشي العائم الدوار أسفل الذبابة كما تم الإبلاغ عنه سابقا ، مما يسمح بتحليل اتجاه الحركة46،47.

يحتوي هذا البروتوكول على بعض القيود ، بما في ذلك الإجهاد الذي يتعرض له الذباب أثناء الجراحة المجهرية لإعداد الذباب للتصوير الحي. يتطلب التعامل مع الذباب الصغير ، وتطبيق الغراء باعتدال ، وفتح كبسولة الرأس بعناية دون الإضرار بأي أنسجة دماغية أو جسم خبرة كبيرة ، والتي لا يمكن اكتسابها إلا من خلال الممارسة الدقيقة والتكرار. في حين أن هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لدراسة العمليات المعرفية على المستوى الخلوي ، إلا أن التصوير في الجسم الحي لا يزال له بعض القيود عند مقارنته بالتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية. بالإضافة إلى ذلك ، بينما يتجنب بروتوكولنا استخدام التخدير قبل التصوير ، لا تزال الذبابة مقيدة بغرفة مادية ، والتي يمكن أن تغير دائما الاستجابات الخلوية. ومع ذلك ، توفر منهجيتنا أقرب طريقة للحفاظ على صحة الذبابة للحصول على التصوير الأمثل في الجسم الحي . بالمقارنة مع الطرق الحالية التي تستخدم التخدير وتقيد الذبابة ، تهدف طريقتنا إلى الحفاظ على حركة الذبابة بحرية قدر الإمكان مع القدرة على التصوير من الخلايا بأقل قدر من الحركة.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة ل 1R01GM147917-01A1 ومؤسسة أبحاث الدماغ والسلوك ل 30442.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.102 مم سلك البلاتينSurepure Chemetals2690
0.25 OD ، 0.125 ID ، أنابيب سيليكون معالجة بالبلاتينVWR89068-474
0.3 مم معرف أنابيب سيليكون   ؛فيشر ساينتفيك11-189-14
سدادات الموزورقة أكريليك سوداء من أمازون
للغرفة 0.0125 فيماركة الدقة44250
كلوريد الكالسيومسيجما ألدريتش746495
شبكة صدمة نحاسية
للمقاوم البلاتينيفيشر ScientificS35740
أداة Dremel 3000-1Dremel3000-N / 18
ذبابة الفاكهة السوداء / ؛ uas-tdtomBDSC36328
ذبابة الفاكهة السوداء / ; uas-gcamp6f;BDSC42747تم دمج خط uas هذا مع ؛؛ uas-td-tom لتوليد مخزون يحتوي على كل من الإدخالات
ذبابة الفاكهة السوداء / ؛ MB077C-gal4BDSC68287
غراء الايبوكسي  الغوريلا4200102
1.5 لتر في الدقيقةأمازونB01N0UWZ2T
زجاج 1 مل ماصة مصلية  فيشر العلمي50-232-9516
شرائح زجاجيةفيشر العلمية 12-550-A3
الجلوكوزسيجما ألدريتشG7528
هيبسسيجما ألدريتشH4034
الجلد 12TW قياس الأنابيبMicrogroup316H12TW
تحت الجلد 22X قياسالأنابيب Microgroup304H22X
كلوريد المغنيسيوم سداسي الهيدراتسيجما ألدريتشM9272
Myristic AcidAcros Organics156961000
مغناطيس النيوديميوم 3X2 ممنصائح AmazonB0CXSQ387M
P1000Genesee Scientific  23-165RL
P200 نصائحGenesee Scientific 23-150RL
موصل دفع هوائي 6 مم ODأمازونB07ZHG8Y1Y
كلوريد البوتاسيومSigma-AldrichP3911
أنابيب PTFE 6 مم ODشفرات الحلاقة الأمازون
  ؛أمازونB08LYD6645
بيكربونات الصوديومسيجما ألدريتشS5761
كلوريد الصوديومفيشر ScientificS271-500
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدةسيجما ألدريتشS0876
السكروزسيجما ألدريتشS9378
تريهالوزسيجما ألدريتشT0167
مصدر طاقة تيار مستمر مخصص مقياس تدفق غاز تحت

المراجع

  1. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
  2. Chen, T. W., Wardill, T. J., Sun, Y., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  3. Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  4. Akerboom, J., Chen, T. W., Wardill, T. J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  5. Zhao, Y., Araki, S., Wu, J., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
  6. Sun, F., Zeng, J., Jing, M., et al. A genetically encoded fluorescent sensor enables rapid and specific detection of dopamine in flies, fish, and mice. Cell. 174 (2), 481-496 (2018).
  7. Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat Neurosci. 15 (7), 1047-1053 (2012).
  8. Wang, L., Wu, C., Peng, W., et al. A high-performance genetically encoded fluorescent indicator for in vivo cAMP imaging. Nat Commun. 13 (1), 5363(2022).
  9. Jing, M., Zhang, P., Wang, G., et al. A genetically encoded fluorescent acetylcholine indicator for in vitro and in vivo studies. Nat Biotechnol. 36 (8), 723-737 (2018).
  10. Yu, D., Akalal, D. B. G. B., Davis, R. L. Drosophila alpha/beta mushroom body neurons form a branch-specific, long-term cellular memory trace after spaced olfactory conditioning. Neuron. 52 (5), 845-855 (2006).
  11. Hige, T., Aso, Y., Modi, M. N., Rubin, G. M., Turner, G. C. Heterosynaptic plasticity underlies aversive olfactory learning in Drosophila. Neuron. 88 (5), 985-998 (2015).
  12. Berry, J. A., Phan, A., Davis, R. L. Dopamine neurons mediate learning and forgetting through bidirectional modulation of a memory trace. Cell Rep. 25 (3), 651-662 (2018).
  13. Cervantes-Sandoval, I., Davis, R. L., Berry, J. A. Rac1 impairs forgetting-induced cellular plasticity in mushroom body output neurons. Front Cell Neurosci. 14, 258(2020).
  14. Martinez-Cervantes, J., Shah, P., Phan, A., Cervantes-Sandoval, I. High order unimodal olfactory sensory preconditioning in Drosophila. Elife. 11, 79107(2022).
  15. Faber, T., Joerges, J., Menzel, R. Associative learning modifies neural representations of odors in the insect brain. Nat Neurosci. 2 (1), 74-78 (1999).
  16. Yu, D., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Davis, R. L. Detection of calcium transients in Drosophila mushroom body neurons with camgaroo reporters. J Neurosci. 23 (1), 64-72 (2003).
  17. Yu, D., Keene, A. C., Srivatsan, A., Waddell, S., Davis, R. L. Drosophila DPM neurons form a delayed and branch-specific memory trace after olfactory classical conditioning. Cell. 123 (5), 945-957 (2005).
  18. Yu, D., Ponomarev, A., Davis, R. L. Altered representation of the spatial code for odors after olfactory classical conditioning: Memory trace formation by synaptic recruitment. Neuron. 42 (3), 437-449 (2004).
  19. Tully, T., Quinn, W. G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophilamelanogaster. J Comp Physiol A. 157 (2), 263-277 (1985).
  20. Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. Conditioned behavior in Drosophilamelanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 71 (3), 708-712 (1974).
  21. Quinn, W. G., Dudai, Y. Memory phases in Drosophila. Nature. 262 (5569), 576-577 (1976).
  22. Tempel, B. L., Bonini, N., Dawson, D. R., Quinn, W. G. Reward learning in normal and mutant Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (5), 1482-1486 (1983).
  23. Turner, G. C., Bazhenov, M., Laurent, G. Olfactory representations by Drosophila mushroom body neurons. J Neurophysiol. 99 (2), 734-746 (2008).
  24. de Belle, J. S., Heisenberg, M. Associative odor learning in Drosophila abolished by chemical ablation of mushroom bodies. Science. 263 (5147), 692-695 (1979).
  25. Schwaerzel, M., Monastirioti, M., Scholz, H., Friggi-Grelin, F., Birman, S., Heisenberg, M. Dopamine and octopamine differentiate between aversive and appetitive olfactory memories in Drosophila. J Neurosci. 23 (33), 10495-10502 (2003).
  26. Kim, Y. C., Lee, H. G., Han, K. A. D1 dopamine receptor dDA1 is required in the mushroom body neurons for aversive and appetitive learning in Drosophila. J Neurosci. 27 (29), 7640-7647 (2007).
  27. Riemensperger, T., Völler, T., Stock, P., Buchner, E., Fiala, A. Punishment prediction by dopaminergic neurons in Drosophila. Curr Biol. 15 (21), 1953-1960 (2005).
  28. Mao, Z., Davis, R. L. Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: Anatomical and physiological heterogeneity. Front Neural Circuits. 3 (5), 1-17 (2009).
  29. Liu, C., Plaçais, P. Y., Yamagata, N., et al. A subset of dopamine neurons signals reward for odour memory in Drosophila. Nature. 488 (7412), 512-516 (2012).
  30. Burke, C. J., Huetteroth, W., Owald, D., et al. Layered reward signaling through octopamine and dopamine in Drosophila. Nature. 492 (7429), 433-437 (2012).
  31. Tomchik, S. M., Davis, R. L. Dynamics of learning-related cAMP signaling and stimulus integration in the Drosophila olfactory pathway. Neuron. 64 (4), 510-521 (2009).
  32. Gervasi, N., Tchenio, P., Preat, T. PKA dynamics in a Drosophila learning center: Coincidence detection by rutabaga adenylyl cyclase and spatial regulation by dunce phosphodiesterase. Neuron. 65 (4), 516-529 (2010).
  33. Séjourné, J., Plaçais, P. Y., Aso, Y., et al. Mushroom body efferent neurons responsible for aversive olfactory memory retrieval in Drosophila. Nat Neurosci. 14 (7), 903-910 (2011).
  34. Aso, Y., Sitaraman, D., Ichinose, T., et al. Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila. Elife. 3, 04580(2014).
  35. Pai, T. P., Chen, C. C., Lin, H. H., et al. Drosophila ORB protein in two mushroom body output neurons is necessary for long-term memory formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (19), 7898-7903 (2013).
  36. Owald, D., Felsenberg, J., Talbot, C. B., et al. Activity of defined mushroom body output neurons underlies learned olfactory behavior in Drosophila. Neuron. 86 (2), 417-427 (2015).
  37. Perisse, E., Owald, D., Barnstedt, O., Talbot, C. B., Huetteroth, W., Waddell, S. Aversive learning and appetitive motivation toggle feed-forward inhibition in the Drosophila mushroom body. Neuron. 90 (5), 1086-1099 (2016).
  38. Aso, Y., Rubin, G. M. Dopaminergic neurons write and update memories with cell-type-specific rules. Elife. 5, 16135(2016).
  39. Hige, T., Aso, Y., Rubin, G. M., Turner, G. C. Plasticity-driven individualization of olfactory coding in mushroom body output neurons. Nature. 526 (7572), 258-262 (2015).
  40. MacMillan, H. A., Nørgård, M., MacLean, H. J., Overgaard, J., Williams, C. J. A critical test of Drosophila anaesthetics: Isoflurane and sevoflurane are benign alternatives to cold and CO2. J Insect Physiol. 101, 97-106 (2017).
  41. Margulies, C., Tully, T., Dubnau, J. Deconstructing memory in Drosophila. Curr Biol. 15 (17), R700-R713 (2005).
  42. Amiri, A., Karvandian, K., Ramezani, N., Amiri, A. Short-term memory impairment in patients undergoing general anesthesia and its contributing factors. Saudi J Anaesth. 14 (4), 454-458 (2020).
  43. Wang, R., Zhang, L., Wang, X., et al. Electrophysiological activity pattern of mouse hippocampal CA1 and dentate gyrus under isoflurane anesthesia. Front Cell Neurosci. , 18(2024).
  44. Berry, J. A., Cervantes-Sandoval, I., Chakraborty, M., Davis, R. L. Sleep facilitates memory by blocking dopamine neuron-mediated forgetting. Cell. 161, 1656-1667 (2015).
  45. Delestro, F., et al. In vivo large-scale analysis of Drosophila neuronal calcium traces by automated tracking of single somata. Sci Rep. 10, 1-15 (2020).
  46. Moore, R. J. D., et al. FicTrac: A visual method for tracking spherical motion and generating fictive animal paths. J Neurosci Methods. 225, 106-119 (2014).
  47. Seelig, J. D., Chiappe, M. E., Lott, G. K., et al. Two-photon calcium imaging from head-fixed Drosophila during optomotor walking behavior. Nat Methods. 7 (7), 535-540 (2010).

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

التصوير الوظيفينسيان الذاكرةالمجهر البؤريتصوير الكالسيومالجسم الفطريتحضير الذبابة المستيقظةاللدونة التشابكية
في الجسم الحي تصوير النشاط العصبي في ذبابة الفاكهة البالغة غير المخدرة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.