مقالة منهجية

نموذج فأر محسن للحث على سرطان القولون المرتبط بالتهاب القولون باستخدام أزوكسي ميثان وكبريتات ديكستران الصوديوم لدراسات مناعة الورم وعلاجه

DOI:

10.3791/68351

⸱

يوليو 25, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Therapeutics, University of Florida College of Medicine, 2Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida College of Medicine, 3Department of Immunology, H. Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute, 4University of Florida Health Cancer Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد سرطان القولون المرتبط بالتهاب القولون الناجم عن أزوكسيميثان (AOM) / ديكستران كبريتات الصوديوم (DSS) نهجا راسخا وفعالا من حيث التكلفة لنمذجة الأورام الأصلية في الأمعاء الغليظة في الفئران. نقدم بروتوكولا محدثا ونناقش الاعتبارات الحاسمة لتحسين جرعة DSS الخاصة بالجنس ومساهمة الميكروبيوم في الصرامة والمتانة والتكاثر.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن يؤدي أزوكسي ميثان (AOM ، وهو عامل ضار للحمض النووي) وكبريتات ديكستران الصوديوم (DSS ، وهو عامل معزز لالتهاب القولون) إلى إحداث أورام في الأمعاء الغليظة للفئران ذات الاختراق العالي. يقف نموذج سرطان القولون المرتبط بالتهاب القولون الفئراني (CAC) الناجم عن AOM / DSS كمعيار ذهبي في التحقيق في سرطان القولون المرتبط بالالتهاب ، نظرا لدقته في تلخيص الخصائص السريرية ل CAC البشرية. تشمل مزايا النموذج أصله وتطوره من الأنسجة الداخلية ، والكفاءة المناعية التي تحافظ على ذخيرة كاملة من التفاعلات المناعية للورم ، والقدرة على التكيف مع العديد من سلالات الفئران ، وراحة زمن الوصول لمدة 3 أشهر ، والتكاليف المنخفضة نسبيا. على الرغم من هذه المزايا، هناك العديد من التحديات التي تحد من فعالية البروتوكول. يؤدي التباين في جرعة DSS وفي اختراق الورم عبر الدراسات إلى ملاحظات غير متسقة. بالإضافة إلى ذلك ، تساهم الاختلافات في ميكروبات الأمعاء في زيادة التباين التجريبي ، مما يؤثر سلبا على القوة الإحصائية. وتزيد الفروق بين الجنسين في الاستجابة ل AOM/DSS من تعقيد تفسير النتائج. علاوة على ذلك ، فإن تباين DSS من لوت إلى لوت يعيق قابلية تكرار النتائج. تعد معالجة هذه التحديات أمرا بالغ الأهمية لتعزيز موثوقية هذا النموذج وقابليته للتطبيق في البحوث قبل السريرية. لحل هذه المشكلة ، باستخدام الفئران C57BL / 6J كنموذج ، قمنا بتحسين البروتوكول المعمول به باستراتيجيات للتحسين الفعال لتعزيز قابلية التكاثر والمواءمة بين الدراسات. وتشمل هذه التوصيات لمعايرة جرعة DSS في كل من الفئران من الذكور والإناث ، وتنفيذ تجانس الجراثيم قبل كل دورة DSS للتخفيف من عدم تجانس فلورا الأمعاء من قفص إلى قفص. قللت هذه الخطوات بشكل كبير من التباين وتحسين قابلية التكاثر ، مما أدى إلى تحريض قوي ل CAC. إدراكا للدور المحوري للالتهاب وآليات المناعة الخلوية في تطور CAC ، يصف البروتوكول أيضا إجراءات معالجة الأنسجة المناسبة لعزل الحمض النووي الريبي أو البروتين ولتحديد السيتوكينات الالتهابية من أورام القولون وأنسجة القولون المحيطة. في النهاية ، يضمن استخدام هذه الطريقة إنتاج CAC أكثر صرامة وقوة وقابلية للتكرار.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سرطان القولون والمستقيم (CRC) هو ثالث أكثر أنواع السرطان شيوعا في جميع أنحاء العالم والسبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان1،2. بالمقارنة مع سرطان القولون والمستقيم المتقطع ، ينشأ سرطان القولون والمستقيم المرتبط بالتهاب القولون (CAC) نتيجة لتلف الأمعاء المطول والمتكرر في المرضى الذين يعانون من مرض التهاب الأمعاء (IBD) 3،4 ، ويتميز بدرجة خبيثة أعلى وميل للعرض متعدد البؤر في سن أصغر. بسبب هذه العوامل ، يتطلب CAC عموما علاجا أكثر عدوانية مع نتائج سريرية أقلملاءمة 5. على الرغم من أن CAC يعتبر كيانا متميزا يرجع ذلك جزئيا على الأقل إلى التوقيت الفريد لاكتساب الطفرات والدور الكبير لآليات المناعة الالتهابية والميكروبيوم ، إلا أن CAC و CRC المتقطع يشتركان في العديد من أوجه التشابه فيما يتعلق بالمناظر الطبيعية الجينومية الشاملة والسمات المسببة للأمراض. لتعزيز فهمنا لسرطان الخلايا السرطانية بشكل عام و CAC بشكل خاص ، ولتحسين الاستراتيجيات العلاجية ، تعد النماذج قبل السريرية القوية ضرورية.

من بين النماذج المختلفة المستخدمة لدراسة CRC ، يعد نموذج CAC المستحث عن AOM / DSS هو الأكثر اعتمادا على نطاق واسع ويعتبر المعيار الذهبيالحالي 6،7. بدأ هذا النموذج بإهانة قوية مطفرة قدمتها AOM ، ويعتمد هذا النموذج على نوبات متكررة من التهاب القولون الناجم عن DSS والتي تحاكي عن كثب مرض التهاب الأمعاء البشري ، مثل مرض كرون والتهاب القولون التقرحي ، وهما من عوامل الخطر الراسخة ل CAC8. يوفر نموذج AOM / DSS العديد من المزايا الرئيسية مقارنة بأساليب أخرى في الجسم الحي . على عكس الطرق التي تعتمد على حقن المواد الخارجية التي تبدأ السرطان لإنشاء أورام الخاصرة أو حتى تقويم العظام ، فإن CAC الناجم عن AOM / DSS هو أصلي ، مما يعني أن بدء الورم يحدث داخليا وتطور السرطان يتكشف في البيئة المكروية للأنسجة الأصلية ، مما يعكس عن كثب بيولوجيته وتاريخه الطبيعي. على عكس الطعوم الغريبة لخطوط الخلايا البشرية أو المواد المشتقة من المريض والتي لا يمكن زراعتها إلا في الفئران التي تعاني من نقص المناعة ، فهي قادرة على المناعة ، مما يتيح دراسة التفاعلات المناعية للسرطان. على عكس النماذج المعدلة وراثيا التي تنتج أورام ذات دوافع وراثية محددة ، فمن المحايد للطفرات المحددة مسبقا ، مما يسمح بنمذجة أوسع لمسارات إشارات السرطان وآليات التثقيف المناعي. أخيرا ، يمكن تكييف نموذج AOM / DSS بسهولة مع العديد من سلالات الفئران المختلفة ، مما يلغي الحاجة إلى مخططات تربية طويلة ، مما يجعله فعالا من حيث الوقت والتكلفة. ومع ذلك ، فإن عوامل مثل جنس ، وجرعة DSS ، والاختلافات في ميكروبات الأمعاء يمكن أن تؤدي إلى تباين ، مما يؤثر على قابلية التكاثر ويعقد تطبيقه في البحث الانتقالي.

لقد هدفنا إلى تحسين هذا البروتوكول للتخفيف من تأثير هذه العوامل التي تدعم التناقضات في مدى التهاب القولون وتكوين أورام CAC. هناك تباين كبير في تركيزات DSS المستخدمة للحث على التهاب حاد أو التهاب القولون أو الالتهاب المزمن و CAC9،10. DSS هو بوليمر ، ويمكن أن يختلف متوسط الوزن الجزيئي بين القطع والمصنعين ، مما يؤثر على التباين في النتائج التجريبية. لذلك ، من الضروري اختبار كل دفعة من DSS لضمان الاتساق عبر الدراسات. بالإضافة إلى ذلك ، يتأثر مدى الالتهاب الناجم عن DSS بشكل كبير بميكروبيوم الأمعاء ، والذي يمكن أن يختلف اختلافا كبيرا بين مرافق الفئران حول العالم ، وحتى بين مواقع الاحتجاز والمستعمرات المختلفة داخل نفس المؤسسة11،12. يمكن أن يؤثر هذا التباين في التركيب الميكروبي على نتائج النموذج ويساهم في نتائج غير متسقة13. يعد السكن المشترك للحيوانات من المجموعات التجريبية المختلفة ، كلما أمكن ذلك ، أمرا بالغ الأهمية لتقليل التباين ، ومع ذلك قد لا يكون كافيا لمعالجة هذا المربك ، حيث تخضع المجتمعات الميكروبية للانجراف العشوائي بمرور الوقت وتؤدي إلى تأثيرات القفص في نماذج الالتهابالمزمن 14. نظرا لأن بروتوكول AOM / DSS يتضمن علاجا طويل الأمد للحفاظ على الالتهاب المزمن ، فقد قمنا بتنفيذ تجانس الجراثيم عن طريق خلط الفراش بشكل دوري من جميع الأقفاص التي تحتوي على معالجة AOM / DSS. تساعد هذه الممارسة على تجانس بيئة الكائنات الحية الدقيقة ، مما يؤدي إلى تقليل التباين التجريبي. إلى جانب ذلك ، تشير الملاحظات إلى أن تأثيرات DSS يمكن أن تختلف بناء على جنس15،16 ، مما قد يؤدي إلى استجابات تفاضلية في الالتهاب وتطور السرطان. قمنا بتحسين البروتوكول الحالي عن طريق معايرة DSS في إناث وذكور الفئران بشكل منفصل لاختيار جرعة مناسبة من DSS لكلا الجنسين ، مما يضمن نتائج أكثر اتساقا وتوفير مدخلات حاسمة لحسابات الطاقة الإحصائية لتحديد أحجام العينات المثلى في كل من الفئران من الذكور والإناث

بشكل عام ، لتعزيز قابلية تكرار نموذج AOM / DSS ، نحدد مجموعة موحدة من إرشادات البروتوكول التي تأخذ في الاعتبار هذه العوامل المربكة وتخفف من حدتها. نحن نستخدم تقنيات تجانس الميكروبيوم ، بالإضافة إلى وصف التعديل الدقيق لجرعة DSS لتحقيق نتائج أكثر اتساقا وقابلية للتكرار ، وبالتالي تحسين فائدة نموذج AOM / DSS والمواءمة عبر الدراسات المختلفة. يبرز بروتوكولنا على أنه يوضح انخفاض التباين من الأقفاص المتجانسة بالميكروبات ويوفر إرشادات واضحة خطوة بخطوة لتنفيذ ممارسات التكاثر هذه. نتيجة لذلك ، يؤدي التباين المنخفض داخل المجموعة الذي تتأثر بتحسينات البروتوكول هذه إلى تقليل أحجام العينات اللازمة لتحقيق القوة الإحصائية المطلوبة في الكشف عن الاختلافات بين المجموعات التجريبية. تم تصميم هذا البروتوكول المحسن للباحثين الذين يهدفون إلى تكييف نموذج AOM / DSS مع نماذج الفئران والتصميمات التجريبية الخاصة بهم ، بغض النظر عن السلالة أو الخلفية الجنسية ، لدراسة آليات تكوين الأورام أو الأهداف العلاجية أو استكشاف ديناميكيات الخلايا المناعية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يجب تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا لبروتوكول معتمد مؤسسيا لضمان التعامل الإنساني والالتزام بالمعايير الأخلاقية. تمت الموافقة على الدراسات الموضحة هنا من قبل لجنة رعاية المؤسسي بجامعة فلوريدا (IACUC).

1. تحسين جرعات DSS

  1. احصل على الفئران من العمر والسلالة والمصدر لاستخدامها في التجربة الرئيسية ، مع توزيع متساو للذكور والإناث. قم بتسمية كل ماوس عن طريق ثقب الأذن أو علامة الذيل أو أي طريقة أخرى معتمدة للتتبع الفردي. قياس وتسجيل وزن الجسم الأولي لكل.
    ملاحظة: يجب أن تكون ذكور الفئران في سكن مشترك قبل الفطام ويجب عدم إعادة توزيعها بين الأقفاص لتقليل القتال.
  2. في حالة استخدام الري التلقائي ، قبل أسبوع واحد من بدء التجربة ، قم بتبديل إلى زجاجات المياه وفي نفس الوقت سد فوهات القفص (أنابيب الشرب المعدنية في القفص) بسدادات معقمة.
    ملاحظة: تأكد من الموافقة على أي تغييرات في توصيل المياه ، مثل فوهات مياه الشرب الآلية المسدودة ، من قبل IACUC أو الهيئة التنظيمية المناسبة التي تشرف على الاستخدام الإنساني للحيوانات. قد تتطلب أقفاص فحوصات يومية لضمان الوصول دون انقطاع إلى مياه الشرب.
  3. تحضير محلول DSS عن طريق إذابة DSS في مياه الشرب المعقمة بتركيزات متفاوتة من 1.5٪ إلى 5٪ (وزن / حجم) ، باستخدام قضيب تقليب مغناطيسي ولوحة تقليب. انتظر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة حتى يذوب مسحوق DSS تماما في الماء. قم بإعداد ماء DSS طازجا كل أسبوع وقم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
  4. املأ أنبوبين مخروطيين سعة 50 مل بماء DSS عند كل تركيز (واحد للذكور والآخر للإناث) وقم بتوصيل فوهة شرب معقمة معقمة بإحكام لمنع التسرب.
  5. قم بإعطاء ماء DSS في كل تركيز للإناث والذكور من الفئران ، مع تلقي 3 فئران في كل قفص نفس التركيز. استخدم مياه الشرب المعقمة بدون DSS كعنصر تحكم سلبي. استبدل ماء DSS كل يومين.
  6. إدارة مياه DSS لمدة 7 أيام. سجل وزن جسم كل فأر يوميا.
  7. في اليوم 8 ، أعد جميع إلى مياه الشرب العادية.
  8. في اليوم الثامن ، قم بتقييم شدة الإسهال بناء على تناسق البراز باستخدام نظام تسجيل موحد كما هو موضح17 وسجل الدرجات. سجل "1" كحبيبات براز ناعمة ولكن لا تزال مكونة ، و "2" كحبيبات براز ناعمة جدا ، و "3" على أنها إسهال.
  9. في اليوم 8 ، اجمع 2-3 حبيبات براز طازجة وقم بتقييم وجود دم غافي (انظر جدول المواد). سجل وجود أو عدم وجود دم في العينة.
  10. تقييم النزيف المعوي بناء على مزيج من معيارين للتسجيل، تناسق البراز (0-3) ووجود دم في البراز (0-3)، للحصول على درجة إجمالية تتراوح من 0 إلى 6.
  11. من اليوم 9 إلى اليوم 12 ، سجل وزن جسم كل فأر يوميا وراقب عن كثب المعالجة ب DSS لفقدان وزن الجسم بشكل كبير والإسهال الشديد. القتل الرحيم على الفور للحيوانات التي تصل إلى نقاط النهاية الإنسانية أو تتجاوزها عن طريق اختناق ثاني أكسيد الكربون (CO2) أو أي طريقة مناسبة أخرى وفقا لبروتوكول استخدام المعتمد والمبادئ التوجيهية الأخلاقية المعمول بها.
  12. من اليوم 13 إلى اليوم 18 ، استمر في مراقبة وسجل وزن جسم كل فأر يوميا حتى يتعافى تماما إلى مستويات ما قبل التجربة.
  13. حدد التركيز الأمثل ل DSS ، حيث يؤدي ذلك إلى فقدان وزن الجسم بنسبة 20٪ تقريبا مصحوبا ببراز ناعم ولكنه لا يزال متكونا. قد تختلف الجرعة المثلى ل DSS بين الذكور والإناث ، وسلالات الفئران ، والأعمار ، والكثير من DSS ، والمرافق الحيوانية.

2. تحريض CAC

  1. اليوم 0-6: علاج AOM اليوم 7-28: الدورة الأولى من علاج DSS
    1. تحضير مخزون AOM: قم بإذابة مسحوق AOM في محلول ملحي معقم لتحقيق تركيز مخزون يبلغ 10 مجم / مل. قم بتصفية المحلول من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر ، ووزع 1 مل من الحصص في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل ، وقم بتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى عام واحد.
      ملاحظة: AOM مادة مسرطنة متطايرة ويجب التعامل معها بحذر تحت غطاء السلامة الحيوية مع معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) ، باتباع توصيات السلامة الخاصة بالشركة المصنعة. يجب التخلص من AOM وأي مواد ملوثة ب AOM وفقا لبروتوكولات التخلص من النفايات الكيميائية الخطرة الخاصة بالمؤسسة. تقع على عاتق المحقق مسؤولية تأمين الموافقات اللازمة على الصحة والسلامة البيئية في وقت مبكر.
    2. في حالة استخدام سقي الأقفاص الآلي ، قبل أسبوع واحد من بدء التجربة ، قم بحظر فوهة مياه الشرب الآلية وقم بتبديل إلى زجاجات المياه للتأقلم كما في الخطوة 1.2.
    3. في اليوم 0 ، قم بوزن وتسجيل وزن جسم كل فأر لحساب الكمية الإجمالية المطلوبة من AOM. ثم احسب الحجم الإجمالي ل AOM (1 مجم / مل تركيز العمل النهائي) بناء على وزن كل لتحقيق جرعة 10 مجم / كجم ، على سبيل المثال ، 200 ميكرولتر للفأر 20 جم.
    4. قم بإذابة العدد المطلوب من الحصص الجديدة البالغة 10 مجم / مل AOM على الثلج قبل كل استخدام. قم بتخفيف كل 1 مل من AOM مع 9 مل من المحلول الملحي المعقم لتحقيق تركيز عمل يبلغ 1 مجم / مل.
    5. يتم تطبيق AOM للفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق. قم بتنفيذ هذا الإجراء داخل خزانة السلامة الحيوية أثناء ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة مثل القفازات المزدوجة وقناع N95 للحصول على الحماية المثلى.
      تنبيه: تخلص من أي بقايا محلول AOM وفقا لمتطلبات التخلص من النفايات الكيميائية الخطرة.
    6. في اليوم 3 ، انقل المعالجة ب AOM إلى أقفاص نظيفة. ارتد معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند التعامل مع الأقفاص الملوثة ب AOM وغيرها من المواد للحماية.
      تنبيه: تخلص من فراش القفص المتسخ وأي طعام متبقي وفقا لإجراءات التخلص من النفايات الكيميائية الخطرة المعتمدة من المؤسسة.
      ملاحظة: يتم إفراز AOM ومستقلباته تماما لمدة 72 ساعة بعد الإعطاء18 ، وعند هذه النقطة يمكن التخلص من فراش القفص المتسخ.
    7. في اليوم 7 ، قم بإجراء تجانس ميكروبات الأمعاء لتقليل التباين من قفص إلى قفص. للقيام بذلك ، قم بأخذ عينات من 25٪ من الفراش من كل قفص ، واخلطها جيدا ، وأعد توزيعها مرة أخرى في كل قفص.
      ملاحظة: الامتناع عن تغيير الأقفاص خلال أسبوع علاج متلازمة الترصد التموين ولمدة خمسة أيام بعد ذلك. التنسيق مع خدمة تغيير أقفاص التربية في المنشأة ، حسب الضرورة.
    8. ابدأ تحريض التهاب القولون من خلال توفير DSS في مياه الشرب باستخدام أنابيب مخروطية سعة 50 مل مزودة بفوهات مناسبة. افحص الفئران يوميا للتأكد من أن لديها وصول غير مقيد إلى مياه DSS. استبدل ماء DSS كل يومين. سجل وزن جسم كل فأر يوميا.
    9. في اليوم 14 ، استبدل مياه DSS بزجاجات مياه الشرب العادية. استمر في مراقبة عن كثب بحثا عن الألم والضيق.
    10. في الأيام 14-19 ، قم بوزن كل فأر يوميا. القتل الرحيم للحيوانات التي تفقد أكثر من 25٪ من وزن جسمها ، أو إذا وصل إلى أي من نقاط النهاية الإنسانية الموضحة في بروتوكول رعاية واستخدامها المعتمد. بالإضافة إلى ذلك ، راقب وسجل أي حالات نزيف المستقيم.
  2. اليوم 7-28: الدورة الأولى من علاج DSS
    1. في اليوم 7 ، قم بإجراء تجانس ميكروبات الأمعاء لتقليل التباين من قفص إلى قفص. للقيام بذلك ، قم بأخذ عينات من 25٪ من الفراش من كل قفص ، واخلطها جيدا ، وأعد توزيعها مرة أخرى في كل قفص.
      ملاحظة: الامتناع عن تغيير الأقفاص خلال أسبوع علاج متلازمة الترصد التموين ولمدة خمسة أيام بعد ذلك. التنسيق مع خدمة تغيير أقفاص التربية في المنشأة ، حسب الضرورة.
    2. ابدأ تحريض التهاب القولون من خلال توفير DSS في مياه الشرب باستخدام أنابيب مخروطية سعة 50 مل مزودة بفوهات مناسبة. افحص الفئران يوميا للتأكد من أن لديها وصول غير مقيد إلى مياه DSS. استبدل ماء DSS كل يومين. سجل وزن جسم كل فأر يوميا.
    3. في اليوم 14 ، استبدل مياه DSS بزجاجات مياه الشرب العادية. استمر في مراقبة عن كثب بحثا عن الألم والضيق.
    4. في الأيام 14-19 ، قم بوزن كل فأر يوميا. القتل الرحيم للحيوانات التي تفقد أكثر من 25٪ من وزن جسمها ، أو إذا وصل إلى أي من نقاط النهاية الإنسانية الموضحة في بروتوكول رعاية واستخدامها المعتمد. بالإضافة إلى ذلك ، راقب وسجل أي حالات نزيف المستقيم.
  3. اليوم 29-49 : الدورة الثانية من علاج متخلل التموين التصحيري
    1. كرر تجانس الجراثيم مع إعطاء DSS ، باتباع نفس الإجراءات كما في الخطوات 2.2.1-2.2.4. اختياري: بعد الدورة الثانية و / أو الدورة الثالثة DSS ، قم بإجراء تنظير القولون كما هو موضحسابقا 19.
  4. اليوم 50-70: الدورة الثالثة من علاج DSS
    1. كرر تجانس الجراثيم مع إعطاء DSS ، باتباع نفس الإجراءات كما في الخطوات 2.2.1-2.2.4. نظرا لأن الفئران تميل إلى فقدان أكبر قدر من الوزن بعد ثلاثة أيام من الدورة الثالثة من DSS ، راقب عن كثب جميع بحثا عن فقدان الوزن المفرط للجسم أو لأي مؤشرات على نزيف المستقيم خلال هذه الفترة وتوفير طعام رطب للرعاية الداعمة إذا لزم الأمر.

3. تقييم شدة التهاب القولون وأمراض CAC الإجمالية

  1. في اليوم 70 ، اجمع 2-3 حبيبات براز طازجة من كل فأر لاختبار وجود دم غافي و / أو علامات التهاب مثل ليبوكالين -220 لتقييم شدة التهاب القولون. استخدم الكواشف / المجموعات المناسبة (انظر قائمة المواد والمعدات) واتبع تعليمات الشركة المصنعة لإجراء المقايسات ، الموضحة بإيجاز أدناه.
  2. لتحضير عينات البراز لتقييم مستويات علامة الالتهاب ليبوكالين -2 ، ضع حبيبات البراز الطازجة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. قم بإذابة الكريات في 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات المعقم (PBS) باستخدام خلاط دوامة حتى يتم الحصول على محلول موحد. الطرد المركزي المحلول عند 10,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. يمكن استخدام المادة الطافية على الفور مع الليبوكالين -2 ELISA أو تخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.
  3. قم بإجراء الماوس lipocalin-2 ELISA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للمجموعة. قم بإجراء تجارب تجريبية للتخفيف التسلسلي لتحديد التخفيف الأمثل لعينات البراز بالنسبة للمعايير.
    ملاحظة: من المتوقع أن تزيد مستويات Lipocalin-2 بمقدار 1000 ضعف على الأقل في الفئران المعالجة ب DSS مقارنة بحيوانات التحكم المعالجة بالماء20.
  4. تقييم شدة التهاب القولون باستخدام نظام تسجيل الإسهال17 كما هو موضح في الخطوات 1.8-1.10.
  5. في اليوم 70 ، قم بالقتل الرحيم للحيوانات عن طريق خنق ثاني أكسيد الكربون2 أو باستخدام أي طريقة إنسانية أخرى معتمدة.
  6. رش منطقة بطن كل بنسبة 70٪ من الإيثانول لتقليل التلوث خلال الخطوات اللاحقة.
  7. استخدم ملقطا جراحيا دقيقا لرفع الجلد والطبقة الصفاقية. قم بعمل شق أفقي بالمقص لفضح تجويف البطن.
  8. اسحب الأمعاء الدقيقة للخارج وحدد الأعور. ارفع الأعور والقولون برفق باستخدام الملقط. قم بتشريح القولون بعناية عن طريق قطع المساريق والأوعية الدموية المرتبطة به باستخدام المقص ، وتجنب ثقب القولون أو قطعه.
  9. قطع عظم الحوض والجلد المحيط بمنطقة المستقيم الشرجي لكشف القولون البعيد بالكامل. من المهم تشريح القولون بأكمله مع الحفاظ على الجزء البعيد سليما ، حيث تحدث معظم الأورام عادة في هذه المنطقة.
  10. ضع القولون المقطوع على شريط نظيف من ورق الترشيح ، وقم بتصويبه برفق.
  11. قم بقياس طول النقطتين بمسطرة وقم بتوثيقه بصورة. قم بتضمين المسطرة في الصورة للقياس.
  12. نظف بقع باير على الجزء الخارجي من القولون ، مع الحرص على عدم ثقب الأنسجة.
  13. اشطف القولون في PBS المعقم البارد.
  14. قم بتثبيت طرف ماصة دقيقة سعة 200 ميكرولتر (بدون فلتر) على حقنة سعة 3 مل باستخدام غشاء البارافين. استخدم هذا الإعداد لملء المحقنة ب PBS معقم ، وأدخل طرف الماصة في تجويف القولون ، واغسل محتويات القولون برفق 2-3 مرات ، مما يضمن الإزالة الكاملة لحبيبات البراز.
  15. قم بتمديد القولون برفق على شريط نظيف ومبلل مسبقا من ورق الترشيح. اقطع القولون طوليا وضعه بشكل مسطح على ورق الترشيح.
  16. تحديد الأورام الأكبر حجما ، والتي تظهر عادة على شكل فقاعة بارزة بارزة من جدار القولون ذات مظهر أحمر ملتهب.
  17. بالنسبة للأورام الأصغر حجما ، توخي الحذر الشديد أثناء التعرف عليها. استخدم حلقة بذر بكتيرية معقمة لفحص سطح القولون برفق بحثا عن أي مخالفات أو نتوءات. تأكد من أن أي نتوءات تم اكتشافها ليست بقايا الغدد الليمفاوية أو الأوعية الدموية الموجودة على الجزء الخارجي من جدار القولون.
  18. استخدم الفرجار الرقمي لقياس عرض وطول كل ورم.
  19. سجل عدد الأورام وحجم كل ورم وموقعه على خريطة القولون المطبوعة مسبقا.

4. تقييم الأنسجة

  1. استخدم زوجين من الملقط ذو الرؤوس الدقيقة لإمساك كلا الطرفين الجانبيين للقولون البعيد. قم بلف القولون من الطرف البعيد إلى الطرف القريب إلى شكل لفائف سويسرية كما هو موضح في مكان آخر21. تأكد من أن الطرف البعيد في وسط اللفة ، وأن الطرف القريب يشكل الطبقة الخارجية.
  2. قم بتأمين كل قولون ملفوف سويسرا باستخدام إبرة 27 / 2 جرام.
  3. ضع كل قولون ملفوف سويسري مؤمن في شريط مناديل مكتوب عليه بشكل مناسب.
  4. اغمر أشرطة الأنسجة التي تحتوي على القولون السويسري في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في PBS المعقم. اترك الأنسجة تبقى في المثبت لمدة 24 ساعة.
  5. بعد 24 ساعة ، انقل الأنسجة إلى 70٪ من الإيثانول. يمكن حفظ الأنسجة في 70٪ من الإيثانول عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر.
  6. يمكن استخدام Swiss-roll لفحوصات التشريح المرضي المتعددة ، بما في ذلك تلطيخ الهيماتوكسيلين والأيوزين التقليدي (H & E) ، والكيمياء المناعية ، والتألق المناعي.

5. حصاد الأنسجة لعزل البروتين والحمض النووي الريبي عن الأورام والقولون المحيط

  1. العمل على الثلج واستخدام الأنابيب والكواشف المبردة مسبقا للحفاظ على سلامة المادة البيولوجية.
  2. بعد تقييم الورم ، قم بتشريح الأورام وتجميعها في أنابيب مبردة مسبقا ومسماة مسبقا مع مخزن مؤقت مناسب (انظر أدناه) على الجليد. اعتمادا على التصميم التجريبي ، قم بتجميع جميع الأورام من نفس أو معالجتها بشكل فردي. إذا رغبت في ذلك ، اجمع بالمثل ~ 1 سم من أنسجة القولون المحيطة غير الورمية.
  3. عزل البروتين
    1. أضف 0.5 مل من حبات زجاجية مطحنة 800 ميكرومتر و 400 ميكرولتر من محلول التحلل (1٪ NP-40 في 150 ملي كلوريد الصوديوم مع 20 ملي مولار Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.5) و 1٪ كوكتيل مثبط البروتياز والفوسفاتيز في كل أنبوب تجانس للأنسجة ونقل أنسجة القولون / الورم إلى كل أنبوب.
    2. قم بتجانس أنسجة القولون / الورم باستخدام مجانس الأنسجة القائم على الخرز بسرعة 6 م / ث لمدة 30 ثانية ، كرر مرتين للتجانس الكامل.
      ملاحظة: ضع الأنابيب على الجليد بين الدورات لمنع ارتفاع درجة حرارة العينة من التجانس الميكانيكي.
    3. بعد التجانس ، قم بشفط 150 ميكرولتر من المحللة (المادة الطافية) وانقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف سعة 1.5 مل.
    4. قم بتدوير المحللة عند 10,000 جم عند 4 درجات مئوية لحبيبات أي مادة غير قابلة للذوبان. انقل المادة الطافية إلى أنبوب نظيف إذا رغبت في ذلك.
    5. تحديد تركيز البروتين الكلي عن طريق فحص حمض البيسنشونيك (BCA) أو أي طريقة أخرى مناسبة.
    6. إذا رغبت في ذلك ، اضبط تركيز البروتين الكلي إلى 4 مجم / مل لكل عينة بنفس المخزن المؤقت للتحلل.
    7. استخدم محللات البروتين على الفور لإجراء فحوصات المصب مثل النشاف المناعي أو تحليل السيتوكين ، أو تخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.
  4. تنقية الحمض النووي الريبي:
    1. بعد التشريح ، ضع القولون / الأورام في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل واغمرها في 200 ميكرولتر من كاشف الحفاظ على الحمض النووي الريبي المناسب.
      ملاحظة: نقطة الإيقاف المؤقت: يمكن تجميد أنسجة القولون / الورم الطازجة في النيتروجين السائل وتخزينها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية لمعالجتها لاحقا
    2. قم بإذابة القولون / أنسجة الورم على الجليد.
    3. نقل القولون / الورم إلى أنبوب تجانس الأنسجة يحتوي على 500 ميكرولتر من محلول التحلل المناسب المناسب لعزل الحمض النووي الريبي و 200 ميكرولتر من طحن الخرز الزجاجي.
    4. تجانس باستخدام مجانس الأنسجة القائم على الخرز بسرعة 6 م / ث لمدة 30 ثانية ثلاث مرات ، مع استراحة لمدة دقيقتين بين كل دورة.
      ملاحظة: انقل الأنبوب على الجليد بين الدورات لمنع تدهور الحمض النووي الريبي من ارتفاع درجة الحرارة أثناء التجانس الميكانيكي.
    5. انقل 300 ميكرولتر من المحللة إلى أنبوب جديد للطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل.
    6. عزل الحمض النووي الريبي الكلي باستخدام إجراء تنقية الحمض النووي الريبي المناسب حسب الضرورة. قياس تركيز الحمض النووي الريبي ونقاءه وجودته / سلامته حسب الاقتضاء للاستخدام النهائي.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجرينا تحسين جرعة DSS لظروفنا التجريبية. يجب إعادة معايرة جرعات DSS لكل منشأة حيوانية ، وسلالة الفأر ، وتصميم الدراسة ، والكثير من DSS. في هذه الدراسة ، تم إيواء الفئران C57BL / 6J في فيفاريوم محدد خال من مسببات الأمراض في أقفاص جيدة التهوية مع نظام غذائي للقوارض البروتين المشع بنسبة 18٪. يبدأ كل من الفئران من الذكور والإناث في إنقاص الوزن بدءا من اليوم 5 بعد وضعه على ماء DSS ، ويصل إلى أدنى وزن له بعد ثلاثة أيام من انسحاب DSS (الشكل 1 أ ، ج). في يوم أكبر فقدان للوزن ، أظهرت ذكور الفئران فقدانا للوزن بنسبة 15٪ تقريبا ، بينما أظهرت إناث الفئران فقدان الوزن بنسبة 20٪ (الشكل 1 ب ، د). بناء على هذه النتائج ، حددنا أن الجرعة المثلى لظروفنا التجريبية المحددة كانت 3.0٪ للإناث و 3.25٪ للذكور. تم تحديد جدول العلاج ل AOM / DSS في الشكل 2 أ ، مع حدوث تجانس الميكروبيوم في بداية كل دورة علاج DSS حتى تنتهي التجربة للتخفيف من تأثيرات القفص والتباين. تظهر الديناميكيات النموذجية لفقدان وزن وتعافيه طوال مدة التجربة في الشكل 2 ب. تتعافى تماما إلى وزن الجسم الأصلي في غضون أسبوعين بعد التوقف عن إعطاء متلازمة ترصد آجل الصيف. ينتج عن نموذج التهاب القولون DSS الذي تمت معايرته جيدا حبيبات براز ناعمة ولكن لا تزال متكونة بدلا من الإسهال (درجة تناسق البراز 1-2) ، مع الكشف العرضي عن الدم الخفي في البراز مما يدل على نزيف تحت الإكلينيكي وحالات قليلة من الدم المرئي في البراز (درجة وجود الدم 1-2) 17. لتقييم شدة التهاب القولون ، تم جمع عينات البراز لتحليل مستويات ليبوكالين -2 الواسمية الالتهابية. لم يتم الكشف عن وجود دم غامض في الفئران التي تتلقى مياه شرب منتظمة طوال التجربة ، على عكس المعالجة ب DSS (الشكل 2 ج). باستمرار ، ارتفعت مستويات الليبوكالين -2 بمقدار 1,000 مرة تقريبا في الفئران المعالجة ب AOM / DSS مقارنة بعناصر التحكم في AOM / الماء فقط (الشكل 2 د).

في النهاية ، قمنا بتشريح القولون وعد الأورام باستخدام خريطة سجل الورم (الشكل 3 أ). ينتج عن التهاب القولون DSS طول القولون أقصر بكثير ، على عكس أدوات التحكم في AOM / الماء فقط (الشكل 3 ب). علاوة على ذلك ، تصاب المعالجة ب AOM / DSS بأورام القولون المرئية ، والتي يتشكل معظمها في النهاية البعيدة (الشكل 3 ج). كشف الفحص النسيجي لأقسام القولون الملطخة ب H & E عن تآكل كبير للخلايا الظهارية ، والتسلل المناعي ، والتقرح في الفئران AOM / DSS (الشكل 4 أ). يمكن قياس شدة أمراض القولون باستخدام أنظمة التسجيل المعمول بها ل CAC الفئران الناجم عن DSS ، بناء على أربع معايير (الشكل 4 ب): التسلل المناعي والوذمة (0-3) ، والتقرح (0-3) ، ومورفولوجيا ظهارة القولون (0-4) ، والأورام (0-4) 22،23،24. يتم عرض نتائج هذه التقييمات ، كما هو مطبق على أمثلة علم الأنسجة في الشكل 4 أ ، في الشكل 4 ج. تم تقييم التكاثر الظهاري للقولون من خلال التحليل الكيميائي المناعي باستخدام تلطيخ Ki67 ، مما يدل على أن علاج DSS يعزز تكاثر الخلايا الظهارية في القولون. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام أقسام القولون لتلوين الفلورسنت المناعي لعلامات مختلفة ، مثل علامة تكوين الأوعية الدموية CD31 (الشكل 4D ، E).

قمنا بتقييم تأثيرات تجانس الجراثيم على نقاط النهاية التجريبية مثل حجم التهاب القولون وفقدان وزن الجسم وعبء الورم التراكمي في كل. تم إيواء مجموعة واحدة من الفئران في أقفاص تعرضت لخلط وإعادة توزيع الفراش المتسخ في اليوم 0 لتحقيق تجانس الجراثيم ، جنبا إلى جنب مع التحكم في أقفاص حيث تم حذف هذا التلاعب. تلقت في كلتا المجموعتين 2.5٪ من مياه DSS لمدة 7 أيام. في حين أن متوسط مستويات العلامة الالتهابية ليبوكالين -2 في البراز لكل قفص في اليوم 8 لم يختلف اختلافا كبيرا بين المجموعات (اختبار ويلش t) ، فقد لاحظنا تباينا أقل بشكل ملحوظ بين نقاط البيانات في الأقفاص التي خضعت لتجانس الجراثيم (الشكل 5 أ ، اختبار ويلش F لمقارنة التباينات ، ص <0.0001). باستمرار ، بحلول اليوم 8 ، أظهرت جميع مدى مماثل من فقدان وزن الجسم مقارنة بخط الأساس في اليوم 0. ومع ذلك ، أظهرت الفئران في مجموعة تجانس الجراثيم تباينا أقل في فقدان وزن الجسم مقارنة بالمجموعة الضابطة (الشكل 5 ب). علاوة على ذلك ، في بروتوكول تحريض CAC لمدة 10 أسابيع (الشكل 2 أ) مع (تجانس الجراثيم) وبدون خلط فراش القفص (التحكم) قبل كل دورة DSS ، كان عبء الورم التراكمي لكل فأر أكثر اتساقا في مجموعة الكائنات الحية الدقيقة المتجانسة مقارنة بالضوابط التي كانت أكثر تغيرا بشكل ملحوظ (الشكل 5 ج). بشكل عام ، تقدم هذه البيانات دليلا قويا على أن تجانس الكائنات الحية الدقيقة يحسن بقوة متانة وقابلية استنساخ نموذج AOM / DSS.

figure-results-1
الشكل 1. معايرة الجرعة DSS في ذكور وإناث الفئران. (A-D) النسبة المئوية لتغير وزن الجسم مقارنة باليوم 0 في الفئران البرية C57BL / 6J البالغة من العمر 14 أسبوعا (A ، B) والإناث (C ، D) C57BL / 6J التي تم الحفاظ عليها على الماء بتركيزات DSS المشار إليها (1٪ ، 1.5٪ ، 2٪ ، 2.5٪ ، 3٪ للذكور و 2٪ ، 3٪ ، 4٪ للإناث). (أ ، ج) تم إعطاء DSS لمدة 7 أيام وتمت مراقبتها لفقدان وزن الجسم لمدة تصل إلى 12 يوما. يظهر B و D فقدان وزن الجسم لذكور الفئران في اليوم 8 (B) وإناث الفئران في اليوم 9 (D) من بداية علاج DSS. يتم تقديم البيانات كمتوسطات ± SEM. n = 3 في A & B ، n = 4 في C & D. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2. الجدول الزمني والمراقبة الناجم عن AOM / DSS. (أ) الجدول الزمني التجريبي ل CAC الناجم عن AOM / DSS. (ب) وزن الجسم بالنسبة لليوم 0 في الفئران التجريبية المعالجة ب AOM / DSS (أحمر) أو التحكم (AOM فقط ، بدون DSS ، أسود) أنثى الفئران من النوع البري C57BL / 6J. تلقت جميع جرعة واحدة من AOM (10 مجم / كجم) وتم توزيعها عشوائيا إما على ثلاث دورات من 3٪ DSS (أحمر) أو مياه شرب عادية (تحكم ، أسود) لمدة 70 يوما. يتم تقديم البيانات كمتوسطات ± SEM ، n = 2 و 11. (ج) اختبار إناث الإناث المنقولة في البراز من التحكم (AOM فقط) أو المعالجة ب DSS (AOM و 1.5٪ DSS). (د) مستويات البراز ليبوكالين -2 من 6 عناصر تحكم (AOM فقط ، أسود) أو 35 معالجة (AOM و 1.5٪ DSS ، أحمر) إناث الفئران في اليوم 70. يتم تقديم البيانات كمتوسطات ± التسويق عبر محرك البحث. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3. التقييم العياني للقولون. (أ) مثال على خريطة سجل الورم. (ب) صور القولون التمثيلية من الفئران الشاهدة (AOM فقط) أو إناث الفئران المعالجة ب DSS (AOM و 1.5٪ DSS) في اليوم 70. يشير تقصير طول القولون إلى زيادة الالتهاب في المعالجة ب DSS. شريط - 5 مم ؛ ، ص = 0.002 ، اختبار مجموع رتبة مان ويتني ؛ ن = 12 و 30. (ج) صور مرضية إجمالية تمثيلية للقولون المصابة بأورام في اليوم 70 من إناث الفئران التي عولجت ب AOM و 3٪ DSS (الأورام محاطة بدائرة وتمييزها بمثلثات سوداء). شريط - 5 مم. وسيلة الشرح - عرض موسع لمناطق القولون البعيدة مع الأورام ؛ شريط - 1 مم). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4. تقييم أنسجة CAC. (أ) الأقسام الممثلة الملطخة ب H & E من القولون السويسري المدرفلة من الفئران المعالجة ب AOM / DSS والتحكم (AOM فقط) في اليوم 70 مع تضخم المناطق البعيدة من 3 معروضة على اليمين. تظهر النقطتين الضابطة تنظيم تشبو القولون السليم. تتميز القولون من الفئران المعالجة ب AOM / DSS بسماكة تحت المخاطية (رؤوس الأسهم) ، والتسلل المناعي (الأسهم) ، واضطراب أو فقدان بنية القبو (النجمة) ، وتآكل الطبقة الظهارية ، وتضخم الظهارة أو ظهارة خلل التنسج (دوائر) مع الورم الحميد وتكوين السرطان الغدي (محدد بخط منقط). شريط - 500 ميكرومتر. (ب) نظام تسجيل علم الأنسجة المرضية المستخدم لتقييم شدة النمط الظاهري ل CAC. (ج) مثال على درجات أنسجة القولون من الفئران المعالجة AOM فقط أو AOM / DSS الموضحة في A. (د) تلطيخ الكيمياء المناعية التمثيلية لعلامة تكاثر Ki67 في القولون السويسري المدرفلة من المعالجة ب AOM بعد 1 أو 3 دورات من DSS. تتكاثر الخلايا الإيجابية Ki67 (البنية) في الجزء السفلي من الخبايا القولونية ولكنها تنتشر لأعلى وتغزو داخل الخبايا مع بدء CAC وعلم أمراض أكثر تقدما. شريط - 100 ميكرومتر (E). تلطيخ الفلورسنت المناعي التمثيلي لتقييم الأوعية الدموية بناء على علامة البطانية CD31 (حمراء) ومضادة ل DAPI لتصور النوى (الزرقاء) في أقسام القولون من الفئران المعالجة ب AOM / DSS. شريط - 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5. يقلل تجانس الجراثيم من التباين في التهاب القولون وعبء ورم CAC. (أ) متوسط مستويات البراز ليبوكالين -2 في الفئران التي عولجت ب 2.5٪ DSS في اليوم 8. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار ويلش t لمقارنة متوسط مستويات ليبوكالين 2 في البراز بين المجموعتين (p = 0.137 ، n = 6 و 12 قفصا). بالإضافة إلى ذلك ، تم إجراء اختبار F على التباينات ، مما أسفر عن قيمة p قدرها 0.0001 ، مما يشير إلى اختلافات كبيرة في التباين بين المجموعتين. (ب) متوسط فقدان وزن الجسم في المعالجة ب AOM / DSS التي تتلقى ماء DSS في اليوم 8. في حين أن متوسط فقدان وزن الجسم بين المجموعتين لا يختلف اختلافا كبيرا (اختبار ويلش t ، ص = 0.194 ، ن = 6 و 12) ، فإن التباين داخل المجموعات يختلف اختلافا كبيرا (اختبار F ، ص = 0.027). (ج) عبء الورم لكل فأر بعد 10 أسابيع من علاج AOM / DSS. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار ويلش t لتقييم الاختلافات في متوسط عبء الورم بين المجموعات (p = 0.211 ، n = 8 & 18) واختبار F لتقييم الفرق بين التباينات (p = 0.013). (أ-ج) تصور مخططات الكمان الأزرق المجموعة التي خضعت لتجانس الجراثيم ، بينما تمثل قطع الكمان الأخضر المجموعة الضابطة (بدون تجانس الجراثيم) ، ns - ليست مهمة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تقديم بروتوكول AOM / DSS لأول مرة في عام 1996 بواسطة Okayasu et al.25 ومنذ ذلك الحين تم الاعتراف به كنموذج ممتاز لمحاكاة بدء وتطور سرطان القولون بأمانة من الأنسجة الطبيعية إلى التغيرات الورمية الغدية والسرطان في النهاية ، كما أوضح سوزوكي وآخرون في عام 200626 ، خاصة في سياق التهاب القولون. قيمت الدراسات اللاحقة تأثيرات AOM و AOM / DSS عبر سلالات الفئران المختلفة ، بالإضافة إلى تأثير فترات العلاج المتفاوتة على النمط الظاهري للورم والاختراق26،27،28. في عام 2018 ، نشر كريستوفر ويليامز ومجموعته بروتوكولامحدثا 29 وضع أساسا حاسما لتطوير هذه المنهجية. أثبتت التطورات الحديثة أيضا فائدة نموذج AOM / DSS لدراسات المناعة المخاطية من خلال دمج طرق عزل الارتشاح المناعي المعوي والتنميط المناعي عن طريق قياس التدفقالخلوي 30.

تتمثل إحدى نقاط القوة الرئيسية لبروتوكول AOM / DSS في سهولة التكيف مع أي سلالة من الفئران تقريبا ، مما يؤدي إلى التحقيق في تأثيرات الخلفيات الجينية المختلفة. وهكذا ، سوزوكي وآخرون قارن القابلية لسرطان القولون الناجم عن AOM / DSS في أربع سلالات مختلفة من الفئران باستخدام اختراق الورم الحميد في القولون كقراءة ، مع النتائج التالية: BALB / c > C57BL / 6N > DBA / 2N = C3H / HeN26. وجدت دراسات إضافية أن الفئران FVB / N تصاب بأورام القولون بسهولة أكبر بعد علاج AOM المتكرر مقارنة بسلالات C57BL / 6J و 129 / SvJ27. والجدير بالذكر أنه تم الإبلاغ عن تطور سرطان غدي في القولون جيد التمايز مع اختراق يقارب 100٪ في الفئران FVB / N في بروتوكول تحريض AOM / DSS CAC لمدة 10 أسابيع31. تشير هذه النتائج مجتمعة إلى أن سلالات الفئران المختلفة قد لا تكون عرضة بنفس القدر لعلاج AOM / DSS ، مما يساهم في الاختلافات في تكوين الأورام ويسلط الضوء على الحاجة إلى مجموعة متسقة من المبادئ التوجيهية لتنسيق بروتوكول AOM / DSS وقابلية التكاثر عبر سلالات الفئران ومرافق الإسكان والمتغيرات الأخرى. من بين هؤلاء ، يعيق التباين الكبير في ميكروبيوم الأمعاء قابلية تكرار الدراسات التي تركز على الالتهاب واختراقالورم 9،10. على وجه التحديد ، يمكن أن يكون لتكوين ميكروبيوم الأمعاء ، بما في ذلك أنواع Duncaniella muricolitica و Alistipes okayasuensis ، تأثير كبير على شدة التهاب القولونDSS 13. سلطت دراسة أخرى الضوء على أهمية تكوين الجراثيم في تحريض CAC من خلال إثبات أن الفئران التي تعاني من نقص NLRP3 أظهرت نمطا ظاهريا لالتهاب القولون المتفاقم الذي يتميز بزيادة وجود شعب البكتيريا Bacteroidetes (على وجه التحديد Prevotellaceae) و TM710.

على الرغم من شعبية الطريقة ، إلا أن بروتوكولات AOM / DSS الحالية لم تعالج المشكلة المهمة المتمثلة في التباين العالي الذي لوحظ عبر داخل المجموعاتالتجريبية 32. لمواجهة هذا التحدي، قدمنا مجموعة من التوصيات لتحسين البروتوكول ومواءمته من خلال تنفيذ معايرة DSS (مع مراعاة جنس) وتجانس الجراثيم. يهدف نهجنا إلى تقليل التباين وتعزيز قابلية استنساخ نموذج AOM / DSS عبر السلالات الحيوانية والتصاميم التجريبية ونقاط النهاية. على الرغم من أننا لا نستطيع تقديم توصيات محددة فيما يتعلق بأحجام العينات، إلا أن عدد التكرارات التجريبية سيسترشد بتصميم الدراسة المحدد وأحجام التأثير المتوقعة لكل تجربة. يتطلب التباين المنخفض داخل المجموعة الذي تحققه هذه التحسينات عددا أقل من في كل حالة لتحقيق نفس القوة الإحصائية في اكتشاف هذه الاختلافات. نتوقع أن تؤدي هذه التحسينات إلى تعزيز الاستخدام الأخلاقي للحيوانات ، والإشراف المسؤول على أموال الأبحاث ، وتقليل العمالة ، مما يؤدي إلى زيادة الكفاءة.

نموذج AOM / DSS له قيمة انتقالية كبيرة في دراسة سرطان القولون والمستقيم المرتبط بالتهاب القولون البشري. نظرا لتحديات نمذجة سرطان الخلايا السرطانية البشرية بسبب مسبراته المعقدة ، من المهم التأكيد على أنه على الرغم من أن نموذج AOM / DSS قد يوفر بعض الأفكار حول التسبب في سرطان الخلايا السرطانية المتقطع ، إلا أنه الأنسب لدراسات الأورام الخبيثة المرتبطة بالالتهاب. علاوة على ذلك ، فإن السرطان الناجم عن AOM / DSS لديه معدل منخفض للورم الخبيث33،34 ، وبالتالي فهو غير مناسب لدراسة الانتشار النقيلي. على الرغم من هذه القيود ، فإن نموذج AOM / DSS شديد الاختراق وموثوق به ، ويوضح علم الأنسجة المرضي ذي الصلة بالإنسان ، ويحاكي بدقة تطور المرض من الالتهاب إلى خلل التنسج إلى السرطان الغدي ، كل ذلك مع الحفاظ على فعاليته من حيث التكلفة. في هذا البروتوكول ، نقدم توصيات لتوليد نتائج قابلة للتكرار وتقليل العوامل المربكة بناء على سير العمل الحالي8،35.

يعد تحديد الجرعة المثلى ل DSS من خلال التجارب التجريبية للاستجابة للجرعة ، مع مراعاة جنس كمتغير بيولوجي16،36،37 ، الخطوة الأولى الحاسمة نحو إنشاء بروتوكول AOM / DSS قوي (الشكل 1). وجدنا أن العلاج ب 3٪ DSS لمدة 7 أيام أدى إلى انخفاض أكثر أهمية في وزن الجسم لدى الإناث (~ 20٪) مقارنة بالذكور (~ 15٪) (الشكل 1 ب ، د). ومع ذلك ، قد تكون ذكور الفئران أكثر أو أقل أو بنفس القدر من الحساسية تجاه DSS مقارنة بالإناث. قد يعزى ذلك إلى سلالات الفئران المختلفة والاختلافات في تكوين ميكروبيوم الأمعاء عبر المرافق الحيوانية ، مما يستلزم إعادة تعديل تركيز DSS المصمم خصيصا لكل مجموعة محددة من التجارب. التركيز الأمثل ل DSS هو مقايضة بين تعظيم التهاب القولون وتحريض الورم دون تجاوز السمية المسموح بها. من خلال تجربتنا ، من المرجح أن يتحقق هذا التوازن بجرعات DSS مما يؤدي إلى فقدان وزن الجسم بنسبة 20٪ تقريبا بعد الدورة الأولى. تميل إلى فقدان وزن أقل في الدورة الثانية من العلاج ، ولكن لوحظ انخفاض أكبر في وزن الجسم بشكل عام في الدورة الثالثة من DSS ، ربما بسبب تكوين الورم في القولون. لذلك ، يمكن اعتماد فقدان وزن الجسم بنسبة 25٪ كنقطة نهاية إنسانية لبروتوكولات استخدام المؤسسية. علاوة على ذلك ، ينتج عن التهاب القولون DSS الذي تمت معايرته جيدا حبيبات براز ناعمة ولكن لا تزال متكونة بدلا من الإسهال واختبار الدموي الإيجابي في بعض الأحيان ، ولكن حالات قليلة من آثار الدم المرئية في البراز ، حيث من المتوقع أن تتعافى تماما في غضون أسبوعين بعد التوقف عن إعطاء DSS.

DSS هو بوليمر بوزن جزيئي يتراوح من 36,000 إلى 50,000 Da. نظرا للتباين من الكثير إلى الدفعة في تصنيع DSS ، من الضروري إجراء تجارب إعادة معايرة جرعة DSS لكل دفعة جديدة من المنتج. للحفاظ على الاتساق ، من العملي تقدير المبلغ الإجمالي ل DSS المطلوب للدراسة بأكملها ليتم شراؤها من نفس القطعة. علاوة على ذلك ، يصف هذا البروتوكول أيضا خطوات توحيد تكوين الجراثيم عبر المجموعة التجريبية بأكملها من الفئران أثناء تحريض CAC ، وبالتالي التخفيف من تأثيرات القفص المحتملة لتقليل التباين. كإجراء احترازي إضافي لتقليل تأثيرات الأقفاص ، يوصى بإيواء من مجموعات تجريبية مختلفة كلما أمكن ذلك. اعتمادا على الأهداف التجريبية المحددة وسياسات الاستخدام الأخلاقي للحيوانات ، يجب أن تنعكس هذه الاعتبارات في التجارب التجريبية. قد يعجل انجراف الجراثيم أيضا عن طريق تغيير الفراش في قفص مبلل مع تسريب زجاجات الشرب. من الأفضل الامتناع عن تغيير الأقفاص أثناء تسليم مفاجآت DSS ولمدة خمسة أيام بعد ذلك. يقلل استخدام أنابيب سعة 50 مل لإعطاء المياه DSS من خطر التسرب ويقلل من نفايات DSS. قد تتطلب هذه الاعتبارات اللوجستية تعاونا وثيقا بين موظفي البحث وفنيي رعاية الذين يقومون بتغيير الأقفاص وخدمات التربية.

في هذا البروتوكول ، نقدم أيضا سير عمل أساسيا لحصاد الأنسجة والخلايا ، بالإضافة إلى جمع البيانات. يتضمن ذلك اختبار وجود دم غامض (الشكل 2 ج) ورسم خرائط للأورام (الشكل 3 أ). نموذج AOM / DSS مناسب للفئران ذات الكفاءة المناعية ، مما يجعله نظاما مثاليا لاستكشاف البيئة المكروية المناعية للورم بسبب الجهاز المناعيالسليم تماما 38،39 ، على عكس مناهج الطعم الغريب. والجدير بالذكر أنه قابل للاضطراب التجريبي للجهاز المناعي أو المكونات اللحمية ، سواء من خلال نظام Cre-Lox الجيني للضربات القاضية / الخروج من الجينات الخاصة بنوع الخلية أو أشرطة المراسل ، أو نقش أو استنفاد مجموعات خلايا معينة. على سبيل المثال ، من خلال الجمع بين نموذج AOM / DSS مع زرع نخاع العظم ، قمنا سابقا بالتحقيق في كيفية تعديل الطفرات في نظام المكونة للدم شدة CAC والعبء40. للمساعدة في مثل هذه الدراسات ، هناك طرق منشورة ممتازة لعزل الكريات البيض القابلة للحياة التي تتسلل إلى الورم مناسبة لمزيد من التحليلات ، مثل التنميط المناعي ، والمقايسات الوظيفية ، والخلايا المتعددة أحاديةالخلية 41. أخيرا ، نظرا للاختراق العالي والكمون المتسق ، فإن نموذج AOM / DSS مناسب للدراسات العلاجية قبل السريرية باستخدام عبء الورم الكلي كقراءة أولية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا العمل جزئيا من خلال جوائز المعاهد الوطنية للصحة R01 DK121831 (OAG) و R01 AI067846 (DA). كما تم دعم OAG من قبل مؤسسة Edward P Evans ومؤسسة Oxnard Family Foundation. DA مدعومة بجائزة جمعية الاستحقاق. UFHCC هو مركز سرطان معين من قبل المعهد الوطني للسرطان (P30 CA247796).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مسحوق أزوكسي ميثانسيجما ألدريتشCAS 25843-45-2 ، Cat # A4586مادة مسرطنة للحث على أورام القولون جهاز
الطرد المركزي الدقيق BenchtopNA& nbsp ؛ NAلإعداد العينة 
C57BL / 6J الفئرانجاكسون مختبر000664سلالة والعمر حسب الاقتضاء لكل دراسة محددة
أنابيب مخروطية ، 50 ملفيشر14955239لإدارة DSS ماء
ديكستران كبريتات الصوديوم ملح الصوديوم ، ميغاواط كاليفورنيا 40،000كايمان كيماويات   ؛23250للحث على انتفاخ القولون 
الإيثانول ، 70٪فيشر   ؛43655223لتعقيم أسطح العمل وأدوات التشريح
طحن الخرز الزجاجي ، 800 وميكرو ؛ m VWR12621-148لتسهيل تجانس أنسجة القولون / الورم
HemoCue America   ؛ بيكمان كولتر Hemoccult ICT Immunochemical Immunochemical Bracalt Occult Blood THemoCue America 395065Aكتالوج رقم 23280010للكشف عن الدم الخفي في البراز
حقنة الأنسولين 27GX5 / 8 1CC & nbsp ؛BD 3294-12لحقن
AOM حاصرات LixitNANA لمنع توصيل المياه آليا إلى أقفاص الفئران ، إن وجدت (مقدمة من منشأة ، معقم ) & nbsp ؛
شريط التحريك المغناطيسي ولوحة التحريك   ؛NANA لحل DSS 
خالط حبة Microtube ، BeadBlaster 24   ؛المعيارD2400لتجانس القولون / الورم
فأر Lipocalin-2 / NGAL DuoSet ELISAR & كتالوج أنظمة Dرقم DY1857للكشف عن الليبوكالين -2 من محلول NP-40 للعينات البرازية
، 10٪Thermo Fisher Scientific85124لتحلل الورم / أنسجة القولون
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher ScientificA65453لتحديد تركيز البروتين في محللات الأنسجة الكلية ، أو أي طريقة أخرى مناسبة
كوكتيل مثبط للبروتاز والفوسفات   ؛فيشرPI78440لإعداد عينات لتحليل السيتوكينات / البروتينات
RLTplus bufferQiagen1053393لعزل الحمض النووي الريبي ، أو أي طريقة أخرى مناسبة لعزل الحمض
النووي الريبي RNAlaterThermo Fisher ScientificAM7021للحفاظ على عينات الأنسجة قبل عزل الحمض النووي الريبي
RNeasy Microprep kit   ؛QIAGEN74004لعزل الحمض النووي الريبي ، أو طريقة أخرى لعزل وتنقية الحمض النووي الريبي حسب الاقتضاء
فوهة زجاجة ماء القوارض (30 مم)نوع الرؤيةEلإدارة الماء أو محلول DSS
مقص وملقط معقمNANAلإبر حقنة تشريح
الأنسجة ، بطول 27 جم × 1/2 بوصة (قصير)BD & nbsp ؛305109لتثبيت أنسجة القولون السويسري-رول  
المحاقن ، قفل لور ، 3 ملBD & nbsp ؛309657لتنظيف القولون قبل التشريح والتدريج
TapeStationAgilentلتركيز الحمض النووي الريبي وتقييم الجودة / السلامة
Teklad 2918Evigo BioproductsT.2918M.15النظام الغذائي القياسي للقوارض ، 18٪ بروتين ،
كاسيت الأنسجةVWR# 87002-472للحفاظ على العينة لتضمين
ميزان المختبر التحميل العلوي ، 0-220 جمNANAلوزن
Whatman Blotting PaperVWR InternationalCat # 28298-020لتنظيم القولون التشريح لعلم الأمراض الإجمالي وعد الأورام
Kit المشع

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morgan, E., et al. Global burden of colorectal cancer in 2020 and 2040: Incidence and mortality estimates from globocan. Gut. 72 (2), 338-344 (2023).
  2. Siegel, R. L., Wagle, N. S., Cercek, A., Smith, R. A., Jemal, A. Colorectal cancer statistics 2023. CA Cancer J Clin. 73 (3), 233-254 (2023).
  3. Lu, C., et al. Survival outcomes and clinicopathological features in inflammatory bowel disease-associated colorectal cancer: A systematic review and meta-analysis. Ann Surg. 276 (5), e319-e330 (2022).
  4. Porter, R. J., Arends, M. J., Churchhouse, A. M. D., Din, S. Inflammatory bowel disease-associated colorectal cancer: Translational risks from mechanisms to medicines. J Crohns Colitis. 15 (12), 2131-2141 (2021).
  5. Pan, Q., et al. Genomic variants in the mouse model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate improperly mimic human colorectal cancer. Sci Rep. 7 (1), 25(2017).
  6. Johnson, R. L., Fleet, J. C. Animal models of colorectal cancer. Cancer Metastasis Rev. 32 (1-2), 39-61 (2013).
  7. De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10, 9(2011).
  8. Thaker, A. I., Shaker, A., Rao, M. S., Ciorba, M. A. Modeling colitis-associated cancer with azoxymethane (aom) and dextran sulfate sodium (dss). J Vis Exp. (67), e4100(2012).
  9. Chen, Y., Zhang, P., Chen, W., Chen, G. Ferroptosis mediated DSS-induced ulcerative colitis associated with Nrf2/Ho-1 signaling pathway. Immunol Lett. 225, 9-15 (2020).
  10. Elinav, E., et al. Nlrp6 inflammasome regulates colonic microbial ecology and risk for colitis. Cell. 145 (5), 745-757 (2011).
  11. Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274 (3), G544-G551 (1998).
  12. Bleich, A., Fox, J. G. The mammalian microbiome and its importance in laboratory animal research. ILAR J. 56 (2), 153-158 (2015).
  13. Forster, S. C., et al. Identification of gut microbial species linked with disease variability in a widely used mouse model of colitis. Nat Microbiol. 7 (4), 590-599 (2022).
  14. Mccafferty, J., et al. Stochastic changes over time and not founder effects drive cage effects in microbial community assembly in a mouse model. ISME J. 7 (11), 2116-2125 (2013).
  15. Wagnerova, A., et al. Sex differences in the effect of resveratrol on dss-induced colitis in mice. Gastroenterol Res Pract. 2017, 8051870(2017).
  16. Son, H. J., et al. Effect of estradiol in an azoxymethane/dextran sulfate sodium-treated mouse model of colorectal cancer: Implication for sex difference in colorectal cancer development. Cancer Res Treat. 51 (2), 632-648 (2019).
  17. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).
  18. Fiala, E. S. Investigations into the metabolism and mode of action of the colon carcinogens 1,2-dimethylhydrazine and azoxymethane. Cancer. 40 (5 Suppl), 2436-2445 (1977).
  19. Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nat Protoc. 1 (6), 2900-2904 (2006).
  20. Chassaing, B., et al. Fecal lipocalin 2, a sensitive and broadly dynamic non-invasive biomarker for intestinal inflammation. PLoS One. 7 (9), e44328(2012).
  21. Dooley, S. A., et al. Optimized protocol for intestinal swiss rolls and immunofluorescent staining of paraffin embedded tissue. J Vis Exp. (209), e66977(2024).
  22. Cooper, H. S., Murthy, S. N., Shah, R. S., Sedergran, D. J. Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis. Lab Invest. 69 (2), 238-249 (1993).
  23. Arthur, J. C., et al. Intestinal inflammation targets cancer-inducing activity of the microbiota. Science. 338 (6103), 120-123 (2012).
  24. Karrasch, T., Kim, J. S., Muhlbauer, M., Magness, S. T., Jobin, C. Gnotobiotic IL-10-/-;NF-Kappa B(egfp) mice reveal the critical role of TLR/NF-Kappa B signaling in commensal bacteria-induced colitis. J Immunol. 178 (10), 6522-6532 (2007).
  25. Okayasu, I., Ohkusa, T., Kajiura, K., Kanno, J., Sakamoto, S. Promotion of colorectal neoplasia in experimental murine ulcerative colitis. Gut. 39 (1), 87-92 (1996).
  26. Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Nakagama, H., Tanaka, T. Strain differences in the susceptibility to azoxymethane and dextran sodium sulfate-induced colon carcinogenesis in mice. Carcinogenesis. 27 (1), 162-169 (2006).
  27. Nambiar, P. R., et al. Preliminary analysis of azoxymethane induced colon tumors in inbred mice commonly used as transgenic/knockout progenitors. Int J Oncol. 22 (1), 145-150 (2003).
  28. Arnesen, H., et al. Induction of colorectal carcinogenesis in the C57BL/6J and a/j mouse strains with a reduced dss dose in the aom/dss model. Lab Anim Res. 37 (1), 19(2021).
  29. Parang, B., Barrett, C. W., Williams, C. S. AOM/DSS model of colitis-associated cancer. Methods Mol Biol. 1422, 297-307 (2016).
  30. Eich, C., Vogt, J. F., Langst, V., Clausen, B. E., Hovelmeyer, N. Isolation and high-dimensional flow cytometric analysis of tumor-infiltrating leukocytes in a mouse model of colorectal cancer. Front Immunol. 15, 1295863(2024).
  31. Barderas, R., et al. Sporadic colon cancer murine models demonstrate the value of autoantibody detection for preclinical cancer diagnosis. Sci Rep. 3, 2938(2013).
  32. Dzhalilova, D., Zolotova, N., Fokichev, N., Makarova, O. Murine models of colorectal cancer: The azoxymethane (AOM)/dextran sulfate sodium (DSS) model of colitis-associated cancer. PeerJ. 11, e16159(2023).
  33. Rosenberg, D. W., Giardina, C., Tanaka, T. Mouse models for the study of colon carcinogenesis. Carcinogenesis. 30 (2), 183-196 (2009).
  34. Pothuraju, R., et al. Colorectal cancer murine models: Initiation to metastasis. Cancer Lett. 587, 216704(2024).
  35. Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nat Protoc. 2 (8), 1998-2004 (2007).
  36. Lee, S. M., et al. The effect of sex on the azoxymethane/dextran sulfate sodium-treated mice model of colon cancer. J Cancer Prev. 21 (4), 271-278 (2016).
  37. Jang, S., Han, H., Oh, Y., Kim, Y. Sex differences in inflammation correlated with estrogen and estrogen receptor-beta levels in azoxymethane/dextran sodium sulfate-induced colitis-associated colorectal cancer mice. Heliyon. 10 (6), e28121(2024).
  38. Xin, B., et al. Enhancing the therapeutic efficacy of programmed death ligand 1 antibody for metastasized liver cancer by overcoming hepatic immunotolerance in mice. Hepatology. 76 (3), 630-645 (2022).
  39. Rivera, M., et al. Patient-derived xenograft (pdx) models of colorectal carcinoma (crc) as a platform for chemosensitivity and biomarker analysis in personalized medicine. Neoplasia. 23 (1), 21-35 (2021).
  40. Feng, Y., et al. Hematopoietic-specific heterozygous loss of dnmt3a exacerbates colitis-associated colon cancer. J Exp Med. 220 (11), (2023).
  41. Mcmanus, D., Novaira, H. J., Hamers, A. aJ., Pillai, A. B. Isolation of lamina propria mononuclear cells from murine colon using collagenase e. J Vis Exp. (151), e59821(2019).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

DSS DSS C57BL 6J
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة