مقالة منهجية

عزل وثقافة وتوصيف الخلايا الليفية المرتبطة بسرطان البروستاتا

1.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68367

⸱

أغسطس 1, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Department of Science and Technological Innovation, University of Piemonte Orientale, 3Division of Urology, Department of Surgical Sciences, University of Turin, 4Department of Surgical Sciences and Urology, Città della Salute e della Scienza di Torino, University of Turin, 5Department of Pathology, University of Turin, and AOU Città della Salute e della Scienza

في هذه المقالة

ملخص

يوفر هذا البروتوكول إجراء شاملا لعزل الخلايا الليفية وتوسيعها وتخليدها من استئصال البروستاتا الجذري. علاوة على ذلك ، فإنه يصف المقايسات التي تم تطويرها لتقييم الآثار الوظيفية للحديث المتبادل لخلايا الخلايا الليفية والورم ، مع الاستفادة من كل من العلاج بالوسط المكيف والزراعة المشتركة.

الملخص

يمكن تشكيل سدى الورم بنشاط بواسطة الخلايا السرطانية لتبني خصائص مؤيدة للأورام ، مما يجعلها نقطة محورية في أبحاث السرطان. من بين المكونات اللحمية ، تلعب الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) - غالبا ما تكون أكثر أنواع الخلايا وفرة في البيئة المكروية للورم (TME) - دورا محوريا في تعزيز تطور السرطان من خلال تفاعلاتها مع الخلايا السرطانية والمكونات اللحمية الأخرى. يتطلب توضيح الآليات الكامنة وراء هذه التفاعلات طرقا قوية لعزل وتوصيف CAFs ، والتي يمكن أن تضع أيضا الأساس لتطوير علاجات جديدة للسرطان تستهدف CAF. تقدم هذه الدراسة طريقة لعزل الخلايا الليفية عن كل من الورم والمناطق الطبيعية المجاورة لعينات استئصال البروستاتا الجذري التي تم الحصول عليها من مرضى سرطان البروستاتا (PCa). يتيح هذا النهج العزل المتزامن ل CAFs ونظيراتها العادية (NFs) عن نفس الفرد ، مما يوفر نظاما تجريبيا مزدوجا. يتم توفير بروتوكولات مفصلة للحفاظ على CAFs الأولية و NFs للتحليلات النهائية في المختبر ، وكذلك لتخليدها لتسهيل الدراسات طويلة الأجل. نصف أيضا المقايسات الوظيفية المصممة لمقارنة تأثيرات CAFs و NFs على سلوكيات الخلايا السرطانية ، بما في ذلك التكاثر والهجرة والنمو المستقل عن المرسى. تم تفصيل طريقتين تكميليتين: علاج الخلايا السرطانية بالوسائط المشروطة المشتقة من الخلايا الليفية (CM) ، والزراعة المشتركة المباشرة للخلايا الليفية مع الخلايا السرطانية. تمثل هذه المنهجيات معا مجموعة أدوات شاملة للتحقيق في التفاعل الديناميكي بين CAFs والخلايا السرطانية ، ليس فقط في PCa ولكن ربما عبر مجموعة من السرطانات البشرية. علاوة على ذلك ، قد يكشف التوصيف الجزيئي لهذه التفاعلات عن وسطاء رئيسيين لتكوين الأورام المدفوع ب CAF ، مما يوفر أهدافا واعدة للتدخل العلاجي.

المقدمة

سرطان البروستاتا (PCa) هو أكثر أنواع السرطان التي يتم تشخيصها بشكل متكرر لدى الرجال في ما يقرب من ثلثي البلدان في جميع أنحاء العالم. في عام 2022 ، تم الإبلاغ عن ما يقرب من 1.5 مليون حالة جديدة ، مما أدى إلى وفاة 3,97,000 على مستوى العالم. هذه الأرقام تجعل PCa ثاني أكثر أنواع السرطان شيوعا والسبب الرئيسي الخامس للوفيات المرتبطة بالسرطان بين الرجال1.

PCa هو مرض متعدد البؤر ومعقد بيولوجيا ، يتميز بعدم تجانس كبير بين الأورام2،3،4 ، وأنواع فرعية جزيئية متنوعة ، ونتائج سريرية متغيرة5،6 ، وكلها تؤثر بشكل كبير على التشخيص والاستجابة العلاجية7.

في حين أن الدور الحاسم للبيئة المكروية للورم (TME) في بدء ورم البروستاتا وتطوره راسخ8،9 ، فإن التفاعلات الجزيئية بين الخلايا السرطانية والحيز اللحمي المحيط لا تزال غير مفهومة تماما. في حين أنه من الثابت أن البيئة المكروية لورم البروستاتا (TME) تلعب دورا مهما في بدء الورم وتطوره ، إلا أن التفاعلات الجزيئية بين الخلايا السرطانية والسدى المحيط بها لا تزال غير محددة بشكل كاف. يتكون TME من مجموعة متنوعة من الخلايا اللحمية ، بما في ذلك تلك ذات اللحمة المتوسطة والمناعية ، والتي يتم تنشيطها استجابة للإشارات المشتقة من الورم ثم تكتسب وظائف تعزيزالورم 10،11. من بين هذه ، غالبا ما تمثل الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) أكثر مجموعات اللحمة وفرة. تساهم CAFs في إعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، وتعزيز نمو الورم ، وتسهيل غزو الخلايا السرطانية وهجرتها4،11،12،13. من خلال العوامل المفرزة والتفاعلات المباشرة بين الخلايا الخلوية ، تؤثر CAFs أيضا على الانتشار والغزو ومقاومة العلاج. والجدير بالذكر أن CAFs هي مجموعة غير متجانسة. على الرغم من ارتباطها بشكل عام بالوظائف المؤيدة للأورام ، إلا أن بعض الأنواع الفرعية قد تمارس أدوارا مثبطة للورم14،15. الأهم من ذلك ، أن عدم وجود علامات فريدة ل CAFs يطرح تحديات لتحديد دقيقا لها والتشريح الوظيفي لأدوارهاالمتنوعة 12،16.

يتضمن النهج القوي للتحقيق في الحديث المتبادل الوظيفي بين CAFs والخلايا السرطانية عزل CAFs الأولية والخلايا الليفية الطبيعية المتطابقة (NFs) ، ثم تقييم تأثير كل منها على سلوكيات الخلايا السرطانية مثل الانتشار والهجرة وتكوين المستعمرة والنمو المستقل عن الرسو17،18،19. تصف هذه المقالة بروتوكولا دقيقا وقابلا للتكرار بدرجة كبيرة لعزل CAFs و NFs من عينات استئصال البروستاتا الجذري لمرضى PCa المعرضين لمخاطر عالية. يتمثل أحد المكونات الحاسمة لهذا البروتوكول في التحديد الدقيق للوحي والتشريح الدقيق للورم والمناطق الخالية من الأورام من قبل أخصائي أمراض المسالك البولية الخبير ، مما يسمح باستقاق CAFs و NFs من نفس المريض. يساعد نهج العينة المزدوجة هذا في التحكم في عدم التجانس بين الأورام والمتغيرات الفردية الخاصة بالمريض والتي يمكن أن تؤثر على الأنماط الظاهرية للأروماتالليفية 20،21،22. لضمان توفر أنسجة ورمية كافية ، نركز على عينات من المرضى الذين حصلوا على درجة جليسون ≥7.

يتطلب التوصيف الظاهري الموثوق به للأرومات الليفية المعزولة استخدام علامات متعددة لتمييزها عن أنواع الخلايا الأخرى ، وخاصة الخلايا الظهارية ، والتي قد تشترك في تعبير العلاماتالمتداخل 16. نظرا لأن الخلايا الليفية الأولية PCa تخضع عادة للشيخوخة بعد 10-15 ممر ، مما يعقد التحليلات طويلة المدى ، فإننا نقدم أيضا بروتوكولا لتخليد الخلايا عن طريق التعبير المستقر عن النسخ العكسي للتيلوميراز البشري (hTERT) 23.

لاستكشاف التأثيرات الوظيفية ل CAFs و NFs على الخلايا السرطانية ، اختبرنا وقمنا بتحسين العديد من الاستراتيجيات التجريبية. بالنظر إلى أن CAFs تمارس تأثيرها من خلال كل من العوامل المفرزة والتلامس المباشر بين الخلاياالخلوية 24 ، تم تطوير نظامين للفحص التكميلي: (1) علاج الخلايا السرطانية بوسط مكيف بالخلايا الليفية (CM) ، و (2) الزراعة المشتركة المباشرة للأرومات الليفية والخلايا السرطانية. تقوم هذه المقايسات بتقييم خصائص الخلايا السرطانية الرئيسية ، بما في ذلك التكاثر والنمو المستقل عن المرسى والهجرة. لتوحيد تأثير العوامل المفرزة ، تم تركيز الوسائط المكيفة من CAFs و NFs وقياسها كميا (conCM) بناء على محتوى البروتين الكلي.

يمكن أن يدعم إظهار التأثيرات الوظيفية المهمة من خلال هذه المقايسات تحديد الوسطاء الهامين لتكوين الأورام المدفوعة ب CAF ، مما يوفر أهدافا محتملة للتدخل العلاجي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أجريت هذه الدراسة في امتثال تام للمبادئ التوجيهية المؤسسية لاستخدام العينات السريرية ، على النحو المعتمد من قبل لجنة أخلاقيات البيولوجيا في مستشفى Città della Salute Molinette في تورينو ، إيطاليا. تم الحصول على جميع العينات بعد توقيع الموافقة المستنيرة من قبل المرضى المشاركين. يوفر القسم التالي بروتوكولا مفصلا خطوة بخطوة لعزل الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) ونظيراتها الليفية الطبيعية المتطابقة (NF). يتضمن البروتوكول تشريح الورم والمناطق غير السرطانية المجاورة ، ومعالجة الأنسجة ، وزراعة الخلايا ، والتوصيف الظاهري والوظيفي للخلايا المعزولة. يجب تنفيذ جميع الإجراءات في ظل ظروف معقمة داخل خزانة سلامة حيوية معتمدة. تمت زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو مرطب يحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 باستخدام وسط النسر المعدل الكامل من Dulbecco (cDMEM) ، مكمل بنسبة 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، و 100 وحدة / مل بنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ، ما لم ينص على خلاف ذلك. يتم تنفيذ جميع خطوات الطرد المركزي مع تعشيق الفرامل. راجع جدول المواد للحصول على قائمة شاملة بالكواشف والمواد والمعدات المستخدمة في جميع أنحاء البروتوكول. تم تحسين هذه المنهجية لعينات سرطان البروستاتا عالية الخطورة ، مع درجة جليسون 4 + 3 أو أعلى.

1. تشريح العينة الجراحية

ملاحظة: تم إجراء هذا الإجراء على العينات الجراحية التي تم جمعها من إجراءات استئصال البروستاتا الجذري25 التي أجريت على المرضى المصابين بسرطان البروستاتا عالي الدرجة (PCa) ، وتمت إدارتها باتباع بروتوكولات موحدة ، بناء على المبادئ التوجيهية المؤسسية الداخلية والأدبيات الدولية الراسخة وأفضل الممارسات26،27،28.

  1. ضع غدة البروستاتا تحت غطاء للسلامة الحيوية على ستارة معقمة ، وقم بتوجيهها وفقا للمعالم التشريحية.
    ملاحظة: يجب تنفيذ هذا الإجراء من قبل طبيب أمراض المسالك البولية المتمرس.
  2. باستخدام شفرة معقمة ، قم باستئصال شرائح الأنسجة من المناطق المحددة في تقرير الخزعة قبل الجراحة على أنها ورمية أو خالية من الخلايا السرطانية.
  3. إجراء تحليل سريع للتبريد29 على عينتي الأنسجة، عن طريق تحضير أقسام الأنسجة بسمك 2.5 ميكرومتر وتلطيخها بالهيماتوكسيلين واليوزين (H&E) للتحقق من وجود أو عدم وجود خلايا سرطانية في المناطق المختارة، وفقا لمعايير تشخيص سرطان البروستاتا الغدي في أحدث إصدار من تصنيف منظمة الصحة العالمية30 (انظر الشكل 1 أ).
    ملاحظة: في حالة ظهور تناقضات ، كرر عملية أخذ العينات حتى يتم الحصول على تأكيد نسيجي لكل من المناطق الورمية وغير الورمية.
  4. استئصال ما يقرب من 10 مم2 عينات من المناطق الورمية وغير الورمية ، وضعها في أنابيب مخروطية سعة 15 مل تحتوي على 7 مل من مخزن تخزين الأنسجة المثلجة ، واحتفظ بها على الجليد للإجراءات اللاحقة.
    ملاحظة: يمكن تخزين العينات عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 48 ساعة في هذا المخزن المؤقت.

2. عزل الخلايا الليفية

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع إجراءات المعالجة التالية على الجليد عند 4 درجات مئوية ما لم يذكر خلاف ذلك. انظر الشكل 1 أ للحصول على مخطط.

  1. اليوم 1: وزن عينات الأنسجة.
    ملاحظة: يتم الحصول على 70-100 مجم في المتوسط.
  2. انتقل إلى أطباق 6 سم وقم بإجراء أربع غسلات متتالية ، مرتين في 4 مل من PBS المثلج ومرتين في 4 مل من cDMEM المثلج ، وكلاهما مكمل ب 200 وحدة / مل من البنسلين ، 200 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين (2x) ، باستخدام ملقط معقم لنقل الأنسجة من طبق إلى آخر.
  3. قم بتعطيل الأنسجة ميكانيكيا عن طريق وضعها في صفيحة 6 سم على الثلج ، مع 1 مل من DMEM مكمل ب 100 U / مل بنسلين G و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ، ثم فرمها إلى شظايا صغيرة (<1 مم2) باستخدام مقص أو شفرات.
  4. انقله إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 5 مل من cDMEM المثلج. جهاز طرد مركزي عند 754 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  5. استخدم ماصة سعة 10 مل لإزالة المادة الطافية بعناية وإعادة تعليق الحبيبات في 5 مل من cDMEM المثلج. جهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 754 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  6. قم بإزالة المادة الطافية على النحو الوارد أعلاه وأعد تعليق الحبيبات في Collagenase II (1 مجم / مل في DMEM) ، باستخدام 1 مل / 100 مجم من الأنسجة. انتقل إلى أنبوب دقيق سعة 1.5 مل.
    ملاحظة: نظرا لتباين دفعات الكولاجيناز ، اختبر دفعات مختلفة وتأكد من أن لديها ما يكفي لإجراء جميع عمليات العزل المتوقعة.
  7. قم بتغطية الأنابيب بغشاء البارافين وهضم عينات O / N (8-12 ساعة) عند 37 درجة مئوية مع التأرجح المستمر.
    ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات التالية في اليوم 2.
  8. انقل العينات إلى أنابيب مخروطية سعة 15 مل وأضف 5 مل من cDMEM المثلج إلى تعليق الخلية لتعطيل الكولاجيناز ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 754 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يتم التخلص من الكولاجيناز عن طريق شفطه في حاوية تحتوي على منظفات.
  9. قم بشفط المادة الطافية باستخدام ماصة سعة 10 مل وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من 0.05٪ Trypsin / EDTA. احتضن لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية ، مع رج الرج من حين لآخر.
  10. أضف 1 مل من DNase I إلى العينات واخلطها جيدا. استخدم محلول 25 مجم / مل طازجا في PBS.
    ملاحظة: يساعد علاج DNase I في هذه المرحلة في الحصول على محلول خلية واحدة.
  11. جهاز طرد مركزي عند 754 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  12. استخدم ماصة سعة 10 مل لشفط المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 5 مل من cDMEM البارد. جهاز طرد مركزي عند 754 × جم لمدة 5 دقائق و 4 درجات مئوية.
  13. إعادة تعليق الخلايا في 20٪ FBS cDMEM. صفيحة واحتضانها عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، و 95٪ رطوبة لمدة 3 أيام على الأقل. احرص على عدم تحريك / إمالة الطبق. للحصول على 70-100 مجم من الأنسجة ، قم بتوزيع تعليق الخلية في أطباق 2 × 3.5 سم ، في 2 مل من المتوسط. قم بتقليص الحجم وفقا لذلك إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: أقل من 50 مجم من الأنسجة سيؤدي إلى اشتقاق خلوي غير فعال. يظهر مخطط التقسيم والتجميد في الشكل 1 ب.
  14. بعد 3 أيام ، افحص الخلايا بحثا عن مورفولوجيا / قابلية للحياة واستبدل 2/3 من الوسط للحفاظ على عوامل النمو التي تنتجها الخلايا. سيستغرق الأمر حوالي 7-10 أيام حتى تصل الخلايا إلى التقاء ، لتحل محل الوسط كل يومين.
  15. بمجرد التقاء الخلايا ، قم بتمرير الخلايا إلى طبق واحد مقاس 10 سم في 20٪ FBS cDMEM.
  16. استبدل الوسيط كل يومين ، باستخدام 15٪ FBS متوسط مرتين ، ثم مرة واحدة ، 12.5٪ ، ثم 10٪. بالنسبة لتحليلات FACS ، تتبع مخزونات استخراج وتجميد الحمض النووي الريبي والبروتين المخطط الوارد في الشكل 1 ب.
  17. انقسام الخلايا عندما تتلاقى حوالي 100٪ (حوالي 10 أيام). اغسل 2-3 مرات باستخدام PBS وفير لمدة 5 دقائق لكل منهما. أضف 1٪ من التربسين / EDTA (2x) وضعها في الحاضنة ، وتحقق من انفصال الخلية كل بضع دقائق.

3. حالة الاستزراع

  1. قم بتمرير الخلايا فقط عندما تكون ملتقية بنسبة 100٪ ، لا تزيد عن 1: 3.
  2. قم بتجميد الحصص المقابلة ل 50٪ من طبق ملتقى 10 سم في 0.5 مل من وسط التجميد المثلج (10٪ DMSO في FBS). قم بإذابة كل قطعة في طبق 10 سم.
    ملاحظة: متوسط وقت المضاعفة هو 80-90 ساعة.

4. تحليل FACS

ملاحظة: يضمن هذا البروتوكول توصيفا موثوقا به لمجموعة الخلايا الليفية ويحدد التلوث المحتمل من الخلايا الظهارية أو البطانية أو المناعية. يتم إجراء تحليل FACS في المقطع 2 ، كما هو موضح في الشكل 2 أ.

  1. حصاد الخلايا وإعادة تعليقها في مخزن FACS المؤقت (PBS بالإضافة إلى 2٪ FBS) بتركيز 106 خلايا / مل.
  2. قم بتسمية أنابيب قياس التدفق الخلوي وأضف 1 × 105 خلايا في حجم 100 ميكرولتر في كل منها. للتلوين ب 4 أجسام مضادة ، قم بإعداد 11 أنبوبا لحساب كل من التلوين والبوابات ، على النحو التالي (الجدول 1)
    ملاحظة: 1 أنبوب ، لا توجد أجسام مضادة (تحكم غير ملطخ) ، لتقييم التألق الذاتي للخلية ، 1 أنبوب مع التحكم في النمط المتملي للجسم المضاد ، لتقييم ارتباط محدد ، 4 أنابيب ، لكل منها جسم مضاد واحد ، للتعويض ؛ يمكن أن تحل حبات التعويض محل الخلايا ، 4 أنابيب مضان ناقص واحد (FMO) للبوابات ، كل منها يترك أحد الأجسام المضادة ، 1 أنبوب مع جميع الأجسام المضادة الأربعة (العينة الفعلية). يتم استخدام الأجسام المضادة التالية ذات العلامات الفلورية (انظر جدول المواد): (1) Anti-EpCAM-PE (علامة الخلية الظهارية) ، (2) Anti-CD31-VioBlue (علامة الخلية البطانية) ، (3) Anti-CD45-FITC (علامة الخلية المناعية) ، (4) Anti-CD90-APC (علامة الخلايا الليفية). يمكن استخدام الأجسام المضادة المترافقة مع الفلوروفورات الأخرى ، وفقا لمرشحات مقياس التدفق الخلوي المتاحة. قم بتنفيذ جميع الخطوات على الجليد للحفاظ على صلاحية الخلية.
  3. احتضان الخلايا باستخدام حاصرات المستقبلات القابلة للتبلور (FcR) ، مثل الأجسام المضادة النقية المضادة ل CD16 / CD32 أو المخزن المؤقت المانع (PBS 1٪ -2٪ BSA). استخدم كاشف حجب FcR 1-5 ميكرولتر لكل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية ، واحتضانه عند 4 درجات مئوية لمدة 10-15 دقيقة.
  4. استمر مباشرة في تلطيخ دون غسل. أضف تخفيفات الأجسام المضادة المناسبة أو عناصر التحكم في النمط المتماثل المقابلة إلى الأنابيب ، كما هو محدد في الجدول 1.
  5. اخلطيها برفق واحتضانها عند 4 درجات مئوية في الظلام لمدة 30 دقيقة.
  6. يغسل ب 2 مل من المخزن المؤقت FACS.
  7. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم ، عند 4 درجات مئوية.
  8. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من المخزن المؤقت FACS الجديد.
  9. أضف صبغة الجدوى (يوديد البروبيديوم) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
  10. احصل على العينات على مقياس التدفق الخلوي.
  11. استخدم عناصر التحكم في التعويض أحادية اللون لإعداد مصفوفة التعويض. لتحليل البيانات ، قم بتطبيق استراتيجية البوابات التالية على مخططات كثافة FACS:
  12. بوابات مبعثرة أمامية وجانبية: مؤامرة FSC-A مقابل. SSC-A وتصميم منطقة حول مجموعة الخلايا الرئيسية لاستبعاد الحطام الخلوي.
  13. للاستبعاد المزدوج: المؤامرة FSC-A مقابل. FSC-W (أو FSC-H مقابل. FSC-A) وتصميم منطقة لاستبعاد كتل الخلايا ، والتي ستظهر زيادة في العرض بالنسبة للمنطقة (أو زيادة المساحة بالنسبة للارتفاع). حدد الخلايا المفردة وقم بتنفيذ نفس الإجراء، مع رسم SSC-A مقابل. SSC-W (أو SSC-H مقابل. SSC-A) لزيادة نقاء سكان الخلية الواحدة.
  14. ارسم صبغة الجدوى (أي يوديد البروبيديوم) مقابل. SSC-A وحدد الخلايا الحية السلبية.
  15. في الخلايا الحية ، ارسم CD326 (المحور السيني) مقابل CD31 (المحور y) ؛ استخدم عينات FMO المقابلة لضبط البوابات بدقة. يسمح FMO للمرء بحساب انتشار التألق في قناة معينة تسببها الفلوروفورات الأخرى.
    1. بالنظر إلى عينة CD326 FMO ، ارسم بوابة رباعية تتضمن جميع الخلايا في الأرباع اليسرى (أي سالبة ل CD326). كرر نفس الإجراء باستخدام عينة CD31 FMO لضبط البوابة من أجل الحصول على جميع خلايا FMO في الأرباع السفلية (أي سلبية ل CD31). استخدم هذا الربع لتحليل العينات، وحدد الخلايا الموجودة في الربع الأيسر السفلي (CD31- CD326-).
  16. كرر نفس الإجراء مع رسم CD326 (المحور السيني) مقابل. CD45 (المحور y)، باستخدام CD326 FMO و CD45 FMO لتعيين البوابة الرباعية. استخدم هذا الربع لتحليل جميع العينات وتحديد الخلايا في الربع الأيسر السفلي (CD45- CD326-).
  17. مؤامرة CD90 مقابل. SSC-A واستخدم CD90 FMO لتعيين منطقة تستبعد الخلايا السالبة وتتضمن CD90 + فقط. استخدم هذه المنطقة لتحليل جميع العينات ، وقياس النسبة المئوية لخلايا CD90 + . النتائج التمثيلية موضحة في الشكل 2 أ.

5. خلود الخلايا الليفية

ملاحظة: يتم تحقيق تخليد مجموعات CAF و NF عن طريق التنبيغ المستقر مع ناقل فيروسي قهقري يعبر عن hTERT. فيما يلي بروتوكولات لتحضير جزيئات الفيروسات الزائفة المعدية وتحويل الخلايا.

  1. إنتاج جزيئات الفيروسات القهقرية
    1. اليوم 1 ، طلاء بولي L-lysine وطلاء الخلايا: قم بتغطية طبق 10 سم ب 6 مل من محلول بولي إل ليسين (0.1 مجم / مل في H2O) ، واحتضن لمدة 5 دقائق تحت غطاء محرك TC ، واستنشق ، واترك الطبق المفتوح يجف تحت غطاء المحرك قبل طلاء 3 × 106 خلايا HEK293T.
    2. اليوم 2: أضف 30 ميكرولتر من كاشف التعداء بوساطة الدهون الكاتيونية إلى 0.75 مل وسط محسن خال من المضادات الحيوية لشفط الدهون.
    3. في موازاة ذلك ، أضف 2 ميكروغرام من ناقل تغليف pCL-Ampho Retrovirus و 2 ميكروغرام من بلازميدات pBABE-puro-hTERT إلى 0.75 مل أخرى من الوسط المحسن الخالي من المضادات الحيوية.
    4. احتضن لمدة 5 دقائق في RT.
    5. امزج المخففتين في أنبوب مخروطي سعة 15 مل واحتضانه لمدة 20 دقيقة في RT.
    6. وفي الوقت نفسه ، استبدل وسط HEK293T ب 6 مل من الوسط المحسن لعمل الدهون المكمل بنسبة 10٪ FBS.
    7. قم بتوزيع مجمعات الحمض النووي برفق على سطح الطبق واحتضانها لمدة 6 ساعات إلى O / N في حاضنة CO2 المرطبة.
    8. اليوم 3: استبدل الوسط ب 7 مل من cDMEM واحتضانه لمدة 48 ساعة.
      ملاحظة: بدءا من هذه الخطوة ، يجب تنفيذ العمل في منشأة زراعة الأنسجة من المستوى 3 (BSL3) للسلامة البيولوجية ، وفقا للقواعد المؤسسية.
    9. في اليوم 5 ، اجمع الوسط المحتوي على الفيروس وقم بالتصفية من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر.
    10. Aliquot وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  2. التنبيغ الفيروسي
    1. اليوم 1: الخلايا الليفية ذات الممر المنخفض عند التقاء 60٪ في بئرين من صفيحة مكونة من 6 آبار.
    2. اليوم 2: استبدل الوسط ب 1 مل من مستحضر الفيروس القهقري pBABE-puro-hTERT المنتج مسبقا والذي يحتوي على 8 ميكروغرام / مل من البوليبرين واحتضانه لمدة 12-16 ساعة.
    3. اليوم 3: استبدل الوسط المحتوي على الفيروس ب 2 مل من cDMEM.
    4. اليوم 4: بعد 24 ساعة، ابدأ جولتين لمدة 48 ساعة من اختيار بورومايسين (2 ميكروغرام/مل).
      ملاحظة: يجب تحديد التركيز تجريبيا لكل دفعة من المضادات الحيوية ونوع الخلايا ، ويجب اختيار أقل تركيز لقتل جميع الخلايا في غضون 4 أيام من الاختيار.
    5. اليوم 8: تحقق من أن خلايا التحكم غير المصابة قد ماتت جميعا. استبدل الوسط ب cDMEM واترك الخلايا المصابة تنمو حتى تلتقي قبل مرورها 1: 3. دع الخلايا تصل إلى التقاء وتنقسم مرة أخرى 1: 3. في هذه المرحلة ، يمكن للخلايا الخروج من منشأة BLS3.
      ملاحظة: قم بإعداد الحصص المجمدة في أسرع وقت ممكن. لضمان حدوث الخلود ، قم بتمرير الخلايا من 5 إلى 6 مرات وسجل معدلات مورفولوجيتها وازدواجها ، والتي لا ينبغي أن تتغير مع المقاطع. قارن وظيفيا الخلايا الخالدة بنظيراتها الأساسية ، باستخدام الطرق الموضحة أدناه.

6. توصيف الخلايا الليفية

  1. يحلل الخلايا المعزولة بشكل ظاهري للتعبير عن علامات CAF / NF ، ويميز وظيفيا لأنشطتها المحتملة المؤيدة للأورام على الخلايا السرطانية.
    ملاحظة: تم الإبلاغ عن قليل النوكليوتيدات والأجسام المضادة qPCR المحسنة لتقييم مستويات تعبير العلامات على كل من مستويات الحمض النووي الريبي والبروتين في الجدول 2 وجدول المواد ، على التوالي. احذر من أن الأجسام المضادة ضد بروتين تنشيط الخلايا الليفية (FAP) غالبا ما تكون غير محددة. تأكد من تضمين الضوابط الإيجابية والسلبية المناسبة31،32. يمكن استخدام طرق مختلفة لتقييم الحديث المتبادل بين الخلايا الليفية والخلايا السرطانية. هنا ، يتم وصف طريقتين بديلتين ، يتألفان إما من معالجة الخلايا السرطانية بوسط مشروط (CM) مشتق من CAFs أو NFs ، أو الزراعة المشتركة للأرومات الليفية والخلايا السرطانية. يتم وصف فعالية أي من النهجين لتعزيز تكاثر الخلايا السرطانية.

7. تحضير وتركيز الوسط المكيف

ملاحظة: يتم تركيز الوسط المكيف وجرعته بدقة بعد التجميع لتسهيل المقارنة بين الخلايا المختلفة.

  1. ضع الخلايا عند التقاء 70٪ في طبق 15 سم في cDMEM.
  2. في اليوم التالي ، قم بالتبديل إلى 15 مل من وسط التجويع (DMEM بدون FBS) واحتضنه لمدة 48 ساعة لإنتاج CM.
  3. اجمع CM ، جهاز الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في RT ، وقم بالتصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر للتخلص من حطام الخلية وتعقيمها.
  4. نقل إلى أنابيب التركيز (MWCO 10,000 Da) ، وأجهزة الطرد المركزي 20 دقيقة عند 2000 × جم و 4 درجات مئوية ، أو وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، للحصول على حوالي 1 مل من CM المركز (conCM) ، أي تركيز 15 ×.
  5. Aliquot conCM وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  6. حدد محتوى البروتين في conCM الذي تم جمعه باستخدام مقايسة البروتين اللوني.
    ملاحظة: متوسط التركيز الذي تم الحصول عليه هو 0.5 و 2 ميكروغرام / ميكرولتر ، ولا يزال من الممكن استخدام تركيزات أقل.

8. اختبار الانتشار

ملاحظة: تم تقييم تكاثر الخلايا (باستخدام خطوط خلايا PCa البشرية DU145 أو LNCaP) باستخدام أداة تحليل الخلايا الحية في ظل إعدادين مختلفين ، إما معالجة الخلايا السرطانية باستخدام conCM ، أو المشاركة في زراعتها باستخدام CAFs أو NFs. في هذه الحالة ، يجب استخدام الخلايا السرطانية الفلورية. النتائج التمثيلية موضحة في الشكل 3.

  1. مقايسة الانتشار عند المعالجة ب conCM
    ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول لخلايا DU145 ؛ قد تتطلب الخلايا المختلفة تعديلات.
    1. خلايا ورم الصفيحة في cDMEM في صفيحة 96 بئرا (750 خلية / بئر) ، مع الأخذ في الاعتبار ما لا يقل عن 3 مكررات لكل حالة ، واحتضان O / N.
    2. يستعاض عن cDMEM بوسط تجويع ، مكملا أم لا ، ب 50 ميكروغرام / مل من conCM.
    3. انقل اللوحة إلى غرفة أداة تحليل الخلايا الحية داخل الحاضنة.
    4. اتركيه دافئا عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، ثم ابدأ المسح الأول.
    5. استخدم قناة تباين الطور ، واختر هدفا مناسبا وعدد الحقول / البئر المطلوب (يوصى باستخدام هدف 10x و 5 حقول / بئر) ، ونوع المسح القياسي. مسح كل 6 ساعات لمدة 4-5 أيام (يجب تحديد المدة تجريبيا للظروف وأنواع الخلايا).
    6. قم بإجراء التحليل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
    7. احسب لكل بئر (التكرارات الفنية لكل شرط) تغير الطية بالنسبة لقيمته في الوقت صفر. قم بإنشاء الرسوم البيانية المقابلة وتقييم الأهمية الإحصائية باستخدام البرامج المناسبة.
  2. اختبار الانتشار عند الزراعة المشتركة
    1. لوحة مشتركة 750 تعبر عن RFP خلايا DU145 و CAFs أو NFs بنسبة 1: 3 في cDMEM في لوحة 96 بئرا.
    2. في اليوم التالي، قم بالتبديل إلى 2٪ FBS DMEM. انقل اللوحة إلى غرفة أداة تحليل الخلايا الحية في الحاضنة وابدأ المسح القياسي كل 6 ساعات لمدة 4 أيام ، باستخدام كل من تباين الطور والقناة البرتقالية.
    3. قم بإجراء تحليل الانتشار وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
    4. احسب لكل بئر (التكرارات الفنية لكل شرط) تغير الطية بالنسبة لقيمته في الوقت صفر. قم بإنشاء الرسوم البيانية المقابلة وتقييم الأهمية الإحصائية باستخدام البرامج المناسبة.

9. فحص هجرة التئام الجروح

ملاحظة: هنا ، يتم تقديم نسخة آلية من اختبار الخدشالكلاسيكي 33 لقياس هجرة الخلايا ، باستخدام أداة تحليل الخلايا الحية.

  1. خلايا سرطانية صفيحية في صفيحة 96 بئرا مناسبة لأداة تحليل الخلايا الحية للحصول على طبقة أحادية التقاء.
  2. في اليوم التالي ، عالج الخلايا ب 10 ميكروغرام / مل من ميتومايسين سي لمدة ساعتين.
    ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لتجنب تكاثر الخلايا أثناء الفحص ، مما قد يربك النتائج.
  3. ضع الخدش على الآبار باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
  4. يغسل ب 100 ميكرولتر من PBS لإزالة الخلايا المنفصلة.
  5. أضف وسط التجويع ، مع 50 مجم / مل أو بدون (تحكم).
  6. ضع اللوحة في غرفة تحليل الخلايا الحية في الحاضنة.
  7. بعد 30 دقيقة ، قم ببرمجة بروتوكول مسح التئام الجروح الموصى به ، كل 4 ساعات لمدة يوم واحد أو أكثر ، اعتمادا على الخلايا والظروف.
  8. قم بتحليل النتائج وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).

10. نمو مستقل عن المرسى عن طريق فحص أجار الناعم

  1. لوحة CAFs أو NFs عند التقاء 70٪ في ألواح من 12 بئرا ، تاركة ثلاثة آبار فارغة كعنصر تحكم.
  2. في اليوم التالي ، قم بإعداد محلول مخزون أجار ناعم 4x (3.6٪) عن طريق إضافة 0.45 جم من أجار منخفض الذوبان إلى 12.5 مل PBS في أنبوب مخروطي سعة 50 مل في ظل ظروف معقمة.
  3. تذوب في فرن الميكروويف. احذر من الغليان المفرط الذي قد يتسبب في تركيز المحلول.
  4. تبرد عند 37 درجة مئوية ، ثم قم بإعداد محلول عمل 1x عن طريق تخفيف 1: 4 باستخدام cDMEM الدافئ مسبقا.
  5. استنشق الوسط من اللوحة المكونة من 12 بئرا وأضف 500 ميكرولتر من محلول أجار 1x إلى كل بئر.
  6. اتركه يتماسك لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، مع تخزين باقي محلول الأجار عند 37 درجة مئوية.
  7. وفي الوقت نفسه ، قم بالتربسين في الخلايا السرطانية وقم بإعداد معلق خلوي 2 × 104 خلية / مل.
  8. امزج كميات متساوية من تعليق الخلية ومحلول أجار 1x عن طريق سحب العينات عدة مرات ، وقم بتوزيع 500 ميكرولتر (أي 5000 خلية) فوق طبقة الأجار الأولى في كل بئر. تأكد من تحضير ما لا يقل عن 10٪ من تعليق الخلية.
  9. دع الأجار يتجمد عن طريق الحضانة لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  10. أضف 1 مل من cDMEM إلى كل بئر وجددها كل يومين عن طريق شفط الوسط برفق من حافة البئر وإضافة الوسط الطازج إلى المنتصف ، بالتنقيط تقريبا لتجنب إزاحة طبقة الأجار الناعمة.
  11. احتضان حتى تظهر مستعمرات يمكن رؤيتها بسهولة. عادة ما تستغرق خلايا DU145 حوالي 12 يوما ، مع اختلافات طفيفة.
  12. تخلص من المستعمرات المتوسطة والبقع عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من محلول كلوريد النيتروبلو تيترازوليوم (1 مجم / مل في PBS). احتضان بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة.
  13. بمجرد تلطيخ المستعمرات ، تخلص من محلول الصبغة واحصل على الصور باستخدام المجهر المجسم. ضع اللوحة على مرحلة المجهر واضبط التكبير على أدنى قيمة لها (0.8x) للتأكد من أن البئر بأكمله مرئي. استخدم مقبض التركيز البؤري الخشن لإضفاء التركيز البؤري الحاد للمستعمرات ، ثم اضبط إعدادات الإضاءة والوضع قبل التقاط الصور.
  14. استخدم البرنامجالمناسب 34 لتحديد عدد المستعمرة والمساحة المحتلة باتباع الخطوات المنصوص عليها في الملف التكميلي 1.
  15. سجل توزيع عدد وحجم المستعمرات (انظر الشكل 4).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم عزل أزواج CAF و NF من 7 مرضى PCa عالي الدرجة بنجاح باستخدام هذا البروتوكول. يتم تلخيص عمر المرضى في الجراحة ودرجات جليسون في الجدول 3. لتقييم نقاء مجموعات الخلايا الليفية المشتقة ، تم فصل ممر اثنين من CAFs و NFs الأولية وتلطيخها بالأجسام المضادة الفلورية المشار إليها أو باستخدام يوديد بروبيديوم لتقييم موت الخلايا المبرمج. تظهر النتائج التمثيلية لتحليل FACS اللاحق في الشكل 2 أ ، مع تسليط الضوء على استراتيجية البوابات والنسب المئوية للخلايا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوفر اشتقاق الخلايا وتحليلها من أنسجة PCa نموذجا تجريبيا ذا صلة ، لا سيما بالنظر إلى أن النماذج الحيوانية المتاحة لا تكرر تشريح البروستاتا البشري بشكل كامل وتطور المرض37. تشبه غدد البروستاتا في الشمبانزي تشريحيا البشر ولكنها تظهر تطورا بطيئا وعشوائيا للمرض ، بالإضافة إلى وجود قيود أخلاقية. تختلف اختلافا كبيرا في بنية البروستاتا وعلم الأحياء المرضي وتتطور إلى مرض البروستاتا المتقطع المرتبط بالعمر. تختلف النماذج المعملية الشائعة مثل الفئران والفئران في تشريح البروست...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح متضاربة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل الجمعية الإيطالية لأبحاث السرطان (AIRC) ، IG16930 و IG24851 إلى نائب الرئيس. وزارة الجامعة والبحث الإيطالية (MIUR PRIN 2017 و 2022 إلى نائب الرئيس) ؛ مؤسسة Truus and Gerrit van Riemsdijk ، ليختنشتاين ، التبرع لنائب الرئيس ؛ منطقة بيدمونت (انحراف). تم دعم A.S. من قبل زمالة ما بعد الدكتوراه التابعة لمؤسسة أبحاث السرطان الإيطالية (FIRC) ، وتم دعم لوس أنجلوس من قبل Fondazione Umberto Veronesi. الشكل 2 تم إنشاؤه باستخدام BioRender.com.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
12 صحن بئرسارستيدت833921
24 صحن بئرسارستيدت833922
6 صحن بئرسارستيدت833920
96 لوحة بئرسارستيدت833924
ماوس مضاد ل GAPDH mAb (6C5)سيجما ألدريتشسي بي 1001المصدر: فأر. التخفيف ل WB: 1: 1000
aSMAسيجما ألدريتشA5228 المصدر: فأر. التخفيف ل WB: 1: 3000
كافيولينتقنية إشارات الخليةCST3267المصدر: أرنب. التخفيف ل WB: 1: 1000
CD31-VioBlueميلتيني بيوتيك130-119-980قياس التدفق الخلوي AB ، علامة الخلايا البطانية
CD326-PE (EPCAM)ميلتيني بيوتيك130113-826قياس التدفق الخلوي Ab ، علامة الخلية الظهارية
CD45-FITCميلتيني بيوتيك130-110769قياس التدفق الخلوي Ab ، علامة الكريات البيض
CD90-APCميلتيني بيوتيك130-114-903قياس التدفق الخلوي Ab ، علامة الخلايا الليفية
الكولاجين السادس (COL6A1)أبكامأب182744المصدر: أرنب. التخفيف ل WB: 1: 1000
أنبوب مخروطي 15 ملسارستيدت62554502
أنبوب مخروطي 50 ملسارستيدت62547254
أنابيب Microtubes Cryopure 2 ملسارستيدت72380992
صفيحة الاستزراع قطرها 100 مم   ؛كورنينج353003
صفيحة الاستزراع قطرها 100 مم   ؛كورنينج353025
صفيحة ثقافة قطرها 60 مم   ؛كورنينج353002
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)سيجما ألديرشD8418استخدم في غطاء بيولوجي
دولبيكو النسر المعدل s متوسط (DMEM)جيبكو11965092يخزن في 4 ° ج ، استخدم في غطاء بيولوجي
فابأبكامأب53066المصدر: أرنب. التخفيف لهيكل الأسباب: 1:500
كاشف حجب FcR ، إنسانميلتيني بيوتيك130-059-901مانع لجنة الاتصالات الفيدرالية
مصل الأبقار الجنينية (FBS)جيبكو16000044يخزن في 4 ° ج ، استخدم في غطاء بيولوجي
نصائح مفلترة 10 µ Lسارستيدت703010255
نصائح مفلترة 100 µ Lسارستيدت703030255
نصائح مفلترة 1000 µ Lسارستيدت703060255
نصائح مفلترة 20 µ Lسارستيدت703030265
نصائح مفلترة 200 µ Lسارستيدت703031255
Filtropur S Plus 0,20 µ ؛ م  سارستيدت831826102
ملقط2بيول1102412
FSP1 / S100A4تقنية إشارات الخليةD9F9D (13018)المصدر: أرنب. التخفيف لهيكل العمل: 1:2000
IL6تقنية Abclonalأ 0286المصدر: أرنب. التخفيف ل WB: 1: 1000
إيمج جيالمعهد الوطني للصحةالإصدار 1.53cبرنامج لتحليل الصور
لوحة incucyte imagelock 96 بئرسارتوريوسبكالوريوس -04857
Incucyte® SX5سارتوريوسSX5أداة تحليل الخلايا الحية 
كاشف التعداء ليبوفيكتامين 2000ثيرموفيشر العلمية11668019كاشف تعداء دهني الكاتيون
MACS ® حل تخزين الأنسجةميلتيني بيوتيك130-100-008
قارئ صفيحة دقيقة (امتصاص 600 نانومتر)بروميجاجي إم 3500
الأنابيب الدقيقة 1.5 مل   ؛سارستيدت7269001
إن كادأبكامأب18203المصدر: أرنب. التخفيف ل WB: 1: 1000
نيترو بلو رباعي الزيوم   ؛سيجما ألديرشرقم 5514
بارافيلم  سيجما ألديرشHS234526B
بيبي بورو إتش تيرتأدجين1771يخزن في -20 درجة ؛ ج ، استخدم في غطاء بيولوجي
بي سي إل-أمفونوفوس بيولوجي NBP2-29541يخزن في -20 درجة ؛ ج ، استخدم في غطاء بيولوجي
PDGFRBسانتا كروزSC-432المصدر: أرنب. التخفيف ل WB: 1: 1000
البنسلين الستربتومايسين (PS ، 10،000 &mu ؛ ز / مل)  جيبكو15140122يخزن في 4 ° ج ، استخدم في غطاء بيولوجي
مجهر تباين الطور   ؛أوليمبوس بي اكس 42
الفوسفات المحلول الملحي المخزن  (برنامج تلفزيوني)محلي الصنعكلوريد الصوديوم, 137 ملم; KCl ، 2.7 ملي ؛ Na2HPO4 ، 10 ملي ؛ KH2PO4 ، 1.8 ملم. الأوتوكلاف والتخزين في RT
محلول بولي إل يسينسيجما ألديرشص 8920يخزن في 4 ° ج ، استخدم في غطاء بيولوجي
بورومايسين ثنائي هيدروكلوريدسيجما ألديرشص 8833
سيكورا شبه مايكرو بالانسسارتوريوسSECURA125-1 ثانية
ماصة مصلية 10 مل   ؛سارستيدت861254001
ماصة مصلية 2 مل   ؛سارستيدت861252001
ماصة مصلية 25 مل   ؛سارستيدت861256001
ماصة مصلية 5 مل   ؛سارستيدت861253001
إحصائيات 3CST9139المصدر: فأر. التخفيف ل WB: 1: 1000
ستات3 Y705CST9131المصدر: أرنب. التخفيف ل WB: 1: 1000
مجهر مجسملايكاMZ125
حقنة 10 ملخماسي00202260D12
تيرمو ميكرإيبيندورف22331
التربسين-EDTA (0.5٪) ، بدون فينول أحمرجيبكو15400054
فيمسانتا كروزSC-6260المصدر: فأر. التخفيف لهيكل العمل: 1:2000
مكثف الطرد المركزي Vivaspin 20   ؛سيجما ألديرشZ614602MWCO 10,000 دولار أمريكي ؛
مقص فاغنر2بيول14070-12

المراجع

  1. Bray, F. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 74 (6), 229-263 (2024).
  2. Yadav, S. S., Stockert, J. A., Hackert, V., Yadav, K. K., Tewari, A. K. Intratumor heterogeneity in prostate cancer. Urol Oncol. 36 (8), 349-360 (2018).
  3. Owen, J. S., Clayton, A., Pearson, H. B. Cancer-associated fibroblast heterogeneity, activation and function: Implications for prostate cancer. Biomolecules. 13 (1), 67(2023).
  4. Ge, R., Wang, Z., Cheng, L. Tumor microenvironment heterogeneity an important mediator of prostate cancer progression and therapeutic resistance. NPJ Precis Oncol. 6, 1-8 (2022).
  5. Pejčić, T., Todorović, Z., Đurašević, S., Popović, L. Mechanisms of prostate cancer cells survival and their therapeutic targeting. Int J Mol Sci. 24 (3), 2939(2023).
  6. Shoag, J., Barbieri, C. Clinical variability and molecular heterogeneity in prostate cancer. Asian J Androl. 18 (4), 543-548 (2016).
  7. Segura-Moreno, Y. Y., Sanabria-Salas, M. C., Varela, R., Mesa, J. A., Serrano, M. L. Decoding the heterogeneous landscape in the development of prostate cancer. Oncol Lett. 21 (5), 376(2021).
  8. Hägglöf, C., Bergh, A. The stroma-a key regulator in prostate function and malignancy. Cancers (Basel. 4 (2), 531-548 (2012).
  9. Teng, L. K. H., et al. Mast cell-derived SAMD14 is a novel regulator of the human prostate tumor microenvironment. Cancers (Basel). 13 (6), 1-25 (2021).
  10. Galbo, P. M., Zang, X., Zheng, D. Molecular features of cancer-associated fibroblast subtypes and their implication on cancer pathogenesis, prognosis, and immunotherapy resistance. Clin Cancer Res. 27 (9), 2636-2647 (2021).
  11. Mao, X., et al. Crosstalk between cancer-associated fibroblasts and immune cells in the tumor microenvironment: New findings and future perspectives. Mol Cancer. 20 (1), 1-30 (2021).
  12. Pederzoli, F., et al. Stromal cells in prostate cancer pathobiology: Friends or foes. Br J Cancer. 128 (6), 930-939 (2022).
  13. Sasaki, T., Franco, O. E., Hayward, S. W. Interaction of prostate carcinoma-associated fibroblasts with human epithelial cell lines in vivo. Differentiation. 96, 40-48 (2017).
  14. Cirri, P., Chiarugi, P. Cancer-associated fibroblasts, and tumor cells: A diabolic liaison driving cancer progression. Cancer Metastasis Rev. 31 (1-2), 195-208 (2012).
  15. Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: A dynamic niche in cancer progression. J Cell Biol. 196 (4), 395-406 (2012).
  16. Kahounová, Z. The fibroblast surface markers FAP, anti-fibroblast, and FSP are expressed by cells of epithelial origin and may be altered during epithelial-to-mesenchymal transition. Cytometry A. 93 (9), 941-951 (2018).
  17. Giannoni, E., et al. Reciprocal activation of prostate cancer cells and cancer-associated fibroblasts stimulates epithelial-mesenchymal transition and cancer stemness. Cancer Res. 70 (17), 6945-6956 (2010).
  18. Paland, N., et al. Differential influence of normal and cancer-associated fibroblasts on the growth of human epithelial cells in an in vitro cocultivation model of prostate cancer. Mol Cancer Res. 7 (8), 1212-1235 (2009).
  19. Jaeschke, A., et al. Cancer-associated fibroblasts of the prostate promote a compliant and more invasive phenotype in benign prostate epithelial cells. Mater Today Bio. 8, 100073(2020).
  20. Ellem, S. J., et al. A pro-tumourigenic loop at the human prostate tumor interface orchestrated by oestrogen, CXCL12 and mast cell recruitment. J Pathol. 234 (1), 86-98 (2014).
  21. Lawrence, M. G., et al. Alterations in the methylome of the stromal tumor microenvironment signal the presence and severity of prostate cancer. Clin Epigenetics. 12 (1), 48(2020).
  22. Nguyen, E. V. Proteomic profiling of human prostate cancer-associated fibroblasts (CAF) reveals LOXL2-dependent regulation of the tumor microenvironment. Mol Cell Proteomics. 18 (7), 1410-1427 (2019).
  23. Smith, M. C., Goddard, E. T., Perusina Lanfranca, M., Davido, D. J. hTERT extends the life of human fibroblasts without compromising type I interferon signaling. PLoS One. 8 (3), e58233(2013).
  24. Kay, E. J., et al. Cancer-associated fibroblasts require proline synthesis by PYCR1 for the deposition of pro-tumorigenic extracellular matrix. Nat Metab. 4 (6), 693-710 (2022).
  25. Huynh, L. M., Ahlering, T. E. Robot-assisted radical prostatectomy: A step-by-step guide. J Endourol. 32, S28-S32 (2018).
  26. Srigley, J. R., et al. Protocol for the examination of specimens from patients with carcinoma of the prostate gland with guidance from the CAP Cancer and CAP Pathology Electronic Reporting Committees. , https://documents.cap.org/protocols/cp-prostate-2017-v4020.pdf (2017).
  27. Goldblum, J. R., Lamps, L. W., McKenney, J. K. Rosai and Ackerman's Surgical Pathology E-Book. , https://books.google.it/books/about/Rosai_and_Ackerman_s_Surgical_Pathology.html?id=7ZEDwAAQBAJ (2024).
  28. Montironi, R., Beltran, A. L., Mazzucchelli, R., Cheng, L., Scarpelli, M. Handling of radical prostatectomy specimens: Total embedding with large-format histology. Int J Breast. 2012, (2012).
  29. Arcega, R. S., Woo, J. S., Xu, H. Performing and cutting frozen sections. Methods Mol Biol. 1897, 279-288 (2019).
  30. IARC. WHO Classification of Tumors, 5th edition, volume 8: Urinary and male genital tumors. , https://www.iarc.who.int/news-events/who-classification-of-tumours-5th-edition-volume-8-urinary-and-male-genital-tumours/ (2025).
  31. Sfanos, K. S., et al. If this is true, what does it imply? How end-user antibody validation facilitates insights into biology and disease. Asian J Urol. 6 (1), 10-25 (2019).
  32. Brennen, W. N., et al. Overcoming stromal barriers to immuno-oncological responses via fibroblast activation protein-targeted therapy. Immunotherapy. 13 (2), 155-175 (2021).
  33. Pinto, B. I., Cruz, N. D., Lujan, O. R., Propper, C. R., Kellar, R. S. In vitro scratch assay to demonstrate effects of arsenic on skin cell migration. J Vis Exp. (133), e58838(2019).
  34. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  35. Sauzay, C., Voutetakis, K., Chatziioannou, A. A., Chevet, E., Avril, T. CD90/Thy-1, a cancer-associated cell surface signaling molecule. Front Cell Dev Biol. 7, 444743(2019).
  36. True, L. D., et al. CD90/THY1 is over-expressed in prostate cancer-associated fibroblasts and could serve as a cancer biomarker. Mod Pathol. 23 (10), 1346(2010).
  37. Strand, D. W., Aaron, L. T., Henry, G., Franco, O. E., Hayward, S. W. Isolation and analysis of discreet human prostate cellular populations. Differentiation. 91 (4-5), 139(2015).
  38. Krönig, M., et al. Cell type-specific gene expression analysis of prostate needle biopsies resolves tumor tissue heterogeneity. Oncotarget. 6 (2), 1302-1314 (2014).
  39. Goldstein, A. S., et al. Purification and direct transformation of epithelial progenitor cells from primary human prostate. Nat Protoc. 6 (5), 656-667 (2011).
  40. Kassen, A., et al. Stromal cells of the human prostate: Initial isolation and characterization. Prostate. 28 (2), 89-97 (1996).
  41. Linxweiler, J., et al. Cancer-associated fibroblasts stimulate primary tumor growth and metastatic spread in an orthotopic prostate cancer xenograft model. Sci Rep. 10 (1), 12575(2020).
  42. Liu, A. Y., et al. Cell-cell interaction in prostate gene regulation and cytodifferentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10705-10710 (1997).
  43. Olumi, A., et al. Carcinoma-associated fibroblasts direct tumor progression of initiated human prostatic epithelium. Cancer Res. 59 (19), 5002(1999).
  44. Luthold, C., Hallal, T., Labbé, D. P., Bordeleau, F. The extracellular matrix stiffening: A trigger of prostate cancer progression and castration resistance. Cancers (Basel). 14 (12), 2887(2022).
  45. Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 40 (8-9), 268-277 (2004).
  46. Yun, Y. R., et al. Fibroblast growth factors: Biology, function, and application for tissue regeneration. J Tissue Eng. 1 (1), 1-18 (2010).
  47. Baranyi, U., et al. Primary human fibroblasts in culture switch to a myofibroblast-like phenotype independently of TGF beta. Cells. 8 (7), 721(2019).
  48. Ortiz-Otero, N., et al. Cancer-associated fibroblasts confer shear resistance to circulating tumor cells during prostate cancer metastatic progression. Oncotarget. 11 (12), 1037-1050 (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة