استخدام طريقة نقل القطرات لتحضير حويصلات أحادية الصفائح العملاقة بشكل موثوق

Dario Cecchi; Elisa Roberti; Eugenia De Remigis; Stefano Palagi

doi:10.3791/68340

مقالة منهجية

استخدام طريقة نقل القطرات لتحضير حويصلات أحادية الصفائح العملاقة بشكل موثوق

DOI:

10.3791/68340

⸱

سبتمبر 19, 2025

Dario Cecchi¹^,² , Elisa Roberti¹^,² , Eugenia De Remigis¹^,² , Stefano Palagi¹^,²

¹The Biorobotics Institute, Sant'Anna School of Advanced Studies - Pisa, ²Department of Excellence in Robotics & AI, Sant'Anna School of Advanced Studies

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم دليل المبتدئين هذا بروتوكولا عاما لإعداد الحويصلات أحادية الصفائح العملاقة (GUVs) عبر طريقة نقل القطرات ، ومناقشة الخطوات الحاسمة وتقديم رؤى للمساعدة في التعديلات المحتملة المطلوبة للتطبيقات المختلفة ، بما في ذلك البيولوجيا التركيبية والروبوتات الدقيقة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على مدى العقدين الماضيين ، أثبتت طريقة نقل القطرات ، والمعروفة أيضا باسم المستحلب المقلوب ، أو المستحلب المزدوج ، أو نقل الطور ، أو نقل المستحلب ، أنها مفيدة لتحضير الحويصلات العملاقة أحادية الصفائح (GUVs) وعلى وجه الخصوص ، لتحميلها بشحنات مختلفة ، وبالتالي تلعب دورا مهما في البيولوجيا التركيبية. نظرا لكفاءة التغليف وبساطة التنفيذ ، فقد تم استخدامه على نطاق واسع لتطوير الخلايا الاصطناعية. لوحظ تباين كبير في العديد من المعلمات في الأدبيات ، مما يؤدي إلى نتائج متغيرة للغاية. ويرجع ذلك جزئيا إلى التعديلات المطلوبة للاحتياجات والتطبيقات المختلفة لهذه الطريقة متعددة الاستخدامات ، ومع ذلك قد يكون مربكا للباحثين الذين يقتربون من هذه التقنية لأول مرة.

لتزويد المبتدئين بفهم أساسي للطريقة ودور المعلمات الحرجة ، يتم تقديم بروتوكول جنبا إلى جنب مع تلميحات حول المبادئ الفيزيائية والكيميائية الأساسية الكامنة وراء تكوين GUV من خلال نقل القطرات. وبالتالي ، يتضمن هذا الدليل المفصل خطوة بخطوة لإعداد GUVs اعتبارات واقتراحات عملية تستند إلى الأدبيات والخبرة المباشرة.

بالنظر إلى المصادر المحتملة للتباين ، يتم تحديد بعض الجوانب على أنها حاسمة: حساسية الدهون الفوسفورية للضوء والأكسدة والتحلل المائي. اختيار الزيت لإذابة الدهون الفوسفورية (محلول الدهون أو LS) ؛ واستعادة GUVs بعد الطرد المركزي. وتقترح تدابير فعالة من حيث التكلفة لتقليل تداخل الأكسجين والرطوبة في الغلاف الجوي. للمساعدة في تحديد التركيبات المناسبة من الزيت والفوسفوليبيدات ، يتم استكمال البروتوكول العام بمناقشة حول الخصائص الفيزيائية والكيميائية ذات الصلة ل LS. أخيرا ، لتجنب الإجراءات غير العملية ، يتم اقتراح طريقة مباشرة وآمنة لإزالة طور الزيت تماما مرة واحدة واستعادة تشتت GUV نظيف. تعمل هذه التدابير على تسريع تنفيذ التعديلات على تركيبات GUV الجديدة ، مما قد يوسع اعتمادها في البيولوجيا التركيبية والمجالات المجاورة ، بما في ذلك الروبوتات الدقيقة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنفيذ تقنية موصوفة سابقا لإنتاج الجسيمات الشحمية¹ ، أنشأ Pautot et al. بروتوكولا لإنتاج حويصلات دهنية بأقطار تتراوح قطرها من 0.1 إلى 1 ميكرومتر². أثبتت طريقة نقل القطرات فعاليتها بسرعة في إنتاج حويصلات أكبر حجما (أقطار تتجاوز 1 ميكرومتر)³ ، وتكتسب شعبية متزايدة لبساطة التنفيذ وكفاءة التغليف العالية. في الواقع ، بالمقارنة مع طرق التورم (مثل تورم الهلام أو التشكيل الكهربائي) ، يقلل هذا البروتوكول من حجم محلول الشحن المطلوب لتشكيل عدد مماثل من الحويصلات والنفايات المرتبطة بها⁴. يمكن تجميع GUVs من واجهات السوائل من خلال طرق بديلة بكفاءة تغليف مماثلة. ومع ذلك ، عند مقارنتها بتلك القائمة على رقائق الموائع الدقيقة⁵^،⁶ أو تغليف عبور واجهة القطرات المستمر (cDICE) ⁷ ، يوفر نقل القطرات أبسط إعداد ميسور التكلفة في أي مختبر مزود بمعدات أساسية. علاوة على ذلك ، قد تؤدي طرق الموائع الدقيقة إلى GUVs مع شوائب زيتية غير مرغوب فيها في الغشاء. لهذه الأسباب ، كان نقل القطرات هو الطريقة المفضلة لتحميل GUVs بشحنات قيمة في مجالات الخلايا الاصطناعية ³^،⁸^،⁹^،¹⁰ ، ومؤخرا ، الروبوتات الدقيقة ¹¹^،¹².

تعتمد الطريقة على تكوين منشورات الأغشية من خلال تثبيت واجهات الماء / الزيت بوساطة الدهون الفوسفورية. أولا ، يتم إذابة الدهون الفوسفورية في زيت (محلول دهني ، LS) ، ثم يتم تحضير مستحلب الماء في الزيت مع المحلول المائي الذي يحتوي على شحنة GUV المطلوبة (المحلول الداخلي ، IS) في LS الزيتية. ثم يتم نقل المستحلب إلى أنبوب حيث تم موازنة محلول مائي آخر (يسمى محلول خارجي ، OS) مسبقا مع LS لتشكيل واجهة ماء وزيت. تتشكل GUVs عندما تضطر قطرات الماء إلى عبور واجهة OS / LS هذه عن طريق الطرد المركزي: تتشكل النشرة الداخلية ل GUVs على سطح قطرات IS ، بينما تتشكل النشرة الخارجية بين OS و LS (الشكل 1).

تم وصف العديد من متغيرات البروتوكول مع تعديل المعلمات وفقا للاحتياجات التجريبية الطارئة. تم وصف أول محاولة واسعة لتحسين العملية من قبل Moga et ^al.13 ، بينما جمع Zhang et al. معظم الأمثلة ذات الصلة في مراجعة حديثة¹⁴. على الرغم من العديد من المعلمات الموصوفة التي تؤثر على البروتوكول، لا يوجد ما يشير إلى كيفية إجراء عملية تحسين لتركيبة GUV جديدة، ولا أفضل الممارسات لاستعادة GUV ومعالجته بعد الإنتاج. بناء على الأدبيات العلمية المتاحة وخبرتنا المباشرة ، نقدم هنا بروتوكولا عاما لإنتاج GUVs أثناء مناقشة المبادئ الأساسية. من خلال القيام بذلك، نقدم مؤشرات مفيدة لتحسين تركيبات GUV الجديدة واثنين من الاحتياطات التي تنطبق دائما على البروتوكول: تحضير LS في بيئة خاضعة للرقابة وطريقة لإزالة مرحلة الزيت العلوية بسهولة لاستعادة عينة GUV نظيفة. اخترنا مثالين: أحدهما يحتوي على 240 ملي مولار من السكروز مثل IS و 0.2 ملي مولار DOPC في زيت السيليكون AR20 ك LS (الحالة E [فارغة] ، انظر الجدول 1) والآخر يتكون من 0.2٪ 1.1 ميكرومتر من الجسيمات الدقيقة من البوليسترين في 240 ملي مولار من السكروز مثل IS و 3.18 ملي مولار DOPC في الزيت المعدني مثل LS (الحالة P [مع الجسيمات] ، انظر الجدول 1). تم إنتاج كلتا العينتين باستخدام 240 ملي مولار جلوكوز كنظام تشغيل. اخترنا هذه الأسمولية للحصول على GUVs التي تحتوي ، في الظروف الفسيولوجية ، على غشاء دهني مريح (توتر غشاء منخفض).

figure-introduction-1
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لطريقة نقل القطرات. (أ) يتم تحضير ثلاثة محاليل في قوارير منفصلة: الدهون الفوسفورية في الزيت (الطور الأصفر) لتشكيل محلول دهني ، ومحلول يحتوي على السكروز (باللون السماوي) كمحلول داخلي ، ومحلول جلوكوز مكافئ (أبيض) كمحلول خارجي. (ب) ثم يتم خلط LS مع IS لتشكيل مستحلب مستقر ، ثم (C) يسمح للواجهة بين OS و LS بالموازنة قبل (D) يتم سكب المستحلب فوقه. (ه) تضطر قطرات الماء إلى عبور السطح البيني LS / OS بقوة الطرد المركزي من أجل (F) السماح بتكوين GUVs. الرقم ليس مقيما ويهدف إلى توفير مخطط للطريقة فقط. الاختصارات: LS = محلول دهني; IS = الحل الداخلي ؛ نظام التشغيل = الحل الخارجي ؛ GUV = حويصلة عملاقة أحادية الصفائح. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: ما لم ينص على خلاف ذلك ، يتم تنفيذ العمليات في درجة حرارة الغرفة.

1. تحضير الحلول

تحضير المحاليل المائية (IS و OS)
1. في قاربين مختلفين للوزن ، تزن 2.16 جم من الجلوكوز وكمية السكروز المحددة في الجدول 1. أضيفي المساحيق إلى كوبين سعة 150 مل ، أضيفي 40 مل من الماء عالي النقاء واخلطيهم بالتحريك.
2. انقل المحاليل إلى أسطوانتين سعة 50 مل وأضف ماء فائق النقاء حتى 50 مل للحصول على محاليل جلوكوز 240 ملي مولار ومحاليل السكروز بتركيزات موضحة في الجدول 1. قم بتغطية الأسطوانات بقطعة من البارافيلم واخلط المحاليل عن طريق قلب الأسطوانات عدة مرات.
3. قم بتصفية المحاليل بمحاقن سعة 50 مل ومرشحات 0.22 ميكرومتر لمنع التلوث من الكائنات الحية الدقيقة.
4. بالنسبة للحالة P ، قم بإعداد الخليط التالي: 2 ميكرولتر من 100 مجم / مل 1.1 ميكرومتر تشتت جزيئات البوليسترين ، 24 ميكرولتر من محلول السكروز المحضر في الخطوة 1.1.1 ، وماء فائق النقاء حتى 100 ميكرولتر (التعليق النهائي: 0.2٪ جسيمات دقيقة في محلول سكروز 240 ملليمتر). قم بتخزين المحاليل في درجة حرارة +4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد أو قم بإعداد 1 مل من الحصص في أنابيب سعة 1.5 مل وتخزينها عند -20 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.
إعداد غرفة قفازات لإعداد LS في بيئة خاضعة للرقابة
1. قطع خمس قطع من أنابيب السيليكون بقطر داخلي 7 مم ، وقطر خارجي 13 مم ، والأطوال الموضحة في الجدول 2 (الأنابيب من 1 إلى 5).
2. قطع أربع قطع من أنابيب السيليكون بقطر داخلي 3 مم ، وقطر خارجي 7 مم ، والأطوال الموضحة في الجدول 2 (الأنابيب من 6 إلى 9).
3. قم بتوصيل أحد طرفي الأنبوب 1 بصمام ثنائي الاتجاه والطرف الآخر بتقاطع ثلاثي الاتجاهات (الشكل 2 أ).
4. قم بتوصيل الأنبوب 2 بالأطراف الأخرى للصمام ثنائي الاتجاه ، ثم قم بتوصيل الأنبوب 3 والأنبوب 4 بالتقاطع ثلاثي الاتجاهات ، مع توصيل الأنبوب 3 بالطرف مقابل الأنبوب 1 (الشكل 2 أ).
5. قم بتوصيل الطرف الحر للأنبوب 4 بمدخل غرفة القفازات (أنبوب المدخل ، الشكل 2 ب).
6. قم بتوصيل الصمام ثلاثي الاتجاهات المرفق مع غرفة القفازات بالمخرج ، ثم قم بتوصيل الصمام بالأنبوب 5 (أنبوب المخرج ، الشكل 2 ج).
7. قم بتوصيل أحد طرفي الأنبوب 6 بإبرة 18 جيجا والطرف الآخر بتقاطع ثنائي الاتجاه. كرر هذا مع الأنبوب 7 وإبرة 21 G (الشكل 2D).
8. أدخل الإبرتين في غطاء قارورة مع الحاجز: سيسمح هذا الغطاء الحامل للإبر بالتدفق المتحكم فيه للنيتروجين وتدفق النيتروجين والكلوروفورم. قم بتخزين الغطاء في أنبوب فارغ بدون غطاء سعة 50 مل لتجنب ملامسة الإبر (الشكل 2D).
9. اضغط على الأنابيب 8 و 9 وأدخلها ، على التوالي ، في فتحات المدخل والمخرج من الجانب الداخلي لغرفة القفازات (الشكل 2E).
تحضير LS
1. حرك حجرة القفازات داخل أو بجانب غطاء كيميائي. افتح حجرة القفازات وأدخل جهاز بلورة مملوء بجزيئات السيليكا في الجزء السفلي من الغرفة (الشكل 2F). قم بتغطية جهاز التبلور بسطح الدعم الأبيض وقم بتغطيته بمناشف ورقية.
2. أدخل جميع المواد الضرورية في حجرة القفازات (الشكل 2G): مقياس الرطوبة ، 1،2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) في محلول الكلوروفورم ، الزيت (الزيت) (الجدول 1) ، قوارير زجاجية داكنة نظيفة سعة 20 مل (مفتوحة مع الأغطية المعنية) ، حقنة هاميلتون (الجدول 1) ، ماصة دقيقة P10000 ونصائح. ضع القارورة الزجاجية التي تحتوي على محلول الكلوروفورم على حامل حلقة من الفلين أو دورق سعة 150 مل أو أي حامل آخر مناسب في أقرب وقت ممكن من جانب المشغل.
  ملاحظة: سيمنع هذا الاحتياط إمالة الزجاجات الناجمة عن تضخم وانكماش القفازات على مدار دورات تدفق الفراغ والنيتروجين.
3. أغلق حجرة القفازات ، وتأكد من أن النصفين لا يمكن أن ينزلقوا ، وأغلقهما بمسامير بلاستيكية مزودة بغرفة القفازات.
4. أغلق صمام المخرج واغمس الأنبوب 5 في دورق سعة 500 مل نصف مملوء بالماء (الشكل 2H).
5. قم بتوصيل الطرف المنظم بالصمام لأنبوب المدخل (الأنبوب 2) بخط التفريغ والطرف الآخر بالنيتروجين (الأنبوب 3 ، الشكل 2 أ). تم الآن ضبط حجرة القفازات بالكامل كما هو موضح في الشكل 2J.
6. افتح الصمام وخط التفريغ حتى يؤدي خفض الضغط إلى تضخيم القفازات لدرجة أنها صلبة جدا بحيث لا يمكن ثنيها. أغلق خط التفريغ والصمام.
7. افتح النيتروجين حتى يفرغ الضغط القفازات لدرجة أنها تخرج من غرفة القفازات. أغلق خط النيتروجين.
8. كرر الخطوات من 1.3.6 إلى 1.3.7 10x على الأقل ، مع التأكد من انخفاض الرطوبة الداخلية إلى أقل من 40٪.
9. تحكم في الضغط الداخلي بالفراغ والنيتروجين لتسهيل ارتداء المشغل للقفازات.
10. باستخدام حقنة هاميلتون ، قم بنقل حجم DOPC في محلول الكلوروفورم الموضح في الجدول 1 إلى قارورة زجاجية داكنة. أغلق القارورة بغطاء حامل الإبر المحضر في الخطوة 1.2.9.
11. قم بتوصيل الأنبوب 6 بالأنبوب 8 والأنبوب 7 بالأنبوب 9 عبر التقاطعات ثنائية الاتجاه (الشكل 2I).
12. قم بإزالة القفازات وافتح صمام المخرج.
  ملاحظة: يمكن أن يساعد عامل تشغيل ثان من الخطوات 1.3.13 إلى 1.3.15 لتسريع العملية.
13. افتح تدفق النيتروجين ببطء شديد وتحقق من تدفق الغاز من خلال مراقبة الفقاعات في الدورق حيث تم وضع الأنبوب 5 مسبقا (الخطوة 1.3.4). اضبط تدفق النيتروجين تدريجيا حتى يصل إلى معدل مرتفع نسبيا تظل فيه الفقاعات الفردية قابلة للملاحظة. دع النيتروجين يتدفق لمدة 3 دقائق ، ثم أغلق خط النيتروجين.
  ملاحظة: يمكن أن يتسبب ضغط النيتروجين المفرط في تشتت محلول DOPC في الكلوروفورم في جميع أنحاء القارورة ، مما يقلل من كمية الدهون الفوسفورية المتاحة لمحلول الدهون اللاحق (LS). بالإضافة إلى ذلك ، يزيد الضغط العالي من خطر طرد الإبر من القارورة. لذلك ، من الضروري ضبط تدفق النيتروجين بعناية إلى المستوى الأمثل الذي يحرك الكلوروفورم برفق دون التسبب في تناثر غير منضبط.
14. في غضون ذلك ، قم بإعداد حمام مائي في جهاز بلورة وقم بتسخينه على حرارة 80 درجة مئوية على طبق ساخن.
15. انتظر حتى تخرج الفقاعة الأخيرة في الدورق ، ثم أغلق صمام المخرج. ارتد القفازات مرة أخرى وافصل الأنابيب 8 و 9 عن التقاطعات ذات الاتجاهين.
16. تأكد من تبخر كل الكلوروفورم من القارورة الداكنة ، ثم افتحه وحرك الغطاء مرة أخرى إلى أنبوب 50 مل. افتح زجاجة الزيت ، وانقل الحجم المطلوب من الزيت (الجدول 1) إلى القارورة الداكنة ، وأغلقها بالغطاء. انزع القفازات وافتح حجرة القفازات.
17. ختم LS مع parafilm. دوامة القارورة بقوة لمدة 30 ثانية على الأقل. احتضن عند 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في حمام مائي معد في الخطوة 1.3.14. دوامة القارورة بقوة لمدة 30 ثانية على الأقل. احتضان في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.
18. استمر في تحضير GUVs أو قم بتخزينها في درجة حرارة +4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
  ملاحظة: في مستحضرات GUV غير المتماثلة ، يمكن استخدام اثنين من LS مختلفين للواجهة والمستحلب للحصول على نشرتين غشائيتين مختلفتين¹⁵.

2. إنتاج GUV

إعداد حاوية لسهولة إزالة الزيت
1. باستخدام مقص ، قم بقطع الغطاء عن أنبوب سعة 5 مل. قم بحفر ثقب ~ 8 مم في وسط الغطاء وتأكد من أن الثقب واسع بما يكفي للسماح لطرف P1000 بالملاءمة والقفل (الشكل 3 أ). إذا كانت الثقب ضيقة جدا ، كرر الخطوتين السابقتين ؛ إذا كان واسعا جدا، فتخلص من الغطاء وأعد تشغيله بغطاء جديد من الخطوة 2.1.1.
2. قطع قطعة 2 × 5 سم من ورق الصنفرة ورمل الحفرة. ضع الغطاء المثقوب مرة أخرى فوق الأنبوب سعة 5 مل وجهاز الطرد المركزي عند 3,000 × جم لمدة 5 دقائق لإزالة جميع الحطام البلاستيكي المتبقي من الحفرة. قم بإزالة الغطاء وتخلص من الأنبوب.
3. اقطع الغطاء عن أنبوب جديد سعة 5 مل واستبدله بالغطاء المثقوب. ضع حلقة O أعلى الغطاء وأدخل طرفا P1000 من خلال الفتحة. قم بقفل الحلقة O بين الطرف والغطاء وتحقق من عدم إمكانية دفع الطرف لأسفل الأنبوب (الشكل 3 ب). املأ الأنبوب سعة 5 مل بسعة 5.5 مل من نظام التشغيل من خلال الطرف.
تشكيل واجهة OS/LS
1. قم بإعداد حمام مائي في جهاز بلورة وقم بتسخينه على حرارة 50 درجة مئوية على طبق ساخن.
2. دوامة قارورة LS المعدة في القسم 1.3 ، بقوة لمدة 30 ثانية على الأقل. سخني LS على حرارة 50 درجة مئوية في الحمام المائي لمدة 30 دقيقة.
3. قم بموازنة محاليل الماء المحضرة في القسم 1.1 في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق على الأقل.
4. ماصة 300 ميكرولتر من نظام التشغيل في أنبوب 1.5 مل أو أنبوب 5 مل تم تعديله وفقا للخطوة 2.1. قم بسحب الماصة ببطء 100 ميكرولتر من LS فوق نظام التشغيل ، مع التأكد من تكوين مرحلتين متميزتين ومستمرتين في الأنبوب. دع الواجهة متوازنة لمدة 10 دقائق.
  ملاحظة: للسماح بتكوين طبقة أحادية متجانسة من الدهون الفوسفورية ، يجب توزيع LS بشكل متجانس أعلى نظام التشغيل (الشكل 4 أ). إذا لم تكن طبقة LS مستمرة ، فأعد توزيع حجم LS باستخدام ماصة دقيقة أو قم بزيادة حجم LS (يمكن أن يكون هذا مفيدا جدا مع الزيوت عالية اللزوجة مثل البارافين).
تشكيل مستحلب الماء في الزيت
1. في أنبوب سعة 2 مل ، ماصة ، بهذا الترتيب ، 250 ميكرولتر من LS و 6.25 ميكرولتر من IS للحصول على مستحلب ماء في زيت بنسبة 2.5٪.
  ملاحظة: من واقع خبرتنا ، توفر نسبة الماء في الزيت هذه على الأرجح مستحلبا مستقرا ، وبالتالي زيادة معدل نجاح البروتوكول (الشكل 5). لزيادة إنتاجية GUV ، نوصي بزيادة حجم المستحلب بدلا من نسبة IS / LS.
2. امزج المرحلتين باستخدام واحدة أو أكثر من الطرق التالية حتى يبدو الخليط متجانسا ومستقرا: دوامة ، أو تحريض ميكانيكي فوق رف أنبوب دقيق قياسي ، أو النقر على الأنبوب بإصبع (تحقق من الشكل 5 للحصول على أمثلة على مستحلب متجانس).
3. نقل 200 ميكرولتر من المستحلب أعلى واجهة OS / LS المعدة في القسم 2.2.
4. في حالة استخدام أنبوب 1.5 مل ، ما عليك سوى إغلاق الأنبوب ؛ في حالة استخدام أنبوب 5 مل المعدل من القسم 2.1 ، ضع غطاءا مطاطيا أعلى الطرف وانقل الأنبوب بعناية إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
نقل القطرات عن طريق الطرد المركزي
1. جهاز طرد مركزي للأنابيب في درجة حرارة الغرفة باتباع مؤشرات الجدول 1. في نهاية الطرد المركزي ، تحقق من وجود حبيبات غير شفافة في الجزء السفلي من الأنبوب ومرحلة زيت صافية في الجزء العلوي.

3. استعادة GUV

إزالة الزيت
ملاحظة: وفقا للاحتياجات التجريبية ، يمكن إزالة الزيت في ثلاث خطوات بديلة مختلفة.
1. إذا تم تحضير GUVs في أنابيب قياسية سعة 1.5 مل ، فقم بإزالة الزيت ببطء بمساعدة ماصة P1000 و P200 للقطرات الأخيرة ، مع التأكد من عدم إزعاج الحبيبات.
  ملاحظة: تساعد الأطراف الضيقة في إزالة الزيت ، لذا فإن إدخال طرف لأحجام أصغر (10-200 ميكرولتر) في طرف P1000 سيحسن دقة هذه الخطوة.
2. إذا كنت تتعامل مع مستحضرات متعددة GUV في أنابيب مختلفة سعة 1.5 مل ، فقم بإزالة الزيت بمساعدة قارورة Büchner. قم بتوصيل قطعة واحدة من أنبوب سيليكون سميك (قطر داخلي 7 مم ، خارجي 13 مم) بخط التفريغ وأدخل أنبوبا آخر على فتحة القارورة ، وأغلقه بحشية مطاطية. في الطرف الآخر من هذا الأنبوب ، أدخل طرفا P1000 ، ولفه بparafilm ، وقم بقص حوالي 3 مم من الحافة ، وأدخله في طرف P200. افتح المكنسة الكهربائية واسحب الزيت بطرف P200 ، ثم أغلق المكنسة الكهربائية وقم بإزالة القطرات الأخيرة من خلال ماصة P200.
3. إذا تم تحضير GUVs في الحاوية المفصلة في الخطوة 2.1 ، فقم بإزالة الطرف من الأنبوب ، مع التأكد من عدم انفصال الغطاء المطاطي (الشكل 3D). بعد ذلك ، تخلص من الطرف واحتفظ بالغطاء المطاطي والحلقة O والغطاء المثقوب لإعادة استخدامه.
4. بمساعدة الماصة الدقيقة P1000 ، قم بإزالة نظام التشغيل من الأنبوب (الشكل 3E) ، مع ترك حوالي 50 ميكرولتر من الحجم ، مع التأكد من عدم إزعاج الحبيبات.
5. قم بتغيير الحافة ، وأعد تعليق الحبيبات في الحجم المتبقي ، وانقلها إلى أنبوب نظيف سعة 2 مل.
يغسل GUV
ملاحظة: الغرض من هذه الخطوات هو إزالة آثار طور الزيت التي لم تتم إزالتها في الخطوة 3.1. إذا لزم الأمر ، يجب تكرار الخطوتين 3.2.1 و 3.2.2 حتى لا يلاحظ أي قطرة زيت في الأنبوب.
1. املأ الأنبوب ب 2 مل من نظام التشغيل وجهاز طرد مركزي عند 1,500 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
2. قم بإزالة نظام التشغيل ، وترك حوالي 50 ميكرولتر من الحجم ، وتأكد من عدم إزعاج الحبيبات.
3. كرر الخطوتين الأخيرتين.
توازن الحجم
ملاحظة: نقوم بتضمين هذا القسم للسماح بمقارنة الغلة بين مستحضرات GUV المختلفة.
1. باستخدام الماصة الدقيقة P200 ، أعد تعليق الحبيبات في 50 ميكرولتر من الحجم المتبقي من التكرار الأخير للخطوة 3.2.2.
2. قم بقياس هذا الحجم عن طريق ضبط الماصة على 20 وزيادة الحجم مع غمس الطرف في تشتت GUV دون لمس جدار الأنبوب للسماح للسائل بالتدفق داخل الطرف.
3. أضف نظام التشغيل للوصول إلى الحجم النهائي البالغ 100 ميكرولتر.

