مقالة منهجية

تحليل ثلاثي الأبعاد متزامن لتلف القلب والاستجابة المناعية في احتشاء عضلة القلب الحاد المتكرر باستخدام الفحص المجهري الفلوري للصفائح الضوئية

DOI:

10.3791/68347

⸱

سبتمبر 26, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology and Vascular Medicine, West German Heart and Vascular Center, University Hospital Essen, 2Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG, 3Institute for Experimental Immunology and Imaging, University Hospital, University Duisburg-Essen

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتيح إعادة البناء ثلاثي الأبعاد (3D) لتلف القلب في احتشاء عضلة القلب الحاد (repAMI) القياس الكمي المخلص والتحديد المشترك للأنماط المرتبطة بالأمراض المصاحبة. هنا ، يتم توفير نهج تصوير موجه بورقة ضوئية آلي للقياس المعاصر لتلف القلب والمنطقة المعرضة للخطر واستجابة الخلايا المناعية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحدد التفاعلات الخلوية المعقدة إعادة تشكيل الأنسجة الوظيفية والهيكلية أثناء احتشاء عضلة القلب الحاد (repAMI). تظهر هذه العمليات توزيعا مكانيا متميزا حيث يتم تقسيم عضلة القلب المصابة إلى مناطق مختلفة (منطقة الضرر ، والمنطقة المعرضة للخطر (AAR) ، والمنطقة النائية). يعد التصور ثلاثي الأبعاد (3D) لهذه المناطق أمرا ضروريا لتحليل التفاعلات المختلفة بين خلايا القلب المقيمة والخلايا المناعية المتسللة ، مما يتيح تحديد أهداف العلاج المحتملة. هنا ، يتم وصف بروتوكول للتصور ثلاثي الأبعاد المتزامن والآلي والقياس الكمي لمنطقة تلف القلب ، AAR ، والخلايا المناعية المتسللة (على سبيل المثال ، العدلات) بعد repAMI. يتضمن ذلك تلطيخ الأجسام المضادة داخل الحيوية لمنطقة تلف القلب (CD31neg) وتسلل العدلات (Ly6G +) بعد التصور خارج الجسم الحي ل AAR عن طريق نضح الأجسام المضادة الرجعية والمزيد من إزالة الأنسجة غير السامة للتصوير المجهري الفلوري للصفائح الضوئية (LSFM). تسمح هذه التقنية بالتحليل المكاني للخلايا المستهدفة ، على سبيل المثال ، تسلل الخلايا المناعية والمناطق التالفة في قلب الفأر السليم بعد repAMI. يمكن إجراء الأنسجة التقليدية والكيمياء المناعية بعد إزالة الأنسجة غير السامة والحصول على الصور من خلال المعالجة اللاحقة بمساعدة الكمبيوتر. يسمح ذلك بتعدد الإرسال للحصول على المعلومات داخل نفس قلب الفأر ، مما يعزز متانة البيانات ويكون مهما بشكل خاص في إصابة معقدة للغاية مثل repAMI.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إصابة الأنسجة في احتشاء عضلة القلب الحاد (repAMI) هي العامل الدافع الرئيسي لإعادة تشكيل القلب وتطور قصور القلب1. يؤثر العديد من الوسطاء المحليين وخلايا القلب المقيمة ولكن أيضا تسلل الخلايا المناعية على توسعها في تفاعل معقد2،3. يعد فهم التنظيم المكاني لهذه العمليات أمرا ضروريا لاكتساب معرفة عميقة لتحديد أهداف العلاج الجديدة للحد من إصابة الأنسجة بعد repAMI وتحسين وظائف القلب.

نظرا لأن عضلة القلب نفسها تتكون من أنواع مختلفة من الخلايا ، فإن التحليل التفصيلي لتلف القلب يمثل تحديا حيث يظهر كل نوع من الخلايا قدرة المقاومة الخاصة به أثناء نقص التروية وإصابة إعادة التروية4،5. تتمثل إحدى السمات المميزة المهمة في سياق repAMI في فقدان كبير للأوعية الدموية مصحوبا بتدهور وظيفة الخلايا البطانية6. العلامة الأكثر رسوخا المستخدمة لتصوير بنية الأوعية الدموية وتحليل الخلل البطاني في الفئران والبشر هي CD31 (المعروف أيضا باسم PECAM-1) ، وهو جزيء التصاق يتم التعبير عنه على سطح الخلية البطانية7. في نماذج نقص التروية / إعادة التروية المختلفة ، أظهر فقدان CD31 أنه علامة بديلة جيدة للتمييز بين تلف الأنسجة البطانية8،9،10. علاوة على ذلك ، يتم تمييز ثلاث حجرات إصابة رئيسية في جميع أنحاء القلب بالكامل أثناء repAMI. تمثل أنسجة القلب التي لا تتأثر بإصابة نقص التروية / إعادة التروية (I / R) المنطقة النائية. يتم تعريف عضلة القلب في اتجاه مجرى انسداد الأوعية الدموية على أنها منطقة معرضة للخطر (AAR) 11،12. بعد بداية إعادة التروية ، يمكن تمييز منطقة مميزة من أنسجة القلب داخل AAR ، والتي تضررت بسبب نقص تروية (منطقة التلف) السابقة13. يستخدم التقييم التقليدي لإصابة I / R القلبية في الفئران كلوريد ثلاثي فينيل رباعي الترازوليوم (TTC) في أقسام سميكة متسلسلة تظهر انخفاض النشاط الأيضي لخلايا القلب التالفة13،14. في الوقت نفسه ، يمكن إضافة التلوين الأزرق ل ex vivo Evan لتحديدAAR 15. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب المعمول بها تحمل العديد من القيود ، بما في ذلك تقليل إمكانية التقييم المشترك لتسلل الخلايا المناعية ، والتمييز بين الإصابة المحددة من نوع الخلية ، وإعادة بناء الأنسجة ثلاثية الأبعاد بدقة.

يتيح الفحص المجهري الفلوري للصفائح الضوئية (LSFM) إمكانية تصور أعضاء الفأر الكاملة السليمة التي تم تطهيرها بدقة إشارة مضان وصولا إلى المستوى الخلوي. في الآونة الأخيرة ، تم تقديم طريقة محسنة لإزالة الأنسجة غير السامة باستخدام إيثيل سينامات (ECi) للتصور ثلاثي الأبعاد لقلوب الفئران السليمة8. لمعالجة قيود التلوين الأزرق ل TTC / Evan ، تم استخدام تلطيخ مضان CD31 قائم على الأجسام المضادة داخل الحيوية ، مما كشف عن إصابة بطانة القلب كمناطق بدون تلطيخ CD31 (CD31neg) أثناء repAMI8. الإدارة الإضافية لحقن الأبهر الرجعي خارج الجسم الحي مع جسم مضاد مضاد مضاد CD31 مترافق بالفلوروفور مع طيف مضان آخر كما هو الحال بالنسبة للتلطيخ داخل الحيوية ، فإن التصوير ثلاثي الأبعاد المعاصر ل AAR. علاوة على ذلك ، يمكن توسيع هذه الطريقة عن طريق إضافة تلطيخ العدلات ، مما يسمح بتحليل توزيع الخلايا مفصولا بمنطقة نائية ، و AAR ، وحجم إصابة بطانة القلب لتحسين فهم وظيفة العدلات أثناء repAMI.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع إجراءات التجارب من قبل الوكالة الحكومية المحلية المسؤولة (AZ 81-02.04.2023.A059 - Landesamt für Natur- ، Umwelt- und Verbraucherschutz (LANUV)) وامتثلت لجميع اللوائح الأخلاقية ذات الصلة للاختبار والبحث على. أجريت التجارب على ذكور الفئران C57BL / 6J (9-30 أسبوعا من العمر). تم إيواء واستخدامها في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF) في بيت المحلي في دورة 12 ساعة / 12 ساعة ليلا ونهارا.

ملاحظة: أجريت جميع التدخلات الجراحية تحت تحريض التخدير داخل الصفاق باستخدام الكيتامين (100 ملغ/كغ) والزيلازين (10 ملغ/كغ) مع الصيانة باستخدام الأيزوفلوران (1.5 نسبة حجم). لتقليل معاناة ، تلقت جميع حقنا تحت الجلد بمقدار 0.1 مجم / كغ من البوبرينورفين قبل التخدير وبعده خلال النهار بالاشتراك مع البوبرينورفين المحتوي على مياه الشرب طوال الليل. تم وصف البروتوكول الجراحي لتحريض repAMI سابقا في مكان آخر16،17. قبل البدء بحقن الأجسام المضادة داخل الجسم الحيوي ، قم بإعداد طبقين بتري بطول 6 سم يستخدمان لحقن الأجسام المضادة خارج الجسم الحي في الخطوات اللاحقة الموضحة أدناه. هناك حاجة إلى طبق بتري ضحل واحد مع PBS على الجليد لإزالة الأنسجة المحيطة الزائدة من القلب (يوصى باستخدام قطع مقطوعة حسب الحجم من الشاش داخل الطبق لتسهيل عملية المناولة اللاحقة). هناك حاجة إلى طبق آخر لقنية الأبهر بإبرة قنية فولاذية حادة 20 جرام مغمورة في PBS على الجليد مع عقدة فضفاضة من 5-0 خياطة فوق شق القنية. تجنب أو قم بإزالة فقاعات الهواء داخل القنية ، لأنها يمكن أن تسد الأوعية التاجية وتمنع التروية الكلية.

1. حقن الأجسام المضادة داخل الحيوية

  1. قم بتخدير الفأر باستخدام الكيتامين (100 مجم / كجم) والإزيلازين (10 مجم / كجم).
  2. حقن 10 ميكروغرام من كل من الفأر المضاد ل CD31 المسمى مباشرة (الاستنساخ: MEC13.3 ؛ الفلوروفور: AlexaFluor 790) والفأر المضاد ل Ly6G (الاستنساخ: 1A8 ؛ الفلوروفور: AlexaFluor 647) الأجسام المضادة في PBS بحجم إجمالي يبلغ 5 ميكرولتر لكل جرام من وزن الجسم (100 ميكرولتر لفأر 20 جم) عن طريق حقن وريد الذيل في الوريد.
    ملاحظة: ستقوم حقنة الجسم المضاد هذه بتسمية كل البطانة داخل القلب وتهدف إلى تحديد حجم إصابة repAMI.
  3. اترك الأجسام المضادة المحقونة تنتشر لمدة 10 دقائق قبل متابعة الإجراء.

2. حصاد القلب

ملاحظة: القسمان 2 و 3 لهما أهمية زمنية ويجب إكمالهما في أقل من 6 دقائق.

  1. التضحية بالحيوان عن طريق خلع عنق الرحم بعد 10 دقائق من حقن الأجسام المضادة. تحقق من الموت عن طريق تقييم ردود الفعل.
    ملاحظة: إذا كانت هناك حاجة إلى عينات دم ، فخذها قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
  2. ضع الماوس تحت مجهر ستيريو.
  3. افتح تجويف الصدر وشق الوريد الأجوف العلوي المكشوف بالقرب من خروج الوعاء من القفص الصدري إلى الرقبة.
    ملاحظة: حافظ على الشريان الأورطي سليما كما هو ضروري لحقن الأجسام المضادة خارج الجسم الحي .
  4. قم بتدوير القلوب في الموقع عبر الأذن الأذينية اليمنى واليسرى مع PBS المحتوي على الهيبارين (20 IE / مل) باستخدام إبرة 27 G مع مضخة أسطوانية (70 ميكرولتر / ثانية) لمدة 3 دقائق. تصبح إزالة الدم القلبي الكافية ملحوظة من خلال تلاشي الرسم الوعائي السطحي للقلب وتبييض الرئة والكبد.
    ملاحظة: تجنب نضح القلب عبر البطين الأيمن أو الأيسر لأنه قد يتسبب في تصوير القطع الأثرية أثناء الفحص المجهري المضان للصفائح الضوئية.
  5. استئصال القلب وما لا يقل عن 5 مم من الشريان الأورطي المتبقي مع أنسجة الرئة المحيطة.
    ملاحظة: لا تمسك عضلة القلب مباشرة أثناء الاستئصال لتجنب تلف الأنسجة وتصوير القطع الأثرية أثناء الفحص المجهري الفلوري للصفائح الضوئية.

3. حقن الأجسام المضادة الرجعية في الجسم الحي

  1. انقل القلب إلى طبق بتري مقاس 6 سم مع PBS المثلج والشاش المحضر مسبقا.
  2. اقطع أنسجة الرئة والدهون والأوعية الدموية المحيطة المتبقية حتى يبقى القلب الذي يبلغ طوله حوالي 5 مم فقط من الشريان الأورطي.
  3. نقل القلب إلى طبق مجهز لقنية الأبهر.
  4. اسحب الشريان الأورطي المتبقي فوق القنية الفولاذية الحادة 20 جيجا واربطها بخيط 50 مسبقا بالشق القنية.
    ملاحظة: يجب دفع طرف القنية بالقرب من الصمام الأبهري لضمان عدم تسرب سائل التروية.
  5. أعد ربط الشريان الهابط الأمامي الأيسر (LAD) بشكل دائم بخيطة 6-0 في الموقع الدقيق المستخدم لتحريض repAMI سابقا.
  6. حقن 400 ميكرولتر من PBS يحتوي على 20 ميكروغرام من الجسم المضاد للفأر المضاد ل CD31 (الاستنساخ: MEC13.3) ، المسمى ب AlexaFluor 546 ، باتجاه رجعي عن طريق القنية المدخلة.
    ملاحظة: أغلق الوصلة بين حقنة الحقن والقنية المدخلة بغشاء مانع للتسرب لضمان نضح الأجسام المضادة بالكامل عبر الشرايين التاجية. سيؤدي حقن الجسم المضاد هذا إلى تلطيخ البطانة خارج AAR فقط وبالتالي يمكن استخدامه لقياس AAR.
  7. اسحب القنية المدخلة من الشريان الأورطي.
  8. نقل القلب إلى أنبوب تفاعل بولي بروبيلين سعة 15 مل يحتوي على 10 مل من 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) واحتضان بدون تحريض طوال الليل عند 4 درجات مئوية في الظلام.

4. تجهيز العينات وتطهيرها

  1. اغسل القلب المثبت بثلاثة تغييرات بحجم 5 مل PBS لمدة 10 دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة (RT) في الظلام ، مع التحريك دائما مع دوران علوي قريب في أنابيب تفاعل البولي بروبلين سعة 5 مل.
  2. تجفيف القلب المثبت في سلسلة الإيثانول الصاعدة 5 مل عند 50٪ و 70٪ و 100٪ في الماء منزوع الأيونات ، كل منها لمدة ساعتين على الأقل في RT في الظلام دائما مع دوران علوي قريب في أنابيب تفاعل البولي بروبلين 5 مل.
    ملاحظة: يمكن إطالة فترة الحضانة في 50٪ و 70٪ من الإيثانول حتى اليوم التالي ، بينما يمكن إطالة فترة الحضانة في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة تصل إلى 3 أيام.
  3. مبيض القلب المجفف في أنابيب تفاعل البولي بروبيلين سعة 15 مل تحتوي على 10 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ مع 5٪ DMSO و 5٪ H2O2 بدون تحريض لمدة 4 ساعات عند 4 درجات مئوية في الظلام.
    ملاحظة: قد يتراكم الضغط داخل الأنبوب أثناء عملية التبييض ؛ توخ الحذر عند فتح الأنبوب بعد ذلك.
  4. اغسل القلب المبيض في 5 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ ثلاث مرات لمدة 12 ساعة لكل منها في RT في الظلام ، ودائما ما يكون التحريك مع دوران علوي قريب في أنابيب تفاعل البولي بروبلين سعة 5 مل.
    ملاحظة: يمكن إطالة كل خطوة حضانة لمدة تصل إلى 3 أيام.
  5. انقل القلب إلى أنبوب تفاعل بولي بروبيلين سعة 5 مل يحتوي على 4 مل من إيثيل سينمات (ECi) لتطهير الأنسجة واحتضان بدون إثارة لمدة 3 أيام في RT في الظلام.
    ملاحظة: يمكن أن يبقى القلب المنظف في ECi لمدة 3 أشهر على الأقل دون انخفاض في شدة التألق تحت التخزين الصحيح في الظلام عند RT. لا تقم بتخزين ECi أو العينات المخزنة في ECi أقل من 6 درجات مئوية ، حيث يتجمد ECi عند درجة الحرارة هذه ، مما يضر بالعينة في هذه العملية.

5. تحضير كتل صمغ الجلان

  1. امزج 1 جم من مسحوق صمغ الجيلان في 100 مل من ماء الصنبور الساخن (50-60 درجة مئوية).
  2. اتركيه يمتزج حتى يحل تماما باستخدام محرك مغناطيسي.
    ملاحظة: إذا لم يتم حل المسحوق بشكل صحيح ، سخني المحلول حتى الغليان في الميكروويف.
  3. قم بتصفية محلول صمغ الجيلان من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر.
  4. محلول مصفى في طبق بتري ضحل مقاس 10 سم.
  5. اتركه يبرد حتى يتماسك الجل.
  6. قطع الجل إلى كتل 15 مم 15 مم 5 مم.
  7. تجفيف الكتل في 50 مل من سلسلة الإيثانول الصاعدة بنسبة 50٪ و 70٪ في الماء منزوع الأيونات ، كل منها لمدة ساعتين على الأقل في RT دائما مع دوران علوي قريب في أنبوب تفاعل بولي بروبيلين واحد سعة 50 مل.
    ملاحظة: املأ أنبوب التفاعل بالإيثانول بعد إضافة كتل الجل. املأ أنبوب التفاعل حتى النصف فقط بكتل الجل.
  8. احتضان الكتل المجففة في 50 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ ثلاث مرات لمدة 12 ساعة لكل منها في RT ، مع التحريك دائما مع دوران علوي قريب في أنبوب تفاعل بولي بروبلين واحد سعة 50 مل.
    ملاحظة: املأ أنبوب التفاعل بالإيثانول بعد إضافة كتل الجل. املأ أنبوب التفاعل حتى النصف فقط بكتل الجل. يمكن أن تبقى كتل الهلام في أنبوب التفاعل الأخير مع الإيثانول بنسبة 100٪ لفترات طويلة حتى يتم مسحها في ECi.
  9. نقل الكتل إلى أنبوب تفاعل بولي بروبيلين سعة 50 مل يحتوي على 25 مل من ECi واحتضان بدون تحريض لمدة 3 أيام في RT.
    ملاحظة: ضع بضع كتل فقط في أنبوب تفاعل واحد باستخدام ECi لتجنب إزالة القطع الأثرية. يمكن أن تبقى الكتل التي تم مسحها في ECi لمدة 6 أشهر على الأقل ويتم تخزينها في RT.

6. التصوير

  1. قم بقص كتل علكة الجيلان التي تم تطهيرها بالحجم المطلوب لتثبيت القلب الذي تم تطهيره في حامل عينة المجهر.
    ملاحظة: يمكن إعادة استخدام كتل علكة جيلان عدة مرات.
  2. اكتشف إشارات التألق ذات الأهمية (التألق الذاتي ، تلطيخ AAR [الجسم المضاد المضاد CD31 المسمى ب AlexaFluor 546] ، الأجسام المضادة المضادة ل Ly6G المقترنة ب AlexaFluor647 وتلوينCD31 neg [الجسم المضاد المضاد CD31 المسمى ب AlexaFluor 790]) مع إعدادات مرشح الإثارة والانبعاث المناسبة. للاقتناء ، استخدم عدسة موضوعية 0.1 NA بمسافة عمل 17.6 مم.
    ملاحظة: كشف الإشارات باستخدام ليزر الضوء الأبيض (200 ميجاوات؛ 480-2400 نانومتر). للكشف عن التألق الذاتي المشتق من النسيج الضام ، استخدم مرشح إثارة ممر النطاق 470/30 نانومتر ومرشح انبعاث ممر النطاق 525/50 نانومتر ؛ تم الكشف عن تلطيخ CD31 بجسم مضاد مقترن ب AlexaFluor 546 باستخدام مرشح إثارة ممر نطاق 520/40 نانومتر ومرشح انبعاث ممر نطاق 585/40 نانومتر ؛ تم الكشف عن تلطيخ Ly6G بجسم مضاد مقترن ب AlexaFluor 647 باستخدام مرشح إثارة ممر النطاق 630/30 نانومتر ومرشح انبعاث ممر النطاق 680/30 نانومتر ؛ تم الكشف عن تلطيخ CD31 بجسم مضاد مقترن ب AlexaFluor 790 باستخدام مرشح إثارة ممر النطاق 740/40 نانومتر ومرشح انبعاث ممر النطاق 824/55 نانومتر. يجب تعديل أوقات الإضاءة ونسبة التوهين بالليزر وفقا لجودة الإشارة.
  3. اختر الإعدادات التالية للتصوير المجهري للورقة الضوئية:
    1. اختر ورقة NA من 0.079 ، مما ينتج عنه سمك ورقة خفيفة تبلغ 5 ميكرومتر.
    2. اختر 10 ميكرومتر كمسافة بين مستويين z-فرديين.
      ملاحظة: يؤدي ذلك إلى نقص أخذ العينات وما يترتب عليه من فقدان الدقة في قياس التتبع والحجم. لتجنب ذلك ، يجب أن تساوي المسافة بين مستويتين فرديتين على شكل حرف z نصف سمك ورقة الضوء ، لذلك في هذه الحالة ، 2.5 ميكرومتر. اختارت هذه الدراسة تقليل عينات البيانات ، حيث أن الفوائد المكتسبة من تقليل وقت التصوير وحجم مكدس البيانات تفوق الحد الأدنى من فقدان دقة التحليل.
    3. استخدم عرض ورقة بنسبة 100٪ للحصول على إضاءة متجانسة للعينة.

7. المعالجة اللاحقة للصور

ملاحظة: تمت معالجة بيانات الصور الرقمية التي تم الحصول عليها بشكل أكبر باستخدام برنامج علمي لمعالجة الصور ثلاثية الأبعاد وتحليلها المدرج في جدول المواد.

  1. ابدأ تشغيل برنامج محول ملفات Imaris 10.1 وقم بتحميل مجموعة البيانات الأولية في البرنامج إما عن طريق سحب المجلد الذي يحتوي على ملفات الصور وإفلاته في نافذة محول ملفات Imaris أو النقر فوق تصفح والانتقال إلى المجلد الذي يحتوي على ملفات الصور.
  2. حدد مجلد الإخراج عبر تحديد مجلد.
  3. انقر فوق بدء الكل وانتظر حتى يتم تحويل الملفات إلى ملفات .ims Imaris.
  4. ابدأ تشغيل البرنامج وحدد تجاوز في الزاوية العلوية اليسرى.
  5. افتح مكدسات الصور عن طريق اختيار فتح وحدد ملف بيانات .ims المطابق.
  6. لإنشاء سطح تم إنشاؤه تلقائيا للقلب كله، حدد 3D View وSurfaces.
  7. اختر Segment فقط منطقة اهتمام، ومعالجة الصورة بأكملها أخيرا، وإحصائيات كائن الكائن مع تعطيل تصنيف الأسطح في قسم إعدادات الخوارزمية .
    ملاحظة: يسمح تمكين إحصائيات الكائن بحساب تراكب الأسطح المختلفة والوظائف الموضعية.
  8. انقر فوق زر السهم الأزرق في الزاوية السفلية اليمنى من إنشاء ورقة لمتابعة الخطوات التالية.
  9. حدد منطقة الاهتمام ثلاثية الأبعاد باستخدام المعالجات التي تظهر داخل عرض الصورة.
  10. تابع الخطوة التالية عن طريق اختيار القناة المصدر (قناة التألق التلقائي).
  11. قم بتمكين Smooth واختر الإعداد الافتراضي 11.8 ميكرومتر.
  12. تابع الخطوة التالية وحدد العتبة اللازمة لإنشاء سطح ثلاثي الأبعاد مرضي بصريا يظهر داخل عرض الصورة.
  13. في الخطوة الأخيرة ، اضبط مرشح السطح ، واختر عدد Voxels كنوع المرشح وحدد 10 كعتبة.
  14. قم بإنشاء سطح بالنقر فوق زر السهم الأخضر في الزاوية السفلية اليمنى من قسم إنشاء . باستخدام ورقة الألوان ، قم بتغيير مادة ولون السطح الذي تم إنشاؤه حسب الحاجة.
  15. قم بإنشاء سطحين إضافيين تم إنشاؤهما يدويا ل AAR (حجم CD31neg في قناة AlexaFluor 546) وحجم إصابة بطانة القلب (حجم CD31neg في قناة AlexaFluor 790) عن طريق اختيار 3D View و Surfaces مرة أخرى.
  16. اختر تقسيم منطقة اهتمام فقط، ومعالجة الصورة بأكملها أخيرا، وإحصائيات كائن الكائن أثناء تعطيل تصنيف الأسطح في قسم إعدادات الخوارزمية ، وانقر فوق تخطي الإنشاء التلقائي، وقم بالتحرير يدويا.
  17. داخل ورقة اللوحة ، حدد XY للاتجاه، ولا شيء للرؤية واضبط وحدة التحكم في الدقة يدويا إلى الحد الأقصى.
  18. انتقل إلى ورقة الطراز ، وانقر فوق أيقونة المسافة ، واضبط تباعد الرأس على 100 ميكرومتر.
  19. قم بتمكين رسم وتطويق مناطق CD31neg في قناة AlexaFluor 546 أو قناة AlexaFluor 790 كل 10 شرائح صورة.
  20. بعد الانتهاء من تطويق جميع المناطق وفقا ، اختر Autofit و Perform Autofit.
  21. انقر فوق Create Surface واضبط مادة ولون الأسطح التي تم إنشاؤها في ورقة الألوان .
  22. لعرض العدلات كنقاط Ly6G+ ، قم بإنشاء وظيفة موضعية عن طريق اختيار 3D View و Spots.
  23. حدد تقسيم منطقة الاهتمام فقط، ومعالجة الصورة بأكملها أخيرا، وإحصائيات كائن الكائن مع تعطيل تصنيف النقاط في قسم إعدادات الخوارزمية .
  24. انتقل إلى الخطوات التالية باستخدام زر السهم الأزرق في الزاوية اليمنى السفلية من إنشاء ورقة.
  25. حدد منطقة الاهتمام ثلاثية الأبعاد باستخدام المتلاعبين الذين تظهر داخل عرض الصورة كما هو مذكور أعلاه.
  26. تابع الخطوة التالية باستخدام القناة المصدر (قناة AlexaFluor 647).
  27. اضبط قطر XY المقدر على 10 ميكرومتر ، وقم بتمكين استطالة نموذج PSF على طول المحور Z ، واضبط قطر Z المقدر على 20 ميكرومتر.
  28. تعطيل طرح الخلفية.
  29. تابع الخطوة التالية، وحدد الحد الأدنى للكثافة كعامل تصفير، وقم بتعيين حد مناسب.
    ملاحظة: لتقدير مستوى العتبة، انقر فوق شريحة في المنطقة العلوية من نافذة البرنامج وحدد قناة AlexaFluor 647. حرك المؤشر فوق نقاط مختلفة في شريحة الصورة الأولية التي تمثل تلطيخا إيجابيا ل Ly6G واقرأ قيمة الكثافة في الزاوية السفلية اليسرى من نافذة البرنامج.
  30. قم بإنشاء نقاط بالنقر فوق زر السهم الأخضر في الزاوية اليمنى السفلية من إنشاء ورقة.
  31. قم بتعيين مقياس نصف القطر إلى 3.0 في قسم نمط / جودة النقاط في ورقة الإنشاء .
  32. وصلت إلى ورقة الألوان لضبط اللون الموضعي حسب الرغبة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسمح النهج المقدم باستخدام الفحص المجهري الفلوري للصفائح الضوئية (LSFM) بالتحليل المتزامن ل AAR ، وإصابة البطانة ، وتسلل العدلات بعد repAMI. يوضح الشكل 1 أ تلطيخ الأجسام المضادة داخل الجسم الحي وخارج الجسم الحي لفئران C57BL / 6J بعد 24 ساعة من تحريض repAMI. تم حقن الأجسام المضادة لتلطيخ إصابة بطانة القلب (مضاد CD31 المسمى ب AlexaFluor 790) وتسلل العدلات (مضاد Ly6G المسمى ب AlexaFluor 647) عن طريق الوريد قبل 10 دقائق من التضحية. بعد إزالة الدم بشكل كاف ، تم تلطيخ AAR عن طريق التروية ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك العديد من كيانات التصوير للكشف عن إصابة أنسجة القلب أثناء إعادة AMI في الفئران. توفر هذه التقنيات مزايا مختلفة ولكنها تحمل أيضا قيودا. يعد التلوين ، وانخفاض النشاط الأيضي لخلايا القلب باستخدام TTC ، الطريقة الأكثر استخداما لقياس إصابة I / R القلبية ويمكن دمجه مع تلطيخ إيفان الأزرق لتمييزAAR 13،14،15. هذه طريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة ، ولكنها محدودة في إعادة البناء ثلاثية الأبعاد الدقيق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يبلغ إلياس الحاج يحيى عن رسوم شخصية ورسوم أخرى من AstraZeneca ، والتي هي خارج العمل المقدم. يعمل Simon F. Merz و Lea Bornemann حاليا في Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG. أبلغ ماتياس توتزيك وتينوش رساف عن الرسوم الشخصية ، وآخرين من إدواردز ونوفارتيس وبريستول مايرز سكويب وباير ودايتشي سانكيو وأسترا زينيكا ، وهي خارج العمل المقدم. شارك Tienush Rassaf و Ulrike B. Hendgen-Cotta في تأسيس Bimyo ، وهي شركة تركز على تطوير الببتيدات الواقية من القلب. تلقى ماتياس غونزر تمويلا عاما للأبحاث من شركة Miltenyi BioTec B.V. & Co. KG. يعلن جميع المؤلفين الآخرين عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقر المؤلفون بمصادر التمويل التالية: مؤسسة البحوث الألمانية (عالم سريري UMEA ، FU 356 / 12-2 ، إلياس حاج يحيى ؛ HE6317 / 2-1 ، Ulrike Hendgen-Cotta ، RA969 / 12-1 ، Tienush Rassaf) وجمعية القلب الألمانية (DGK ، Deutsche Gesellschaft für Kardiologie - Herz- und Kreislaufforschung e.V. ، DGK02 / 2022 ، إلياس حاج يحيى). تم تنفيذ بعض هذا العمل في مركز التصوير في إيسن (IMCES) ، وهو مرفق أساسي للخدمة تابع لكلية الطب بجامعة دويسبورغ-إيسن ، ألمانيا. نشكر موظفي IMCES على دعمهم الفني المستمر واستخدام أدواتهم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
إبرة 27 جرامبيكتون ديكنسون305889BD Eclipse
3D معالجة الصور & برامج التحليلبيتبلاينفيرس. 10.1.0إيماريس
5-0 خياطةسيراج ويسنرIC108000حرير
6-0 خياطةإيثيكونطراز EH7814برولين
طقم وضع العلامات على الأجسام المضادة AlexaFluor 546إنفيتروجينأ 20183
طقم وضع العلامات على الأجسام المضادة AlexaFluor 790إنفيتروجينأ20189
الجسم المضاد Ly6G المضاد للفأر (AlexaFluor 647)بيوليجند127610استنساخ: 1A8
مصفاة خلية (100 µ m)كورنينج431752
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)كارل روث7029.1
ايثانولكارل روث0911.4
إيثيل سينيمات (ECi)سيجما ألدريتش112372
برنامج تحويل الملفاتبيتبلاينفيرس. 10.1.0إيماريس
الشاشفورمان10021
مسحوق صمغ جيلانسيجما ألدريتشص 8169فيتاغيل
الهيبارين (25.000 IE / 5 مل)ليو فارما15261203
بيروكسيد الهيدروجين (H2< / sub>O2< / sub> ، 30٪)كارل روث8070.2
حقنة الحقنبي براون9161502 ثانيةأومنيكان و
كيتامين (100 مجم / مل)بيلا فارما402581.00.00
نظام مجهر الصفائح الخفيفةميلتيني بيوتيك-UltraMicroscope Blaze
حقنة قفل لوربيكتون ديكنسون303172BD Plastipak
محرك مغناطيسيVWR444-0572
كاميرا Neo sCMOS (4.2 ميجابكسل)أندور تكنولوجيخلية ZL41 4.2
هدفميلتيني بيوتيك130-133-625MI Plan 1.1x NA 0.1 ، WD 17.6 مم
بارافورمالديهايد (PFA ، 4٪)سيجما ألدريتش1.0049610٪ فورمالين ، مخزنة محايدة
طبق بتريغرينر بيو ون632181
محلول ملحي مخزن من الفوسفات (PBS)جيبكو14190-094بدون MgCl2/CaCl2
أنبوب البولي بروبلين (15 مل)غرينر بيو ون188261
أنبوب البولي بروبلين (5 مل)كارل روث9.1 عدسةأسود
أنبوب البولي بروبلين (50 مل)غرينر بيو ون227261
طبق التحضير لقنية قلب الفأرهوغو ساكس إلكترونيك73-4327القنية متضمنة
الجسم المضاد CD31 المنقى المضاد للفأربيكتون ديكنسون53369استنساخ: MEC13.3
مضخة الأسطوانةإيسماتكرد: 597-230
فيلم الختمبيميسبي إم -996بارافيلم
مجهر ستيريولايكاS6D
أنبوب الدوارهيدولفبولي ماكس 1040
ليزر الضوء الأبيضضوئيات NKTسوبر كي المتطرفة200 ميغاواط ، 480 &ndash ؛ 2400 نيوتن متر
سلالة الماوس WTمختبرات جانفيير-C57BL / 6JRj
زيلازين (2٪)سيفا تيرجيسوندهايت6324464.00.00

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol. 72, 19-44 (2010).
  2. Frangogiannis, N. G. Inflammation in cardiac injury, repair and regeneration. Curr Opin Cardiol. 30 (3), 240-245 (2015).
  3. Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The biological basis for cardiac repair after myocardial infarction: from inflammation to fibrosis. Circ Res. 119 (1), 91-112 (2016).
  4. Koch, A., et al. Capillary endothelia and cardiomyocytes differ in vulnerability to ischemia/reperfusion during clinical heart transplantation. Eur J Cardiothorac Surg. 20 (5), 996-1001 (2001).
  5. Singhal, A. K., Symons, J. D., Boudina, S., Jaishy, B., Shiu, Y. T. Role of endothelial cells in myocardial ischemia-reperfusion injury. Vasc Dis Prev. 7, 1-14 (2010).
  6. Robbers, L. F., et al. Magnetic resonance imaging-defined areas of microvascular obstruction after acute myocardial infarction represent microvascular destruction and haemorrhage. Eur Heart J. 34 (30), 2346-2353 (2013).
  7. DeLisser, H. M., Newman, P. J., Albelda, S. M. Molecular and functional aspects of PECAM-1/CD31. Immunol Today. 15 (10), 490-495 (1994).
  8. Merz, S. F., et al. Contemporaneous 3D characterization of acute and chronic myocardial I/R injury and response. Nat Commun. 10 (1), 2312(2019).
  9. Buscemi, L., Price, M., Bezzi, P., Hirt, L. Spatio-temporal overview of neuroinflammation in an experimental mouse stroke model. Sci Rep. 9 (1), 507(2019).
  10. Zhong, X., et al. Tubular epithelial cells-derived small extracellular vesicle-VEGF-A promotes peritubular capillary repair in ischemic kidney injury. NPJ Regen Med. 7 (1), 73(2022).
  11. Redfors, B., Shao, Y., Omerovic, E. Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice. Exp Clin Cardiol. 17 (4), 268-272 (2012).
  12. Arai, A. E. Magnetic resonance imaging for area at risk, myocardial infarction, and myocardial salvage. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 16 (3-4), 313-320 (2011).
  13. Botker, H. E., et al. Practical guidelines for rigor and reproducibility in preclinical and clinical studies on cardioprotection. Basic Res Cardiol. 113 (5), 39(2018).
  14. Rassaf, T., et al. Circulating nitrite contributes to cardioprotection by remote ischemic preconditioning. Circ Res. 114 (10), 1601-1610 (2014).
  15. Haj-Yehia, E., et al. CD47 blockade enhances phagocytosis of cardiac cell debris by neutrophils. IJC Heart Vasculature. 48, 101269(2023).
  16. Totzeck, M., Hendgen-Cotta, U. B., French, B. A., Rassaf, T. A practical approach to remote ischemic preconditioning and ischemic preconditioning against myocardial ischemia/reperfusion injury. J Biol Methods. 3 (4), e57(2016).
  17. Michel, L., et al. Real-time pressure-volume analysis of acute myocardial infarction in mice. J Vis Exp. (137), e57621(2018).
  18. Ojha, N., et al. Characterization of the structural and functional changes in the myocardium following focal ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2435-H2443 (2008).
  19. Clasen, L., et al. Cardiac ischemia and reperfusion in mice: a comprehensive hemodynamic, electrocardiographic and electrophysiological characterization. Sci Rep. 13 (1), 5693(2023).
  20. Lang, C. I., et al. Expedient assessment of post-infarct remodeling by native cardiac magnetic resonance imaging in mice. Sci Rep. 11 (1), 11625(2021).
  21. Coolen, B. F., et al. Three-dimensional T1 mapping of the mouse heart using variable flip angle steady-state MR imaging. NMR Biomed. 24 (2), 154-162 (2011).
  22. Zhong, X., et al. Comprehensive cardiovascular magnetic resonance of myocardial mechanics in mice using three-dimensional cine DENSE. J Cardiovasc Magn Reson. 13 (1), 83(2011).
  23. Becker, K., Jahrling, N., Kramer, E. R., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Ultramicroscopy: 3D reconstruction of large microscopical specimens. J Biophotonics. 1 (1), 36-42 (2008).
  24. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  25. Rajendran, P. S., et al. Identification of peripheral neural circuits that regulate heart rate using optogenetic and viral vector strategies. Nat Commun. 10 (1), 1944(2019).
  26. Mann, L., Klingberg, A., Gunzer, M., Hasenberg, M. Quantitative visualization of leukocyte infiltrate in a murine model of fulminant myocarditis by light sheet microscopy. J Vis Exp. (123), e55450(2017).
  27. Taki, J., et al. 14C-Methionine uptake as a potential marker of inflammatory processes after myocardial ischemia and reperfusion. J Nucl Med. 54 (3), 431-436 (2013).
  28. Michel, L., et al. PD1 deficiency modifies cardiac immunity during baseline conditions and in reperfused acute myocardial infarction. Int J Mol Sci. 23 (14), 7533(2022).
  29. Park, K. C., Gaze, D. C., Collinson, P. O., Marber, M. S. Cardiac troponins: from myocardial infarction to chronic disease. Cardiovasc Res. 113 (14), 1708-1718 (2017).
  30. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Curr Protoc Neurosci. 81 (2), 28.21-28.28 (2017).
  31. Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using light sheet microscopy. J Am Soc Nephrol. 28 (2), 452-459 (2017).
  32. Weiss, K. R., Voigt, F. F., Shepherd, D. P., Huisken, J. Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging. Nat Protoc. 16 (6), 2732-2748 (2021).
  33. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  34. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  35. Merz, S. F., et al. High-resolution three-dimensional imaging for precise staging in melanoma. Eur J Cancer. 159, 182-193 (2021).
  36. Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation. Front Immunol. 11, 599495(2020).
  37. Pichardo, A. H., et al. Optical tissue clearing to study the intra-pulmonary biodistribution of intravenously delivered mesenchymal stromal cells and their interactions with host lung cells. Int J Mol Sci. 23 (22), 14171(2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة