يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان من أورام الثدي في الفئران كأدوات للدراسات الجزيئية والحسابية

1.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68364

⸱

يوليو 3, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Human Technopole, 3Department of Science and Technological Innovation, University of Piemonte Orientale

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يحدد هذا البروتوكول طرق استزراع ومعالجة وتحليل CAFs للفئران ، بما في ذلك المقايسات الوظيفية في المختبر / في الجسم الحي ، والنسخ ، والتحليل الحسابي. علاوة على ذلك ، فإنه يصف نظاما أساسيا قائما على الويب تم تطويره لتحليل النسخ المتاحة للجمهور لالتقاط الليزر للمكونات اللحمية والظهارية الدقيقة من مجموعة من أورام سرطان الثدي البشرية.

الملخص

أكدت مجموعة مقنعة من الأبحاث الدور الحاسم للبيئة المكروية للورم (TME) في نمو وعدوانية سرطان الثدي (BC). تؤثر الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAF) ، وهي المكون الخلوي السائد في TME ، بشكل كبير على سلوكها من خلال الحديث المتبادل المعقد مع السرطان والخلايا اللحمية الأخرى استجابة لإشارات التنشيط المشتقة من الورم. تستخدم نماذج الفئران على نطاق واسع للتحقيق في الآليات الكامنة وراء دور CAF في تطور BC ، لأنها تسمح بتقييم TME الداخلي وتقييم مشاركة الجهاز المناعي باستخدام دراسات الطعم الغريب المتزابق. هنا ، نقدم مجموعة من الطرق لزراعة CAFs المشتقة من BC ، ومعالجة التعبير الجيني ، وتقييم وظائفها المؤيدة للأورام باستخدام كل من الأساليب في المختبر وفي الجسم الحي . نصف أيضا بروتوكولات التنميط الجيني CAF والتحليل النسخي ، جنبا إلى جنب مع إجراء حسابي لاستنتاج توقيعات النسخ في الأورام الأولية باستخدام بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي السائبة المتاحة للجمهور. بالإضافة إلى ذلك ، نقدم أداة سهلة الاستخدام قائمة على الويب لتحليل نسخ المكونات اللحمية والظهارية من أورام BC التشريح الدقيقة التي تلتقط بالليزر. في النهاية ، يمكن أن توفر هذه الأساليب رؤى قيمة حول الآليات الجزيئية التي تقود تفاعلات ورم CAF ولديها إمكانات لتحديد أهداف علاجية جديدة.

المقدمة

سرطان الثدي (BC) هو أكثر الأورام الخبيثة شيوعا التي تصيب النساء ويتميز بعدم تجانس جزيئي كبير ، مع ملامح جزيئية مميزة توجه التشخيص وقرارات العلاج والتشخيص. البيئة المكروية للورم (TME) هي أيضا غير متجانسة للغاية وتلعب دورا مهما في تطور الورم والمناعة ونتائج العلاج.

الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) هي أكثر أنواع الخلايا وفرة في TME والمنظمين الرئيسيين لتطور الورم. إنها تساهم في ترسب المصفوفة خارج الخلية وإعادة تشكيلها ، وتكوين الأوعية الدموية ، والتهرب المناعي ، ومقاومة الأدوية1،2،3،4،5،6. تؤثر CAFs على الخلايا السرطانية من خلال الاتصال المباشر بالخلايا الخلوية ، وإطلاق الحويصلات خارج الخلية7 ، وإفراز عوامل قابلة للذوبانالمختلفة 2،5 لتعزيز نمو الورم ، والغزو ، ومقاومة العلاج8،9،10. في الواقع ، فإن التوقيعات الجينية المرتبطة بالسدى لها قيمة تنبؤية لتقدم BC والاستجابة للعلاج وترتبط بمقاومة العلاجالكيميائي 11،12،13،14. ومع ذلك ، على الرغم من الأدلة الجوهرية التي تشير إلى أن CAFs كهدف علاجي جذاب ، إلا أن التجارب السريرية التي تستهدف هذه الخلايا قد فشلت إلى حد كبير15. يتمثل أحد التحديات الرئيسية في الفهم المحدود للآليات الجزيئية التي تعدل بها CAFs سلوك الورم. قدمت التطورات الحديثة في تحليلات النسخ أحادية الخلية والمكانية رؤى أعمق حول تعقيد CAFs في BC16،17،18،19،20،21 ، مما مكن من تحديد الأنواع الفرعية المتميزة ل CAF مع برامج وظيفية محددة16،22 وتسليط الضوء بشكل أكبر على تعقيدهاومرونةها 23.

تعد نماذج الفئران المعدلة وراثيا (GEMMs) ، التي يتم فيها التعبير عن الجينات المسرطنة أو الجينات المثبطة للورم بشكل مفرط أو تعطيلها ، نماذج راسخة لدراسة السرطان البشري24،25،26،27. بالمقارنة مع النماذج التركيبية ، والتي تتضمن تطعيم الخلايا السرطانية في الفئران البرية23،28 ، تحاكي GEMMs بشكل أكثر دقة التقدم متعدد الخطوات ل BC والتفاعلات بين الخلايا السرطانية و TME. ومع ذلك ، فإن التلاعب بأنشطة CAFs في GEMMs كان يمثل تحديا بسبب عدم تجانسها ، مما يجعل من الصعب استهداف جميع الأنواع الفرعية ل CAF دون تأثيرات غير مستهدفة على المكونات اللحمية أو الظهاريةالأخرى 5. يمكن أن يساعد الجمع بين GEMMs والأساليب التكميلية ، مثل التلاعب في المختبر CAF ، في إنشاء نماذج خلوية لتجارب فقدان الوظيفة في كل من الإعدادات المختبرية وفي الجسم الحي . ومع ذلك ، فإن تطوير نماذج خلوية مستقرة لاستكشاف الأدوار الوظيفية لجينات معينة لا يزال يمثل تحديا بسبب البداية السريعة للشيخوخة.

هنا ، نصف منصة قوية لتجارب فقدان الوظيفة المستقرة في CAFs ، تليها التحليل الوظيفي في المختبر وفي الجسم الحي والتنميط النسخي للخلايا المهندسة ؛ يقدم هذا النهج استراتيجية شاملة لتشريح الأهمية الوظيفية للجينات المعبر عنها CAF في سرطان الثدي ، مع مزايا في الخصوصية والقابلية للتكاثر والقدرة على التكيف على الطرق الحالية. يتم استكمال هذا النهج أيضا بأداة جديدة قائمة على الويب لاستكشاف نسخ الأجزاء اللحمية والظهارية المجهرية التي يتم التقاطها بالليزر من أورام الثدي البشرية ، مما يتيح إجراء مقارنات بين الأنواع وتسهيل إنشاء الفرضيات من البيانات البشرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تتوافق هذه الدراسة مع جميع الإرشادات المؤسسية المتعلقة بالتعامل مع الفئران وأخذ عينات الأنسجة. تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للقوانين والسياسات الوطنية والدولية. تم إيواء الفئران في وحدة معدلة وراثيا خالية من مسببات الأمراض تحت دورة ضوئية / مظلمة مدتها 12 ساعة عند 22 درجة مئوية مع رطوبة 50٪ وقدمت الطعام والماء بشكل خاص. يجب أن تتبع الإجراءات الجراحية التعليمات البيطرية المؤسسية لضمان التخدير والتسكين المناسبين ، سواء أثناء العملية أو في فترة ما بعد الجراحة. يوفر جدول المواد تفاصيل عن المواد والكواشف والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. زراعة الخلايا

  1. خلايا المزروعة عند 37 درجة مئوية في جو 5٪ CO2 مع رطوبة نسبية 95٪ ، في DMEM (HEK293T ، CAFs ، و CAFs الخالدة (iCAFs)) أو وسط RPMI (4T1) ، مكمل ب 100 وحدة / مل بنسلين ، 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين (1٪ قلم / ستربتو).
    ملاحظة: تكوين الوسائط الكاملة (cDMEM، cRPMI): FBS معطل بالحرارة بنسبة 10٪، وسائط الجوع (sDMEM، sRPMI) التركيب: لا يوجد FBS. متوسط أوقات المضاعفة للخلايا: HEK293T و iCAFs هي 24 ساعة. خلايا 4T1 هي 12 ساعة.
  2. خلايا المرور عند الوصول إلى التقاء 80٪ ، بنسبة لا تزيد عن 1: 5 ، وليس أكثر من 10 مرات بعد الذوبان لتجنب الانجراف الظاهري ، كما هو موضح أدناه.
    1. استنشق الوسط وأضف برفق 7 مل من PBS إلى جانب طبق 100 مم. استنشق PBS ، أضف 1 مل من التربسين EDTA. احتضان لمدة 2-3 دقائق عند 37 درجة مئوية.
      تنبيه: تم إدراج EDTA كمركب خطر من الفئة 2 لتهيج العين. تعامل مع غطاء محرك السيارة البيولوجي / الدخان مرتديا معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
    2. قم بتعطيل التربسين-EDTA مع 5 مل من cDMEM، وفصل الخلايا عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل، وجمعها في أنبوب مخروطي الشكل سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 290 × جم لمدة 5 دقائق.
    3. قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 5 مل من cDMEM. لتقسيم 1: 5 ، قم ببذور 1 مل من الخلايا المعلقة في طبق 100 مم يحتوي على 9 مل من cDMEM.
  3. عد الخلايا: قم بتحميل 10 ميكرولتر من تعليق الخلية من الخطوة 1.2.3 على جانب غرفة عد نيوباور ، وعد الخلايا في المربعات الكبيرة ، واضرب الرقم الذي تم الحصول عليه في 1 × 104 لحساب عدد الخلايا الموجودة في 1 مل من تعليق الخلية.
  4. الحفظ بالتبريد: قم بتجميد 50٪ من طبق 100 مم (حوالي 3 × 106 خلايا) في 0.5 مل من وسط التجميد المثلج (10٪ DMSO في FBS المعطل بالحرارة) كما هو موضح أدناه.
    1. من طبق 100 مم ، قم بتربسين الخلايا كما هو موضح في الخطوتين 1.2.1 و 1.2.2 ، باستثناء أن الخلايا يتم تعليقها في 1 مل من وسط التجميد المثلج.
    2. قم بتوزيع 0.5 مل في كل تبريد، وضعها عند -80 درجة مئوية في وعاء لضمان معدل تبريد يبلغ حوالي 1 درجة مئوية / دقيقة. يمكن إذابة كل قطعة في طبق 100 مم.
  5. اختبار تلوث الميكوبلازما: اجمع 1 مل من وسط النمو من الخلايا المتقاربة المزروعة لمدة 3 أيام على الأقل. يغلي على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. تدور عند 16200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). أضف 5 ميكرولتر من المادة الطافية إلى 45 ميكرولتر من مزيج تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (0.15 ملي مولار dNTPs ، 1.5 ملي مولار MgCl2 ، 1x عازل التفاعل ، 1 U Taq polymerase ، 0.5 ميكرومتر بادئات A و B ، انظر الجدول 1). قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل ، بما في ذلك الضوابط الإيجابية والسلبية ، وفصل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل على جل أغاروز 1٪ جنبا إلى جنب مع سلم الحمض النووي. ستظهر العينات الملوثة بالميكوبلازما نطاقا 600 نقطة أساس.

2. عزل CAFs عن أورام الثدي

ملاحظة: تم تحسين هذه الخطوة للأورام في المرحلة المتقدمة التي يبلغ قطرها 5-10 مم (انظر المرجع29 ).

  1. التضحية بالفأر عن طريق خلع عنق الرحم. عزل أورام الثدي التي لا يقل حجمها عن 125 مم3. استئصال الورم بعناية ، وإزالة الجلد المحيط والأنسجة الثديية والمناطق النخرية المرئية. باستخدام الملقط ، اجمعها في أنبوب دقيق سعة 1.5 مل يوضع على الجليد.
  2. قم بوزن الورم بميزان دقيق ، واستئصال قطعة مكعبة من 0.1-0.3 جم بمشرط ، وانقله إلى أنبوب دقيق جديد سعة 1.5 مل مملوء ب PBS المثلج ، واستمر في وضع الثلج. تأكد من غمر الأنسجة لتجنب الجفاف.
  3. انقله إلى طبق قطره 60 مم على الثلج. يقطع 1 مل من PBS بمشرط حتى تحصل على قطع من 1-2 مم تقريبا.
  4. نقل إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 5 مل لكل 0.1 غرام من الورم في cDMEM بالإضافة إلى 10 ميكروغرام / مل من الكولاجيناز. اشطف الطبق ب 1 مل من نفس الوسط ، باستخدام ماصة P1000 ذات طرف مقطوع لتجنب تلف الخلايا. قم بتأمين الغطاء بغشاء مانع للتسرب لتجنب التسرب.
  5. احتضان أفقيا لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية على شاكر مداري. ضع مصفاة خلية 70 ميكرومتر فوق أنبوب مخروطي 50 مل وانقل المتجانس باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل. استخدم الجزء الخلفي من مكبس حقنة سعة 5 مل لطحن العينة ودفعها عبر الفلتر.
  6. استخدم cDMEM (لا يتجاوز 30 مل من الحجم النهائي) لاستعادة كل شيء من المصفاة. قم بتدوير الخلايا عند 129 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق وتخلص من المادة الطافية.
  7. أضف 3 مل من محلول تحلل كلوريد الأمونيوم والبوتاسيوم (ACK) لإزالة خلايا الدم الحمراء (RBC). أغلق الأنابيب بإحكام واخلطها عن طريق الانعكاس. احتضن لمدة 5 دقائق في RT على شاكر مداري.
  8. أوقف تحلل كرات الدم الحمراء عن طريق إضافة PBS إلى الحجم النهائي البالغ 30 مل. قم بتدوير الخلايا عند 129 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق وتخلص من المادة الطافية.
  9. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من cDMEM واحسب الخلايا القابلة للحياة كما في الخطوة 1.3 باستخدام 10 ميكرولتر من الميثيلين الأزرق: تقلل الخلايا الحية من الصبغة إلى منتج عديم اللون وتصبح غير ملوثة ، في حين أن الخلايا الميتة ملطخة باللون الأزرق.
  10. بذور 5 × 105 خلايا / 60 مم طبق في 5 مل من cDMEM ، واحتضان 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية في جو 5٪ CO2 ، وجمع الخلايا غير الملتصقة ، وإعادة وضعها طوال الليل.
  11. بعد 48 ساعة أو 72 ساعة ، قم بإجراء التربسين التفاضلي. نظرا لأن الخلايا الليفية تنفصل بشكل أسرع من الخلايا الظهارية والخلايا الظهارية30 ، فتابع كما هو موضح في الخطوة 1.2. ولكن مراقبة انفصال الخلية عن كثب تحت المجهر. ستصبح الخلايا على شكل الخلايا الليفية مستديرة وتنفصل بينما تظل الخلايا الظهارية متصلة.
  12. أضف cDMEM لتعطيل التربسين وجمع CAFs المنفصلة ، ونقلها إلى طبق جديد مقاس 60 مم في 5 مل من cDMEM. اجتاز CAFs الأولية 1: 3 (انظر الخطوة 1.2) لثلاثة مقاطع ، ثم قم بإعداد الحصص المجمدة للمرور المبكر كما هو موضح في الخطوة 1.4.

3. الخلود عن طريق نقل الفيروس

ملاحظة: يجب تنفيذ بعض الخطوات التالية في بيئة مناسبة للتعامل مع نواقل الفيروسات القهقرية (على سبيل المثال، BSL2+)؛ تحقق من القواعد المؤسسية الخاصة بك.

  1. تحضير الفيروس المؤتلف
    1. استزراع الخلايا HEK293T وتحقق من تلوث الميكوبلازما (انظر الخطوة 1).
    2. قم بتغطية طبق قطره 100 مم عن طريق سحب 6 مل من محلول 0.1 مجم / مل من بولي إل ليسين في ddH2O لمدة 5 دقائق عند RT ، والشفط ، واتركه حتى يجف تحت غطاء المحرك (حوالي 10 دقائق).
    3. البذور 3 × 106 خلايا HEK293T (مرور منخفض ، الميكوبلازما سلبية) في 10 مل من cDMEM في الطبق المطلي ب poly-L-lysine من الخطوة 3.1.2 (انظر الخطوة 1.3).
    4. في اليوم التالي ، قم بإعداد أنبوبين يحتويان على 0.75 مل من الوسط المحسن الخالي من المضادات الحيوية. أضف إلى أحدهم 30 ميكرولتر من كاشف التعداء بوساطة الدهون الكاتيونية (T1). إلى الثانية ، أضف 2 ميكروغرام من pCL-Ampho (ناقل التعبئة الفيروسية القهقرية) و 2 ميكروغرام من ناقل cDNA pBABE-neo largeT (T2). يضاف T2 إلى T1 ، ويخلط برفق ، ويحتضن لمدة 10 دقائق.
    5. قم بتوزيع الوسط بالتساوي على الخلايا بعد استبداله بوسط محسن خال من المضادات الحيوية + FBS معطل للحرارة بنسبة 10٪. انقل اللوحة إلى منشأة زراعة الأنسجة من مستوى السلامة الحيوية 2+ (BSL-2+). استبدل الوسط ب cDMEM بعد 6-12 ساعة واحتضان الخلايا لمدة 24-48 ساعة.
    6. قم بتصفية الوسط الذي يحتوي على جزيئات الفيروسات الكاذبة من خلال مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لبضعة أيام أو -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.
  2. نقل الفيروس في CAF
    1. قم بالبذور 7.5 × 105 CAFs في كل من طبقين مقاس 60 مم في 4 مل من cDMEM (انظر الخطوة 1.3) وزرعها كما في الخطوة 1.1.
    2. في اليوم التالي ، استبدل وسط طبق واحد ب 2 مل من الوسط المحتوي على الفيروس الكاذب من الخطوة 3.1.6 (CAFs المنقولة) ، أضف 2 مل من cDMEM ، واحتضن لمدة 24 ساعة. اترك الطبق الآخر كما هو (CAFs غير محول).
    3. في اليوم التالي ، كرر الخطوة 3.2.2 على CAFs المحولة. بعد 24 ساعة ، استبدل وسط كلا الطبقين ب 4 مل من cDMEM.
    4. بعد 24 ساعة أخرى ، ابدأ الاختيار عن طريق استبدال وسيط كلا الطبقين ب cDMEM مكمل ب 400 ميكروغرام / مل G418. استبدل الوسط المحتوي على G418 كل 2-3 أيام حتى لا تترك أي خلايا حية في طبق التحكم في CAFs غير المحولة.
      ملاحظة: الخلايا غير المحولة حساسة ل G418 وستموت في غضون 7-10 أيام ، مما يشير إلى أن الخلايا المحولة المقاومة ل G418 فقط هي التي ستعيش في حالة CAFs المحولة. يجب تحديد التركيز الأمثل للمضادات الحيوية لكل نوع من أنواع الخلايا ، وإجراء منحنيات القتل (اختبر نطاقا من 50 إلى 1000 ميكروغرام / مل تركيز G418 لمدة 7-10 أيام وحدد الجرعة التي تقتل جميع الخلايا في غضون 10 أيام).
    5. قم بتمرير الخلايا المحولة المحددة 2x بنسبة 1: 3 (انظر الخطوة 1.2) قبل الخروج من منشأة BSL. قم بإعداد حصص محفوظة بالتبريد من المقاطع المبكرة كما في الخطوة 1.4.
    6. تحقق من استمرار الخلايا في التكاثر دون إظهار نمط ظاهري للشخوخة لعدة مقاطع وانتقل إلى التوصيف الظاهري والوظيفي (انظر الخطوتين 4 و 6-9).

4. توصيف النمط الظاهري

ملاحظة: يمكن تقييم علامات CAFs مثل أكتين ألفا للعضلات الملساء (α-SMA) ، كافيولين ، بروتين تنشيط الخلايا الليفية (FAP) ، N-cadherin ، عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية بيتا (PDGFR-β) ، S100A4 و vimentin29 بواسطة RT-qPCR و Western Blot.

  1. RT-qPCR: استخرج الحمض النووي الريبي الكلي بمحلول أحادي الطور من الفينول والجوانيدين إيزوثيوسيانات كما هو موضح في المرجع15. قم بالنسخ العكسي 2 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي بحجم 20 ميكرولتر ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة لظروف التفاعل. قم بتخفيف (كدنا) 1:20 واستخدم 3 ميكرولتر لإجراء تفاعلات RT-qPCR ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر الجدول 1 للحصول على الاشعال).
    ملاحظة: نوصي بتحضير الحمض النووي الريبي من طبق مكون من 12 بئرا.
  2. لطخة غربية
    1. اغسل 2x باستخدام PBS كما هو موضح في الخطوة 1.2.1 ، وأضف 0.2 مل من محلول التحلل المثلج البارد ، وافصل الخلايا باستخدام مكشطة ، واجمعها في أنبوب دقيق سعة 1.5 مل كما هو موضح في29. اتركيه لمدة 20 دقيقة على الثلج.
    2. قم بتدوير العينات عند 16,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية واجمع المادة الطافية. حدد البروتينات عن طريق الفحص اللوني وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. استخدم ما لا يقل عن 20 ميكروغراما من البروتين للبقعة الغربية (انظر الجدول 2 للأجسام المضادة).
      ملاحظة: نوصي بتحضير البروتينات من ما لا يقل عن 6 آبار في طبق.
  3. تحليل البروتينات المفرزة
    1. قم بزرع 2 × 106 iCAFs (انظر الخطوة 1.3) في طبق قطره 100 مم في 10 مل من cDMEM وزراعتها كما هو موضح في الخطوة 1.1.
    2. بعد 24 ساعة ، قم بإزالة الوسط ، واغسله 2x مع 10 مل من PBS ، واحتضانه لمدة 48 ساعة مع 10 مل من sDMEM (انظر الخطوة 1.1) لتوليد وسط مكيف (سم).
    3. بعد 48 ساعة أخرى ، قم بتصفية CM من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. أمسك كل من المحقنة والأنبوب بإحكام وكن مستعدا لبعض المقاومة. يمكن تخزين CM عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
    4. قم بتركيز CM حوالي 10x باستخدام مكثفات البروتين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، لتوليد CM المركز (conCM). حدد كمية conCM ، واغليها ، وقم بإجراء اللطخة الغربية (انظر الجدول 2 للأجسام المضادة).

5. تحليل ضربة قاضية للجينات

ملاحظة: للتدخل بثبات في التعبير الجيني ، نقوم بتحويل iCAFs مع جزيئات الفيروسية التي تعبر عن shRNAs المصممة خصيصا. ويمكن الحصول عليها عن طريق استنساخ تسلسلات الاستهداف في ناقل فيروسي عدسي مناسب مثل pLKO.1-Puro، باتباع البروتوكولات المتاحة في https://www.addgene.org/protocols/plko/#C. يمكن تحديد تسلسلات الاستهداف المحددة باستخدام أدوات تصميم shRNA المتاحة للجمهور (على سبيل المثال ، GPP-Genetic Perturbation Portal by Broad Institute ، https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/). بدلا من ذلك ، تتوفر مجموعات من متجهات الاستهداف المعدة مسبقا تجاريا (https://en.vectorbuilder.com/products-services/service/shrna-knockdown-solutions.html ، https://www.sigmaaldrich.com/IT/it/technical-documents/technical-article/genomics/gene-expression-and-silencing/mission-shrna-getting-started ، https://www.origene.com/products/rnai/shrna-lentiviral-particles). نوصي بتصميم 4-5 shRNAs مختلفة ضد كل جين واختيار أفضل 2 للتجارب. قم أيضا بإنشاء متجهات غير مستهدفة كعناصر تحكم سلبية. يجب اتخاذ بعض الخطوات التالية في بيئة مناسبة للتعامل مع الفيروسات المشتقة من فيروس نقص المناعة البشرية (على سبيل المثال ، BSL2 +). تحقق من القواعد المؤسسية الخاصة بك.

  1. توليد جزيئات الفيروسات العدسية
    1. البذور 3 × 106 خلايا HEK293T كما في الخطوات 3.1.1-3.1.3. في اليوم التالي ، قم بإعداد مجمعات الكاشف اللاتي بوساطة الدهون - DNA كما في الخطوة 3.1.4 ، باستخدام 9 ميكروغرام و 3 ميكروغرام ، على التوالي ، من نواقل التغليف pCMV-R8.74 و pCMV-VSVG ، و 7 ميكروغرام من بناء pLKO.1 المحتوي على shRNA في 0.75 مل من الوسط المحسن للتعداء الخالي من المضادات الحيوية ، والمضي قدما كما هو موضح في الخطوتين 3.1.5 و 3.1.6.
  2. تحويل CAFs
    1. تصيب الخلايا كما هو موضح في الخطوات 3.2.1 و 3.2.2 و 3.2.4. بعد 24 ساعة ، قم بإزالة وسط العدوى وابدأ الاختيار باستخدام 2 ميكروغرام / مل بورومايسين في cDMEM. انظر الملاحظة في الخطوة 3.2.5 لتحديد التركيز الأمثل.
    2. يستبدل البيورومايسين/cDMEM بعد 48 ساعة. عادة ما يكتمل الاختيار في 3 أيام. قم بتوسيع الخلايا وتجميدها كما في الخطوة 3.2.6. تقييم كفاءة الضربة القاضية بواسطة كل من RT-PCR واللطخة الغربية كما هو موضح في الخطوتين 4.1. و 4.2.

6. التنشيط الفائق ل iCAFs مع CM من الخلايا السرطانية

ملاحظة: توضح الخطوات التالية طرق التوصيف في المختبر للأنشطة المؤيدة للأورام iCAFs. يمكن تعزيز الأنشطة المؤيدة للأورام ل CAFs عن طريق احتضانها ب CM من خلايا ورم الفئران BC (التنشيط الفائق ، s.a.) ، كما هو موضح أدناه.

  1. عد خلايا الفئران 4T1 BC كما هو موضح في الخطوة 1.3 وبذرة 2 × 106 خلايا في طبق قطره 100 مم في 10 مل من cRPMI (انظر الخطوة 1.1).
  2. بعد 24 ساعة ، قم بإزالة الوسط ، واغسله 2x مع 10 مل من PBS ، واحتضانه لمدة 48 ساعة مع 10 مل من sRPMI (انظر الخطوة 1.1) لتوليد CM.
  3. في اليوم التالي ، قم بزرع 2 × 106 iCAFs على طبق قطره 100 مم ، في 10 مل من cDMEM (انظر الخطوة 1.3) وزرعها كما هو موضح في الخطوة 1.1. قم بتصفية CM من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر في أنبوب مخروطي سعة 15 مل كما في الخطوة 4.3.3.
  4. التنشيط الفائق (s.a.): قم بإزالة الوسيط من طبق iCAFs ، واغسل 2x مع 10 مل من PBS ، وأضف 4T1 سم (8-10 مل). احتضان لمدة 48 ساعة للحصول على s.a. iCAFs.

7. تكاثر الخلايا السرطانية

  1. المعالجة المسبقة لخلايا 4T1 لمدة 48 ساعة باستخدام iCAFs CM, أعدت كما في الخطوات 4.3.1, 4.3.2, 4.3.3.
  2. قم بتربسينية عدها ، ثم قم بزرع 4 × 103 خلايا / بئر من صفيحة 96 بئرا في 100 ميكرولتر من cRPMI كما هو موضح في الخطوة 1.3 والثقافة كما في الخطوة 1.1. لوحة فنية ثلاث نسخ.
    1. قم بإعداد طبق واحد سعة 96 بئرا يوميا من الدورة الزمنية. تم تحسين عدد الخلايا المقترحة هنا لبروتوكول مدته 4 أيام. قم بتقليزه لأوقات أطول.
  3. بعد 4 ساعات ، أو بمجرد توصيل الخلايا ، قم بإزالة الوسط ، واغسله باستخدام PBS بإضافة 100 ميكرولتر برفق ، مع الحرص على عدم فصل الخلايا عن طريق وضع الطرف على حافة البئر ، باستخدام ماصة متعددة القنوات واستخدام خزان معقم. قم بإزالة PBS ، ثم أضف بالمثل 100 ميكرولتر من sDMEM (التحكم) أو iCAF CM ، وكلاهما مكمل بنسبة 2٪ FBS معطل بالحرارة (انظر الخطوات 4.3.1 ، 4.3.2 ، 4.3.3).
  4. بعد 4 ساعات ، أوقف لوحة اليوم 0 كما هو موضح من النقطة 7.5. بالنسبة للنقاط الزمنية الأخرى ، استبدل الوسيط كل يومين حتى نهاية التجربة.
  5. لتقييم كثافة الخلية ، قم بإزالة اللوحة المكونة من 96 بئرا من الحاضنة واغسل الآبار 2x ب 100 ميكرولتر من PBS ، كما هو موضح في الخطوة 7.3.
  6. تحت غطاء الدخان ، أضف 100 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) إلى كل بئر وقم بإصلاح الخلايا لمدة 10 دقائق في RT.
    تنبيه: يمكن أن يسبب PFA تلفا خطيرا للعين وتهيج الجلد. إنه ضار إذا تم ابتلاعه واستنشاقه ويشتبه في أنه يسبب عيوبا وراثية وسرطانا. مقبض في غطاء الدخان مرتديا معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE).
  7. اغسل 3 مرات مع 100 ميكرولتر من PBS كما في الخطوة 7.3 واتركها تجف تحت غطاء الدخان (حوالي 10 دقائق).
  8. احتضن 50 ميكرولتر من البنفسج البلوري 0.1٪ في 20٪ ميثانول لمدة 10 دقائق في RT.
    تنبيه: يمكن أن يتسبب البنفسجي الكريستالي في تلف خطير في العين ويتم الإبلاغ عنه كخطر من الفئة 4 للسمية الحادة عن طريق الفم وخطر من الفئة 2 باعتباره مادة مسرطنة. تعامل معها في غطاء الدخان مرتديا معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
  9. اغسل 3x مع 100 ميكرولتر من ddH2O ، وأفرغ الآبار واضغط على اللوحة على وسادة ماصة أو منشفة ورقية لإزالة السائل تماما.
  10. قم بإذابة البنفسج البلوري في 100 ميكرولتر من حمض الأسيتيك 10٪ لمدة 15 دقيقة عند RT وقياس الكثافة الضوئية (OD) بطول موجي 600 نانومتر في قارئ صفيحة دقيقة ، باستخدام 100 ميكرولتر من حمض الأسيتيك 10٪ كفارغ. تطبيع OD لذلك اليوم إلى 0 لكل حالة.

8. الهجرة والغزو

  1. ماصة 700 ميكرولتر من DMEM مكملة بنسبة 1٪ FBS معطلة حراريا ، 1٪ قلم / Strepto ، في آبار صفيحة 24 بئرا. ضع إدراج بئر مسام 8 ميكرومتر ، مطلي (غزو) أم لا (هجرة) مع مصفوفة نشطة بيولوجيا ، في كل بئر. اترك اللوحة في الحاضنة لتتوازن عند 37 درجة مئوية أثناء جمع وعد خلايا 4T1 كما في الخطوة 1.3.
  2. افصل خلايا 4T1 المعالجة مسبقا لمدة 48 ساعة باستخدام iCAFs CM من طبق قطره 100 مم كما في الخطوات 4.3.1 و 4.3.2 و 4.3.3 ، باستخدام 1 مل من 5 ملي مولار EDTA بدلا من التربسين-EDTA.
  3. أضف 5 مل من cDMEM ، وحصاد الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، والحبيبات عن طريق الطرد المركزي كما في الخطوة 1.2. أعد تعليق الخلايا في sDMEM، وقم باحتسابها كما في الخطوة 1.3، وقم بتخفيفها إلى 1 × 105 خلايا / 100 ميكرولتر.
  4. أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى الغرفة العلوية للبئر. كعنصر تحكم في الطلاء ، قم بزرع 100 ميكرولتر من الخلايا في صفيحة مكونة من 24 بئرا ، في 500 ميكرولتر من cDMEM. احتضن لمدة 16 ساعة (هجرة) أو 24 ساعة (غزو) ، وأوقف التجربة كما هو موضح أدناه.
    ملاحظة: يجب تحديد أوقات الحضانة تجريبيا في حالة استخدام خلايا مختلفة.
  5. قم بتسمية الإدخالات الموجودة على جانبها العلوي بعلامة رفيعة واغمرها في أنبوب مخروطي سعة 50 مل مملوء ب PBS للغسيل باستخدام الملقط. نظف الجزء الداخلي من البئر بعناية باستخدام قطعة قطن.
  6. تحت غطاء الدخان ، احتضان العينات في 700 ميكرولتر من 4٪ PFA لمدة 10 دقائق في RT (انظر الخطوة 7.6).
  7. اغسل 3x مع 700 ميكرولتر من PBS واتركه يجف تحت غطاء المحرك (حوالي 10 دقائق). احتضان الحشوات التي تحتوي على 700 ميكرولتر من البنفسج البلوري 0.1٪ في 20٪ من الميثانول لمدة 10 دقائق عند RT (انظر الخطوة 6.10).
  8. اغسل الحشوات 3x وغمرها في أنبوب مخروطي سعة 50 مل مملوء ب ddH2O باستخدام ملاقط. نظف الجزء الداخلي من البئر بعناية باستخدام قطعة قطن. قم بتخزين العينات في RT والتقط الصور حتى 3 أيام بعد ذلك.
  9. باستخدام مجهر تباين الطور ، التقط صورة واحدة مع تصوير موضوعي 10x لمعظم سطح البئر ، ثم احصل على صور من 5 مناطق مستقلة بهدف 20x.
  10. قم بإذابة البنفسج البلوري في حمض الخليك بنسبة 10٪ على النحو التالي: بالنسبة للآبار ، أضف 100 ميكرولتر من حمض الأسيتيك واخلطه على شاكر مداري لمدة 10 دقائق في RT ؛ بالنسبة للآبار ، ضعها ، سطحها السفلي لأعلى ، على مقعد ، وقم بإيداع 50 ميكرولتر من حمض الأسيتيك على السطح واخلطها عن طريق سحب العينات حتى يذوب البنفسج البلوري تماما.
  11. اقرأ الامتصاص عند 600 نانومتر في صفيحة 96 بئرا باستخدام 50 ميكرولتر من المادة الذائبة من الخطوة أعلاه. استخدم 10٪ حمض الأسيتيك كفارغ.
  12. تطبيع الكثافة الضوئية (OD) للتحكم في الطلاء من الخطوة 8.5 والتعبير عن الهجرة أو الغزو بالنسبة لحالة التحكم.

9. نمو الورم الأولي وتكوين النقائل الرئوية

ملاحظة: توضح الخطوة التالية طرق التوصيف في الجسم الحي للأنشطة المؤيدة للأورام في CAFs. تم تحسين هذه الخطوة لتقييم الميزات المؤيدة للأورام في الجسم الحي CAFs عن طريق الحقن المشترك في نماذج الفئران الزاوية. نظرا لأن كلا من خلايا CAFs و 4T1 من خلفية الفأر BALB / c ، يتم استخدام الفئران BALB / c.

  1. في 2 أيام قبل الحقن ، عدد 6 أسابيع من الفئران BALB / c مع علامات الأذن ذات الهوية المعدنية وحلق منطقة الغدة الثديية 4 باستخدام ماكينة حلاقة.
  2. جمع وعد خلايا 4T1 و s.a. iCAFs ، المعدة كما هو موضح في الخطوة 6. في أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، امزج 1 × 105 خلايا 4T1 و 3 × 105 s.a. iCAFs / ماوس ، مع الأخذ في الاعتبار زيادة لا تقل عن 20٪. استخدم 4T1 فقط كعنصر تحكم.
  3. جهاز طرد مركزي عند 290 × جم لمدة 5 دقائق ، يعيد تعليقه في حجم PBS محسوب للحصول على العدد أعلاه من الخلايا / الفئران في 50 ميكرولتر ، ونقله إلى أنبوب دقيق سعة 1.5 مل ، والحفاظ على الجليد.
    ملاحظة: على سبيل المثال ، لحقن 10 فئران ، امزج 1.2 × 106 خلايا 4T1 مع 3.6 × 106 s.a. iCAFs ، وخلايا الحبيبات ، وأعد تعليقها في 600 ميكرولتر من PBS. حقن 50 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل ماوس.
  4. قم بإعداد منطقة العمل عن طريق تنظيف وتطهير سطح غطاء التدفق الرقائقي. قم بتغطية لوح الجراحة الرغوي بورقة واقية من مقاعد البدلاء.
  5. تخدير الفئران واحدة تلو الأخرى ، وفقا للإجراءات المؤسسية (نستخدم الحقن داخل الصفاق لقاعدة التيتيلامين / قاعدة الزولازيبام + زيلازين 70 مجم / كجم + 5 مجم / كجم). ضع مرهما بيطري على العينين لمنع الجفاف. باستخدام طرف قطني ، قم بتطهير الجلد بمحلول بوفيدون اليود.
  6. استخدم اختبار قرصة إصبع القدم للتأكد من أن الفئران تخضع للتخدير المناسب. باستخدام إبرة تحت الجلد ، قم بحقن 50 ميكرولتر من تعليق الخلية في وسادة الدهون الثديية 4. استخدم الحلمة كمرجع وحقن حوالي 3 مم باتجاه الساق المماثلة.
  7. افحص الفئران لبضع ساعات بعد الحقن وفي الأيام التالية. تصبح الأورام واضحة بعد 4 أيام.
  8. قم بقياس حجم الورم كل 48 ساعة باستخدام الفرجار ، وتحديد الأقطار القصوى والصغرى. احسب حجم الورم باستخدام الصيغة: (الطول × العرض2) / 2.
  9. بعد 10 أيام من الحقن ، قم بإزالة الأورام الأولية جراحيا كما هو موضح أدناه.
    1. جهز المنطقة الجراحية كما في الخطوة 9.5. قم بتعقيم الأدوات عن طريق التعقيم ووضعها على سطح معقم أثناء العمل. تعقيم الأدوات بين باستخدام معقم الخرز الساخن.
    2. تخدير الفئران كما في الخطوتين 9.6 و 9.7. باستخدام شفرة مشرط، قم بعمل شق 5-8 مم بالقرب من الورم واسحب الجلد برفق بعيدا، مما يخلق جيبا صغيرا للوصول إلى الورم. قم بالكي لأي وعاء دموي مرئي بقلم كي منخفض الحرارة لتجنب النزيف عند التشريح.
    3. استخدم المشرط لإزالة الورم ، محاولا عدم إزالة أي جلد. ضع اللوحات الجلدية مرة أخرى في موضعها الأصلي ، وخياطتها معا باستخدام خيط جراحي 5-0 بإبرة 17 مم 1 / 2 درجة مئوية ، وأضف الغراء الجراحي لإغلاق الجرح تماما.
    4. لا تترك الفئران دون رقابة حتى تستعيد وعيها الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي. لا يتم إرجاع التي خضعت لعملية جراحية إلى صحبة الأخرى حتى يتم شفائها تماما.
  10. مراقبة عن كثب بعد الجراحة وفي الأيام التالية ، قم بإعطاء العلاج المسكن إذا لزم الأمر ، وفقا للبروتوكولات المؤسسية. نستخدم حقن تحت الجلد من الكاربروفين (3-5 مجم / كجم).
  11. قم بوزن الورم باستخدام ميزان دقيق كما في الخطوة 2.2. قسم الورم إلى نصفين باستخدام المشرط. ضع النصف في أنبوب دقيق سعة 1.5 مل ، ثم قم بالتجميد في النيتروجين السائل ، وقم بتخزينه في -80 درجة مئوية للتحليلات الجزيئية. قم بإصلاح النصف الآخر في 5 مل من 4٪ PFA في أنبوب مخروطي 15 مل لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية للتحليل النسيجي.
  12. في اليوم 21 بعد الحقن ، قم بالتضحية بالفئران عن طريق التعرض لثاني أكسيد الكربون2 وجمع الرئتين عند التسريب داخل القصبة الهوائية مع 4٪ PFA كما هو موضح أدناه. العمل تحت غطاء الدخان.
    1. افتح تجويف الصدر باستخدام مقص جراحي. قم بإزالة الجلد من المنطقة تحت الفك السفلي والغدد اللعابية لكشف القصبة الهوائية بوضوح.
    2. تحضير حقنة إبرة 22G تحتوي على محلول PFA بنسبة 4٪. أدخل الإبرة في القصبة الهوائية للفأر ، ووجهها نحو الرئتين أثناء تثبيت القصبة الهوائية باتجاه الرأس. حقن المحلول حتى تنتفخ الرئتان (حوالي 2 مل).
    3. قم بتشريح الرئتين ووضعها في أنبوب سعة 15 مل يحتوي على محلول PFA بنسبة 4٪. اقلب الأنبوب برفق عدة مرات ، واتركه يثبت لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية.
  13. قم بإجراء أقسام شبه متسلسلة من الرئتين ، وصمة عار باستخدام Hematoxylin و Eosin (H & E) ، شريحة واحدة كل 50/100 ميكرومتر حتى يتم استنفاد العينة ، كما هو موضح في المرجع31.
  14. النقائل عند التحليل الموجه بالبرمجيات للصور المصغرة للأقسام الملطخة ب H & E.

10. توقيعات التعبير الجيني

  1. حدد توقيع الجين كما هو موضح أدناه.
    1. اعتمادا على الإعداد التجريبي والسؤال البيولوجي المحدد الذي تم التحقيق فيه ، احصل على توقيع جيني بعدة طرق. الأكثر شيوعا ، تقييم التعبير التفاضلي بين حالتين (على سبيل المثال ، CAFs مقابل نظرائهم العاديين ، أو معالجتهم بعدة طرق (على سبيل المثال ، التنشيط الفائق أو الصوت) مقابل غير المعالجة.
    2. بدلا من ذلك ، حدد الجينات الأكثر تباينا أو غنية بالمعلومات عبر العينات التي تم تحليلها (على سبيل المثال ، الجينات ذات التباين العالي أو ذات الأحمال العالية على المكونات الأولى لتحليل المكون الرئيسي). هنا ، سنستخدم التوقيع المنظم من قبل STAT3 كمثال. تم تعريف هذا التوقيع على أنه الجينات التي تم تنظيمها عند إسكات STAT3 في BCCAFs 29 ، كما هو موضح أدناه. للحصول على وصف شامل لتسلسل الحمض النووي الريبي ، انظر المراجع32،33.
  2. استخرج إجمالي الحمض النووي الريبي ثلاث نسخ تقنية من كل عينة كما في الخطوة 4.1.1 وقم بتقييم جودة الحمض النووي الريبي للتحقق من سلامة الحمض النووي الريبي (RIN ≥ 9).
  3. إعداد المكتبات من 2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي المحدد poly (A) وتسلسلها. استخدمنا منصة NextSeq 500.
  4. تقرأ الخريطة إلى التجميع المرجعي Mus musculus mm9 باستخدام TopHat v2.0. 1034.
  5. حساب عدد الجينات باستخدام أداة htseq-count من حزمة HTSeq (http://www.huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html).
  6. قم بإجراء تحليل التعبير التفاضلي باستخدام R وحزمة DESeq2 (http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/DESeq2.html). قم بتصفية الجينات الخاضعة للتنظيم باستخدام FDR < 0.05 لتحديد توقيع STAT3.

11. تقدير تعبير التوقيع في الأورام الأولية

ملاحظة: تصف الخطوات التالية إجراء لتقدير التعبير عن التوقيع المنظمب STAT3 29 حسابيا عبر البيانات النسخية المتاحة للجمهور للأورام الأولية في كولومبيا البريطانية ، واختبار علاقتها مع نسبة اللحمة المقدرة في نفس مجموعة العينات.

  1. قم بتثبيت R (https://cran.r-project.org/) و RStudio (https://posit.co/products/open-source/rstudio/). ابدأ تشغيله وقم بتثبيت المكتبات المطلوبة: GSVA35 ، TCGAbiolinks36.
  2. قم بتنزيل بيانات التعبير الجيني الأولي للورم ، مثل بيانات TCGA من https://portal.gdc.cancer.gov/ ، أو بيانات METABRIC من http://synapse.org/ (syn1757063) ، أو بيانات النسخ الأخرى من Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) كمصفوفات تعبير طبيعية مسبقا. يجب تنسيق البيانات كمصفوفة رقمية مع صفوف كجينات وأعمدة كعينات ، وتطبيعها اعتمادا على النظام الأساسي وتغيير حجمها باستخدام إزاحة 1.
    1. قم بتنزيل قائمة أخصائيي تقويم العظام الجيني للفأر والإنسان من Biomart في https://www.ensembl.org/biomart/martview/ ، وحدد قاعدة البيانات: مجموعة الجينات ، واختر مجموعة بيانات الجينات البشرية ، وانقر فوق تحديد السمات في علامة التبويب اليسرى.
    2. من الميزات المحددة مسبقا ، افتح علامة التبويب EXTERNAL وقم بوضع علامة على رمز HGNC ، وحدد Homologues في المربع الموجود أعلى الصفحة ، وقم بوضع علامة على Mouse orthologues / اسم جين Mouse .
    3. انقر على النتائج زر في الزاوية اليسرى العليا ، وحدد تنسيق CSV ، وانقر فوق GO زر لتنزيل الملف.
  3. قم بتحميل توقيع التعبير الجيني (مجموعة من الجينات) في R. في هذه الحالة ، نستخدم قائمة الجينات التي تم تنظيمها عند إسكات STAT3 في CAFs للفئران.
  4. قم بتحميل قائمة أخصائيي تقويم العظام الجيني للفأر والإنسان في R وقم بتعيين توقيع STAT3 إلى أخصائيي تقويم العظام البشريين المقابلين عبر جدول Biomart.
  5. قم بتحميل بيانات التعبير الجيني الأولي للورم في R واستدعاء وظيفة GSVA مع المعلمات ككائن ssgseaParam ، بما في ذلك بيانات الورم الأولية ، وقائمة تشتمل على توقيع STAT3.

12. اختبر العلاقة بين تعبير التوقيع الجيني والسمات السريرية

  1. تحديد المتغيرات ذات الاهتمام. تمثل النسبة اللحمية نسبة الخلايا في عينة الورم المتسلسلة التي تنتمي إلى سدى الورم. استخدم السمات السريرية التالية المرتبطة غالبا ببيانات omic: حجم الورم ، والمرحلة ، وعمر المريض عند التشخيص ، وحالة العقدة الليمفاوية ، وحالة ورم خبيث ، وما إلى ذلك. تتوفر تقديرات النسبة المئوية لللحمة المحسوبة مسبقا ل TCGA.
    ملاحظة: على وجه التحديد ، التقديرات اللحمية المتاحة هي: EDec المناعة / اللحمية = الالتفاف اللاجيني للنسبة اللحمية / المناعية37 ؛ درجة المناعة = ssGSEA بناء على ملامح التعبير الجيني ل 141 جينا مناعيا38 ؛ LUMP = الكريات البيض غير مثيلة للنقاء ، والذي يبلغ متوسطه 44 موقعا خاصا بالمناعة غير الميثيلية39 ؛ درجة اللحمة = ssGSEA بناء على ملامح التعبير الجيني ل 141 جينات لحمية38 ؛ IHC = يقدر بتحليل الصور للشرائح الملطخة بالهيماتوكسيلين واليوزين التي تنتجها المورد الأساسي للعينات الحيوية لمستشفى الأطفال الوطني40 ؛ مطلق = بناء على بيانات رقم النسخ الجسدي41.
  2. قم بتنزيل بيانات EDEc من http://genboree.org/theCommons/documents/569 ودرجات اللحمة والمناعة من https://bioinformatics.mdanderson.org/estimate/disease.html (RNASeqV2) وبيانات نقاء الورم (LUMP ، IHC ، ABSOLUTE) من TCGAbiolinks. بالنسبة لمجموعات البيانات الأخرى ، احسب النسبة المئوية للسدى باستخدام حزمة GSVA ، وحساب ssGSEA للسدى والتوقيعات المناعية التي تم الحصول عليها من Yoshihara et al.38.
  3. احسب العلاقة بين المتجه الرقمي للنسبة اللحمية المقدرة والمتجه الرقمي لتعبير توقيع STAT3 عبر عينات الورم الأولية. يمكن تحقيق ذلك باستخدام وظيفة cor.test في R.
  4. قم بتنزيل البيانات السريرية المرتبطة بمجموعة البيانات النسخية للأورام الأولية كجدول يحتوي على عينات في صفوف والميزات السريرية في الأعمدة.
  5. قم بتحميل البيانات السريرية في R وتحقق من أن العينات في مصفوفة النسخ وفي جدول البيانات الوصفية بنفس ترتيب وظيفة المطابقة.
  6. بالنسبة للمتغيرات الرقمية (على سبيل المثال ، حجم الورم) ، احسب العلاقة بين المتجه الرقمي لتعبير توقيع STAT3 عبر عينات الورم الأولية ومتجه قيم السمات السريرية باستخدام وظيفة cor.test.
  7. بالنسبة للمتغيرات الفئوية (على سبيل المثال ، حالة ورم خبيث) ، اختبر الفرق في تعبير توقيع STAT3 بين مجموعتين من العينات (على سبيل المثال ، الأورام النقيلية مقابل الأورام غير النقيلية) باستخدام اختبار مجموع رتبة ويلكوكسون غير المعلمي (بافتراض أن مجموعتي العينات مستقلتان). يمكن تحقيق ذلك باستخدام وظيفة wilcox.test في R.

13. اختبار تنظيم التوقيع في سدى الورم

ملاحظة: يتميز التعبير عن التوقيع اللحمي في الأورام الأولية التي تم تحليلها من خلال تسلسل الحمض النووي الريبي السائب بالاعتماد على مجموعات كبيرة من المرضى مع التعليقات التوضيحية السريرية التفصيلية. من ناحية أخرى ، فإن فصل السدى والظهارة فقط يسمح بتحديد تغيرات التعبير الجيني في أي من الجزأين الخلويين في الورم عند مقارنتها بالأنسجة الطبيعية42. MetaLCM هو تطبيق لامع يسهل تحليل مجموعات البيانات النسخية لأورام الثدي المجهرية التي يتم التقاطها بالليزر. من خلال هذه الأداة ، يمكن للمستخدم البحث عن جينات قوية معبر عنها تفاضليا بين حالتين عبر مجموعات بيانات النسخ لأورام الثدي المجهرية التي يتم التقاطها بالليزر واختبار تنظيم التوقيعات الجينية المحددة مسبقا في سدى الورم. توضح الخطوات التالية كيفية استخدام MetaLCM.

  1. قم بالوصول إلى التطبيق على الرابط https://aurorasavino.shinyapps.io/metalcm/. لبدء التحليل، حدد ميزات الشروط المقارنة.
  2. اختر اتجاه المقارنة. من خلال اختيار الجينات المنظمة ، يتم عرض الجينات ذات التعبير العالي في الحالة 1.
  3. اختر عتبة القيمة p للتعبير التفاضلي واضغط على تشغيل لتشغيل التحليل، وفي كل مرة يتم فيها تغيير الإعدادات.
  4. لتقييد التحليل بقائمة جينات محددة مسبقا ، اكتب رموز الجينات مفصولة بفواصل أو قم باستيراد ملف CSV يحتوي على رموز الجينات في عمود واحد.
  5. اضغط على إرسال قائمة الجينات لاستيراد رموز الجينات. اضغط على إعادة تعيين لاستعادة التحليل باستخدام جميع الجينات. احفظ قائمة الجينات المعبر عنها تفاضليا: عند توفير قائمة جينات ، يتم إجراء تصحيح اختبار متعدد على تلك الجينات فقط. يشتمل الجدول على متوسط logFC ، وقيمة p المطوية ، وقيم logFC و p الفردية للتعبير التفاضلي في كل مجموعة بيانات متاحة.
  6. ارسم خريطة حرارية مع تغييرات الطيات للجينات المعبر عنها تفاضليا. تظهر خريطة الحرارة فقط الجينات المعبر عنها تفاضليا مع علامة متماسكة تماما للتعبير التفاضلي عبر مجموعات البيانات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

التقييم المختبري لأنشطة CAFs
تمت دراسة مساهمة الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان المشتقة من ورم الثدي (CAFs) في السمات العدوانية لسرطان الثدي (BC) باستخدام CAFs الخالدة (iCAFs) التي تم إنشاؤها وفقا للخطوة 3. تم تنشيط iCAFs بشكل فائق كما هو موضح في الخطوة 6 ، ثم تجويع في sDMEM لجمع CM ، والذي تم استخدامه لعلاج خلايا 4T1 لمدة 48 ساعة (انظر الخطوة 7.1). تبع هذا العلاج فحوصات وظيفية في المختبر . يوضح الشكل 1 أن تكاثر خلايا 4T1 يتم تعزيزه بشكل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذه الدراسة ، نقدم بروتوكولات محسنة لتخليد CAFs الفئران وتوصيف أنشطتها المؤيدة للأورام في المختبر وفي الجسم الحي. بدلا من عزل أنواع فرعية محددة من CAF بشكل انتقائي بناء على تعبير العلامة ، اخترنا الاحتفاظ بمجموعة الخلايا بأكملها للحفاظ على عدم التجانس. تم تصنيف الخلايا وظيفيا ككل ، وتم تحليل ملامح التعبير الجيني الخاصة بها لالتقاط تنوعها. كان تخليد CAFs أمرا بالغ الأهمية لهذا البحث نظرا للعدد المحدود من المقاطع التي يمكن أن تمر بها CAFs الأولية قبل أن تصبح قديمة. تمث...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح متضاربة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل الجمعية الإيطالية لأبحاث السرطان (AIRC ، IG16930 و IG24851 إلى نائب الرئيس). وزارة الجامعة والبحث الإيطالية (MIUR PRIN 2017 و 2022 إلى نائب الرئيس) ؛ مؤسسة Truus and Gerrit van Riemsdijk ، ليختنشتاين ، التبرع لنائب الرئيس ؛ منطقة بيدمونت (انحراف). تم دعم A.S. من قبل زمالة ما بعد الدكتوراه التابعة لمؤسسة أبحاث السرطان الإيطالية (FIRC) ، وتم دعم لوس أنجلوس من قبل Fondazione Umberto Veronesi.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 كيلو بايت بالإضافة إلى سلم الحمض النوويثيرموفيشر العلمية10787018
24 صحن بئرسارستيدت833922
96 لوحة بئرسارستيدت833924
حمض الخليكسيجما ألديرش695092
العمر - HFنيو إنجلاند بيولابس3552 رانديخزن في -20 درجة ؛ C
بيتادينميدا فارما23907076
ب ü غرفة العد rker   ؛VWR40443703
الكي درجة حرارة منخفضة FineTip DispكيلرAX10339KL
الطرد المركزيإيبندورف5810 ص.
أنبوب مخروطي 15 ملسارستيدت62554502
أنبوب مخروطي 50 ملسارستيدت62547254
أنابيب Microtubes Cryopure 2 ملسارستيدت72380992
كريستال بنفسجيسيجما ألديرشج 0775يخزن في RT ، استخدم في غطاء الدخان   ؛
صفيحة الاستزراع قطرها 100 مم   ؛سارستيدت833902
صفيحة ثقافة قطرها 60 مم   ؛سارستيدت833920
دي دي إتش 20محلي الصنعيخزن في RT ، يستخدم في غطاء بيولوجي
الفرجار الرقميبريسيفا02-301-2
المجهر الرقميلايكاDM6B
ثنائي ميثيل سلفوكسيدسيجما ألديرشD8418استخدم في غطاء بيولوجي
دولبيكو النسر المعدل s متوسط (DMEM)جيبكو11965092يخزن في 4 ° ج ، استخدم في غطاء بيولوجي
EcoRI-HFنيو إنجلاند بيولابسR3101يخزن في -20 درجة ؛ C
حمض الإيثيلين أمينرتال أسيتيك (EDTA)سيجما ألديرشE6758يخزن في RT ، يستخدم في غطاء بيولوجي
مصل الأبقار الجنينية (FBS)جيبكو16000044يخزن في 4 ° ج ، استخدم في غطاء بيولوجي
نصائح مفلترة 10 µ Lسارستيدت703010255
نصائح مفلترة 100 µ Lسارستيدت703030255
نصائح مفلترة 1000 µ Lسارستيدت703060255
نصائح مفلترة 20 µ Lسارستيدت703030265
نصائح مفلترة 200 µ Lسارستيدت703031255
Filtropur S Plus 0,20 µ ؛ م  سارستيدت831826102
Filtropur S Plus 0,45 & م  سارستيدت831826
مقص ناعم2بيول1406009
ملقط2بيول1102412
جينيسينجيبكو10131035يخزن في 4 ° ج ، استخدم في غطاء بيولوجي
كاشف التعداء ليبوفيكتامين 2000ثيرموفيشر العلمية11668019يخزن في 4 ° ج ، استخدم في غطاء بيولوجي
غرف غزو Matrigel مع 8 &mu ؛ م غشاء PET كورنينج354480
قارئ صفيحة دقيقة (امتصاص 600 نانومتر)بروميجاجي إم 3500
الأنابيب الدقيقة 1.5 مل   ؛سارستيدت7269001
أوبتيمجيبكو31985047يخزن في 4 ° ج ، استخدم في غطاء بيولوجي
بارافورمالديهايد (PFA)سيجما ألديرش158127تخزينها في RT ، استخدميها في غطاء الدخان
pBABE-neo largeTcDNA أدجين1780يخزن في -20 درجة ؛ ج ، استخدم في غطاء بيولوجي
بي سي إل-أمفونوفوس بيولوجي 18746853يخزن في -20 درجة ؛ ج ، استخدم في غطاء بيولوجي
pCMV-R8.74أدجين22036يخزن في -20 درجة ؛ ج ، استخدم في غطاء بيولوجي
pCMV-VSVG أدجين8454يخزن في -20 درجة ؛ ج ، استخدم في غطاء بيولوجي
البنسلين - الستربتومايسين (قلم ستربتو ، 10،000 &mu ؛ ز / مل)  جيبكو15140122يخزن في 4 ° ج ، استخدم في غطاء بيولوجي
مجهر تباين الطور   ؛أوليمبوس بي اكس 42
الفوسفات المحلول الملحي المخزن  (برنامج تلفزيوني)محلي الصنعيخزن في RT ، يستخدم في غطاء بيولوجي
pLKO.1-Puro أدجين10878يخزن في -20 درجة ؛ ج ، استخدم في غطاء بيولوجي
محلول بولي إل يسينسيجما ألديرشص 8920يخزن في 4 ° ج ، استخدم في غطاء بيولوجي
بورومايسين ثنائي هيدروكلوريد من   Streptomyces albonigerسيجما ألديرشص 8833
rCutSmart Buffer نيو إنجلاند بيولابسب6004يخزن في -20 درجة ؛ C
ماكينة حلاقة القوارضإيسكولابجي تي 416
معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI)جيبكو61870010يخزن في 4 ° ج ، استخدم في غطاء بيولوجي
مسحات العطش المستديرةسيجما ألديرشZ744127
مشرطجيما27041
سيكورا شبه مايكرو بالانسسارتوريوسSECURA125-1 ثانية
ماصة مصلية 10 مل   ؛سارستيدت861254001
ماصة مصلية 2 مل   ؛سارستيدت861252001
ماصة مصلية 25 مل   ؛سارستيدت861256001
ماصة مصلية 5 مل   ؛سارستيدت861253001
غرز 5-0إيثيكون1866 جرام
حقنة 10 ملخماسي00202250E14
حقنة 5 ملخماسي00202250E12
حقنة أومنيكان الأنسولين 1 ملبراون9151125 ثانية
الأنسجة المقاومة3M فيتبوند1469SB
إدراج Transwell 8 & م المسام  صقر353097
إدراج Transwell Matrigel 8 & م المسام  كورنينج354480
التربسين-EDTA (0.5٪) ، بدون فينول أحمرجيبكو15400054
Vivaspin 20 مكثف طرد مركزي MWCO 10,000 Da سيجما ألديرشZ614602

المراجع

  1. Bhattacharya, S., et al. Group behavior and emergence of cancer drug resistance. Trends Cancer. 7 (4), 323-334 (2021).
  2. Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
  3. Marusyk, A., et al. Spatial proximity to fibroblasts impacts molecular features and therapeutic sensitivity of breast cancer cells influencing clinical outcomes. Cancer Res. 76 (22), 6495-6506 (2016).
  4. Su, S., et al. Cd10(+)gpr77(+) cancer-associated fibroblasts promote cancer formation and chemoresistance by sustaining cancer stemness. Cell. 172 (4), 841-856.e16 (2018).
  5. Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nat Rev Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).
  6. Watson, S. S., et al. Microenvironment-mediated mechanisms of resistance to HER2 inhibitors differ between HER2+ breast cancer subtypes. Cell Syst. 6 (3), 329-342.e6 (2018).
  7. Xie, J., et al. Cancer-associated fibroblast-derived extracellular vesicles: Regulators and therapeutic targets in the tumor microenvironment. Cancer Drug Resist. 8, 2(2025).
  8. Du, R., et al. PDPN-positive CAFs contribute to HER2-positive breast cancer resistance to trastuzumab by inhibiting antibody-dependent NK cell-mediated cytotoxicity. Drug Resist Updat. 68, 100947(2023).
  9. Zhang, H., et al. Define cancer-associated fibroblasts (CAFs) in the tumor microenvironment: New opportunities in cancer immunotherapy and advances in clinical trials. Mol Cancer. 22 (1), 159(2023).
  10. Zheng, S., et al. Dissecting the role of cancer-associated fibroblast-derived biglycan as a potential therapeutic target in immunotherapy resistance: A tumor bulk and single-cell transcriptomic study. Clin Transl Med. 13 (2), e1189(2023).
  11. Bainer, R., et al. Gene expression in local stroma reflects breast tumor states and predicts patient outcome. Sci Rep. 6, 39240(2016).
  12. Farmer, P., et al. A stroma-related gene signature predicts resistance to neoadjuvant chemotherapy in breast cancer. Nat Med. 15 (1), 68-74 (2009).
  13. Winslow, S., Leandersson, K., Edsjo, A., Larsson, C. Prognostic stromal gene signatures in breast cancer. Breast Cancer Res. 17 (1), 23(2015).
  14. Xie, J., et al. Turning up a new pattern: Identification of cancer-associated fibroblast-related clusters in TNBC. Front Immunol. 13, 1022147(2022).
  15. Chen, Y., Mcandrews, K. M., Kalluri, R. Clinical and therapeutic relevance of cancer-associated fibroblasts. Nat Rev Clin Oncol. 18 (12), 792-804 (2021).
  16. Bartoschek, M., et al. Spatially and functionally distinct subclasses of breast cancer-associated fibroblasts revealed by single-cell RNA sequencing. Nat Commun. 9 (1), 5150(2018).
  17. Liu, S. Q., et al. Single-cell and spatially resolved analysis uncovers cell heterogeneity of breast cancer. J Hematol Oncol. 15 (1), 19(2022).
  18. Massa, D., Tosi, A., Rosato, A., Guarneri, V., Dieci, M. V. Multiplexed in situ spatial protein profiling in the pursuit of precision immuno-oncology for patients with breast cancer. Cancers. 14 (19), 4885(2022).
  19. Tietscher, S., et al. A comprehensive single-cell map of T cell exhaustion-associated immune environments in human breast cancer. Nat Commun. 14 (1), 98(2023).
  20. Tzoras, E., et al. Dissecting tumor-immune microenvironment in breast cancer at a spatial and multiplex resolution. Cancers. 14 (8), 1999(2022).
  21. Wu, S. Z., et al. A single-cell and spatially resolved atlas of human breast cancers. Nat Genet. 53 (9), 1334-1347 (2021).
  22. Ning, L., et al. Scrna-seq characterizing the heterogeneity of fibroblasts in breast cancer reveals a novel subtype sfrp4(+) caf that inhibits migration and predicts prognosis. Front Oncol. 14, 1348299(2024).
  23. Salemme, V., et al. The role of tumor microenvironment in drug resistance: Emerging technologies to unravel breast cancer heterogeneity. Front Oncol. 13, 1170264(2023).
  24. Attalla, S., Taifour, T., Bui, T., Muller, W. Insights from transgenic mouse models of pymt-induced breast cancer: Recapitulating human breast cancer progression in vivo. Oncogene. 40 (3), 475-491 (2021).
  25. Ferreira, T., Azevedo, T., Silva, J., Faustino-Rocha, A. I., Oliveira, P. A. Current views on in vivo models for breast cancer research and related drug development. Expert Opin Drug Discov. 19 (2), 189-207 (2024).
  26. Holen, I., Speirs, V., Morrissey, B., Blyth, K. In vivo models in breast cancer research: Progress, challenges and future directions. Dis Model Mech. 10 (4), 359-371 (2017).
  27. Pedroza, D. A., Gao, Y., Zhang, X. H., Rosen, J. M. Leveraging preclinical models of metastatic breast cancer. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1879 (5), 189163(2024).
  28. Nuckhir, M., Withey, D., Cabral, S., Harrison, H., Clarke, R. B. State of the art modelling of the breast cancer metastatic microenvironment: Where are we. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 29 (1), 14(2024).
  29. Avalle, L., et al. Stat3 induces breast cancer growth via angptl4, mmp13 and stc1 secretion by cancer associated fibroblasts. Oncogene. 41 (10), 1456-1467 (2022).
  30. Halaban, R., Alfano, F. D. Selective elimination of fibroblasts from cultures of normal human melanocytes. In Vitro. 20 (5), 447-450 (1984).
  31. Avalle, L., et al. Micrornas-143 and -145 induce epithelial to mesenchymal transition and modulate the expression of junction proteins. Cell Death Differ. 24 (10), 1750-1760 (2017).
  32. Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with rna-seq. J Biomed Biotechnol. 2010, 853916(2010).
  33. Ura, H., Togi, S., Niida, Y. A comparison of mrna sequencing (rna-seq) library preparation methods for transcriptome analysis. BMC Genomics. 23 (1), 303(2022).
  34. Kim, D., et al. Tophat2: Accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36(2013).
  35. Hanzelmann, S., Castelo, R., Guinney, J. Gsva: Gene set variation analysis for microarray and rna-seq data. BMC Bioinformatics. 14, 7(2013).
  36. Mounir, M., et al. New functionalities in the tcgabiolinks package for the study and integration of cancer data from gdc and gtex. PLoS Comput Biol. 15 (3), e1006701(2019).
  37. Onuchic, V., et al. Epigenomic deconvolution of breast tumors reveals metabolic coupling between constituent cell types. Cell Rep. 17 (8), 2075-2086 (2016).
  38. Yoshihara, K., et al. Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data. Nat Commun. 4, 2612(2013).
  39. Aran, D., Sirota, M., Butte, A. J. Systematic pan-cancer analysis of tumour purity. Nat Commun. 6, 8971(2015).
  40. Liu, J., et al. An integrated tcga pan-cancer clinical data resource to drive high-quality survival outcome analytics. Cell. 173 (2), 400-416.e11 (2018).
  41. Carter, S. L., et al. Absolute quantification of somatic DNA alterations in human cancer. Nat Biotechnol. 30 (5), 413-421 (2012).
  42. Savino, A., De Marzo, N., Provero, P., Poli, V. Meta-analysis of microdissected breast tumors reveals genes regulated in the stroma but hidden in bulk analysis. Cancers. 13 (13), 3371(2021).
  43. Wiederschain, D., et al. Single-vector inducible lentiviral rnai system for oncology target validation. Cell Cycle. 8 (3), 498-504 (2009).
  44. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of crispr-cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  45. Pfefferle, A. D., et al. Transcriptomic classification of genetically engineered mouse models of breast cancer identifies human subtype counterparts. Genome Biol. 14 (11), R125(2013).
  46. Hahn, W. C., et al. Enumeration of the Simian virus 40 early region elements necessary for human cell transformation. Mol Cell Biol. 22 (7), 2111-2123 (2002).
  47. Counter, C. M., et al. Dissociation among in vitro telomerase activity, telomere maintenance, and cellular immortalization. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (25), 14723-14728 (1998).
  48. Ferrari, N., et al. Dickkopf-3 links hsf1 and Yap/Taz signalling to control aggressive behaviours in cancer-associated fibroblasts. Nat Commun. 10 (1), 130(2019).
  49. Herrera, M., et al. Cancer-associated fibroblast-derived gene signatures determine prognosis in colon cancer patients. Mol Cancer. 20 (1), 73(2021).
  50. Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
  51. Cobos, F. A., et al. Effective methods for bulk RNA-seq deconvolution using scRNA-seq transcriptomes. Genome Biol. 24 (1), 177(2023).
  52. Cheng, P. S. W., Zaccaria, M., Biffi, G. Functional heterogeneity of fibroblasts in primary tumors and metastases. Trends Cancer. 11 (2), 135-153 (2025).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

البيئة المجهرية للورمسرطان الثديتوصيف التعبير الجينيالتحليل الترانسكريبتوميمقايسة الغزومقايسة الهجرةالجينات المستهدفة لـ STAT3التشريح المجهري بالتقاط الليزر
الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان من أورام الثدي في الفئران كأدوات للدراسات الجزيئية والحسابية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.