4. الملاحظة وتحليل الأبعاد

الحصول على الصور المجهرية
1. امزج تشتت GUV برفق عن طريق النقر على الأنبوب بإصبعك.
2. قم بتحميل حجرة Burker ب 10 ميكرولتر من عينة GUV وانتظر 5 دقائق على الأقل للسماح للمواد GUV بالترسيب في الجزء السفلي من الغرفة.
3. راقب العينة تحت مجهر تباين الطور. باستخدام خطوط Burker كمراجع ، انتقل عبر العينة واحصل على 20 صورة على الأقل ، مع التأكد من أن مناطق المراقبة غير متداخلة.
تحليل الأبعاد
1. قم بتحميل الصور على ImageJ.
2. لحساب معامل تحويل البكسل / ميكرومتر ، اختر صورة واحدة تعرض مربعا 50 × 50 ميكرومتر من غرفة Burker (راجع ورقة بيانات الشركة المصنعة للحصول على التعريف الصحيح) ، ثم حدد أداة تحديد الخط المستقيم ، وارسم خطا بين زاويتين متتاليتين من المربع وقم بقياس الخط بالنقر فوق تحليل | قياس. كرر 3x واحسب متوسط القيمة.
3. قم بتعيين عامل التحويل بالنقر فوق تحليل | تعيين المقياس. أدخل القيمة من الخطوة 4.2.2 في المربع المسافة بالبكسل، ثم أدخل القيمة 50 في المسافة المعروفة وميكرومتر في وحدة الطول.
4. انقر فوق تحليل | قم بتعيين القياسات وحدد المربع المساحة . حدد أداة التحديد البيضاوي ، ثم انقر فوق زر الماوس الأيسر واضغط مع الاستمرار على مفتاح shift لتداخل الدائرة الناتجة حول GUV. قم بقياس القطر بالنقر فوق تحليل | قياس. كرر هذا لكل GUV في كل صورة.
5. في نافذة النتائج، انقر فوق ملف | حفظ باسم... لتصدير ملف csv لمنطقة GUV ، ثم تحليل توزيع الحجم باستخدام البرنامج النصي المتاح على GitHub¹⁶.
  ملاحظة: من الممكن تخطي الخطوة 4.2.3 وتشغيل البرنامج النصي الذي يحدد معامل تحويل البكسل/ميكرومتر. لحساب هذه القيمة، اقسم القيمة التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.2.2 على 50.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتميز المستحضر الأمثل ل GUV بتكوين مرحلة زيتية صافية وحبيبات مميزة (الشكل 4 أ). في الحالات التي تفشل فيها قطرات الماء في التحول إلى GUVs ، فإنها تنهار عادة وتترك حطام الفوسفوليبيد عند واجهة OS / LS (الشكل 4 ج). من المرجح أن يكون هذا التأثير ناتجا عن تراكم الدهون الفوسفورية والجزيئات الأخرى من طور الزيت ، الناتج عن عدم كفاية توازن الدهون الفوسفورية في واجهة الماء / الزيت. ومع ذلك ، على الرغم من عدم وجود حبيبات مرئية أو وجود حطام في الواجهة ، قد تستمر GUVs في التشكل ، مما يسمح باستمرار العملية. في حين أن خطوات الغسيل ليست فعالة تماما في إزالة جميع بقايا الدهون الفوسفورية ، إلا أنها تساعد بشكل كبير في التخلص من قطرات الزيت ، وتحسين جودة العينة الإجمالية (قارن الشكل 6 أ والشكل 6 ب).

غالبا ما يؤدي استخدام LS أو LS القديم المحضر في ظروف الرطوبة العالية إلى تقليل تشتت GUV مع انخفاض الإنتاجية ومحتوى أعلى من الركام المضطرب الذي يتكون على الأرجح من الدهون الفوسفورية والجزيئات الأخرى من مرحلة الزيت (الشكل 6 ج). بالنسبة ل LS المحضر في ظروف الرطوبة العالية ، لاحظنا معاملات التباين أعلى من 0.8 في إنتاج GUV (مع عينات تحتوي على عدد قليل جدا من GUVs) ، بينما بالنسبة ل LS المحضر في غرفة القفازات المعدلة ، كان معامل التباين أقل من 0.5.

قد تؤثر ظروف الطرد المركزي المختلفة على إنتاجية وجودة الغاز الطبيعي للغاز المرتب. من التحليل النوعي ، تم تحديد 20 دقيقة عند 3,300 3,300 × جم كحالة جيدة ل GUVs المحملة بالسكروز (العينة E). أدى خفض السرعة (45 دقيقة عند 500 × جم) إلى انخفاض المحصول ، بينما أدت الزيادة (5 دقائق عند 16,600 × جم) إلى زيادة تكوين مجاميع الدهون الفوسفورية المضطربة. قد تمنع قوة الطرد المركزي الضعيفة العديد من القطرات من عبور واجهة OS / LS ، وبالتالي انخفاض العائد ، في حين أن القوة القوية قد لا توفر وقتا كافيا لتنظيم الدهون الفوسفورية على النشرة الخارجية أثناء عبور الواجهة (الشكل 7). يمكن أيضا تحسين تغليف الجسيمات الدقيقة من خلال التعديلات على معلمات الطرد المركزي ، بشرط أن تتطابق كثافة كتلة الجسيمات الدقيقة تقريبا مع كثافة IS. لهذا الغرض ، يسمح خفض تسارع الطرد المركزي (وبالتالي زيادة وقت الطرد المركزي) بتغليف أكثر تجانسا للجسيمات ، عن طريق تجنب كسر الغشاء الفوسفوليبيدي بسبب القوة التي تمارسها الجسيمات الصلبة (يظهر مثال على التغليف الجيد في الشكل 6 د بينما لا يزال التحقيق في معلمات الطرد المركزي المثلى مستمرا¹⁷).

نظرا لأن انتشار الدهون الفوسفورية يمكن أن يتأثر بمرحلة الزيت ، يمكن إجراء اختبار نوعي بسيط لتقييم استقرار المستحلب (الشكل 5). بمساعدة صبغة تلوين (Brilliant Blue FCF) مذابة في IS لتحسين التصور ، يمكن تحضير المستحلبات بنسب مختلفة من الماء / الزيت ومراقبتها بمرور الوقت. يمكن تصور فقدان الاستقرار من خلال تجميع قطرات الماء وما يترتب على ذلك من انفصال عن مرحلة الزيت. نظرا لأن القطرات الكبيرة (المرئية بالعين المجردة) أقل عرضة للتحويل إلى GUVs ، فإننا نوصي باستخدام حالة المستحلب التي توفر أقل فصل للطور.

يمكن التحقق من تأثير الاختلافات في البروتوكول من خلال تحليل توزيع الحجم كما هو موضح في قسم البروتوكول 4: يمكن قياس أقطار GUVs باستخدام ImageJ من صور مجهر تباين الطور ، ويمكن تحليل توزيع الحجم باستخدام برنامج نصي متاح على GitHub¹⁶. باتباع هذا البروتوكول ، كان من الممكن ، على سبيل المثال ، ملاحظة زيادة في GUVs بأقطار أكبر عند اختيار الزيت المعدني على زيت السيليكون AR20 (الشكل 8).

figure-results-1
الشكل 2: إعداد غرفة القفازات. يوضح هذا الشكل التعديلات الرئيسية على غرفة القفازات لإعداد محلول الدهون. (أ) اتصال المدخل بالنيتروجين والفراغ ؛ (ب) اتصال المدخل بغرفة القفازات ؛ (ج) صمام المخرج؛ (د) غطاء حامل للإبر لتبخر المذيبات ؛ (ه) أنابيب رقيقة لتبخر المذيبات ؛ (و) جزيئات السيليكا لامتصاص الرطوبة ؛ (ز) العناصر التي توضع في حجرة القفازات: مقياس الرطوبة الحراري الرقمي (1)، محلول الدهون في المذيب العضوي (2)، حامل حلقة الفلين (3)، حقنة زجاجية (4)، غطاء مفتوح مع الحاجز والإبر (5)، محلول الزيت (6)، قارورة داكنة مفتوحة مع غطاء (7)، أطراف 10 مل (8)، ماصة P10000 (9)؛ (ح) طرف أنبوب المخرج المغموس في الماء ؛ (I) قارورة مغلقة بغطاء حامل للإبر متصل بالمدخل والمخرج ؛ (ي) مخططات غرفة القفازات المعدلة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 3: حاوية لإزالة الزيت بسهولة. الخطوات الرئيسية في تحضير GUVs في حاوية لسهولة إزالة الزيت وفقا لقسم البروتوكول 2.1. (أ) يتم حفر ثقب في غطاء أنبوب سعة 5 مل للسماح بملاءمة طرف P1000؛ ثم (ب) يتم وضع الغطاء على أنبوب فارغ سعة 5 مل مع إدخال الطرف في الفتحة من خلال حلقة O. (ج) توضع المحاليل في الأنبوب وفقا لقسمي البروتوكول 2.2 و 2.3 ، ويتم تغطية الطرف ، ويتم وضع الأنبوب داخل أنبوب سعة 50 مل. تم تحميل GUVs المحضرة من 0.2 ملي مولار DOPC في زيت السيليكون ب 230.7 ملي مولار من السكروز و 3.1 ملي مولار من Brilliant Blue FCF لتعزيز التصور. (د) بعد الطرد المركزي ، يتم احتجاز مرحلة الزيت العلوية داخل الحافة مع جزء من المخزن المؤقت GUV (الذي يظهر سماوي بسبب فشل جزء من القطرات في التحول إلى GUVs وإطلاق الصبغة في نظام التشغيل). بفضل الغطاء المطاطي ، يمكن إزالة الطرف بسهولة من الأنبوب سعة 5 مل مع المحتوى السائل ، مما يسمح بإزالة سريعة وسهلة لمرحلة الزيت بأكملها. (ه) يمكن جمع حبيبات GUV بسهولة من قاع الأنبوب في تشتت واضح ، مع عدم وجود تلوث واضح بالزيت ، كما تم التحقق منه (F) بواسطة الفحص المجهري لتباين الطور. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الاختصارات: LS = محلول دهني; IS = الحل الداخلي ؛ نظام التشغيل = الحل الخارجي ؛ GUV = حويصلة أحادية الصفائح العملاقة. DOPC = 1،2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 4: تشكيل GUV. أمثلة على (أ) واجهة OS / LS ، (ب) حبيبات GUV نظيفة مع طور زيت واضح ، و (ج) حبيبات GUV مع حطام في واجهة OS / LS (يبدو الحطام والحبيبات ضارب إلى الحمرة لأن IS من هذه المجموعة GUV تم استكمالها ب 1.65 ملي مولار صبغة كوكسين جديدة لتعزيز التصور). الاختصارات: LS = محلول دهني; IS = الحل الداخلي ؛ نظام التشغيل = الحل الخارجي ؛ GUV = حويصلة عملاقة أحادية الصفائح. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 5: استقرار المستحلب بنسب مختلفة من الزيت والماء إلى الزيت. يوضح الشكل ثبات المستحلبات بمرور الوقت ، اعتمادا على نوع الزيت ونسبة الماء / الزيت (w/o) المستخدمة. يتكون IS من 230.7 ملي مولار سكروز و 3.1 ملي مولار من Brilliant Blue FCF لتعزيز تصور المستحلبات. المستحلبات المحضرة بالزيت المعدني أقل استقرارا من نظيراتها المصنوعة من زيت السيليكون AR20. يتم تضخيم هذا التأثير بشكل أكبر مع زيادة نسب w/o. على الرغم من أن المستحلبات في زيت السيليكون AR20 أكثر استقرارا بشكل ملحوظ ، إلا أن ثباتها يتناقص أيضا مع زيادة نسبة w/o ، مع ظهور فصل الطور مباشرة بعد الاستحلاب (زيت السيليكون AR20 بنسبة 10٪). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 6: مراقبة GUVs باستخدام مجهر تباين الطور. تكبير 20x من GUVs المحملة بالسكروز المحضرة من LS يتكون من 3.18 ملي مولار DOPC في الزيت المعدني. (أ) عينة تم استردادها بعد إزالة الزيت؛ (ب) عينة تم استردادها بعد خطوات الغسيل؛ (ج) ضعف إنتاجية المياه المحمولة من المياه المحمولة المحضرة في بيئات ذات أكسجين ورطوبة غير منظمة؛ (د) المركبات العضوية المحمولة بالجسيمات الدقيقة. شريط المقياس = 10 ميكرومتر ؛ قطرات الزيت محاطة بدائرة ، ويشار إلى أمثلة على المجاميع المضطربة من الدهون الفوسفورية وجزيئات الزيت بسهم. الاختصارات: LS = محلول دهني; GUVs = حويصلات أحادية الصفائح العملاقة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 7: تأثير ظروف الطرد المركزي المختلفة على تكوين GUV. صور تباين الطور لGUVs المحملة بالسكروز المحضرة باستخدام LS المكونة من 0.2 ملي مولار DOPC في زيت السيليكون AR20. ويبين الشكل مقارنة نوعية بين الترددات الأزرعة في (أ) 600 16 × غرام لمدة 5 دقائق، و (ب) 300 3 × جم لمدة 20 دقيقة، و (ج) 500 × غرام لمدة 45 دقيقة. في حين أن سرعة الطرد المركزي العالية تؤدي إلى وجود أعلى لركام الدهون الفوسفورية ، فإن سرعة الطرد المركزي المنخفضة تؤدي إلى انخفاض المحصول. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الاختصارات: LS = محلول دهني; GUV = حويصلة أحادية الصفائح العملاقة. DOPC = 1،2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7
الشكل 8: تحليل توزيع الحجم. مقارنة بين عينتين من GUV المحملة بالسكروز تم الحصول عليها من (A) 0.2 mM DOPC في الزيت المعدني و (B) 0.2 mM DOPC في زيت السيليكون AR20 (* تم تخفيف العينة 10x للسماح بتمييز واضح بين GUVs تحت مجهر تباين الطور). أظهر التحليل الذي تم إجراؤه بعد القسم 4 من البروتوكول أن توزيع الحجم تحول نحو أقطار أعلى لعينة الزيوت المعدنية فيما يتعلق بعينات زيت السيليكون AR20. ومع ذلك ، فإن عائد عينة السيليكون أعلى بمقدار 20 مرة تقريبا. الاختصارات: GUV = حويصلة أحادية الصفائح العملاقة. DOPC = 1،2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

درج	الشرط ه	الشرط P	وصف
1.1.1	4.11 جرام	17.11 جرام	كتلة السكروز
1.1.1	2.16 جرام	2.16 جرام	كتلة الجلوكوز
1.1.2	240 ملي متر	1000 ملي	تركيز السكروز
1.1.2	240 ملي متر	240 ملي متر	تركيز الجلوكوز
1.3.2	زيت السيليكون	الزيوت المعدنية	مرحلة الزيت ل LS
1.3.2	حقنة زجاجية 0.1 مل	حقنة زجاجية 0.5 مل	حقنة زجاجية لنقل DOPC في محاليل الكلوروفورم
1.3.10	63 ميكرولتر	500 ميكرولتر	حجم DOPC في محلول الكلوروفورم
1.3.16	10 مل	5 مل	حجم الزيت
2.4.1	3300 جرام 20 دقيقة	500 جرام 45 دقيقة	حالة الطرد المركزي

الجدول 1: الاختلافات في البروتوكول. يشير الجدول إلى الاختلافات في الخطوات المختلفة للبروتوكول (المشار إليها في العمود الأول) لإعداد مجموعتين مختلفتين من GUV: GUVs المحملة بالسكروز (الحالة E) و GUVs المحملة بالجسيمات الدقيقة (الحالة P).

معرف	الخطوات المتضمنة	القطر الداخلي (مم)	القطر الخارجي (مم)	الطول (مم)
1	1.2.1; 1.2.3	7	13	50
2	1.2.1; 1.2.4; 1.3.5	7	13	50
3	1.2.1; 1.2.4; 1.3.5	7	13	100
4	1.2.1; 1.2.4; 1.2.5	7	13	2000
5	1.2.1; 1.2.6; 1.3.13	7	13	2000
6	1.2.2; 1.2.7; 1.3.11	3	7	50
7	1.2.2; 1.2.7; 1.3.11	3	7	50
8	1.2.2; 1.2.9; 1.3.11; 1.3.15	3	7	200
9	1.2.2; 1.2.9; 1.3.11; 1.3.15	3	7	200

الجدول 2: أنابيب توصيلات الغاز والفراغ في غرفة القفازات. يسرد الجدول أبعاد أنابيب السيليكون المستخدمة لتوصيل حجرة القفازات بخطوط النيتروجين والتفريغ. يتم توفير المعرفات المرجعية لتسهيل عملية التجميع.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن تقسيم طرق إنتاج GUVs إلى مجموعتين رئيسيتين: الطرق القائمة على التورم من الركائز من خلال الترطيب وتلك القائمة على التجميع من واجهات السوائل. تعتبر الطرق من المجموعة الأولى فعالة للغاية في توفير مجموعات كبيرة من GUV للتوصيفات الفيزيائية الحيوية للأغشية الدهنية أو البروتينات عبر الغشاء. في المقابل ، يتم اختيار طرق مثل نقل القطرات بشكل أساسي لتغليف البضائع بسبب انخفاض استهلاك الشحنات وكفاءة التغليف العالية¹⁸.

لهذا السبب ، تم تغليف عدد كبير من الشحنات المختلفة في GUVs ، مما يجعل نقل القطرات عملية مرجعية للخلايا الاصطناعية³^،⁸^،⁹^،¹⁰ وحلا محتملا لبناء روبوتات دقيقة جديدة للمحاكاة الحيوية¹¹^،¹². لتعديل الخصائص الفيزيائية والكيميائية لأغشية GUV ، يمكن تضمين جزيئات مختلفة ، مثل الدهون الفوسفورية الأيونية¹⁰ ، أو الأحماض الدهنية¹⁹ ، أو البوليمرات مثل PEG²⁰ ، أو الكوليسترول²¹ (على الرغم من أن الجزيئات الكارهة للماء مثل الكوليسترول لها تقارب كبير مع الزيت ، مما يؤدي إلى انخفاض التحكم في تكوين الغشاء فيما يتعلق بطرق التورم²²). البروتوكول متعدد الاستخدامات بما يكفي للسماح بهذه التعديلات ، لكن بعض الخطوات لها تأثير أعلى من غيرها.

لمناقشة الجوانب الحرجة للطريقة ، وصفنا هنا بروتوكولا لإعداد مجموعتين مختلفتين من GUV: مستحضر واحد من GUVs يحتوي على محلول السكروز وآخر مستحضر GUVs التي تغلف الجسيمات الدقيقة. تم تفصيل الاختلافات في البروتوكول في الجدول 1 كحالة E (فارغة) والحالة P (مع الجسيمات). تسمح هذه الطريقة بتكوين GUVs عن طريق نقل قطرات الماء من طور الزيت إلى طور مائي في عملية ثنائية الثبات مدفوعة بالدهون الفوسفورية²³ وتتأثر بالخصائص الفيزيائية والكيميائية لجميع المراحل الثلاثة المعنية: IS و OS و LS.

من بين الثلاثة ، LS هو الأكثر حساسية بسبب قابلية الدهون الفوسفورية للضوء والأكسدة والتحلل المائي²⁴^،²⁵^،²⁶. لهذا السبب ، يجب تنفيذ الخطوة الأولى لتبخير المذيب العضوي المستخدم لتخزين الدهون الفوسفورية على المدى الطويل عند -20 درجة مئوية (عادة الكلوروفورم أو الميثانول) في قوارير العنبر تحت تدفق النيتروجين أو الأرجون. إذا لم يتم ضمان مستويات الرطوبة المنخفضة في بيئة المختبر ، فقد تتلف الدهون الفوسفورية¹³ ^، ¹⁴ ^، ²⁷. لذلك ، يجب تحضير LS في بيئة محصورة مثل صندوق القفازات أو غرفة القفازات المعدلة الفعالة من حيث التكلفة الموضحة في هذا البروتوكول. بمجرد إضافة الزيت إلى فيلم الدهون ، يمكن إزالة LS من غرفة القفازات ، ويتم الذوبان الكامل للدهون الفوسفورية عن طريق دوامة المحلول وتسخينه.

على الرغم من أن بعض البروتوكولات تتضمن صوتنة في هذه الخطوة¹³ ، إلا أن الزيادات الموضعية في درجة الحرارة قد تؤدي إلى أضرار غير موصوفة حتى الآن لبعض تركيبات LS. لهذا السبب ، قد يوفر تسخين المحلول في حمام مائي عملية متجانسة ويتم التحكم فيها بشكل أفضل. لتقليل فرص إتلاف LS بشكل أكبر ، يقترح هذا البروتوكول استخدام درجتين حرارتين مختلفتين: نظرا لأن إذابة LS المعدة حديثا تتطلب طاقة أعلى من LS المذاب مسبقا (بسبب التعبئة الأكثر كثافة من جزيئات الفوسفوليبيد في الفيلم المنتشرة على سطح القارورة الزجاجية) ، تم اعتماد 80 درجة مئوية لإذابة الطبقة الدهنية الأولى و 50 درجة مئوية لإعادة إذابة الدهون الفوسفورية قبل استخدامها مباشرة. نظرا لأن زيادة في تباين الأداء بمرور الوقت لوحظت بشكل عام ل 3.18 ملي مولار DOPC في الزيت المعدني (الشكل 4 ج) ، فإن استخدام LS في غضون أسبوع هو ممارسة موصى بها بشكل عام. ومع ذلك ، قد يكون لبعض مجموعات الزيت والفوسفوليبيدات عمر طويل ، ويبدو أن استخدام غرفة القفازات يحسن أيضا استقرار LS بمرور الوقت.

قد يتطلب تخصيص أغشية GUV بمجموعات محددة من الدهون الفوسفورية تطبيقات مخصصة للبروتوكول. للتنقل بين جميع الاختلافات المحتملة ، يمكن الحصول على إرشادات من الخصائص الفيزيائية والكيميائية ل LS. تتأثر تركيزات ميسيلار الحرجة (CMC) وانتشار الدهون الفوسفورية في LS بالتفاعلات الكيميائية مع الجزيئات في المحلول²⁸. وبالتالي ، يتأثر تكوين قطرات الماء في مستحلب IS / LS بمدى سرعة انتشار الدهون الفوسفورية في طور الزيت والوصول إلى واجهات الماء / الزيت لتشكيل طبقة أحادية مستقرة (النشرة الداخلية للغشاء). لوحظت اختلافات في الانتشار للزيتين المستغلتين في هذا البروتوكول ، حيث يوفر زيت السيليكون AR20 ثباتا أعلى لمستحلب IS / LS (الشكل 6). نظرا لأن المستحلب الأكثر استقرارا لكلا الزيتين لوحظ عندما تم تشتيت الماء بنسبة 2.5٪ (بما يتفق مع الملاحظات السابقة في الزيوت^{المعدنية 13}) ، فقد قمنا بإصلاح هذا كنسبة صالحة بشكل عام.

ومع ذلك ، نظرا لأن النسب الأعلى يمكن أن توفر ميزات مفيدة (على سبيل المثال ، أظهر POPC في الزيوت المعدنية تحولا نحو GUVs أكبر¹³) ، فإننا نوصي بإجراء اختبار نوعي أولي مثل الاختبار المذكور في الشكل 6 للحصول على نظرة ثاقبة حول استقرار المستحلب ، وبالتالي الكفاءة المتوقعة للتغليف. هنا ، ننصح القراء بعدم الاعتماد على التوقيت الدقيق أو تكرارات الإجراءات لتكوين المستحلب لأن الفعالية تعتمد بشكل صارم على المشغل أو الأداة المعتمدة. بدلا من ذلك ، نقدم نقطة تفتيش لمساعدة المشغل على فهم متى تكون جودة المستحلب جيدة بما يكفي - على الأقل من الناحية النظرية - لتعظيم فرص تحويل القطرات إلى GUVs. يؤثر انتشار الدهون الفوسفورية في الزيت أيضا على قدرتها على إعادة الترتيب أثناء نقل القطرات وتشكيل النشرة الخارجية لغشاء GUV²^،⁷^،¹⁸^،²⁹. تفضل هذه الخطوة من خلال التوازن المناسب لواجهة LS / OS. في حين أن وقت الحضانة المعتمد في هذا البروتوكول يتماشى مع التوصيات العامة¹⁸ ، مع قياسات التوتر البيني من التقارير السابقة⁷ وتجاربنا الأولية ، قد تستفيد GUVs المحضرة باستخدام LS مختلفة من وقت حضانة أطول.

يتأثر تكوين النشرة الخارجية أيضا بسرعة قطرات الماء التي تعبر واجهة LS / OS ، وهي خطوة متصلة بكثافة ولزوجة المراحل^{الثلاث 30}. يجب أن تتبع اختلافات الكثافة دائما الترتيب: نظام التشغيل IS > > LS. هذا ضروري للسماح أولا بترسيب قطرات IS باتجاه واجهة LS / OS ، ثم عبور الواجهة للتحويل إلى GUVs وترسيب باتجاه أسفل الأنبوب. على الرغم من أن العملية يمكن أن تحدث تلقائيا حتى عند استخدام الماء منزوع الأيونات ككل من IS و OS²³ ، فقد تم إدخال اختلاف في الكثافة بين IS و OS لصالح تكوين GUV³¹. الزوج الأكثر شيوعا لهذا الغرض هو السكروز في IS والجلوكوز في نظام التشغيل: عند تركيزات متساوية السمولية المطلوبة لمنع تلف GUVs المكونة بسبب الإجهاد التناضحي ، يوفر السكروز محلولا أكثر كثافة من الجلوكوز. نظرا لأن الفرق في الكثافة يزداد مع أسمولية هذه المحاليل ، فإن عائد GUVs يختلف وفقا لذلك ، مع عدم ملاحظة أي تحسن إضافي يتجاوز 600 ملي ماستر¹³.

ترتبط ظروف الطرد المركزي المثلى ارتباطا وثيقا بكثافة ولزوجة المراحل الثلاث وانتشار الدهون الفوسفورية. في حالة عدم وجود توصيف كامل للمراحل الثلاث ، يجب فحص شروط متعددة. من الاختبارات النوعية (الشكل 4E والشكل 5) والتحليل المنهجي الأولي¹⁷ ، كان من الممكن تحديد ظروف الطرد المركزي الجيدة للعينتين الموصوفتين في هذا البروتوكول. ومع ذلك ، فإن جودة العينات مفتوحة للتحسين إذا تم فحص المزيد من الظروف. عندما لا يتم الحفاظ على التوازن بين انتشار الفوسفوليبيد في LS ، وكثافة ولزوجة المراحل الثلاث بشكل صحيح ، تفتقر الدهون الفوسفورية إلى الوقت الكافي لتحقيق التوازن في واجهة LS / OS وإعادة الترتيب بشكل صحيح مع تحرك قطرات الماء نحو نظام التشغيل. غالبا ما يؤدي هذا إلى تكوين راسب أبيض عند الواجهة أو أسفلها مباشرة ، ومن المحتمل أن يتكون من الدهون الفوسفورية وجزيئات الطور الزيتي الأخرى التي يتم سحبها بواسطة قطرات تفشل في التجمع في GUVs أثناء الطرد المركزي.

يمكن أن يكون تغليف محلول متجانس مدفوعا بزيادة كثافة IS مع الحفاظ على التوازن التناضحي مع نظام التشغيل (كما هو الحال بالنسبة لزوج السكروز والجلوكوز) ، لكن تغليف تشتت الجسيمات الدقيقة يتطلب كثافة الطور المائي لتتناسب مع الجسيمات الدقيقة³². تتأثر كفاءة تغليف البضائع أيضا بالتركيب الكيميائي لمحلول / تشتت البضائع. أظهرت التقارير السابقة تأثيرا سلبيا على إنتاجية GUV الناجم عن العديد من هاليدات المعادن القلوية³³ أو تغيرات الأس الهيدروجيني¹³ ، على الأرجح بسبب التفاعلات أو التحولات في صافي شحنة الرؤوس المحبة للماء zwitterionic للفوسفوليبيدات. لذلك ، غالبا ما يتطلب تغليف التفاعلات البيولوجية (مثل تخليق البروتين الأنزيمي أو الخالي من الخلايا) حلا وسطا ، حيث يجب تعديل تركيزات الأس الهيدروجيني والملح (مثل KCl أو كلوريد الصوديوم) إلى مستويات دون المستوى الأمثل للتفاعل نفسه. ومع ذلك ، حتى مخاليط التفاعل المعقدة مثل تخليق البروتين الخالي من الخلايا يمكن تعديلها لتوفير خلايا اصطناعية وظيفية قائمة على GUV³⁴.

من الناحية العملية ، على الرغم من أن طريقة نقل القطرات توفر عملية مباشرة للغاية ، إلا أن استرداد GUVs من نظام التشغيل يمكن أن يفرض بعض القيود. للمساعدة في إزالة الزيت من المرحلة العلوية بعد خطوة الطرد المركزي، من الممكن استغلال طرفين من الماصة لإزالة أدق (خطوة البروتوكول 3.1.1) أو قارورة Buchner لإزالة أسرع عند تحضير عينات متعددة (خطوة البروتوكول 3.1.2). ومع ذلك ، نظرا لعدم إزالة الزيت بالكامل ، فمن الضروري إجراء خطوة غسيل للحصول على تشتت GUV نظيف (خطوة البروتوكول 3.2). على الرغم من أن خطوات الغسيل أدت إلى الإزالة الفعالة لقطرات الزيت المتبقية دون فقدان ملحوظ في GUVs (الشكل 4 أ ، ب) ، إلا أن هذا المقطع قد يكون أقل وضوحا مع الزيت عالي اللزوجة ، ويمكن أن يستغرق وقتا طويلا عند تحضير تركيبات GUV متعددة. تم وصف طريقة بديلة لتجاوز إزالة الزيت واستعادة GUV من أسفل الأنبوب من خلال ثقب مثقوب بمساعدة إبرة³⁵. هذه العملية, ومع ذلك, قد لا تسمح بالتعافي الكامل لحبيبات GUV إذا لم يتم ثقب الأنبوب في الموضع المناسب و, علاوة على ذلك, من المحتمل أن يكون ضارا للمشغل.

للمساعدة في تعافي GUV ، نقدم هنا نهجا جديدا وبسيطا لإزالة مرحلة الزيت بسرعة. يعتمد ذلك على حبس مرحلة الزيت العلوية الأقل كثافة في طرف ماصة مغطى بحيث يمكن إزالة الطرف بعد الطرد المركزي بطريقة لا تقطر فيها السوائل. تسمح هذه الإستراتيجية البسيطة بإزالة سريعة وسهلة لمرحلة الزيت بأكملها في وقت واحد ، مما يبسط هذه الخطوة التي تستغرق وقتا طويلا باستمرار.

لتقييم كفاءة البروتوكول ، تم تنفيذ بعض الطرق للكشف التلقائي عن GUVs لتسريع العد وتحليل توزيع الحجم. يوفر وضع العلامات على GUVs باستخدام مجسات الفلورسنت استراتيجية بسيطة وفعالة مطبقة على كل من قياس التدفق الخلوي³⁶^،³⁷ والتصوير المجهري جنبا إلى جنب مع خوارزميات الكشف عن الدائرة¹³^،³⁷^،³⁸^،³⁹. في الآونة الأخيرة ، يتم استكشاف الأدوات القائمة على الذكاء الاصطناعي للكشف عن الكائنات لتحسين هذه العملية⁴⁰^،⁴¹. ومع ذلك ، يمكن أن تؤثر الأصباغ الفلورية على خصائص GUV ، وبالتالي إدخال القطع الأثرية في التحليل. إذا تم استبعاد إشارة الفلورسنت القابلة للاكتشاف ، يظل الفحص المجهري هو الخيار الأكثر موثوقية ، حيث يكون الفحص المجهري لتباين الطور هو الطريقة المفضلة للتصور الأمثل¹⁸ وتطبيق خوارزميات الكشف عن الدائرة³⁸.

بدلا من ذلك ، من الممكن استغلال الخصائص الغريبة لتركيبات محددة لاستراتيجيات الكشف الفريدة. على سبيل المثال ، استفاد Hadorn et al. من وجود الإلكتروليتات في IS للكشف عن GUVs باستخدام عداد الخلية القائم على المعاوقة³³. عندما لا تكون أي من هذه الطرق الآلية أو الخاصة بالصياغة ممكنة ، يظل التعليق التوضيحي اليدوي للدائرة احتياطيا قابلا للتطبيق عالميا. في مثل هذه الحالات ، تقدم ImageJ أداة عملية لتسريع العملية واستخراج قياسات القطر الخام بسهولة كما هو موضح في هذا البروتوكول.

على الرغم من الاعتماد الواسع لطريقة نقل القطرات ، إلا أنه لا يتم تكريس سوى القليل من الاهتمام لعمليات التحسين المطلوبة لتركيبات GUV الجديدة. في هذا العمل ، قمنا بجمع المعلومات المتاحة من الأدبيات لتنفيذ بروتوكول منهجي لتوجيه وتبسيط هذا التحسين. يأخذ هذا الدليل العملي في الاعتبار المبادئ الأساسية التي ينطوي عليها إنتاج تركيبات جديدة من GUV وفي استعادة عينة ملوثة بالحد الأدنى من الزيت ، وهو جانب غالبا ما يتم تجاهله من البروتوكول¹³^،¹⁴. في حين أن التنبؤ بالتحسين الذي تتطلبه أي تركيبة GUV غير ممكن ، إلا أن هذا الدليل يقدم نصائح ورؤى مفيدة لتسريع تنفيذ GUVs الجديدة ، مما قد يؤدي إلى تطبيقات بما في ذلك الخلايا الاصطناعية والروبوتات الدقيقة.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين مصالح متنافسة للإعلان.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذه النتائج هي جزء من مشروع CELLOIDS (الروبوتات الدقيقة الذكية المستوحاة من الجسيمات المستوحاة من الخلية) الذي تلقى تمويلا من مجلس البحوث الأوروبي (ERC) في إطار برنامج Horizon 2020 للبحث والابتكار التابع للاتحاد الأوروبي (اتفاقية المنحة رقم 948590). تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل المفوضية الأوروبية من خلال مشروع NextGenerationEU BRIEF. نشكر ميشيل الإبراهيمي على الدعم الفني في إنشاء غرفة القفازات وعلى المناقشة المفيدة حول تنفيذ الحاوية لسهولة إزالة النفط.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
0.22 & م غشاء استرات السليلوز المختلط ؛ مرشحات الحقنة	ميرك	SLGSVR255F
أنابيب 1.5 مل	بيوكلاس	06.0279.00
100 μ حقنة زجاجية L	ميرك	20737
دورق 150 مل	أفانتور	213-1123	3 على الأقل
قوارير زجاجية داكنة سعة 20 مل ND24	أفانتور	548-9001 أ
أنابيب 2 مل	بيوكلاس	07.3534.99
اسطوانة 50 مل	أفانتور	612-3843
500 μ حقنة زجاجية L	هاملتون	549-1166
أنبوب الصقر 50 مل	ميرك	CLS352070
حقنة 50 مل ؛	فيشر العلمية	8SS50L1
أنابيب 5 مل	غرينر بيو ون	622201
دورق 600 مل	أفانتور	213-1126
ب ü قارورة Chner	ميرك	Z740682
حلقات الفلين للقوارير المستديرة أسفل	أفانتور	217-1000
جهاز التبلور	دوتشر	080474 أ
د- (+) - جلوكوز	سيجما ألدريتش	جي 8270
د- (+) - السكروز	سيجما ألدريتش	س 9378
مقياس الرطوبة الحراري الرقمي	بوهليندر	الإصدار 1863-07
دوبكسي	أبحاث أفانتي	850375 ج
نقب	دريميل	4000
ملح ثنائي الصوديوم Erioglaucine (Brilliant Blue FCF)	سيجما ألدريتش	861146
إبرة حقنة G18	تيرومو	AN1838R1
إبرة حقنة G21	تيرومو	AN2138R1
غرفة القفازات	بيل آرت	F50030-0000	إذا كان متاحا ، يمكن استخدام صندوق القفازات ولكن في المختبرات ذات مستويات الرطوبة المنخفضة قد لا يكون ضروريا
محرك مغناطيسي للوحة الساخنة	LLG مختبر	6.263 448
زيت معدني خفيف	سيجما ألدريتش	330779
كوكسين جديد	سيجما ألدريتش	199737
حلقة مطاطية من النتريل ، تجويف 8 مم ، قطر خارجي 12 مم	RS	196-4863
أغطية لولبية مفتوحة مع الحاجز ND24	أفانتور	548-0031 أ
ماصة دقيقة P1000	فيشر العلمية	12346132
ماصة دقيقة P10000	أفانتور	89079-978
ماصة دقيقة P200	فيشر العلمية	12326132
مناشف ورقية	أفانتور	KIMB6657
بارافيلم	أفانتور	291-1214
أطراف ماصة (1000)	إيبندورف	0030000919
أطراف ماصة (10000)	إيبندورف	0030000765
أطراف ماصة (200)	إيبندورف	0030000870
جزيئات البوليسترين ، 1.1 & m	سيجما ألدريتش	رطل 11-1 مل
غطاء مطاطي	بيوکلاس SRL	12.2300.05
طوقا مطاطية مخروطية	أفانتور	217-0211
أغطية المسمار ؛ ND24	أفانتور	548-0161 أ
زيت السيليكون AR20	سيجما ألدريتش	10836
أنبوب سيليكون (قطر داخلي 1.6 مم قطر خارجي 3 مم)	RS	667-8441
أنبوب السيليكون (القطر الداخلي 6 مم القطر الخارجي 12 مم)	RS	273-2541	6 م على الأقل
تقاطع ثلاثي الاتجاهات	RS	795-405
تقاطع ثنائي الاتجاه	RS	419-7287
صمام ثنائي الاتجاه	كلابر	91280
مياه فائقة النقاء	ثيرمو فيشر العلمي	22934	عند توفره ، يمكن استبدال هذا المنتج بمياه منقاة من خلال أنظمة Milli-Q
مقص عالمي	بوكيم	4154

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Träuble, H., Grell, E. Carriers and specificity in membranes. IV. Model vesicles and membranes. The formation of asymmetrical spherical lecithin vesicles. Neurosci Res Program Bull. 9 (3), 373-380 (1971).
Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (51), 17669-17674 (2004).
Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. ChemBioChem. 11, 848-865 (2010).
Ernits, M., et al. Microfluidic production, stability and loading of synthetic giant unilamellar vesicles. Sci Rep. 14 (1), 14071(2024).
Bao, P., et al. Production of giant unilamellar vesicles and encapsulation of lyotropic nematic liquid crystals. Soft Matter. 17 (8), 2234-2241 (2021).
Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), (2011).
Elani, Y., Law, R. V., Ces, O. Vesicle-based artificial cells as chemical microreactors with spatially segregated reaction pathways. Nat Commun. 5 (1), 5305(2014).
Heili, J. M., et al. Controlled exchange of protein and nucleic acid signals from and between synthetic minimal cells. Cell Syst. 15 (1), 49-62.e4 (2024).
Shimane, Y., Kuruma, Y. Rapid and facile preparation of giant vesicles by the droplet transfer method for artificial cell construction. Front Bioeng Biotechnol. 10, 873854(2022).
Sato, Y., Hiratsuka, Y., Kawamata, I., Murata, S., Nomura, S. M. Micrometer-sized molecular robot changes its shape in response to signal molecules. Sci Robot. 2 (4), eaal3735(2017).
De Remigis, E., et al. Infiltration of cell-inspired ultra-deformable magnetic microrobots in restrictive environments. IEEE Trans Med Robot Bionics. 7 (1), 123-129 (2024).
Moga, A., Yandrapalli, N., Dimova, R., Robinson, T. Optimization of the inverted emulsion method for high-yield production of biomimetic giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 20 (20), 2674-2682 (2019).
Zhang, Y., Obuchi, H., Toyota, T. A practical guide to preparation and applications of giant unilamellar vesicles formed via centrifugation of water-in-oil emulsion droplets. Membranes. 13 (4), 440(2023).
Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Engineering asymmetric vesicles. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (19), 10718-10721 (2003).
Palagi, S. GUV-dimensional-analysis. , https://github.com/microrobotlab/GUV-dimensional-analysis/tree/v1.0 (2025).
De Remigis, E., et al. Optimisation of encapsulation technique for confining microparticles in lipid membranes. Zenodo. 2023, DOI: 10.5281/zenodo.8069819 (2023).
Dimova, R., Stano, P., Marques, C. M., Walde, P. Preparation methods for giant unilamellar vesicles. Giant Vesicle Book. , 3-20 (2019).
Tyler, A. I. I., Greenfield, J. L., Seddon, J. M., Brooks, N. J., Purushothaman, S. Coupling phase behavior of fatty acid containing membranes to membrane bio-mechanics. Front Cell Dev Biol. 7, (2019).
Hamada, S., et al. Giant vesicles functionally expressing membrane receptors for an insect pheromone. Chem Commun. 50 (22), 2958(2014).
Roberti, E., Petrocelli, E. L., Cecchi, D., Palagi, S. Dimensions, stability, and deformability of DOPC-cholesterol giant unilamellar vesicles formed by droplet transfer. Open Res Eur. 5 (77), (2025).
Weakly, H. M. J. Several common methods of making vesicles (except an emulsion method) capture intended lipid ratios. Biophys J. 123 (19), 3452-3462 (2024).
Ito, H., et al. Dynamical formation of lipid bilayer vesicles from lipid-coated droplets across a planar monolayer at an oil/water interface. Soft Matter. 9 (40), 9539-9547 (2013).
Reis, A., Spickett, C. M. Chemistry of phospholipid oxidation. Biochim Biophys Acta BBA Biomembr. 1818 (10), 2374-2387 (2012).
Storage and handling of lipids. , https://avantiresearch.com/tech-support/storage-handling-of-lipids (2025).
Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synth Biol. 10 (7), 1690-1702 (2021).
Faizi, H. A., Tsui, A., Dimova, R., Vlahovska, P. M. Bending rigidity, capacitance, and shear viscosity of giant vesicle membranes prepared by spontaneous swelling, electroformation, gel-assisted, and phase transfer methods: a comparative study. Langmuir. 38 (34), 10548-10557 (2022).
Lehtinen, O. -P., et al. Effect of temperature, water content and free fatty acid on reverse micelle formation of phospholipids in vegetable oil. Colloids Surf B Biointerfaces. 160, 355-363 (2017).
Takahashi, H., Ogawa, A. Preparation of a millimeter-sized supergiant liposome that allows for efficient, eukaryotic cell-free translation in the interior by spontaneous emulsion transfer. ACS Synth Biol. 9 (7), 1608-1614 (2020).
Whittenton, J., Harendra, S., Pitchumani, R., Mohanty, K., Vipulanandan, C., Thevananther, S. Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides. Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).
Hamada, T., Miura, Y., Komatsu, Y., Kishimoto, Y., Vestergaard, M., Takagi, M. Construction of asymmetric cell-sized lipid vesicles from lipid-coated water-in-oil microdroplets. J Phys Chem B. 112 (47), 14678-14681 (2008).
Natsume, Y., Toyota, T. Giant vesicles containing microspheres with high volume fraction prepared by water-in-oil emulsion centrifugation. Chem Lett. 42 (3), 295-297 (2013).
Hadorn, M., Boenzli, E., Hotz, P. E. A quantitative analytical method to test for salt effects on giant unilamellar vesicles. Sci Rep. 1 (1), 168(2011).
Toparlak, ÖD., et al. Artificial cells drive neural differentiation. Sci Adv. 6 (38), eabb4920(2020).
Fujii, S., Matsuura, T., Sunami, T., Nishikawa, T., Kazuta, Y., Yomo, T. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nat Protoc. 9 (7), 1578-1591 (2014).
Matsushita-Ishiodori, Y., Hanczyc, M. M., Wang, A., Szostak, J. W., Yomo, T. Using imaging flow cytometry to quantify and optimize giant vesicle production by water-in-oil emulsion transfer methods. Langmuir. 35 (6), 2375-2382 (2019).
Caliari, A., Hanczyc, M. M., Imai, M., Xu, J., Yomo, T. Quantification of giant unilamellar vesicle fusion products by high-throughput image analysis. Int J Mol Sci. 24 (9), 8241(2023).
van Buren, L., Koenderink, G. H., Martinez-Torres, C. DisGUVery: a versatile open-source software for high-throughput image analysis of giant unilamellar vesicles. ACS Synth Biol. 12 (1), 120-135 (2023).
Pazzi, J., Subramaniam, A. B. Nanoscale curvature promotes high yield spontaneous formation of cell-mimetic giant vesicles on nanocellulose paper. ACS Appl Mater Interfaces. 12 (50), 56549-56561 (2020).
Ekosso, C., Liu, H., Glagovich, A., Nguyen, D., Maurer, S., Schrier, J. Accelerating the discovery of abiotic vesicles with AI-guided automated experimentation. Langmuir. 41 (1), 858-867 (2025).
Lee, I. -H., Passaro, S., Ozturk, S., Ureña, J., Wang, W. Intelligent fluorescence image analysis of giant unilamellar vesicles using convolutional neural network. BMC Bioinformatics. 23 (1), 48(2022).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

استخدام طريقة نقل القطرات لتحضير حويصلات أحادية الصفائح العملاقة بشكل موثوق

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة