مقالة منهجية

أداة تصوير الكبد القابلة لإعادة الاستخدام: أداة قابلة لإعادة الاستخدام مطبوعة ثلاثية الأبعاد للمجهر داخل الكبد الحيوي

DOI:

10.3791/68337

⸱

مارس 17, 2026

 ,  ,  , 
1Cavendish Laboratory, Department of Physics, University of Cambridge, 2Thoracic and GI Malignancies Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, 3Facultad de Ciencias Físicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 4Programa de Pós-Graduação em Ciências de Materiais, Centro de Ciências Exatas e da Natureza, Universidade Federal de Pernambuco

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هذا البروتوكول أداة تصوير كبد قابلة لإعادة الاستخدام متطورة (RHIT) للمجهر داخل الحيوية (IVM) للفئران الحية، مما يعزز استقرار الأنسجة للتجارب السريعة والحدة. يوفر تصميم RHIT المطبوع ثلاثي الأبعاد إنتاجا فعالا من حيث التكلفة، وقابلية التوسع، وتنوعا، مما يتيح مراقبة مطولة للعمليات الأيضية في فئران بأحجام مختلفة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن تقييم وظيفة الكبد وخللها من خلال التصوير المباشر للعمليات الديناميكية للكبد باستخدام المجهر الحيوي القائم على الكونفوكال (IVM). على وجه الخصوص، يمكن تحقيق دقة مكانية وزمنية ممتازة في استخراج المعلومات النوعية والكمية. على مستوى المجهر، يظل الحفاظ على الحالة الفسيولوجية للأنسجة مع تحقيق الاستقرار والتكرار تحديا. زيادة الوزن ومحتوى الدهون في الكبد لها تأثير سلبي على هذه العملية في نماذج الحيوانات لمرض السكري من النوع الثاني (T2D) ومرض الكبد الدهني غير الكحولي (MAFLD). لتجاوز هذه القيود، أنشأنا RHIT، وهو تصميم ثوري لجهاز تصوير يحسن وصول الأنسجة واستقرارها. RHIT هو جهاز تصوير كبدي قابل لإعادة الاستخدام وقابل للتوسع يصنع باستخدام الطباعة ثلاثية الأبعاد بطريقة فعالة من خطوة واحدة. يمكن تغيير أبعادها لتناسب فئران بأحجام مختلفة. باختصار، RHIT هو جهاز مطبوع ثلاثي الأبعاد لوضع وتثبيت الحيوانات المخبرية أثناء المجهر داخل الكبد الحيوي، يستخدم بعد تحضير جراحي قصير لتقليل التعامل مع الحيوانات والإجهاد والتغير. تصميمها القابل لإعادة الاستخدام والموحدة سهل الإنتاج والتخصيص، مما يدعم مجموعة من الأحجام والتصاميم التجريبية المحتملة. تظهر النتائج الأولية تحسنا ملحوظا في استقرار وموثوقية التصوير داخل الحيوية الكبدية، مما أتاح التصور التفصيلي للهياكل تحت الخلوية مثل قطرات الدهون. تسهل هذه الدقة المحسنة دراسات الأيض والفسيولوجيا مع وضوح وتكرار وإمكانات أفضل للتصاميم الطولية. يقدم البروتوكول نهجا موحدا وسهل الوصول يعالج التحديات التقنية طويلة الأمد في IVM الكبدية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المجهر داخل الحيوية هو أداة قوية لتصوير العمليات البيولوجية في الجسم الحي ديناميكيا 1,2,3، على عكس علم الأنسجة الفلوري المناعي التقليدي الذي يتضمن تصوير الأنسجة الثابتة أو الخلايا الحية وتحليل تدفق الخلايا الخلوية للخلايا المعزولة. لفحص الكبد، تم استخدام IVM لفحص إفراز الصفراء وتدفقها4،5، وتحريك الجلوكوز6،7، والخلايا غير المحيطة بالكهمية8،9،10، وأمراض الكبد11،12. علاوة على ذلك، فيما يتعلق بدراسة تراكم الدهون، يتيح IVM معلومات فورية حول ديناميكيات تكون قطرات الدهون ونموها وتحللها في الأنسجة الحية مثل تصور وقياس قطرات الدهون بدقة مكانية عالية، وكذلك للارتباط المباشر بين تراكم قطرات الدهون والعمليات الخلوية والفسيولوجية الأخرى13. رغم هذه المزايا، لا يزال التلقيح الصناعي يمثل تحديا تقنيا: فهو يتطلب معداتوخبرة متخصصة، وقد يسبب تلفا للأنسجة، ويغير سلوك الخلايا، ويتطلب إجراءات تدخلية. توفر الدراسات التقليدية في الحياةالتي تعتمد على الملاحظة السلوكية، والمراقبة الفسيولوجية، والتحليل الوراثي معلومات قيمة لكنها تفتقر إلى الدقة المكانية والزمنية التي يوفرها المجهر داخل الحيوية.

التحدي الرئيسي الأول في IVM هو التحكم في عدم استقرار القطع الأثرية الناتجة عن نبض القلب والتنفس للحيوان المفحص، مما قد يؤثر على جودة الصورة، مما يؤدي إلى تشويه أو تشويه الصور للعمليات البيولوجيةالتي يتم رصودها. غالبا ما تؤدي محاولات تصحيح ذلك بمعالجة الصور إلى فقدان معلومات مكانية وزمانية مهمة أو تتطلب معدات جراحية متقدمة وصيانة16,17. ثانيا، نماذج الفئران لدراسات أمراض الكبد، مثل MAFLD وT2D، غالبا ما تكون سمنة، وبالتالي يصعب استقرارها بسبب زيادة حجمها ومحتوى الدهون في الأنسجة 16,18. في نماذج الفئران السمنة لمرض الورد الكبيلي والنوع الثاني من النوع الثاني، يشكل زيادة كتلة الجسم تحديات ميكانيكية للتصوير داخل الحيوية من خلال تجاوز سعة التحميل لمراحل المجهر القياسية وتعقيداستقرار الحيوانات. يزيد هذا الوزن الإضافي من خطر حدوث تشوهات الحركة وضغط الأنسجة، وكلاهما يؤثر على دقة التصوير20.

في الوقت نفسه، يزيد ارتفاع محتوى الدهون الكبدية من تعتيم الأنسجة وتشتت الضوء، مما يقلل من دقة الصورة والتباين. غالبا ما تتفاقم هذه التأثيرات بسبب الأمراض الأيضية المصاحبة مثل تغير التروية والالتهاب، مما يقلل أكثر من توزيع الصبغة ووضوح الإشارة21. وأخيرا، قد يكون من الصعب ويعيق التكرار الحفاظ على درجة حرارة جسم ثابتة طوال التصوير للحفاظ على فسيولوجيا الأنسجة والأنشطة البيولوجية. بالإضافة إلى ذلك، فإن تحديد موقع الكبد المستقر على مرحلة المجهر أثناء عملية التلقيح الصناعي أمر بالغ الأهمية لمنع الإجهاد الميكانيكي أو تلف الأنسجة7. كشف نسيج الكبد هو إجراء حساس يتطلب دقة تقنية لمنع النزيف الشديد وتلف نسيج الكبد7. ولتقليل آثار الحركة، كان القفص الصدري للفأر يرفع سابقا من مرحلة المجهر باستخدام الورق المقوى، مما يسمح للجاذبية بسحب الكبد بعيدا عن بقيةالجسم. على الرغم من أن هذا النهج ثبت نجاحه في إنتاج بيانات قابلة للقياس، إلا أن المادة الكرتونية غير مستدامة لأنها تفقد شكلها ويصعب تنظيفها. بالإضافة إلى ذلك، من الصعب تغيير أبعاد الإدخال الكرتوني لاستيعاب نماذج الفئران السمينة.

في السنوات الأخيرة، ظهرت عدة تقنيات متقدمة في المجهر الحيوي الكبدي، بما في ذلك المجهر الضوئي الماسح والأنظمة البصرية المحسنة حسابيا، والتي أظهرت تحسنا في الدقة المكانيةوالزمانية 23، وتقليل السمية الضوئية24، وعمق التصوير الأكبر25، 26، وقمع التشويش الحركي27. تمثل هذه التطورات، كما أظهرت الدراسات الحديثة28، 29، 30 تقدما تكنولوجيا مهما في المجال. تقدم هذه الورقة أداة التصوير الكبدي القابلة لإعادة الاستخدام (RHIT)، وهي أداة مبتكرة لعملية التصوير الصناعي للكبد في كبد الفأر. تساهم RHIT في هذا المشهد المتطور من خلال تقديم أداة قابلة للتوسع وإعادة الاستخدام تعزز الاستقرار الميكانيكي وإمكانية الوصول للأنسجة عبر نماذج حيوانية متنوعة، بما في ذلك تلك التي تعاني من أمراض الأيض. يعالج تصميمه التحديات المستمرة في الحركة والتباينات وتعقيد الإعداد من خلال دمج التوافق التشريحي، وقابلية تكرار المرحلة، وسهولة الاستخدام. توافق RHIT مع وسائل التصوير التقليدية والمتقدمة يوسع فائدة هذه التقنيات الناشئة، مما يعزز التصوير الحيوي داخل الكبد بشكل موثوق ومستقر فسيولوجيا.

بينما تم اقتراح طرق مختلفة لتثبيت الأنسجة أثناء عملية التلقيح الصناعي، مثل نافذة جراحية 9,31,32,33,34,35,36 ومرحلة الأكريليك المجمعة خصيصا 6,37، إلا أن هذه الطرق تقدم أيضا العديد من القيود والتعقيدات فيما يتعلق بقابلية التوسع، وقابلية التكرار، والمهارات الجراحية. بالمقارنة، يتميز RHIT وظيفيا بغرضه وتصميمه. لا يعتمد على الضغط المباشر أو التضمين القائم على الهلام38. بدلا من ذلك، يعمل RHIT كأداة قابلة للتوسع، قابلة لإعادة الاستخدام، ومصممة تشريحيا تدعم عزل الكبد عبر التموضع الجاذبي، مع الحفاظ على التوجيه الفسيولوجي دون تقييد أو تشويه الأنسجة. الأهم من ذلك، يحسن RHIT قابلية تكرار البيانات، ودقة التصوير، واتساق الإجراءات عبر مجموعة واسعة من أحجام الفأرة. يلغي الحاجة إلى الجل أو المواد اللاصقة أو واجهات جراحية معقدة، مع تبسيط محاذاة الأنسجة والتحكم في درجة الحرارة. علاوة على ذلك، يعد RHIT أداة متخصصة تربط بين الحيوان والمجهر، مصممة للمساعدة في الدعم الفسيولوجي ودقة التصوير.

تعالج RHIT بشكل مباشر التحديات الميكانيكية والبصرية للنماذج المتضررة أيضيا من خلال هندسته القابلة للتوسع، التي تستوعب أحجام أكبر للحيوانات مع توزيع الوزن بشكل متساو لتقليل عدم استقرار المنصة. تثبت فتحة الكبد الغائرة النسيج باستخدام الجاذبية دون قوة ضغط، مما يتيح وصولا مستمرا ويقلل الحركة أثناء التصوير. تصميمها القابل لإعادة الاستخدام وغير النشط كيميائيا يضمن التوافق مع الأنسجة البيولوجية مع دعم إعادة الاستخدام الصحي. من خلال تمكين التموضع المتسق، وتقليل التشوهات الحركية، والحفاظ على سلامة الأنسجة، يوفر RHIT تقدما أساسيا في سير عمل المجهر داخل الحيوية. تعزز مرونتها وتوفر المصادر المفتوحة الفائدة الواسعة عبر المختبرات ونماذج الحيوانات، مما يضع معيارا جديدا لأدوات التصوير التي تدعم كل من العينة ونظام التصوير.

علاوة على ذلك، قد تتطلب مراحل المجهر المسخن المتوفرة تجاريا إعدادات متقدمة والتعامل مع المجهر39. فهي غير قابلة للتوسع حسب العينة وعادة ما تكون أغلى سعرا، مما يجعلها أقل سهولة للعديد من الباحثين. لذا، فإن إدخال قابل لإعادة الاستخدام قابل للتوسع مهم لتوحيد IVM لنماذج الحيوانات المختلفة. أصبحت تقنية الطباعة ثلاثية الأبعاد، المعروفة أيضا بالتصنيع الإضافي، شائعة بشكل متزايد في المختبرات العلمية، حيث غيرت بروتوكولات مختبرات الكيمياء الحيوية والفيزياء وعلم الأحياء. في IVM، تم استخدام تقنية ثلاثية الأبعاد لتصنيع نوافذ تصوير بصرية خفيفةالوزن 41,42، وتحسين إمكانية الوصول للأنسجة43، وتسهيل إصلاح وإعادة بناء الأنسجة44. لذا، فإن أداة مخصصة لتثبيت الأنسجة، والتي حسب علمنا لم توصف بعد، تمثل فرصة ممتازة لاستخدام الطباعة ثلاثية الأبعاد لتجاوز بعض تحديات الطباعة الذاتية الكبدية.

يتم إنشاء RHIT باستخدام طريقة طباعة ثلاثية الأبعاد من خطوة واحدة وتحسن بشكل كبير استقرار الأنسجة لفترة طويلة. RHIT سهل الوصول إليها ومناسبة لتجارب التلقيح الصناعي الحادة التي تتطلب خبرة جراحية محدودة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن توسيع RHIT بسهولة لتناسب حجم الحيوانات وتكلفة الإنتاج منخفضة. وأخيرا، نثبت أن RHIT يتيح تصوير فلوري مستقر بتقنية التايم لابس ويحسن استقرار الأنسجة مقارنة بالإدخال الكرتوني المستخدم سابقا. يبسط RHIT عملية IVM لتوازن الدهون الكبدي دون تلامس مباشر أو تأثير قابل للقياس على الحالات الفسيولوجية. وبالتالي، تقدم RHIT ميزة تنافسية كمساهمة متسارعة وقابلة لإعادة الاستخدام وقابلة للتكيف في IVM 34,36,45.

figure-introduction-1
الشكل 1: تصميم RHIT. (أ) تصميم وأبعاد RHIT بقطر 3.0 مم مقياس لفأر سمين. تظهر الصورة العريضة (على اليسار) أبعاد وموقع وحجم فتحة الأنسجة، بالإضافة إلى اتجاه الفأر أثناء التصوير. العرض الجانبي (يمين) يشمل الأبعاد ويشير إلى موقع وسادة الحرارة وإدخال مسبار درجة الحرارة. تم تقديم معاملات التحجيم لأحجام الفأرة المختلفة في الجدول 1. (B) عرض ثلاثي الأبعاد لواجهة RHIT المولد من ملف STL مفتوح المصدر، يوضح مكان إدخال سلك المجس المستقيم عبر المنفذ المخصص (أبعاد إدخال المجس المستقيم الموضح في أعلى اليمين). (ج) التجميع الفني ل RHIT الذي يظهر دمج جهاز التسخين والإدخالات الهيكلية المخصصة لأحجام RHIT المختلفة، حيث يتم تركيب السلك في إدخال المجس المستقيم للوصول إلى المجس الحراري. الاختصار: RHIT = أداة تصوير الكبد القابلة لإعادة الاستخدام. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تم تصميم RHIT في الأصل كتركيبة من جزء واحد باستخدام ABS (أكريلونيتريل بوتادين ستايرين)، وهو بوليمر حراري يستخدم على نطاق واسع في نمذجة الترسيب المنصهرة للطباعة ثلاثية الأبعاد45. يقدم ABS عدة مزايا لهذا التطبيق: فهو خفيف الوزن، مقاوم للحرارة (نقطة انصهار ~200 °م)، وله مقاومة جيدة للصدمات46، 47، 48. يستفيد تصميم RHIT من الكثافة القابلة للضبط لنظام ABS، مما يسمح له بامتصاص الحركة الفسيولوجية مثل نبضات القلب والتنفس. تعزز كثافة الحشو المتزايدة تخميد الحركة، مما يؤدي إلى استقرار تصوير أكبر وجودة صورة أفضل.

تم تصميم RHIT لامتصاص الحركة من خلال تعديلات على كثافة مادة خاملة كيميائيا مثل ABS. في هذا السياق، تشير الكثافة تحديدا إلى نسبة الحشو الداخلية المستخدمة أثناء الطباعة ثلاثية الأبعاد، والتي تؤثر على صلابة المنصة وقدرتها على تخميد الاهتزازات 49,50,51. لوحظ أن زيادة كثافة ABS تقلل من انتقال الحركة الناتجة عن نبض القلب والتنفس، مما يوفر منصة مستقرة للتصوير وتحسين جودة الصورة. اختبرنا تراكيب RHIT بكثافات داخلية متفاوتة (20-100٪) ولاحظنا نوعيا أن التكوينات ذات الكثافة الأعلى أدت إلى انخفاض واضح في تشوهات الحركة أثناء التصوير داخل الكبد في الفئران. لم يتم إجراء القياس الرسمي، حيث أثبت التكوين عالي الكثافة قوته وفعاليته الكافية عبر جميع أحجام RHIT التي تم اختبارها، وقدم أداء موثوقا باستمرار تحت ظروف التصوير الروتيني. بالنسبة لمعظم المستخدمين، ستكون هذه الكثافة الافتراضية مناسبة دون تعديل إضافي. ومع ذلك، بالنسبة للتجارب التي تتطلب خصائص ميكانيكية محددة، يمكن تعديل كثافة الحشو ومعايير التصميم، كما تم توفير تعليمات طباعة ثلاثية الأبعاد كاملة لدعم هذا التخصيص.

يمكن استخدام مواد بديلة للطباعة؛ ومع ذلك، فإن ABS هو المادة المفضلة لتصنيع RHIT لأنه يوفر عدة مزايا رئيسية. إنه خامل كيميائيا، مما يقلل من خطر التفاعل مع الأنسجة أو سوائل الجسم، وغير قابل للذوبان في الماء، مما يتيح تنظيفا وتخزينا وإعادة استخدام فعال. تجعل هذه الخصائص ABS خيارا موثوقا ومتينا للاستخدام التجريبي. عندما يكون الوصول إلى طابعة نمذجة الترسيب المنصهرة محدودا، يمكن استخدام تقنيات ومواد أخرى للطباعة ثلاثية الأبعاد. التصوير الستيريوليثوغرافيا، والتلبيد بالليزر الانتقائي، والاندماج متعدد النفاثات هي خيارات مناسبة مع مواد مثل النايلون، راتنجات البوليمر الضوئي، أو المساحيق المركبة. يوفر النايلون المتانة والمرونة، بينما توفر راتنجات الستيريوليثوغرافيا دقة عالية للتطبيقات التي تتطلب تفاصيل هيكلية دقيقة. يمكن تكييف تصميم RHIT بسهولة مع تفاوتات وقيود المواد المختلفة، مما يجعله متوافقا مع مجموعة من منصات الطباعة. يجب على المستخدمين اختيار المواد بناء على الاستقرار الميكانيكي، والتوافق الحيوي، والتوافق مع سير عمل التصوير، وموارد الطباعة المتاحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت جميع الدراسات على الحيوانات في مرافق الحيوانات التابعة للمعاهد الوطنية للصحة وفقا للإرشادات والبروتوكولات المصرح بها من قبل لجنة الأخلاقيات للتجارب الحيوانية (البروتوكول رقم LCMB-037). يطلب من جميع الأفراد أن يخضعوا للتدريب المناسب قبل المضي قدما في البروتوكولات التالية. تم التعامل مع الحيوانات وفقا للإرشادات المؤسسية.

يحدد بروتوكول RHIT إعداد أدوات تصوير الكبد القابلة لإعادة الاستخدام (RHITs) لاستخدامها في تجارب المجهر داخل الحيوي (IVM). تجرى الإجراءات التجريبية في غرفة مجهر معقمة أو غطاء مجهر، وتتضمن سلسلة من الخطوات: أولا، طباعة RHIT، التخدير، ووضع العلامات الفلورية على الفأرة، ثم إعداد المجهر، ثم الإجراء الجراحي، وأخيرا تطبيق تقنية التلقيح الصناعي بمساعدة RHIT. توضح الشكلان 1 و2 المكونات المطلوبة لتصوير العينات الحية باستخدام المجهر الكونفوكلي، والتي تشمل إدخال معدني 5,6,7 (محول مجهر لتصوير العينات الحية) لوضع RHIT، بالإضافة إلى RHITs للاستخدام في التعقيم المتقدم أو المسيطر عليه. لاختبار النظام، تم الحصول على ذكر C57BL/6J Musculus musculus العمري بين 6-10 أسابيع وتم إطعامه بنظام غذائي قياسي أو غربي لمدة 8-10 أسابيع قبل التجربة.

1. تصميم RHIT مع التعديلات

  1. لإعادة إنشاء RHIT، استخدم برنامج تصميم المنتجات ثلاثي الأبعاد (انظر جدول المواد). افتح برنامج التصميم وأنشئ جزءا قياسيا جديدا. احفظ الملف مع وصف مناسب.
  2. أنشئ رسم تخطيطي ل RHIT على المستوى الأمامي باستخدام ميزة إنشاء رسم تخطيطي ثنائي الأبعاد .
    1. انقر على أيقونة المستطيل ووضع الزاوية السفلية اليسرى عند نقطة البداية لمستوى الرسم.
    2. ارسم مستطيلا ثانيا داخل الأول لتمثيل نافذة التصوير في RHIT.
    3. أضف أبعاد لكلا المستطيلين باستخدام ميزة الأبعاد ، لضمان أن جميع الأطوال والعرض تشير إلى الأصل وبالنسبة لبعضها البعض.
    4. قم بضبط أبعاد RHIT حسب حجم الفأرة.
    5. أضف السماكة إلى RHIT عن طريق اختيار المستطيل الخارجي فقط والنقر على البثق. عندما تظهر نافذة منبثقة، اختر الرسم باستخدام أداة البثق لترك فتحة في المنتصف.
    6. اختر الوجه السفلي لجهاز RHIT المبثق وابدأ رسم تخطيطي ثنائي الأبعاد جديد باستخدام ميزة Start 2D Sketch .
  3. ارسم مستطيلا لتحديد جيب وسادة التسخين. طبق الأبعاد المكتسبة باستخدام ميزة البعد .
    1. اخرج من الرسم ثنائي الأبعاد وقم بإزالة المواد باستخدام أداة Cut Extrude لإنشاء تجويف عميق لوسادة الحرارة.
  4. ابدأ رسم تخطيطي جديد لمسبار درجة الحرارة على نفس وجه التجويف. انقر على بدء رسم ثنائي الأبعاد واختر أيقونة الدائرة . ضع الدائرة على سطح المستوي وحدد بعدها وفقا لذلك. اخرج من وضع الرسم التخطيطي .
    1. انقر على البثق واختر رسم الدائرة. في وضعe xtrusion ، انقر على قطع البثق، وانتظر ظهور نافذة منبثقة تحتوي على خيار لإزالة المادة. اضغط موافق. وضع الخروج من البثق .
    2. أضف شرائح على حواف النافذة بالنقر على أيقونة الفيليت واختيار جميع الحواف الثمانية الحادة. أضف حجم الفيليت واخرج من وضع الفيليت .
      ملاحظة: إذا كان هناك حاجة لامتصاص حركة إضافي، يمكن للمستخدمين زيادة كثافة الحشو الداخلية أثناء التحضير للطباعة ثلاثية الأبعاد.
  5. جهز النموذج للطباعة ثلاثية الأبعاد عن طريق التنقل إلى تبويب البيئة واختيار تبويب الطباعة ثلاثية الأبعاد.
    1. استخدم دالة التوجيه المعين للتأكد من أن النموذج مستلق بشكل مسطح على سرير الطباعة وليس موجها عموديا.
    2. انقر على خيارات الطباعة لضبط إعدادات الوحدة وضبط المقياس إذا لزم الأمر.
    3. احفظ النموذج النهائي في. تنسيق STL يستخدم وظيفة تصدير STL .
    4. اخرج من تبويب البيئة واضغط على الحفظ لحفظ RHIT كجزء قوي.
  6. أغلق برنامج التصميم.
    ملاحظة: تأكد من أن الطابعة متوافقة مع . تنسيق ملف STL أو تحويله إلى الصيغة المناسبة حسب متطلبات برنامج الطابعة ثلاثية الأبعاد.

2. رفع وطباعة RHIT من ملفات STL

  1. قم باستيراد ملف .stl من الشكل 1A أو الملف التكميلي 1، إلى برنامج التصميم بمساعدة الحاسوب ثلاثي الأبعاد (CAD) عن طريق النقر على الاستيراد واختيار ملف .stl. انقر على زر التحضير لتقطيع النموذج إلى طبقات رقيقة للطباعة ثلاثية الأبعاد.
  2. اختر الطابعة التجارية ثلاثية الأبعاد المناسبة وانقر على الطباعة. ثم راقب تقدم الطباعة، وبعد اكتمال الطباعة، قم بإزالة وتنظيف الجسم المطبوع ثلاثي الأبعاد حسب الحاجة.
حجم الفأروزن جسم الفأر (g)سمك RHIT (مم)حجم نافذة التصوير L X W (MM)
صغير (S)17-201.517 × 17
متوسط (ذكر)22-252.521 × 21
كبير (يسار)35-40326 × 26

الجدول 1: تكبير حجم الفأرة إلى RHIT. يتم قياس وزن الفأر ليكون سمكا ليكون RHIT، حيث يعادل الوزن الأكبر من 30 جرام (رأس السهم) أكبر RHIT (3.0 مم). أخف فأر يمثل أرق فأر RHIT، والفئران السمينة تمثل بأكثر RHITs سمكا. يمكن تعديل هذه الأبعاد في برامج CAD. يمكن أن يختلف طول RHIT وفتحة التصوير حسب موقع العضو المستخدم في العينة؛ كان الطول الثابت وفتحة التصوير لجميع RHITS الثلاثة مناسبين لهذه الدراسة. الاختصارات: RHIT = أداة تصوير الكبد القابلة لإعادة الاستخدام؛ CAD = التصميم بمساعدة الحاسوب.

3. تحضير المجهر واستخدام RHIT

figure-protocol-1
الشكل 2: IVM للكبد باستخدام تقنية RHIT. (أ) مخطط إعداد المجهر الكونفوكالي المقلوب مع فأر مخدر. (ب) تم استخدام محول مجهر معدني (إدراج) لوضع الفأر على منصة المجهر للتصوير الحي. (ج) تم استخدام RHIT المطبوع ثلاثي الأبعاد مع شريط شاش لتسهيل التلاعب ببارنشيم الكبد. (د) صورة للكبد المخرج مسبقا قبل تحديد موقع RHIT. تم استخدام مخروط الأنف للتخدير قبل وأثناء الجراحة. (ه) صورة للكبد الخارج قبل وضع RHIT أثناء إجراء حاد. لم يكن الحلاقة مطلوبة. (و) صورة الفأرة المقلوبة في الوضع النهائي للوجه على جهاز RHIT للتصوير. (G) RHIT مثبت بإحكام على مرحلة المجهر. (ح) فأرة موضوعة على محول RHIT ومعدني. (I) الفئران النحيلة (السهم الأزرق) والسمينة (السهم الأخضر) المعروضة مع إدخالات RHIT متقشرة على التوالي في J-L تصور صورا تشريحية عامة للكبد السمين والكبد النحيف (على التوالي). صور IVM عالية الدقة M,N للكبد من فئران سمينة ونحيفة موسومة ب BODIPY (أخضر، مصورة بسهم وردي) لتسمية قطرات الدهون وHoechst 33342 (أبيض، مصور بسهم سماوي) لتسمية النوى على التوالي. الاختصارات: RHIT = أداة تصوير الكبد القابلة لإعادة الاستخدام؛ IVM = المجهر داخل الحيوية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

  1. جهز مجهر كونفوكلي مقلوب تقليدي لعملية IVM في الكبد كما هو موضح في الشكل 2.
    1. أدخل محول مسرح لاستيعاب العينة. لاتباع هذا البروتوكول، استخدم إدخال معدني مخصص بفتحة دائرية بقطر 35 مم وزجاج تغطية بقطر 40 مم.
    2. نظف جانبي زجاج الغطاء جيدا قبل وبعد كل تصوير باستخدام 70٪ إيثانول حسب الحاجة.
  2. ثبت ال RHIT المناسب بناء على حجم الفأرة (الجدول 1) باستخدام شريط لاصق (اختياري) عن طريق محاذاة فتحة RHIT مع العدسة الموضوعية وبشكل متوازي فوق غطاء التصوير (الشكل 2G) على الإدخال المعدني مع شريط لاصق فوق زجاج الغلاف.
  3. اختر هدفا للتصوير بناء على حجم المنطقة، والدقة المكانية، ووقت التصوير، مثل هدف الماء 25x/0.95.
    ملاحظة: بينما التكبير الأعلى يحسن الدقة، فإنه يزيد أيضا من احتمالية حدوث تشوهات حركية.
    1. استوى الهدف بالقرب من زجاج الغلاف.
  4. ثبت شريط من الشاش (حوالي 1 × 8 سم، الشكل 2C,D) عبر نافذة RHIT باستخدام شريط لاصق للمساعدة في وضع الأنسجة وفصلها عن باقي أعضاء البطن (الشكل 2C).
  5. يتم تسخين RHIT مسبقا باستخدام وسادة حرارة تدرج في الفتحة وتثبيت المجس الحراري المجاور لجهاز RHIT (الشكل 2G,H) للحفاظ على درجة حرارة جسم الفأرة أثناء التصوير.

4. وضع العلامات الفلورية وتخدير الفأر

  1. قلل من إجهاد الفأر عن طريق تعقيم غرفة الحث المخدر للتخلص من أي آثار أخيرة من رائحة الحيوانات.
  2. شغل مكثف الأكسجين، ونظام حماية البيئة (EPS)، ومبخر الإيزوفلوران.
  3. ضع الفأر في غرفة الحث وتخدر باستخدام 2-3٪ من الأيزوفلوران لمدة تقارب 3-5 دقائق، أو حتى يظهر الحيوان تنفسا مستقرا وفقدان ردود الفعل الصحيحة وردود الفعل البدائية.
    1. بعد التخدير، انقل الفأر إلى وسادة التدفئة وحافظ على التخدير باستخدام 1-2٪ من الإيزوفلوران الذي يمر عبر مخروط الأنف (الشكل 2D)، مع تعديل التخدير حسب الحاجة لضمان مستوى جراحي مستقر من التخدير طوال الإجراء.
    2. قيم عمق التخدير بإجراء اختبار ضغط على إصبع القدم لمراقبة أي حركة إرادية.
  4. لوضع علامة على البنى الغنية بالدهون، يتم حقن 200 نانومول من BODIPY 665/676 مخفف في PBS (الحجم الكلي 200 ميكرولتر) عبر الوريد الذيلي باستخدام حقنة أنسولين 31 جيجابايت.
    1. للحصول على أفضل إشارة، أعط بوديبي مرة واحدة يوميا لمدة يومين متتاليين قبل التصوير. اترك ما لا يقل عن 3-4 ساعات بعد الحقنة الثانية لضمان إزالة الخلفية بشكل جهازي وتثبيت إشارة الأنسجة.
  5. لتوفير التباين النووي، يتم حقن هوشت 33342 (2 ميكروغرام/جم وزن الجسم) مخفف في محلول هيبارين واحد (معد بخلط 120 ميكرولتر من الهيبارين مع 180 ميكرولتر من المحلول الملحي لإنتاج 400 وحدة حرارة/مل) عبر الجيب العكسي باستخدام حقنة إنسولين بقوة 31 جيجابايت.
    ملاحظة: يعطى هوشت بشكل منفصل لتجنب الهطول عند خلطه مع أصباغ أخرى.
  6. لرؤية الأوعية الدموية، يتم حقن 18 ميكروغرام/جم من وزن الجسم من الديكستران الفلوري (70 كيلو دالتون) مخفف في نفس محلول الهيبارين 1x الموصوف في الخطوة 4.5، عبر الجيب الخلفي الجانبي المقابل باستخدام حقنة أنسولين بقوة 31 جيلون (الجدول 2).
    ملاحظة: يحتوي الهيبارين على الهيبارين لتقليل تكون الجلطات وتعزيز تدفق الدم المستمر أثناء التصوير.
  7. انتظر 10-15 دقيقة بعد حقن هوشت ودكستران قبل بدء الجراحة والتصوير.
مراسل فلوريالغرضالجرعة لكل وزن (أو التركيز)
هوشت 33342نوى الصبغة2 ميكروغرام/غرام: زيادة حجم الحقن إلى 50 ميكرولتر باستخدام محلول الهيبارين
بوديبي 665/676قطرات الدهون التي تصبغ0.8 ميكروغرام/غرام: زيادة حجم الحقن إلى 200 ميكرولتر في محلول ملحي
2M رباعي ميثيل رودامين-ديكسترن (ديكسترن)الأوعية الدموية الصبغية18 ميكروغرام/غرام: أضف حجم الحقن إلى 50 ميكرولتر باستخدام محلول الهيبارين

الجدول 2: خيارات المراسلين الفلوريين. يقدم هذا الجدول وصفا مفصلا للطرق المستخدمة لتصنيف أنسجة الفئران للتصوير في حياتها. يتم تحضير محلول الهيبارين أولا ثم يستخدم لصنع حلول DAPI-هيبارين ودكستران-هيبارين7. يتم حقن هوشت 33342 بشكل رجعي في عين واحدة، بينما يتم حقن BODIPY مباشرة في الوريد الذيلي قبل يومين إلى ثلاثة أيام، مع تركيز أعلى للفئران السمينة. يتم حقن ديكستران بشكل رجعي في العين الأخرى. من المهم إجراء حقن رجعية الحجارة بشكل منفصل في كل عين. الاختصار: DAPI = 4',6-دياميدينو-2-فينيليندول.

5. إجراء جراحي للفئران

  1. احلق معطف البطن باستخدام مقص الشعر و/أو كريم إزالة الشعر. أزل بقايا الشعر واستخدم 70٪ إيثانول لتنظيف الجلد المكشوف.
    ملاحظة: اعتمادا على متطلبات IACUC المؤسسية، قد يستخدم فرك متبادل من البيتادين والإيثانول لضمان تجهيز الموقع الجراحي المناسب.
  2. أعد تقييم عمق التخدير قبل الجراحة.
  3. كشف الكبد عن طريق عمل شق أفقي على شكل هلال بعرض 2-3 سم تحت القفص الصدري باستخدام مقص جراحي من الزيفويد، وينتهي عند الجانب الأيسر من الجزء العلوي من البطن.
  4. بعد الشق الأولي، قم بعمل شق ثانوي أصغر بعناية في طبقة العضلات لكشف الفص الأيسر من الكبد، ثم قم بكي (اختياري) حسب الحاجة لتجنب النزيف (الشكل 2E).
    1. لمنع تلف الكبد بالحرارة أثناء استخدام جهاز الكي عن طريق وضع شاش مبلل بمحلول ملحي بين الكبد وطبقة العضلات لامتصاص الحرارة المنبعثة من طبقة العضلات.
    2. تجنب أي نزيف مفرط، أو إصابات جراحية أو ميكانيكية، أو ضغط خارجي.
  5. بمجرد تعريض الكبد، انقل الفأر إلى مرحلة المجهر.

6. وضع الفأر على مرحلة المجهر

  1. ضع بطن الفأر المخدر مواجها للأسفل فوق منصة RHIT في المجهر.
    1. اضبط مخروط الأنف بحيث يبقى الفأر تحت التخدير.
    2. استخدم أداة تطبيق مبلعة بمحلول ملحي برأس قطني لتحريك الفص الجانبي الأيسر للكبد بلطف ضد الغطاء مع الضغط الخارجي اللطيف على التجويف الصدري.
      ملاحظة: استغل الجاذبية لتحريك الكبد بعناية إلى الزجاج الغطائي.
    3. استخدم شريط شاش لفصل الكبد بلطف عن جسم الفأر (الشكل 2E-H).
  2. افحص مخروط الأنف مرة أخرى للتأكد من بقاء الفأر تحت التخدير أثناء التصوير.
  3. تجنب جفاف الأنسجة عن طريق تطبيق جل مائي حول حواف التجويف المكشوف وتجنب الاتصال المباشر مع وسادة الحرارة.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام المجهر الذي يحتوي على غرفة رطوبة مغلقة 5,6,7 في الحفاظ على درجة الحرارة والرطوبة.
  4. ضع مرهم العيون على العينين لمنع جفاف القرنية.
  5. جهز IVM بتقنية التايم لابس لبدء التصوير 7,52.
    1. افتح مصاريع الليزر، وقيم العلامات الفلورية، وحدد منطقة مستقرة ذات اهتمام مع تدفق دم ملحوظ. اختر معلمات التقاط الصورة المناسبة، بما في ذلك تنسيق الصورة، سرعة الاكتساب، فترات التصوير، مدة الالتقاط الكلي، ومتوسط الخط/الإطار (512 × 512 بكسل؛ 1-5 إطارات ثانية لكل منطقة؛ فترات تصوير من 5-30 ثانية؛ إجمالي وقت التقاط 5-20 دقيقة؛ متوسط الخط/الإطار من 2-8، حسب متطلبات التجريب). تحسين التعرض لموميض الفلورة لاستيعاب الفلوروفورات المستخدمة.
    2. حدد الحدود العليا والسفلى لمكدس Z عن طريق اختيار Z-Stack في لوحة الاستحواذ ، وضبط مستويات البؤرة العليا والسفلية باستخدام ضوابط موضع Z، وتأكيد النطاق باستخدام Set First/Last؛ ثم ابدأ تسجيل التايم لابس بالنقر على Start Experiment (أو Start Acquisition). عند انتهاء التصوير، قم بقتل الحيوان وفقا لبروتوكولات رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية المعتمدة من اللجنة.

figure-protocol-2
الشكل 3: قياس استقرار IVM الكبدي المحسوب ل RHIT باستخدام SSIM. IVM الكبدي للفص السفلي الأيسر تحت ثلاث شروط تثبيت: (أ) عدم إدخال (لا شيء)، (ب) إدخال كرتوني، و(ج) RHIT. الأنسجة موسومة ب BODIPY (أرجواني، دهون)، Hoechst 33342 (خضراء، نوى)، ودكستران (سماوية، وعائية)؛ تظهر اللوحات A و B تشويه مرئي وتشويشات حركة، بينما تظهر C وضوحا معزنا باستخدام RHIT. (د) تم حساب مؤشر التشابه الهيكلي (SSIM) لقياس استقرار الصورة. تظهر الأشرطة متوسط ± SEM، وكل نقطة ملونة تمثل نسخة بيولوجية فردية: RHIT (n = 14)، كرتون (n = 10)، بدون إدراج (n = 8). هذه المجموعات هي مجموعات فرعية مأخوذة من المجموعة التجريبية الكاملة التي تضم حوالي 50-70 فأرا. تم تحليل الجلسات التي استوفت معايير تصوير محددة (مثل محاذاة الإطارات المتسقة وجودة الصورة) فقط عبر SSIM. أنتجت RHIT باستمرار قيم SSIM أعلى (المتوسط 0.511 ± SEM)، مما يشير إلى تحسين الاستقرار والدقة عبر ظروف التصوير. أشرطة المقياس = 15 ميكرومتر. تعرض صور تمثيلية؛ يعكس SSIM جلسات IVM متسلسلة دون ملاحظة تلف أو اضطراب في الأنسجة. الاختصارات: RHIT = أداة تصوير الكبد القابلة لإعادة الاستخدام؛ IVM = المجهر داخل الحيوية؛ SSIM = مؤشر التشابه الهيكلي؛ بطاقة = إدخال كرتوني. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تصميم RHIT باستخدام تطبيق CAD (الشكل 1). أبعاد RHIT مقياس لاستيعاب الفئران الصغيرة والمتوسطة والثقيلة (الجدول 1). يتكون تصميم RHIT من مادة ABS مسطحة بطول 107.50 مم مع فتحة موضوعة لاستيعاب تصوير الكبد. تم إجراء IVM في ظروف مثالية (RHIT) ودون مثالية (بدون إدخال أو كرتون) (انظر الشكل 3A-C). هذا يوضح نطاق النتائج الممكنة ومدى الاستقرار الذي يتم تحقيقه عند استخدام RHIT. تم اختبار RHIT على حوالي 50...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت دراسة المجهر داخل الكبد بشكل موسع، ومع ذلك، غالبا ما تتطلب الطرق السابقة إجراءات جراحية شديدة التوغل وغير موحدة للتصوير النهائي المستقر 5,6,7,9,31,32. الحركة هي بلا شك العائق الأكثر تحديا الذي يمنع التصوير القابل للتكرار في التصوير الصناعي الصناعي الكبدي. الحل الأكثر فعالية لتجنب الآثار ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل برنامج البحوث الداخلية في المعاهد الوطنية للصحة الأمريكية، والمعهد الوطني للسرطان، ومكتبة المعاهد الوطنية للصحة. يشكر ه. سانشيز كورنيخو وكالة كونسيتك البيروفية على الدعم المالي من خلال المنحة رقم PE501087367-2024-بروتشينسيا. نود أن نشكر أعضاء مختبر بورات-شليوم والمتعاونين في مجموعة الفيزياء الكمومية بجامعة كامبريدج على القراءة النقدية، وموظفي مكتبة NIH، وجينيتي غاغا على المساعدة التقنية. تم إنشاء الصورة ثلاثية الأبعاد في الشكل 2A باستخدام Biorender.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
شريط لاصق ½ بوصةشريط 3M العام للقناع:b40069428
أغطية 40 ممBioptech40-1313-03191
70٪ (v/v) إيثانولثيرمو فيشر العلميBP2818-470٪ إيثانول بالحجم و30٪ ماء بالحجم
جهاز التخدير: AMD-3 PlusسومنيAMD-17106
جل نقل الموجات فوق الصوتية Aquasonic 100مختبرات باركر  01 08
بوديبي 665/67ثيرمو فيشر ساينتيفيك (إنفيتروجين)B3932انظر الجدول 2
برامج CAD (مثل Autodesk Inventor أو ما يعادلها) أوتوديسك (برنامج CAD تمثيلي)لا يوجدالبرمجيات
نظام الكيالجوزاءGEM 5917
مطهر كليدوكسمختبرات أبحاث فارماكال المحدودةVWR، MSPP-96118F
المجهر الكونفوكلي (Leica SP8 أو ما يعادله)لايكاSP8
أدوات تطبيق القطنالمنتجات الطبية البيوريتانية25-806 1WC
إدخال مرحلة ألمنيوم مخصص (سمك 3 مم، تعمق 35 مم)لا يوجدلا يوجد
فوران (إيزوفلوران، USP) سائل للاستنشاق، 250 ملباكستر10019-360-60
مقص الشعر (اختياري)أونيكس فاين إنسترومنتسASWRHC
وسادة تدفئة مع مسبار شرجيأجهزة ALA العلميةوسادة التدفئة 1/2
صوديوم الهيبارين، 1000 وحدة USP U/mLحكما0641-0391-12
هوشت 33342ثيرمو فيشر ساينتيفيك (إنفيتروجين)62249انظر الجدول 2
وسادة تسخين الفأرةأجهزة ALA العلميةوسادة التدفئة 1/2
موسكولوسمختبر جاكسونC57BL/6فأر المختبر
محلول ملحي عادي (كلوريد الصوديوم 0.9٪)ثيرمو فيشر العلمي7210-16
RHIT (أداة تصوير الكبد القابلة لإعادة الاستخدام) الحجم المناسبمقدملا يوجدانظر الجدول 1
ملقط جراحي، طرف منحنيأدوات العلوم الدقيقة11251-23
الشاش الجراحيماكسون6939
المقص الجراحيأدوات العلوم الدقيقة14001-14
تتراميثيلرودامين ديكسترانثيرمو فيشر ساينتيفيك (إنفيتروجين)D7139انظر الجدول 2
محاقن الأنسولين فائقة الدقة U-100، 31 جرامبيتي ميلزBD326730

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Scheele, C. L. G. J., et al. Multiphoton intravital microscopy of rodents. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 89(2022).
  2. Hor, J. L., Germain, R. N. Intravital and high-content multiplex imaging of the immune system. Trends Cell Biol. 32 (5), 406-420 (2022).
  3. Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: ready for prime time. J Cell Biol. 201 (7), 969-979 (2013).
  4. Meyer, K., et al. A predictive 3D multi-scale model of biliary fluid dynamics in the liver lobule. Cell Syst. 4 (3), 277-290.e9 (2017).
  5. Porat-Shliom, N., et al. Liver kinase B1 regulates hepatocellular tight junction distribution and function in vivo. Hepatology. 64 (4), 1317-1329 (2016).
  6. Acevedo-Acevedo, S., et al. LKB1 acts as a critical brake for the glucagon-mediated fasting response. Hepatol Commun. 6 (7), 1949-1961 (2022).
  7. Stefkovich, M. L., Kang, S. W. S., Porat-Shliom, N. Intravital microscopy for the study of hepatic glucose uptake. Curr Protoc. 1 (1), e139(2021).
  8. Zhang, X. Y., Sun, C. K., Wheatley, A. M. A novel approach to the quantification of hepatic stellate cells in intravital fluorescence microscopy of the liver using a computerized image analysis system. Microvasc Res. 60 (2), 232-240 (2000).
  9. Gola, A., et al. Commensal-driven immune zonation of the liver promotes host defence. Nature. 589 (7840), 131-136 (2021).
  10. Kamoun, W. S., Schmugge, S. J., Kraftchick, J. P., Clemens, M. G., Shin, M. C. Liver microcirculation analysis by red blood cell motion modeling in intravital microscopy images. IEEE Trans Biomed Eng. 55 (1), 162-170 (2008).
  11. Davis, R. P., et al. Optimization of in vivo imaging provides a first look at mouse model of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) using intravital microscopy. Front Immunol. 10 (1), 2988(2020).
  12. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145(2012).
  13. Soulet, D., Lamontagne-Proulx, J., Aube, B., Davalos, D. Multiphoton intravital microscopy in small animals: motion artefact challenges and technical solutions. J Microsc. 278 (1), 3-17 (2020).
  14. Mempel, T. R., Bauer, C. A. Intravital imaging of CD8+ T cell function in cancer. Clin Exp Metastasis. 26 (4), 311-327 (2009).
  15. Lee, S., Courties, G., Nahrendorf, M., Weissleder, R., Vinegoni, C. Motion characterization scheme to minimize motion artifacts in intravital microscopy. J Biomed Opt. 22 (3), 036005(2017).
  16. Rhodes, G. J. Surgical preparation of rats and mice for intravital microscopic imaging of abdominal organs. Methods. 128 (1), 129-138 (2017).
  17. Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
  18. Davis, R. P., et al. Optimization of in vivo imaging provides a first look at mouse model of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) using intravital microscopy. Front Immunol. 10 (1), 2988(2019).
  19. Dawson, C. A., et al. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nat Protoc. 16 (4), 1907-1935 (2021).
  20. Murphy, K. J., Reed, D. A., Trpceski, M., Herrmann, D., Timpson, P. Quantifying and visualising the nuances of cellular dynamics in vivo using intravital imaging. Curr Opin Cell Biol. 72 (1), 41-53 (2021).
  21. Pereira, E. N. G. dS., et al. Hepatic microvascular dysfunction and increased advanced glycation end products are components of non-alcoholic fatty liver disease. PLoS One. 12 (6), e0179654(2017).
  22. Stefkovich, M. L., Kang, S. W. S., Porat-Shliom, N. Intravital microscopy for the study of hepatic glucose uptake. Curr Protoc. 1 (1), e139(2021).
  23. Lu, Z., et al. Long-term intravital subcellular imaging with confocal scanning light-field microscopy. Nat Biotechnol. 43 (4), 569-580 (2025).
  24. Lu, Z., et al. A practical guide to scanning light-field microscopy with digital adaptive optics. Nat Protoc. 17 (8), 1953-1979 (2022).
  25. Zhang, Y., et al. Computational optical sectioning with an incoherent multiscale scattering model for light-field microscopy. Nat Commun. 12 (1), 6391(2021).
  26. Zhao, Z., et al. Two-photon synthetic aperture microscopy for minimally invasive fast 3D imaging of native subcellular behaviors in deep tissue. Cell. 186 (11), 2475-2491.e22 (2023).
  27. Lu, Z., et al. Virtual-scanning light-field microscopy for robust snapshot high-resolution volumetric imaging. Nat Methods. 20 (5), 735-746 (2023).
  28. Chen, S., et al. Hepatocyte-specific Mas activation enhances lipophagy and fatty acid oxidation to protect against acetaminophen-induced hepatotoxicity in mice. J Hepatol. 78 (3), 543-557 (2023).
  29. Chen, S., et al. Myeloid-Mas signaling modulates pathogenic crosstalk among MYC+CD63+ endothelial cells, MMP12+ macrophages, and monocytes in acetaminophen-induced liver injury. Adv Sci. 11 (1), 2306066(2024).
  30. Wu, J., et al. Iterative tomography with digital adaptive optics permits hour-long intravital observation of 3D subcellular dynamics at millisecond scale. Cell. 184 (12), 3318-3332 (2021).
  31. Benechet, A. P., Ganzer, L., Iannacone, M. Intravital microscopy analysis of hepatic T cell dynamics. Methods Mol Biol. 1514 (1), 49-61 (2017).
  32. Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital microscopy imaging of the liver following Leishmania infection: an assessment of hepatic hemodynamics. J Vis Exp. 98 (1), e52303(2015).
  33. Heymann, F., et al. Long-term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (98), e52607(2015).
  34. Surewaard, B. G. J., Kubes, P. Measurement of bacterial capture and phagosome maturation of Kupffer cells by intravital microscopy. Methods. 128 (1), 12-19 (2017).
  35. Wang, J., Kubes, P. A reservoir of mature cavity macrophages that can rapidly invade visceral organs to affect tissue repair. Cell. 165 (3), 668-678 (2016).
  36. Wang, Y., Wang, J. Intravital imaging of inflammatory response in liver disease. Front Cell Dev Biol. 10 (1), 922041(2022).
  37. Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
  38. Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver. J Vis Exp. 188 (1), e64239(2022).
  39. Liu, T. W., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, D. Multi-modal multi-spectral intravital microscopic imaging of signaling dynamics in real time during tumor-immune interactions. Cells. 10 (3), 499(2021).
  40. Burkovskiy, I., Lehmann, C., Jiang, C., Zhou, J. Utilization of 3D printing for an intravital microscopy platform to study the intestinal microcirculation. J Microsc. 264 (3), 224-226 (2016).
  41. Kuss, M., Crawford, A. J., Alimi, O. A., Hollingsworth, M. A., Duan, B. Three-dimensional printed abdominal imaging windows for in vivo imaging of deep-lying tissues. Machines. 10 (8), 697(2022).
  42. Xie, W., et al. 3D-printed lightweight dorsal skin fold chambers from PEEK reduce chamber-related animal distress. Sci Rep. 12 (1), 11599(2022).
  43. Burkovskiy, I., Lehmann, C., Jiang, C., Zhou, J. Utilization of 3D printing for an intravital microscopy platform to study the intestinal microcirculation. J Microsc. 264 (3), 224-226 (2016).
  44. Urciuolo, A., et al. Intravital three-dimensional bioprinting. Nat Biomed Eng. 4 (8), 901-915 (2020).
  45. Dul, S., Gutierrez, B. J. A., Pegoretti, A., Alvarez-Quintana, J., Fambri, L. 3D printing of ABS nanocomposites: comparison of processing and effects of multi-wall and single-wall carbon nanotubes on thermal, mechanical and electrical properties. J Mater Sci Technol. 121 (1), 52-66 (2022).
  46. Stansbury, J. W., Idacavage, M. J. 3D printing with polymers: challenges among expanding options and opportunities. Dent Mater. 32 (1), 54-64 (2016).
  47. Ligon, S. C., Liska, R., Stampfl, J., Gurr, M., Mulhaupt, R. Polymers for 3D printing and customized additive manufacturing. Chem Rev. 117 (15), 10212-10290 (2017).
  48. Das, A., et al. Current understanding and challenges in high-temperature additive manufacturing of engineering thermoplastic polymers. Addit Manuf. 34 (1), 101218(2020).
  49. Turaka, S., Jagannati, V., Pappula, B., Makgato, S. Impact of infill density on morphology and mechanical properties of 3D-printed ABS/CF-ABS composites using design of experiments. Heliyon. 10 (9), e29920(2024).
  50. Ahmad, M. N., Yahya, A. Effects of 3D printing parameters on mechanical properties of ABS samples. Designs. 7 (6), 136(2023).
  51. Nguyen, T. T., Tran, V. T., Nguyen, V., Nguyen, V. T. T. Effect of infill ratios in SLA 3D printing on mechanical properties of castable wax patterns for molded shells in investment casting. PLoS One. 20 (2), e0311245(2025).
  52. Acevedo-Acevedo, S., et al. LKB1 acts as a critical brake for the glucagon-mediated fasting response. Hepatol Commun. 6 (7), 1949-1961 (2022).
  53. Wang, Z., Bovik, A. C., Sheikh, H. R., Simoncelli, E. P. Image quality assessment: from error visibility to structural similarity. IEEE Trans Image Process. 13 (4), 600-612 (2004).
  54. Madhav, B. T. P., Rao, M. V. G., Pisipati, V. G. K. M. Identification of liquid crystalline phases in 7O.O9 compound based on structural similarity index measure. Liq Cryst. 42 (2), 198-203 (2015).
  55. Zhou, W., Bovik, A. C. A universal image quality index. IEEE Signal Process Lett. 9 (1), 81-84 (2002).
  56. Winkler, S. Human Vision and Electronic Imaging IV. , 175-184 (1999).
  57. Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection. Front Cell Dev Biol. 8 (1), 620471(2020).
  58. Matsumoto, S., Kikuta, J., Ishii, M. Intravital Imaging of Dynamic Bone and Immune Systems: Methods and Protocols. Ishii, M. , 137-143 (2018).
  59. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145(2012).
  60. Honda, M., et al. Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice. Transplantation. 95 (5), 551-558 (2013).
  61. Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver. J Vis Exp. 188 (1), e64239(2022).
  62. de Paz, J. L., et al. Profiling heparin-chemokine interactions using synthetic tools. ACS Chem Biol. 2 (11), 735-744 (2007).
  63. Taqueti, V. R., Jaffer, F. A. High-resolution molecular imaging via intravital microscopy: illuminating vascular biology in vivo. Integr Biol (Camb). 5 (3), 278-290 (2013).
  64. Freund, J. B., Goetz, J. G., Hill, K. L., Vermot, J. Fluid flows and forces in development: functions, features and biophysical principles. Development. 139 (7), 1229-1245 (2012).
  65. Tabira, K., et al. An in vitro study of digital impressions and three-dimensional printed models of orbital defects using mobile devices and monoscopic photogrammetry. J Oral Sci. 65 (2), 127-130 (2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة