مقالة منهجية

أجهزة الاستشعار الحيوية المشفرة وراثيا القائمة على الفلوروفور للتصوير الفلوري النسبي في الميكروبات

DOI:

10.3791/68339

⸱

أغسطس 1, 2025

 ,  , 
1Department of Biology, Heinrich-Heine Universität Düsseldorf, 2Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga, 3Institute of Cell and Interaction Biology, Heinrich-Heine Universität Düsseldorf, 4Université de Lyon, INSA Lyon, CNRS, Université Claude Bernard Lyon 1

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول تطبيق أجهزة الاستشعار الحيوية المشفرة وراثيا القائمة على الفلوروفور في الميكروبات للتصوير المضان النسبي الكمي في ظل ظروف خاضعة للرقابة. من خلال دمج استراتيجيات الاستشعار الحيوي هذه مع تقنيات التصوير المتقدمة ، تتيح الطريقة تحليلا عالي الدقة في الوقت الفعلي على مستوى الخلية الواحدة ، مما يوفر رؤى أعمق لديناميكيات الجزيئات الصغيرة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد التحقيق في ديناميكيات الجزيئات الصغيرة داخل الميكروبات أمرا ضروريا لإجراء دراسات شاملة للوظيفة الميكروبية. تلعب كل من ديناميكيات الجزيئات الصغيرة داخل الكائنات الحية وبين الكائنات الحية أدوارا حاسمة في فسيولوجيا الميكروبات والتكافل والمرض. ومع ذلك ، لا تزال مراقبة هذه الديناميكيات صعبة للغاية باستخدام معظم التقنيات الموجودة. تعد المستشعرات الحيوية المشفرة وراثيا القائمة على الفلوروفور أدوات قوية لتتبع ديناميكيات الجزيئات الصغيرة في الجسم الحي ولديها إمكانات عالية لقيادة الاكتشافات الجديدة. تستخدم هذه المستشعرات الحيوية بشكل شائع في التصوير الفلوري ، غالبا بالاشتراك مع أجهزة التروية التي تسمح بالتحكم الدقيق في الظروف البيئية. عند دمجه مع تقنيات التصوير المتقدمة ، يوفر هذا النهج بيانات عالية الدقة وحلها مكانيا وزمانيا ، مما يتيح رؤى حول الاستجابات الميكروبية أحادية الخلية. على الرغم من وعودهم ، لا يزال تنفيذ مثل هذه المستشعرات الحيوية يمثل تحديا تقنيا. يعد فهم الخطوات الرئيسية أمرا بالغ الأهمية لتبني أوسع. هنا ، نقدم بروتوكولا مصمما لدعم النشر الفعال لأجهزة الاستشعار الحيوية المصممة حديثا في الميكروبات للتصوير المضان النسبي الكمي في ظل ظروف خاضعة للرقابة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستخدم الباحثون على نطاق واسع المستشعرات الحيوية القائمة على كثافة الفلوروفور المزدوج والفلوروفور المزدوج لمجموعة متنوعة من التطبيقات1. استخدمت بعض الدراسات تحليلات أجهزة الاستشعار الحيوية متعددة الإرسال لتتبع إشارات متعددة داخل نفس الخلايافي وقت واحد 2. تعتمد العديد من هذه المستشعرات الحيوية على مجالات ربط الترابط ، حيث تؤدي أحداث الربط إلى تغييرات توافقية تغير خصائص التألق3،4. أصبحت أجهزة الاستشعار الحيوية المشفرة وراثيا أدوات أساسية للتصوير في الجسم الحي عبر مجموعة من الأنظمة5 ، مما يتيح المراقبة عالية الدقة لمستويات الأيونات والمستقلبات في المكان والزمان1. ومع ذلك ، كانت أجهزة الاستشعار الحيوية المبكرة محدودة في النطاق الديناميكي ونسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) 6. أدت التطورات الحديثة في أجهزة الاستشعار الحيوية المكثفة الفلوروفورية المفردة القائمة على بروتينات الفلورسنت الحساسة للتوافق (csFPs) إلى تحسين الأداء بشكل كبير. ومع ذلك ، يمكن أن تؤثر الاختلافات في مستويات التعبير عن البروتين على قياسات في الجسم الحي باستخدام أجهزة الاستشعار الحيوية القائمة على الفلوروفورالمشفرة وراثيا 6 ، والتي تستخدم بشكل شائع لتصور جزيئات الإشارات والمستقلبات في الخلايا الحية7،8. لا تسمح أجهزة الاستشعار الحيوية المكثفة أحادية الفلوروفور بتطبيع مستويات التعبير عن المستشعر الحيوي ، والتي قد تتقلب في الجسم الحي. ومع ذلك ، يمكن أن يؤدي دمج بروتين الفلورسنت المرجعي إلى تحويل أجهزة الاستشعار الحيوية أحادية الفلوروفور إلى إصدارات نسبية مزدوجة الفلوروفور ، مما يتيح تقديرات كمية أكثر موثوقية9. بسبب فقدان الطاقة من العمليات غير الإشعاعية ، يتم تحويل طيف انبعاث الفلورسنت بالنسبة إلى طيف الامتصاص ، وهي ظاهرة تعرف باسم تحول ستوكس10. تم استخدام بروتين الفلورسنت الكبير Stokes Shift (LSSFPs) كفلوروفورات مرجعية مثالية في أجهزة الاستشعار الحيوية النسبية المزدوجةالفلوروفور 9،11. يتمثل التقدم الأخير في تطوير أجهزة الاستشعار الحيوية أحادية اللون للتفاح الأخضر (GA) Matryoshka ، والمعروفة باسم GA-MatryoshCaMP6s ، والتي تشتمل على LSSFP أحمر ، يسمى LSSmApple12. عند دمجها مع الأجهزة الدقيقة مثل أنظمة الموائع الدقيقة ، توفر المستشعرات الحيوية المشفرة وراثيا القائمة على الفلوروفور نهجا طفيفا التوغل للتصوير النسبي الكمي باستخدام تقنيات مثل الفحص المجهري متحد البؤر. يتيح هذا التكامل التصوير عالي السرعة والمراقبة في الوقت الفعلي لديناميكيات الجزيئات الصغيرة في الخلايا المفردة تحت الضغط البيئي. على سبيل المثال ، تم تطبيق أجهزة الاستشعار الحيوية cAMP والجلوكوز بنجاح في الخميرة. عند استخدامها جنبا إلى جنب مع السلالات الطافرة ، ساعدت هذه المستشعرات الحيوية في توضيح الشبكات التنظيمية الرئيسية التي تحكم امتصاص السكر13،14. على الرغم من التقدم الكبير ، لم تصل هذه التقنيات بعد إلى إمكاناتها الكاملة للتحقيق في الأسئلة البيولوجية الحرجة التي تنطوي على ديناميكيات الجزيئات الصغيرة في الجسم الحي15. ونتيجة لذلك، لا يزال اعتمادها على نطاق واسع في المختبرات محدودا، ولا تزال المنهجيات الموحدة للتنفيذ على نطاق أوسع غير متوفرة.

بالمقارنة مع المنهجيات التقليدية التي تعتمد على أجهزة الاستشعار الحيوية أحادية الفلوروفور غير النسبية أو القياسات على المستوى السائب ، فإن بروتوكولنا القائم على المستشعرات الحيوية GA Matryoshka يتيح التصوير عالي الدقة وحيدة الخلية مع تحليل النسبة الكمي. من خلال دمج الفلوروفور الكبير لإزاحة ستوكس كمرجع داخلي ، تعوض الطريقة عن التباين في تعبير المستشعر الحيوي ، وهو قيد رئيسي للتصميمات السابقة. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح الجمع بين أجهزة الموائع الدقيقة بالتحكم الدقيق في الظروف البيئية ، مما يوفر تحسينا على غرف التروية التقليدية أو أنظمة الاستزراعالثابتة 12. يوفر هذا النهج أيضا مزايا مميزة لدراسة التفاعلات الديناميكية بين الميكروبات ومضيفيها ، مثل التفاعلات بين مسببات الأمراض النباتية والارتباطات التكافلية مثل الفطريات الفطرية ، حيث يكون الدقة المكانية والزمانية على المستوى الخلوي ضرورية للكشف عن الآليات الجزيئية للاتصال وتبادل المغذيات.

في هذا السياق ، نقدم بروتوكولا مفصلا خطوة بخطوة لتصوير المستشعر الحيوي النسبي في الميكروبات. على الرغم من تحسينه خصيصا للتنفيذ في الخميرة ، إلا أنه يمكن تكييف هذا البروتوكول للاستخدام في الميكروبات الأخرى ، بما في ذلك البكتيريا ، ويمتد ليشمل الكائنات الحية غير النموذجية مثل الميكروبات المرتبطة بالنباتات. على سبيل المثال ، يمكن استخدام أجهزة الاستشعار الحيوية جنبا إلى جنب مع أنظمة الموائع الدقيقة للتصوير الفلوري الكمي لإشارات الكالسيوم في الخميرة ، مما يتيح المراقبة في الوقت الفعلي لاستجابات الكالسيوم تحت الإجهادالبيئي 14.

يهدف هذا البروتوكول إلى توجيه الباحثين في النشر الفعال لأجهزة الاستشعار الحيوية المصممة حديثا ، وبالتالي تعزيز استكشاف العمليات البيولوجية من خلال التصوير الفلوري القائم على أجهزة الاستشعار الحيوية في الأنظمة الميكروبية. ويتضمن توصيات عملية حول ظروف استزراع الخميرة ، وإعدادات الإثارة / الانبعاث المثلى ، والتوافق مع سلالات الخميرة شائعة الاستخدام (على سبيل المثال ، K601 و W303-1A MAT-a). تشمل القيود الملحوظة التبييض الضوئي أثناء جلسات التصوير المطولة والتحديات المتعلقة بالتعبير عن المستشعر الحيوي في العينات البيولوجية. نظرا لأن العديد من العوامل يمكن أن تؤثر على نتائج تجارب التصوير بالمستشعرات الحيوية في الجسم الحي ، فإن هذا البروتوكول خطوة بخطوة يهدف أيضا إلى مساعدة الباحثين على توقع التحديات المحتملة والتغلب عليها ، وبالتالي تسهيل التطبيقات القابلة للتكرار.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. التصميم العقلاني لأجهزة الاستشعار الحيوية النسبية (الشكل 1)

ملاحظة: يتم اختيار البروتين المرتبط المعني باعتباره المجال الحسي بناء على المعايير ذات الصلة ، بما في ذلك (أنا) الخصوصية ، (ثانيا) التقارب ، (ثالثا) المعلومات الهيكلية ، و (رابعا) إعادة ترتيب التشكل عند ربط الترابط. تضمن الخصوصية أن المستشعر الحيوي يستجيب بشكل انتقائي للجزيء المستهدف دون تفاعل متبادل. يعتبر التقارب يتماشى مع نطاق التركيز المتوقع للجزيء المستهدف في السياق البيولوجي. توفر المعلومات الهيكلية ، المستمدة من البيانات التجريبية أو النماذج الحسابية مثل تلك التي تم إنشاؤها بواسطة AlphaFold ، رؤى حول التنظيم ثلاثي الأبعاد للمجال الحسي والتغيرات التوافقية التي يسببها الترابط. تستخدم هذه الأفكار لتحديد نقاط الإدخال المناسبة للفلوروفورات. ثم يتم تطوير استراتيجية التحقق لتقييم استجابة المستشعر الحيوي ونطاقه الديناميكي ، اعتمادا على التطبيقات المقصودة.

  1. قم ببناء تصميم Matryoshka في السيليكو عن طريق إدخال كاسيت Green-Apple Matryoshka12 في المجال الحسي بحيث يستجيب البروتين الفلوري الأخضر المتغير دائريا (cpGFP) ، وهو حساس للتغيرات التوافقية ، لإعادة الترتيب الناجم عن ربط الترابط للمجال الحسي.
    1. استخدم برنامج التصور الجزيئي ، مثل Chimera ، لتحليل بنية مجال الربط. إذا لم يكن الهيكل ثلاثي الأبعاد متاحا ، فاستخدم AlphaFold لإنشاء نموذج موثوق.
    2. حدد الحلقات المرنة داخل بنية البروتين كنقاط ضعف ومواقع إدخال محتملة لكاسيت الفلوروفور المزدوج ، والذي تم اختياره لتجنب تعطيل الوظيفة العامة للبروتين أو استقراره.
    3. استخدم AlphaFold مرة أخرى للتنبؤ ببنية البروتين الخيمري الذي يحتوي على كاسيت FP المزدوج المدرج ، مما يؤكد أن الإدخال لا يؤدي إلى تغييرات هيكلية غير مواتية.
    4. استنساخ المستشعر الحيوي الذي يتحول إلى الحمض النووي البلازميدي الذي يتيح التعبير في خلايا الخميرة. على وجه التحديد ، أدخل الجين الذي يشفر المستشعر الحيوي المصمم حديثا في ناقل مكوك الخميرة pAG416 ، والذي يحتوي على عناصر مناسبة للتعبير عن الخميرة ، باستخدام تقنية استنساخ مناسبة12،13،14.
    5. بعد الاستنساخ ، قم بتحويل البلازميد المؤتلف إلى خلايا بكتيرية لتضخيم الحمض النووي البلازميد. استخدم الحمض النووي البلازميد المنقى لتحويل الخميرة.
    6. أدخل البلازميد المنقى في خلايا الخميرة من خلال التحول بوساطة البولي إيثيلين جلايكول (PEG) كما هو منشور16. تحولت خلايا الخميرة على الوسائط التي تعاني من نقص اليوراسيل ، والتي تختار المستنسخة الإيجابية التي تحتوي على البلازميد الذي يحمل علامة اختيار URA3.

2. إعداد العينة

  1. محولات الخميرة المتسلسلة التي تعبر عن المستشعرات الحيوية GA-Matryoshka على ألواح متوسطة انتقائية (أي SC-Ura) وتحتضن عند 30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام للسماح بنمو المستعمرة.
    ملاحظة: تحمل سلالة الخميرة ضمور ura3، والذي يكمله جين URA3 على البلازميد ، مما يتيح الاختيار على الوسائط التي تعاني من نقص اليوراسيل. يشتمل البلازميد الذي يشفر المستشعر الحيوي على شريط كاسيت يكمل التغذية الحيوية (على سبيل المثال ، pAG416 GPD GA-MatryoshCaMP6s).
  2. توليد محولات الخميرة من سلالة K601 / W303-1A MAT-a (النمط الجيني: ade2-1 ura3-1 his3-11 trp1-1 leu2-3 leu2-112 can1-100). قم بإجراء التحويل باستخدام ناقل تعبير شائع الاستخدام ل خميرة الخميرة ، مثل pAG41612.
  3. بعد التحول ، يتم زراعة خلايا الخميرة عند 30 درجة مئوية على وسط SC-Ura ، محضرة لكل لتر على النحو التالي ، حتى تظهر مستعمرات محولة بشكل مستقل: 0.77 جم CSM-Ura ، 6.7 جم قاعدة نيتروجين الخميرة (YNB) مع كبريتات الأمونيوم ، 20 جم جلوكوز ، 20 جم أجار ، وأدينين مضاف إلى التركيز النهائي البالغ 150 ميكرومتر.
  4. قم بإعداد خلايا الخميرة المختصة وقم بإجراء التحويل بوساطة PEG 3350 وفقا للبروتوكولالمعمول به 16.
  5. لتجارب محاصرة الخلايا الموائع الدقيقة ، قم بوضع مخزون 25٪ من الجلسرين على ألواح SC-Ura واحتضانه عند 30 درجة مئوية لمدة يومين للسماح بنمو مستعمرات مفردة مستقلة. أعد تعليق المستعمرات الفردية في 5 مل من وسط SC-Ura السائل واحتضانها عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز حتى يصل OD600 إلى 0.5-1.0 ، مما يجعلها مناسبة للتحميل في نظام التروية.

3. تحضير نظام التروية (الشكل 2)

  1. قم بإعداد الصفيحة الموائع الدقيقة لخلايا الخميرة أحادية الصيغة الصبغية عن طريق تحميلها ب 50 ميكرولتر من خلايا الخميرة التي تعبر عن أجهزة الاستشعار الحيوية GA-Matryoshka ، جنبا إلى جنب مع وسائط SC-Ura النهائية للنمو والمحلول المخزن للعلاجات (على سبيل المثال ، كلوريد الصوديوم أو السوربيتول).
    1. قم بإزالة محلول التخزين من الآبار 1-8. استنشط محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) من الآبار وأضف 400 ميكرولتر من الماء المعقم.
    2. اغسل الآبار 1-6 و 8. اغسل 1: استنشق محلول الماء المعقم من الآبار 1-8 وأضف 400 ميكرولتر من الماء المعقم. الغسيل 2: كرر الغسيل عن طريق الشفط وإضافة 400 ميكرولتر من الماء المعقم. الغسيل 3: كرر مرة أخرى مع 400 ميكرولتر من الماء المعقم.
    3. الملء النهائي للآبار 1-6: شفط محلول الماء وأضف 300 ميكرولتر من محاليل التروية / النمو النهائية مثل SC-Ura لنمو الخميرة ، أو محلول مخزن يحتوي على التحليلات ذات الأهمية للمعالجة.
    4. تحميل الخلية في البئر 8: أضف 50 ميكرولتر من تعليق خلايا الخميرة (OD600 = 0.5-1.0).
  2. أغلق الألواح بمشعب التحكم في درجة الحرارة لمنصة الموائع الدقيقة وقم بتوصيلها بنظام تصوير الخلايا الحية. تحافظ المشعبات على بيئة حرارية مستقرة عند درجة حرارة 28 درجة مئوية ، بينما تضمن الأنابيب والمضخة إحكاما مناسبا ونضحا مستمرا.
    1. قم بمحاذاة اللوحة على المشعب. قم بتشغيل المكنسة الكهربائية. قم بتشغيل منصة الموائع الدقيقة.
    2. اضغط على Seal وانتظر حتى يضيء الضوء الأخضر. افتح برنامج النظام الأساسي للموائع الدقيقة ، وأنشئ تجربة جديدة ، وحدد لوحة الخميرة المناسبة من القائمة المنسدلة.
    3. انقر فوق الزر Run Liquid Priming Sequence . انقر فوق تشغيل تسلسل تحميل الخلية لتحميل خلايا الخميرة من البئر 8 إلى غرفة الاستزراع ، حيث سيتم احتجازها ونموها تحت التروية المستمرة للوسط الانتقائي SC-Ura بين عشية وضحاها عند 10 كيلو باسكال عند 28 درجة مئوية.
    4. ضمن علامة التبويب الوضع اليدوي، انقر فوق تشغيل تسلسل مخصص أو استخدم محرر البروتوكول لتعيين معلمات تجريبية مثل درجة الحرارة عند 30 درجة مئوية، ومعدل التدفق عند 10 كيلو باسكال، ومدة الخطوة (على سبيل المثال، 10 دقائق)، والقنوات المراد فتحها للنضح.
  3. قم بزراعة الخلايا طوال الليل في غرفة الاستزراع تحت التروية المستمرة مع متوسط انتقائي SC-Ura عند 28 درجة مئوية وضغط 10-17 كيلو باسكال.

4. التصوير الفلوري النسبي (الشكل 3 والشكل 4 والفيديو 1)

  1. تقييم نمو الخلايا والفلورة من خلال تصور مجهري سريع.
    1. ضع صفيحة الموائع الدقيقة على مسرح المجهر المقلوب. ركز على مركز منطقة العرض لتحديد موقع الخلايا.
    2. استخدم الفحص المجهري الساطع و / أو الفلوري لتقييم مورفولوجيا الخلية وقابليتها للحياة وتعبير المستشعر الحيوي.
  2. تحقق من ديناميكيات الحالة المستقرة للكالسيوم في ظل ظروف يتم التحكم فيها بدقة باستخدام نظام الموائع الدقيقة وألواح الموائع الدقيقة المتوافقة4،12،13،14.
  3. قم بإجراء تصوير الخلايا الحية باستخدام مجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر المقلوب مع تكبير a100x وفتحة عددية (NA) تبلغ 1.40. راقب المستشعرات الحيوية الفلوروفورية المزدوجة بواسطة GFP و LSSmApple المثيرين عند 488 نانومتر باستخدام ليزر الأرجون. اجمع إشارات الانبعاث عند 520 نانومتر ل GFP و 610 نانومتر ل LSSmApple (الشكل 5) وقم بإجراء تجارب تصوير مضان نسبي قياسي لتحديد الاستجابات الديناميكية للمستشعر الحيوي. قياس نسبة شدة الانبعاثات (GFP/LSSmApple) بمرور الوقت لمراقبة التغييرات التي يسببها التحليل

5. تحليل الصور باستخدام برنامج مفتوح المصدر (الشكل 6)

  1. احصل على CellProfiler أو أي برنامج آخر مماثل من المستودع الرسمي وقم بتثبيته على محطة عمل محلية.
  2. قم بتنظيم صور الفحص المجهري الفلوري بفاصل زمني بترتيب تسلسلي (على سبيل المثال ، img_001.tif ، img_002.tif ، إلخ) لضمان التوافق مع معالجة الدفعات الآلية.
  3. قم بتشغيل البرنامج وتهيئة مسار تحليل جديد عن طريق تحديد مشروع جديد. قم باستيراد تسلسل صورة اللقطات المتتابعة إلى مساحة عمل البنية الأساسية لبرنامج ربط العمليات التجارية.
  4. قم بدمج وحدة IdentifyPrimaryObjects لاكتشاف الخلايا الفردية داخل كل إطار بناء على إشارة التألق أو المعايير المورفولوجية.
  5. أضف الوحدة النمطية TrackObjects لإنشاء مراسلات زمنية بين الخلايا عبر الإطارات، مما يتيح تعقب الخلية الواحدة بمرور الوقت.
  6. قم بتضمين وحدة MeasureObjectIntensity لتحديد معلمات شدة التألق (على سبيل المثال ، المتوسط والمتوسط والكثافة المتكاملة) لكل خلية متتبعة.
  7. استخدم الوحدة النمطية ExportToSpreadsheet لتجميع البيانات الكمية وتصديرها إلى تنسيق جدولي (على سبيل المثال، CSV) لتحليل المصب.
  8. قم بتحليل البيانات المصدرة باستخدام أدوات إحصائية أو مرئية للبيانات مثل برامج جداول البيانات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتحقيق التصوير النسبي القياسي الناجح لأجهزة الاستشعار الحيوية في الأنظمة الميكروبية ، يجب معالجة العديد من التحديات التقنية.

نظام التعبير: يكمن التحدي الأول في اختيار نظام التعبير. سواء كانت قائمة على البلازميد ، أو متكاملة كروموسومية ، مدفوعة بمحفزات تأسيسية أو محفزة ، ومع أو بدون علامات استهداف تحت الخلوية. يمكن أن تؤثر هذه العوامل بشكل كبير على استقرار المستشعر الحيوي وسميته وتوطينه داخل الخلايا (الشكل 1). من الضروري ضمان مستويات التعبير المثلى لتجنب القطع الأث...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتيح المستشعرات الحيوية القائمة على الفلوروفور المشفرة وراثيا المراقبة في الوقت الفعلي لتركيزات التحليل داخل الخلايا في الخلاياالحية 1. تعمل هذه المستشعرات الحيوية عادة عن طريق تحويل التغييرات التوافقية إلى إشارات ضوئية ، والتي يمكن اكتشافها إما نسبيا أو مكثفا. تعتمد المستشعرات الحيوية المكثفة على تغيرات شدة التألق من FP واحد ، مما يجعلها حساسة للاختلافات في وفرة المستشعرات الحيوية ، مما يؤدي إلى تحيز محتمل في القياس. يمكن التخفيف من هذه المشكلة باستخدام أجهزة الا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا البحث من قبل كرسي الأستاذية المبتدئين من "الوكالة الوطنية للأبحاث (ANR) - PROJET N° ANR-24-CPJ1-0014-01to MS بدعم من منح من "Agencia Estatal de Investigación (AEI) ، Ministerio de Ciencia، Innovación y Universidades الإسبانية (TED2021-129691B-I00) ، بالإضافة إلى زمالة جامعة ملقة (B1-2022_03) الممنوحة ل V.C.R. يسعدنا أن نتوجه بخالص الشكر إلى مركز التصوير المتقدم (CAi) في جامعة هاينريش هاين ومركز ليون للتصوير متعدد النطاقات (LyMIC) من جامعة ليون على المناقشة المثمرة حول تصوير المستشعرات الحيوية و / أو الوصول إلى أنظمة الفحص المجهري.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أجارسيجما ألدريتشA5306-250G
CellASIC ONIX لوحة لخلايا الخميرة أحادية الصيغة الصبغية  ميرك KGaAY04C-02-5PK
CellASIC ONIX2Merck KGaACAX2-S0000
CSM-Uraثيرمو فيشر 11387899
D-جلوكوزسيجما ألدريتش كو.شركة G8270-100G
D-SorbitolSigma-AldrichS1876-10MG
كلوريد الصوديومسيجما ألدريتش المحدودةS9888-25G
pAG416 GPD GA-MatryoshCaMP6sNA7للتعبير عن GA-MatryoshCaMP6s في الخميرة
TCS SP8 STEDLeicaNA
سلالة الخميرة K601 / W303-1A MAT-aNA8ade2-1 ura3-1 his3-11 trp1- 1 leu2-3 leu2-112 can1-100
YNBBocaScientificGCM16.0500
&alpha - عامل التزاوج خلات الملحشركة سيجما ألدريتشT6901-.5 ملغ
شركة العلمي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frommer, W. B., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Genetically encoded biosensors based on engineered fluorescent proteins. Chem Soc Rev. 38, 2833-2841 (2009).
  2. Mehta, S., et al. Single-fluorophore biosensors for sensitive and multiplexed detection of signalling activities. Nat Cell Biol. 20, 1215-1225 (2018).
  3. Deuschle, K., et al. Rapid metabolism of glucose detected with FRET glucose nanosensors in epidermal cells and intact roots of Arabidopsis RNA-silencing mutants. Plant Cell. 18, 2314-2325 (2006).
  4. Kaper, T., Lager, I., Looger, L. L., Chermak, D., Frommer, W. B. Fluorescence resonance energy transfer sensors for quantitative monitoring of pentose and disaccharide accumulation in bacteria. Biotechnol Biofuels. 1, 1-10 (2008).
  5. Yoshinari, A., et al. Using genetically encoded fluorescent biosensors for quantitative in vivo imaging. Arabidopsis Protoc. , 303-322 (2021).
  6. Koldenkova, V. P., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1833, 1787-1797 (2013).
  7. Sadoine, M., et al. Designs, applications, and limitations of genetically encoded fluorescent sensors to explore plant biology. Plant Physiol. 187, 485-503 (2021).
  8. Frei, M. S., Mehta, S., Zhang, J. Next-generation genetically encoded fluorescent biosensors illuminate cell signaling and metabolism. Ann Rev Biophys. 53 (1), 275-297 (2024).
  9. Ast, C., et al. Ratiometric Matryoshka biosensors from a nested cassette of green-and orange-emitting fluorescent proteins. Nat Commun. 8, 431(2017).
  10. Stokes, G. G. On the change of refrangibility of light. , Philosoph Transact Royal Soc London. 463-562 (1852).
  11. Santos, E. M., et al. Design of Large Stokes Shift Fluorescent Proteins Based on Excited State Proton Transfer of an Engineered Photobase. J Am Chem Soc. 143, 15091-15102 (2021).
  12. Ejike, J. O., et al. A Monochromatically Excitable Green-Red Dual-Fluorophore Fusion Incorporating a New Large Stokes Shift Fluorescent Protein. Biochemistry. , (2023).
  13. Bermejo, C., Haerizadeh, F., Sadoine, M. S., Chermak, D., Frommer, W. B. Differential regulation of glucose transport activity in yeast by specific cAMP signatures. Biochem J. 452, 489-497 (2013).
  14. Bermejo, C., Haerizadeh, F., Takanaga, H., Chermak, D., Frommer, W. B. Dynamic analysis of cytosolic glucose and ATP levels in yeast using optical sensors. Biochem J. 432, 399-406 (2010).
  15. Nasu, Y., Shen, Y., Kramer, L., Campbell, R. E. Structure-and mechanism-guided design of single fluorescent protein-based biosensors. Nat Chem Biol. 17, 509-518 (2021).
  16. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc. 2, 31-34 (2007).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9, 676-682 (2012).
  18. Koldenkova, V. P., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: properties and evaluation. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1833, 1787-1797 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة