تتيح إعادة البناء ثلاثي الأبعاد (3D) لتلف القلب في احتشاء عضلة القلب الحاد (repAMI) القياس الكمي المخلص والتحديد المشترك للأنماط المرتبطة بالأمراض المصاحبة. هنا ، يتم توفير نهج تصوير موجه بورقة ضوئية آلي للقياس المعاصر لتلف القلب والمنطقة المعرضة للخطر واستجابة الخلايا المناعية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحليل ثلاثي الأبعاد متزامن لتلف القلب والاستجابة المناعية في احتشاء عضلة القلب الحاد المتكرر باستخدام الفحص المجهري الفلوري للصفائح الضوئية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تحدد التفاعلات الخلوية المعقدة إعادة تشكيل الأنسجة الوظيفية والهيكلية أثناء احتشاء عضلة القلب الحاد (repAMI). تظهر هذه العمليات توزيعا مكانيا متميزا حيث يتم تقسيم عضلة القلب المصابة إلى مناطق مختلفة (منطقة الضرر ، والمنطقة المعرضة للخطر (AAR) ، والمنطقة النائية). يعد التصور ثلاثي الأبعاد (3D) لهذه المناطق أمرا ضروريا لتحليل التفاعلات المختلفة بين خلايا القلب المقيمة والخلايا المناعية المتسللة ، مما يتيح تحديد أهداف العلاج المحتملة. هنا ، يتم وصف بروتوكول للتصور ثلاثي الأبعاد المتزامن والآلي والقياس الكمي لمنطقة تلف القلب ، AAR ، والخلايا المناعية المتسللة (على سبيل المثال ، العدلات) بعد repAMI. يتضمن ذلك تلطيخ الأجسام المضادة داخل الحيوية لمنطقة تلف القلب (CD31neg) وتسلل العدلات (Ly6G +) بعد التصور خارج الجسم الحي ل AAR عن طريق نضح الأجسام المضادة الرجعية والمزيد من إزالة الأنسجة غير السامة للتصوير المجهري الفلوري للصفائح الضوئية (LSFM). تسمح هذه التقنية بالتحليل المكاني للخلايا المستهدفة ، على سبيل المثال ، تسلل الخلايا المناعية والمناطق التالفة في قلب الفأر السليم بعد repAMI. يمكن إجراء الأنسجة التقليدية والكيمياء المناعية بعد إزالة الأنسجة غير السامة والحصول على الصور من خلال المعالجة اللاحقة بمساعدة الكمبيوتر. يسمح ذلك بتعدد الإرسال للحصول على المعلومات داخل نفس قلب الفأر ، مما يعزز متانة البيانات ويكون مهما بشكل خاص في إصابة معقدة للغاية مثل repAMI.
المقدمة
إصابة الأنسجة في احتشاء عضلة القلب الحاد (repAMI) هي العامل الدافع الرئيسي لإعادة تشكيل القلب وتطور قصور القلب1. يؤثر العديد من الوسطاء المحليين وخلايا القلب المقيمة ولكن أيضا تسلل الخلايا المناعية على توسعها في تفاعل معقد2،3. يعد فهم التنظيم المكاني لهذه العمليات أمرا ضروريا لاكتساب معرفة عميقة لتحديد أهداف العلاج الجديدة للحد من إصابة الأنسجة بعد repAMI وتحسين وظائف القلب.
نظرا لأن عضلة القلب نفسها تتكون من أنواع مختلفة من الخلايا ، فإن التحليل التفصيلي لتلف القلب يمثل تحديا حيث يظهر كل نوع من الخلايا قدرة المقاومة الخاصة ب....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع إجراءات التجارب من قبل الوكالة الحكومية المحلية المسؤولة (AZ 81-02.04.2023.A059 - Landesamt für Natur- ، Umwelt- und Verbraucherschutz (LANUV)) وامتثلت لجميع اللوائح الأخلاقية ذات الصلة للاختبار والبحث على. أجريت التجارب على ذكور الفئران C57BL / 6J (9-30 أسبوعا من العمر). تم إيواء واستخدامها في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF) في بيت المحلي في دورة 12 ساعة / 12 ساعة ليلا ونهارا.
ملاحظة: أجريت جميع التدخلات الجراحية تحت تحريض التخدير داخل الصفاق باستخدام الكيتامين (100 ملغ/كغ) والزيلازين (10 ملغ/كغ) مع الصيانة باستخدام الأيزوفلوران (1.5 نسبة حجم). لتقليل معاناة ، تلقت جميع حق....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يسمح النهج المقدم باستخدام الفحص المجهري الفلوري للصفائح الضوئية (LSFM) بالتحليل المتزامن ل AAR ، وإصابة البطانة ، وتسلل العدلات بعد repAMI. يوضح الشكل 1 أ تلطيخ الأجسام المضادة داخل الجسم الحي وخارج الجسم الحي لفئران C57BL / 6J بعد 24 ساعة من تحريض repAMI. تم حقن الأجسام المضادة لتلطيخ إصابة بطانة القلب (مضاد CD31 المسمى ب AlexaFluor 790) وتسلل العدلات (مضاد Ly6G المسمى ب AlexaFluor 647) عن طريق الوريد قبل 10 دقائق من التضحية. بعد إزالة الدم بشكل كاف ، تم تلطيخ AAR عن طريق التروية .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هناك العديد من كيانات التصوير للكشف عن إصابة أنسجة القلب أثناء إعادة AMI في الفئران. توفر هذه التقنيات مزايا مختلفة ولكنها تحمل أيضا قيودا. يعد التلوين ، وانخفاض النشاط الأيضي لخلايا القلب باستخدام TTC ، الطريقة الأكثر استخداما لقياس إصابة I / R القلبية ويمكن دمجه مع تلطيخ إيفان الأزرق لتمييزAAR 13،14،15. هذه طريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة ، ولكنها محدودة في إعادة البناء ثلاثية الأبعاد الدقيق.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يبلغ إلياس الحاج يحيى عن رسوم شخصية ورسوم أخرى من AstraZeneca ، والتي هي خارج العمل المقدم. يعمل Simon F. Merz و Lea Bornemann حاليا في Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG. أبلغ ماتياس توتزيك وتينوش رساف عن الرسوم الشخصية ، وآخرين من إدواردز ونوفارتيس وبريستول مايرز سكويب وباير ودايتشي سانكيو وأسترا زينيكا ، وهي خارج العمل المقدم. شارك Tienush Rassaf و Ulrike B. Hendgen-Cotta في تأسيس Bimyo ، وهي شركة تركز على تطوير الببتيدات الواقية من القلب. تلقى ماتياس غونزر تمويلا عاما للأبحاث من شركة Miltenyi BioTec B.V. & Co. KG. يعلن جميع المؤلفين الآخرين عدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
يقر المؤلفون بمصادر التمويل التالية: مؤسسة البحوث الألمانية (عالم سريري UMEA ، FU 356 / 12-2 ، إلياس حاج يحيى ؛ HE6317 / 2-1 ، Ulrike Hendgen-Cotta ، RA969 / 12-1 ، Tienush Rassaf) وجمعية القلب الألمانية (DGK ، Deutsche Gesellschaft für Kardiologie - Herz- und Kreislaufforschung e.V. ، DGK02 / 2022 ، إلياس حاج يحيى). تم تنفيذ بعض هذا العمل في مركز التصوير في إيسن (IMCES) ، وهو مرفق أساسي للخدمة تابع لكلية الطب بجامعة دويسبورغ-إيسن ، ألمانيا. نشكر موظفي IMCES على دعمهم الفني المستمر واستخدام أدواتهم.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| إبرة 27 جرام | بيكتون ديكنسون | 305889 | BD Eclipse |
| 3D معالجة الصور & برامج التحليل | بيتبلاين | فيرس. 10.1.0 | إيماريس |
| 5-0 خياطة | سيراج ويسنر | IC108000 | حرير |
| 6-0 خياطة | إيثيكون | طراز EH7814 | برولين |
| طقم وضع العلامات على الأجسام المضادة AlexaFluor 546 | إنفيتروجين | أ 20183 | |
| طقم وضع العلامات على الأجسام المضادة AlexaFluor 790 | إنفيتروجين | أ20189 | |
| الجسم المضاد Ly6G المضاد للفأر (AlexaFluor 647) | بيوليجند | 127610 | استنساخ: 1A8 |
| مصفاة خلية (100 µ m) | كورنينج | 431752 | |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) | كارل روث | 7029.1 | |
| ايثانول | كارل روث | 0911.4 | |
| إيثيل سينيمات (ECi) | سيجما ألدريتش | 112372 | |
| برنامج تحويل الملفات | بيتبلاين | فيرس. 10.1.0 | إيماريس |
| الشاش | فورمان | 10021 | |
| مسحوق صمغ جيلان | سيجما ألدريتش | ص 8169 | فيتاغيل |
| الهيبارين (25.000 IE / 5 مل) | ليو فارما | 15261203 | |
| بيروكسيد الهيدروجين (H2< / sub>O2< / sub> ، 30٪) | كارل روث | 8070.2 | |
| حقنة الحقن | بي براون | 9161502 ثانية | أومنيكان و |
| كيتامين (100 مجم / مل) | بيلا فارما | 402581.00.00 | |
| نظام مجهر الصفائح الخفيفة | ميلتيني بيوتيك | - | UltraMicroscope Blaze |
| حقنة قفل لور | بيكتون ديكنسون | 303172 | BD Plastipak |
| محرك مغناطيسي | VWR | 444-0572 | |
| كاميرا Neo sCMOS (4.2 ميجابكسل) | أندور تكنولوجي | خلية ZL41 4.2 | |
| هدف | ميلتيني بيوتيك | 130-133-625 | MI Plan 1.1x NA 0.1 ، WD 17.6 مم |
| بارافورمالديهايد (PFA ، 4٪) | سيجما ألدريتش | 1.00496 | 10٪ فورمالين ، مخزنة محايدة |
| طبق بتري | غرينر بيو ون | 632181 | |
| محلول ملحي مخزن من الفوسفات (PBS) | جيبكو | 14190-094 | بدون MgCl2/CaCl2 |
| أنبوب البولي بروبلين (15 مل) | غرينر بيو ون | 188261 | |
| أنبوب البولي بروبلين (5 مل) | كارل روث | 9.1 عدسة | أسود |
| أنبوب البولي بروبلين (50 مل) | غرينر بيو ون | 227261 | |
| طبق التحضير لقنية قلب الفأر | هوغو ساكس إلكترونيك | 73-4327 | القنية متضمنة |
| الجسم المضاد CD31 المنقى المضاد للفأر | بيكتون ديكنسون | 53369 | استنساخ: MEC13.3 |
| مضخة الأسطوانة | إيسماتك | رد: 597-230 | |
| فيلم الختم | بيميس | بي إم -996 | بارافيلم |
| مجهر ستيريو | لايكا | S6D | |
| أنبوب الدوار | هيدولف | بولي ماكس 1040 | |
| ليزر الضوء الأبيض | ضوئيات NKT | سوبر كي المتطرفة | 200 ميغاواط ، 480 &ndash ؛ 2400 نيوتن متر |
| سلالة الماوس WT | مختبرات جانفيير | - | C57BL / 6JRj |
| زيلازين (2٪) | سيفا تيرجيسوندهايت | 6324464.00.00 |
المراجع
- Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol. 72, 19-44 (2010).
- Frangogiannis, N. G. Inflammation in cardiac injury, repair and regeneration. Curr Opin Cardiol.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
