Method Article

تسلسل Amplicon باستخدام تقنيات التسلسل طويل القراءة

DOI:

10.3791/68370

⸱

August 29th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Science and Innovation - National Research Foundation Centre of Excellence for Biomedical Tuberculosis Research, South African Medical Research Council Centre for Tuberculosis Research, Division of Molecular Biology and Human Genetics, Faculty of Medicine and Health Sciences, Stellenbosch University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تحسين هذا البروتوكول من أجل التسلسل العميق المستهدف ل 18 منطقة مقاومة للأدوية في المتفطرة السلية باستخدام منصة تسلسل طويلة القراءة، متبوعا بتحليل باستخدام خط أنابيب المعلوماتية الحيوية الخاص بالسل مصمم للبيانات طويلة القراءة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تواصل منظمة الصحة العالمية التأكيد على الحاجة الملحة إلى طريقة تشخيص سريعة وفعالة من حيث التكلفة وسهلة الاستخدام للسل والسل المقاوم للأدوية. وقد أدت تكنولوجيات الجيل التالي من التسلسل الوظيفي، التي أقرتها منظمة الصحة العالمية، إلى تحسين الكشف عن السل المقاوم للأدوية بشكل كبير. من بين هذه ، يتيح NGS المستهدف (tNGS) الكشف المركز عن الطفرات الجينية المرتبطة بمقاومة الأدوية ، مما يلغي الحاجة إلى التشخيص التقليدي القائم على الثقافة. يوفر اختبار tNGS المستخدم على نطاق واسع اختبارا سريعا وشاملا للحساسية للأدوية ولكن تم تحسينه بشكل أساسي لمنصات التسلسل بدقة عالية. ومع ذلك، فإن التكلفة العالية لأنظمة التسلسل هذه تحد من إمكانية الوصول إليها في البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل، ولا سيما في جميع أنحاء أفريقيا. تقدم تقنيات التسلسل المحمولة بديلا واعدا ، حيث توفر المرونة ومتطلبات البنية التحتية المنخفضة. في هذه الدراسة ، تم استخراج الحمض النووي من عزلات السل المقاوم للريفامبيسين (RR-TB) ، وتم تضخيمه باستخدام اختبار tNGS ، وتسلسله على منصة تسلسل محمولة. تم أيضا تسلسل منتجات التضخيم نفسها على منصة تسلسل عالية الدقة للقراءة القصيرة لتكون بمثابة مرجع. تمت معالجة البيانات من جهاز التسلسل المحمول باستخدام خط أنابيب المعلوماتية الحيوية المصمم لتسلسل القراءة الطويلة ، بينما تم تحليل بيانات تسلسل القراءة القصيرة باستخدام تطبيق قائم على الويب. أظهر التحليل أن نهج تسلسل القراءة الطويلة نجح في تحديد المتغيرات المرتبطة بالمقاومة عالية التردد التي تم اكتشافها عن طريق تسلسل القراءة القصيرة ولكنه أظهر قيودا في الكشف عن المتغيرات منخفضة التردد.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يزال السل سببا رئيسيا للوفيات على الصعيد العالمي ويمثل تحديا مستمرا للصحة العمومية، خاصة في البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل1،2. وعلى الرغم من المبادرات الرامية إلى تعزيز تدابير مكافحة السل، إلا أن التقدم كان بطيئا، ويرجع ذلك جزئيا إلى الصعوبات في تحقيق تقنيات تشخيصية سريعة ودقيقة وفعالة من حيث التكلفة وشاملة3، 4، 5. في حين أن طرق التشخيص الجزيئي مثل فحوصات المسبار الخطي (LPAs) واختبارات تضخيم الحمض النووي الآلية (NAATs) قد سرعت من تحديد السل والسل المقاوم للأدوية (DR-TB) ، فإن اكتشافها المحدود للطفرات يقيد اختبار الحساسية الدوائية الشامل (DST). ولهذا القيد أهمية خاصة في البلدان المثقلة بالعبء الشديد للسل6، 7، 8، 9.

ولمعالجة هذه القيود، أوصت منظمة الصحة العالمية باستخدام تكنولوجيات التسلسل من الجيل التالي، التي برزت كأدوات قوية لترصد السل والكشف عن مقاومته. يوفر كل من نهج تسلسل الجينوم الكامل (WGS) ونهج NGS المستهدف (tNGS) تغطية طفرة أوسع ، مما يتيح تحديد المتغيرات المرتبطة بالمقاومة عبر أدوية متعددة8،12،13،14،15. بينما يوفر تسلسل الجينوم الكامل (WGS) تقريرا شاملا للتوقيت الصيفي ، فإن اعتماده على الثقافة يجعله غير مناسب للتشخيص السريع ، حيث يمكن أن تستغرق الثقافة ما يصل إلى ستة أسابيع15،16،17. تقدم NGS المستهدفة بديلا أفضل لأنها لا تعتمد على الثقافة. يمكن إجراء التسلسل مباشرة من العينات السريرية18. ونتيجة لذلك، أوصت منظمة الصحة العالمية باستخدام ثلاثة فحوصات tNGS للتوقيت الصيفي: مقايسة Deeplex Myc-TB: يكشف هذا الاختبار عن مقاومة الريفامبيسين والإيزونيازيد والفلوروكينولونات والأمينوغليكوزيدات (أميكاسين والكاناميسين والكابريوميسين) والإيثامبوتول والبيرازيناميد والإيثيوناميد19 و20 و21. اختبار السل الحارس: يستهدف هذا مقاومة الريفامبيسين والأيزونيازيد والفلوروكينولونات وأدوية الخط الثاني القابلة للحقن18،20. اختبار السل المائي المائي القيادي: يحدد هذا المقاومة للريفامبيسين والإيزونيازيد والفلوروكينولون وأدوية الخط الثاني القابلة للحقن. تم تحسين هذه المقايسات للاستخدام على منصة القراءة القصيرة نظرا لدقتهاالعالية 20. من ناحية أخرى ، توفر منصات ONT MinION طويلة القراءة بيانات في الوقت الفعلي ، وقابلية النقل ، وإمكانية التنفيذ الفعال من حيثالتكلفة 22،23. ومع ذلك ، فإن الاستخدام الواسع النطاق ل NGS محدود بسبب متطلبات البنية التحتية والتكلفة ، خاصة مع أنظمة القراءة القصيرة10.

اختبار Deeplex هو الأكثر شمولا من بين المقايسات الثلاثة الموصى بها. وقد صمم هذا الاختبار في الأصل لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل متعدد الإرسال في 18 منطقة مرتبطة بمقاومة 13 دواء مضادا للسل. ومع ذلك، أوصت منظمة الصحة العالمية به لعلاج 10 أدوية مضادة للسل، مما يشير إلى حساسية ونوعية كافية. قامت هذه الدراسة بتحسينه للاستخدام مع ONT MK1B MinION ، وهي منصة تسلسل طويلة القراءة. يقلل نظام خلايا التدفق المحمول والقابل لإعادة الاستخدام لهذه المنصة من تكاليف البنية التحتية وتكاليف التسلسل المحتملة لكل عينة4،22،23. بينما تم تطوير فحوصات أخرى متوافقة مع القراءة الطويلة ، فإنها تميل إلى أن يكون لها نطاق محدود للتوقيت الصيفي ، وعادة ما تستهدف نطاقا ضيقا فقط من جينات المقاومة. في المقابل ، يوفر الاختبار تغطية مستهدفة واسعة ، مما يجعله أداة تشخيص أكثر شمولا للتوقيت الصيفياللامركزي 24،25. يتم توفير قائمة مفصلة بالأهداف الجينومية التي تم تضخيمها بواسطة الفحص وارتباطات الأدوية المقابلة لها في الجدول 1 ، مع تسليط الضوء على القدرات التشخيصية للمقايسة25.

قبل استخراج الحمض النووي ، يجب تطهير العينات وتعطيلها بموجب ظروف السلامة البيولوجية من المستوى 3 (BSL-3) ، باتباع احتياطات السلامة اللازمة25 ، 26 ، 27. يجب دمج التضخيم الداخلي والضوابط الخارجية في كل شوط ، مع تتبع التلوث من خلال الضوابط السلبية والتقييمات المختبرية الروتينية25. يجب تقييم مقاييس الجودة المهمة ، بما في ذلك عمق القراءة واتساع التغطية ونجاح التضخيم ، بعد التسلسل. وبالنسبة للتسلسل المستهدف، تنصح منظمة الصحة العالمية بعمق قراءة لا يقل عن 100 ضعف لكل أمبليكون وتغطية كافية لجميع مناطق مقاومة الأدوية المستهدفة للسماح بالكشف عن المتغيرات الطفيفة الموجودة بنسبة ≥5٪28. وتؤيد منظمة الصحة العالمية طرق التسلسل المستهدفة هذه لتحديد مقاومة أدوية الخط الأول والثاني، بافتراض أن أنظمة ضمان الجودة قد أنشئت وأن جميع المناطق المستهدفة مشمولة بما فيه الكفاية28.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء هذا البحث كجزء من مشروع TS ELiOT ، الذي حصل على موافقة أخلاقية من لجنة أخلاقيات البحث البشري (HREC) في جامعة ستيلينبوش (N21 / 09/093) في 20 أكتوبر 2021. بالإضافة إلى ذلك ، حصلت على إذن من Western Cape Health Research لاستخدام المرافق الحكومية. تم جمع العينات من خلال جهد تعاوني مع NHLS Green Point وجامعة Stellenbosch ، بموجب رقم موافقة SU HREC N09 / 11/296. الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير العينة

  1. تعطيل الحرارة
    1. احتضان مزارع MGIT عند 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لتحقيق تعطيل كامل للحرارة في ظل ظروف BSL-3.
    2. تابع استخراج الحمض النووي باستخدام طريقة InstaGene29.
  2. استخراج الحمض النووي
    1. ضع 5 مل من ثقافة MGIT المعطلة بالحرارة في أنبوب سعة 15 مل.
    2. جهاز طرد مركزي عند 4000 × جم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    3. قم بإزالة المادة الطافية بعناية عن طريق سحب العينات ، وترك الرواسب.
    4. أضف 200 ميكرولتر من كاشف استخراج الحمض النووي القائم على الخلب إلى الرواسب واحتضانه عند 56 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    5. انقل المحلول إلى أنبوب بغطاء لولبي سعة 2 مل وأضف ثلاث حبات زجاجية بقطر 2 مم لكل منها.
    6. دوامة لمدة 10 ثوان لنشر الخلايا ووضع الأنابيب في حاضنة حمام جاف عند 100 درجة مئوية لمدة 8 دقائق.
    7. قم بتجانس العينات باستخدام الخالط المضبوطات بالخرز بالإعدادات التالية: 3 دورات مدة كل منها 20 ثانية بسرعة 4.0 م / ث.
    8. جهاز طرد مركزي عند 12,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند RT ونقل 130 ميكرولتر من المادة الطافية (السائل المحتوي على الحمض النووي) بعناية إلى أنبوب 1.5 مل ، وتجنب الرواسب والحطام.
    9. أعد تعليق الخرزات عن طريق النقر أو الدوامة وأضف 156 ميكرولتر من الخرزات إلى أنبوب 1.5 مل يحتوي على الحمض النووي المستخرج.
    10. قم بتحريك الماصة ببطء لأعلى ولأسفل 10 مرات لخلطها واحتضانها عند RT لمدة 5 دقائق.
    11. ضع الأنابيب على رف مغناطيسي لمدة 5 دقائق لفصل الخرز المرتبط بالحمض النووي.
      ملاحظة: يجب أن يظهر مادة طافية شفافة فوق حبيبات مضغوطة من الخرز المغناطيسي الداكن على جانب الأنبوب المواجه للمغناطيس ، مما يشير إلى الاستعداد لإزالة المادة الطافية.
    12. ماصة من المادة الطافية دون إزعاج الخرز.
    13. أضف 100 ميكرولتر من الإيثانول الطازج بنسبة 80٪ إلى حبيبات الخرزة أثناء وجودها على الرف واتركها لمدة 30 ثانية ، ثم قم بإزالة الإيثانول. كرر خطوة الغسيل.
    14. جفف حبيبات الخرزة بالهواء في RT لمدة 5 دقائق. تأكد من أن حبيبات الخرزة تبدو غير لامعة ولا يتبقى أي سائل مرئي قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
    15. قم بإزالة الأنبوب من الرف المغناطيسي.
    16. أضف 25 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز (NFW) مباشرة إلى الخرزات المجففة وأعد تعليقها عن طريق سحب العينات برفق لأعلى ولأسفل 10 مرات.
    17. احتضن في RT لمدة 5 دقائق.
    18. أعد الأنبوب إلى الرف المغناطيسي لمدة 5 دقائق أخرى.
    19. انقل الحمض النووي المملوطة بعناية (المادة الطافية) إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل.
    20. قم بقياس تركيز الحمض النووي باستخدام كاشف القياس الكمي dsDNA القائم على التألق عالي الحساسية.
      ملاحظة: يمكن تخزين الحمض النووي في فريزر -20 درجة مئوية أو متابعة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
  3. التضخيم (PCR)
    1. تعدد تفاعل البوليميراز المتسلسل وتنظيف ما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة25.
    2. قم بقياس تركيز الحمض النووي باستخدام كاشف القياس الكمي dsDNA القائم على التألق عالي الحساسية.
  4. الرحلان الكهربائي للهلام
    1. قم بإعداد جل الاغاروز بنسبة 2٪ عن طريق إذابة مسحوق الاغاروز في 1x TAE عازل من خلال تسخين الميكروويف حتى يذوب تماما.
    2. أضف 5 ميكرولتر من صبغة هلام الحمض النووي الفلورية غير السامة إلى الاغاروز المذاب واخلطها جيدا.
    3. يسكب مزيج الجل في صينية صب جل مزودة بمشط لتشكيل آبار.
    4. اسمح للجل بالتصلب عند RT.
    5. بمجرد التصلب ، قم بإزالة المشط وضع صينية الجل في خزان الرحلان الكهربائي المملوء بمخزن مؤقت 1x TAE.
    6. قم بتحميل 5 ميكرولتر من سلم الحمض النووي kb ممزوجا ب 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحميل في البئر الأول.
    7. لكل منتج PCR ، امزج 5 ميكرولتر من المنتج مع 5 ميكرولتر من مخزن التحميل وقم بتحميله في آبار فردية.
    8. قم بتشغيل الجل عند 100 فولت لمدة 1 ساعة.
    9. تصور نطاقات الحمض النووي باستخدام نظام توثيق الهلام مع الإضاءة.

2. إعداد مكتبة ONT

  1. نهاية الإعداد
    1. احسب 100 نانوغرام من كل عينة أمبليكون بناء على التركيز وانقل الحجم المطلوب إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل النظيف.
    2. لحساب الكتلة الكلية (بالنانوغرام) للأمبليكونات في عينة معينة ، اضرب تركيز العينة (نانوغرام / ميكرولتر) في حجمها المتبقي (ميكرولتر) بعد مراقبة الجودة (QC).
      ملاحظة: على سبيل المثال ، إذا كان تركيز العينة 2 نانوغرام / ميكرولتر وحجم متبقي قدره 1 ميكرولتر بعد مراقبة الجودة ، فإن كتلة الأمبليكون الإجمالية هي:
      الكتلة الكلية = 2 نانوغرام / ميكرولتر × 1 ميكرولتر = 45 نانوغرام
      لتحضير 10 نانوغرام من الأمبليكونات للتسلسل ، استخدم صيغة التخفيف:
      ج1فولت1 = ج2فولت2
      حيث: C1 = 45 ng ، V1 = غير معروف ، C2 = 10 ng ، V2 = 1 ميكرولتر ، V1 = (C2 × V2) / C1 = (10 ng × 1 μL) / 45 ng = μL
      وبالتالي ، يجب استخدام μL من عينة الأمبليكون الأولية للحصول على 10 نانوغرام من الحمض النووي للتسلسل.
    3. اضبط الحجم الإجمالي لكل عينة إلى 12.5 ميكرولتر باستخدام NFW.
    4. امزج العينات برفق عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل 10 مرات وتدويرها لفترة وجيزة.
    5. أضف 1.75 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتفاعل الإصلاح النهائي والذيل A و 0.75 ميكرولتر من مزيج إنزيم endrepair و A-tailing لكل عينة.
    6. تخلط جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 10 مرات ثم تدويرها لفترة وجيزة.
    7. احتضان الأنابيب في جهاز تدوير حراري عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، متبوعا ب 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: في هذه المرحلة ، إذا قرر المستخدم إيقاف العملية ، فمن المستحسن استخدام الخرز لتنقية الحمض النووي النهائي. يمكن بعد ذلك تخزين الحمض النووي المنقى عند 4 درجات مئوية لمدة أقصاها سبعة أيام.
  2. ربط الباركود الأصلي
    1. قم بإذابة وإعداد الخرزات المغناطيسية لتنقية الحمض النووي واختيار الحجم ، وخرز تنظيف الحمض النووي المغناطيسي ، و EDTA ، والرموز الشريطية الأصلية (NB01-96) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، ثم ضعها على الجليد.
    2. في أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل الجديدة ، أضف ما يلي بالتسلسل: 2.75 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز ، و 1 ميكرولتر من الحمض النووي الجاهز ، و 1.25 ميكرولتر من الرموز الشريطية الأصلية (NB01-96) ، و 5 ميكرولتر من مزيج إنزيم ربط الحمض النووي.
    3. امزج كل تفاعل عن طريق سحب العينة برفق 10 مرات ، ثم قم بالتدوير لفترة وجيزة باستخدام جهاز طرد مركزي دقيق ، واحتضانه لمدة 20 دقيقة في RT.
    4. أضف 1 ميكرولتر من EDTA إلى كل بئر ، واخلطها جيدا عن طريق سحب العينات ، ثم قم بتدويرها لفترة وجيزة.
    5. عينات مشفرة في حمام السباحة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
    6. أعد تعليق حبات تنظيف الحمض النووي عن طريق الدوامة وأضف 0.7 ضعف إجمالي حجم العينة المجمعة (على سبيل المثال ، بالنسبة ل 23 عينة بحجم إجمالي قدره 253 ميكرولتر ، أضف 177.1 ميكرولتر من الخرز).
    7. امزج المحلول عن طريق سحب العينات واحتضانه على HulaMixer لمدة 10 دقائق في RT.
    8. تحضير 2 مل من 80٪ إيثانول عن طريق خلط 1600 ميكرولتر من الإيثانول النقي مع 400 ميكرولتر NFW.
    9. ضع الأنبوب على رف مغناطيسي لمدة 5 دقائق حتى يصبح التميص صافيا وعديم اللون.
    10. قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها دون إزعاج الحبيبات.
    11. اغسل الخرزات ب 700 ميكرولتر من الإيثانول 80٪ المحضر حديثا دون إزعاج الحبيبات ، ثم قم بإزالة الإيثانول والتخلص منه.
    12. كرر خطوة غسل الإيثانول.
    13. الطرد المركزي للأنبوب لفترة وجيزة ، والعودة إلى الرف المغناطيسي ، وإزالة الإيثانول المتبقي.
    14. اترك الخرزات تجف في الهواء لمدة 30 ثانية.
    15. قم بإزالة الأنبوب من الرف المغناطيسي ، وأعد تعليق الخرزات في 35 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز عن طريق النقر اللطيف ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    16. أعد الأنبوب إلى الرف المغناطيسي حتى يصبح الشطف صافيا وعديم اللون.
    17. انقل 35 ميكرولتر من المصفاة إلى أنبوب نظيف للطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل للخطوات اللاحقة.
      ملاحظة: يمكن تخزين المكتبة عند 4 درجات مئوية طوال الليل في هذه المرحلة.
  3. ربط المحول وتنظيفه
    1. قم بإعداد مجموعة كاشف ربط الحمض النووي السريع وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وضعها على الجليد.
    2. امزج المحول الأصلي (NA) و Quick Ligase عن طريق سحب العينات، ثم ضعه على الثلج.
    3. قم بإذابة المخزن المؤقت للشطف (EB) عند RT ، والدوامة ، وجهاز الطرد المركزي ، وضعه على الجليد.
    4. قم بإذابة المخزن المؤقت للشظايا القصيرة (SFB) في RT ، والدوامة ، وأجهزة الطرد المركزي ، وضعها على الجليد.
    5. في أنبوب طرد مركزي دقيق منخفض الارتباط سعة 1.5 مل ، امزج ما يلي: 30 ميكرولتر من العينة المشفرة المجمعة ، و 5 ميكرولتر من المحول الأصلي (NA) ، و 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتفاعل الربط السريع ، و 5 ميكرولتر من ليغازي الحمض النووي T4 سريع المفعول.
    6. قم بخلط الماصة برفق للخلط وجهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة واحتضانها لمدة 20 دقيقة في RT.
    7. أعد تعليق حبات تنظيف الحمض النووي عن طريق الدوامة وأضف 20 ميكرولتر (0.4x) من الخرز إلى التفاعل.
    8. تخلط برفق عن طريق سحب العينة وتحتضن على HulaMixer لمدة 10 دقائق في RT.
    9. قم بتكسير الخرزات على رف مغناطيسي وشفط المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات.
    10. اغسل الخرزات بإضافة 125 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشظايا القصيرة (SFB) ، وأعد تعليقها عن طريق النقر ، وجهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة ، ثم أعد إلى الرف المغناطيسي.
    11. بيليه الخرز وشفط المادة الطافية ؛ كرر خطوة الغسيل مرة واحدة.
    12. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة ، وأعد الأنبوب إلى الرف المغناطيسي ، واستنشق أي مادة طافية متبقية.
    13. قم بإزالة الأنبوب من الرف المغناطيسي وأعد تعليق الخرزات في 15 ميكرولتر من Elution Buffer (EB).
    14. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لتصفية الحمض النووي.
    15. ضع الأنبوب على الرف المغناطيسي ، وحبيب الخرزات حتى يصبح الشطف واضحا وعديم اللون ، واستنشق 15 ميكرولتر من المصفاة في أنبوب نظيف للطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل.
    16. حدد 1 ميكرولتر من التصريف.
    17. قم بتخفيف المكتبة إلى 20 fmol (احسب باستخدام حاسبة NEB) واستخدم 12 ميكرولتر من المكتبة المعدة 20 fmol للتسلسل على خلية التدفق R10.4.1.
      ملاحظة: يمكن الآن تخزين المكتبة عند -20 درجة مئوية ، مما يسمح بالاستخدام المتكرر.
  4. تحضير وتحميل خلية تدفق تسلسل المسام النانوية
    1. قم بإذابة المخزن المؤقت للتسلسل (SB) وخرز المكتبة (LIB) وحبل خلية التدفق (FCT) وتدفق خلية التدفق (FCF) في RT ، واخلطها عن طريق الدوامة ، وقم بتدويرها.
    2. قم بإعداد مزيج تحضير خلايا التدفق عن طريق الجمع بين 5 ميكرولتر من ألبومين مصل الأبقار (BSA ، 50 مجم / مل) ، و 30 ميكرولتر من حبل خلية التدفق (FCT) ، و 1170 ميكرولتر من تدفق خلية التدفق (FCF) ، وخلط المحلول عن طريق الانعكاس والماصة.
    3. افتح منفذ التحضير لخلية التدفق ، واستنشق ~ 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإزالة فقاعات الهواء ، وقم بتحميل 800 ميكرولتر من مزيج التحضير في منفذ التحضير دون إدخال فقاعات هواء ، وانتظر لمدة 5 دقائق.
    4. قم بإعداد المكتبة عن طريق خلط 37.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتسلسل (SB) ، و 25.5 ميكرولتر من حبات المكتبة (LIB) أو محلول المكتبة (LIS) ، و 12 ميكرولتر من مكتبة الحمض النووي 20 fmol في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ، وخلطه جيدا عن طريق سحب العينات.
    5. قم بتجهيز خلية التدفق مرة أخرى عن طريق رفع غطاء منفذ عينة خلية التدفق برفق ، وتحميل 200 ميكرولتر من مزيج التحضير في منفذ التحضير دون إدخال فقاعات هواء ، وإعداد المكتبة للتحميل.
    6. امزج المكتبة المعدة برفق عن طريق سحب العينات وتحميل 75 ميكرولتر من المكتبة في منفذ عينة خلية تدفق التسلسل بالتنقيط ، مما يضمن تدفق كل قطرة إلى المنفذ قبل إضافة القطرة التالية.
    7. أغلق غطاء منفذ عينة خلية التدفق، وتأكد من دخول السدادة إلى منفذ عينة خلية التدفق، ثم أغلق منفذ التحضير.
    8. قم بتوصيل جهاز التسلسل المحمول بجهاز كمبيوتر (مزود بمصدر طاقة غير منقطع) وابدأ التسلسل باستخدام برنامج التحكم والتحليل لجهاز التسلسل.
  5. معلمات البرامج
    ملاحظة: يستخدم تطبيق البرنامج هذا ، الذي طورته ONT ، للإدارة الشاملة لعمليات تشغيل التسلسل وإنشاء تقارير مفصلة.
    1. لبدء عملية التسلسل ، يرجى تحديد خيار البدء متبوعا ببدء التسلسل.
      ملاحظة: سيطلب من المرء بعد ذلك تعيين مجلد لتخزين الملفات وتوفير اسم لتشغيل التسلسل الخاص بك ، على سبيل المثال ، "sequencing_run_1". بعد ذلك ، انقر فوق متابعة إلى الإعدادات لتحديد اسم المجموعة المناسب ، مثل library-sequencing-amplicons-native-barcoding-v14-sqk-nbd114-96 ، وتخصيص وقت التشغيل المطلوب ، على سبيل المثال ، 20 ساعة (الحد الأقصى لوقت التشغيل هو 72 ساعة).
    2. بعد ذلك ، اختر نوع ملف الإخراج ، واختر من بين خيارات مثل POD5 لقراءات الإخراج الأولية و FASTQ للمخرجات basecall. بعد ذلك، حدد نموذج FAST-Basecalling.
    3. يرجى ملاحظة أن بعض الإعدادات الافتراضية تتضمن مسحا متكررا للمسام كل 1.5 ساعة ، وطول قراءة لا يقل عن 200 نقطة أساس ، ودرجة جودة لا تقل عن 8. أخيرا ، راجع الإعدادات وابدأ عملية القراءة.

3. تحليل ما بعد التسلسل

  1. متطلبات النظام
    ملاحظة: دليل لإعداد البيئة وتحليل بيانات تسلسل متفطرة السل باستخدام خط أنابيب ONT-TB-NF. تلبي التعليمات احتياجات كل من مستخدمي Windows (عبر WSL) و macOS.
    1. استخدم ما يلي - نظام التشغيل: Windows 10/11 (مع WSL2) أو macOS ؛ الذاكرة: 8 جيجابايت من ذاكرة الوصول العشوائي (يوصى ب 16 جيجابايت) ؛ التخزين: 50 جيجابايت على الأقل من مساحة القرص الحرة ؛ الإنترنت: مطلوب لتنزيل الطرود والبيانات. الأذونات: القدرة على تثبيت البرامج وإدارة البيئات.
  2. تأكد من إعداد البيئة التالية: مستخدمو Windows (باستخدام WSL2). قم بتمكين WSL2.
    1. افتح PowerShell كمسؤول وقم بتشغيل: wsl - install.
    2. أعد تشغيل الكمبيوتر عندما يطلب منك ذلك.
  3. قم بتثبيت Ubuntu
    1. بعد إعادة التشغيل ، قم بتشغيل Microsoft Store ، وابحث عن Ubuntu ، وقم بتثبيت الإصدار المفضل (على سبيل المثال ، Ubuntu 22.04 LTS).
    2. قم بتشغيل Ubuntu من قائمة ابدأ .
    3. قم بإنشاء اسم مستخدم وكلمة مرور جديدين ل UNIX عندما يطلب منك ذلك.
    4. تحديث قوائم الحزم: sudo apt update & sudo apt upgrade -y.
  4. مستخدمو macOS
    1. قم بتثبيت Homebrew (إذا لم يكن مثبتا بالفعل): / bin / bash -c "$ (curl -fsSL https://raw.githubusercontent.com/Homebrew/install/HEAD/install.sh)".
    2. تثبيت الحزم المطلوبة: brew install git wget
  5. تثبيت Conda أو Mamba
    1. قم بزيارة صفحة تنزيل Miniconda لتنزيل المثبت الصحيح لنظام التشغيل.
    2. لتثبيت Miniconda ، قم بتشغيل برنامج التثبيت واتبع التعليمات التي تظهر على الشاشة. بعد اكتمال التثبيت ، يرجى إعادة تشغيل الجهاز
    3. تكوين قنوات Conda:
      Conda config --إضافة إعدادات القنوات الافتراضية
      تكوين Conda - إضافة قنوات BioConda
      تكوين Conda - إضافة قنوات Conda-Forge
    4. تركيب Mambaforge (Mamba)
      بالنسبة لنظام التشغيل Linux:
      ويجيت
      https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Mambaforge-Linux-x86_64.sh
      لنظام التشغيل macOS:
      ويجيت https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Mambaforge-MacOSX-arm64.sh
    5. قم بتثبيت Mambaforge: bash Mambaforge-*.sh
    6. اتبع التعليمات لإكمال التثبيت ، وأعد تشغيل جهازك لتنشيط Mamba.
  6. إعداد مسار ONT-TB-NF
    1. إنشاء بيئة Conda جديدة: conda create -n ont_tb_env samtools = 1.15.1 minimap2 = 2.24 nanoplot = 1.40.2 mosdepth = 0.3.3 flye = 2.9.1 nanofilt fastqc bedtools -c bioconda
    2. بدلا من ذلك ، استخدم Mamba: mamba create -n ont_tb_env samtools = 1.15.1 minimap2 = 2.24 nanoplot = 1.40.2 mosdepth = 0.3.3 flye = 2.9.1 nanofilt fastqc bedtools -c bioconda
    3. تنشيط البيئة: conda تنشيط ont_tb_env
    4. تثبيت Nextflow: curl -s https://get.nextflow.io | باش ، سودو MV NextFlow / USR / Local / BIN /
    5. استنساخ مستودع ONT-TB-NF: GIT CLONE https://github.com/HKU-BAL/ONT-TB-NF.git
      قرص مضغوط ONT-TB-NF
    6. اسحب صور Docker المطلوبة (في حالة استخدام Docker)
      عامل الإرساء سحب HKUBAL / Clair3: V0.1-R12
      عامل الإرساء سحب quay.io/biocontainers/tb-profiler:4.3.0--pypyh5e36f6f_0
  7. تشغيل المسار
    1. تسلسل ملفات Basecalled FASTQ الخاصة بكل عينة بشكل مستقل باستخدام الأمر التالي.
      قطة * .fastq.gz > concatenated.fastq.gz
      NextFlow Run run_tb_amplicon.nf \
      read_fq /path/to/concatenated.fastq.gz \
      sample_name SAMPLE_ID \
      amplicon_bed /path/to/amplicon_regions.bed \
      المواضيع 16 \
      output_dir /مطلق / مسار / إلى/output_directory
  8. ملفات الإخراج والتفسير
    1. عند التنفيذ الناجح، تأكد من أن المسار ينشئ المخرجات التالية في دليل الإخراج المحدد:
      1. القراءات المحاذاة: *ملفات .bam.
      2. المكالمات المتغيرة: *.vcf الملفات التي تحتوي على تعدد الأشكال وملفات الإيندل.
      3. تقارير موجزة: ملفات * .csv أو * .tsv تلخص طفرات مقاومة الأدوية والمقاييس الأخرى ذات الصلة.
      4. تقارير مراقبة الجودة: * ملفات .htmL التي تم إنشاؤها بواسطة أدوات مثل MultiQC.
      5. السجلات: سجلات مفصلة لتنفيذ خط الأنابيب.
      6. الملفات الوسيطة: مخزنة في دليل العمل / (يمكن حذفها بعد التشغيل الناجح).
        ملاحظة: في حالة مواجهة أخطاء في الأذونات ، من الضروري التحقق من امتلاك المرء للأذونات اللازمة لقراءة الملفات وكتابتها ، وكذلك لتنفيذ البرامج النصية. فيما يتعلق بالقضايا البيئية، يرجى التأكد من تنشيط بيئة Conda المناسبة قبل تنفيذ خط الأنابيب. بالنسبة لأولئك الذين يستخدمون ملفات تعريف Docker ، من الضروري التأكد من أن Docker مثبت وقيد التشغيل. بالإضافة إلى ذلك ، يجب على المرء مراقبة موارد النظام بدقة لتجنب أي قيود على الذاكرة أو التخزين أثناء التنفيذ. يتم عرض نظرة عامة على هذه المنهجيات في الشكل 1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم اختيار طريقة استخراج الحمض النووي المختارة لكفاءتها وإنتاجيتها المتفوقة مقارنة بالتقنيات السريعة الأخرى. لقد أنتجت باستمرار الحمض النووي الجيني عالي الجودة (gDNA) ، وساعد دمج خطوة التنظيف القائمة على الخرز في تقليل وقت المعالجة مع تقليل تكاليف كل عينة. وقد تحقق ذلك من خلال القضاء على الحاجة إلى تقييمات إضافية لمراقبة الجودة مثل القياسات الطيفية الضوئية، مع القياس الفلوري كأداة وحيدة لقياس كمية الحمض النووي. وجد أن تركيزات ما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل هي الأمثل للتسلسل على كل من م...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أظهرت منصة التسلسل طويلة القراءة مزايا ملحوظة في هذه الدراسة ، لا سيما قدرتها على تحقيق تسلسل سريع مع اتساع تغطية عال باستمرار. عبر جميع العزلات المتسلسلة بنجاح ، تم تحقيق اتساع تغطية بنسبة 99.9٪ ، مما يشير إلى تمثيل شبه كامل للمناطق الجينومية المرتبطة بالمقاومة. كان متوسط عمق التغطية عبر جميع الجينات المستهدفة 4462X ، حيث أظهر جين eis أعلى عمق عند 22,242.08X وجين RRS الأدنى عند 99.46X. تعكس هذه القيم قدرة المنصة على توليد بيانات كافية للتنبؤ الموثوق بمقاومة الأدوية

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نعرب عن خالص امتناننا لمركز SAMRC لمرض السل في جامعة ستيلينبوش لتوفير الموارد والمرافق الأساسية. كما أننا ممتنون بشدة لدراسة TS ELiOT لتوفير العينات التي كانت جزءا لا يتجزأ من هذه الدراسة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
15 مل & أنابيب ربط منخفض بسعة 1.5 مل أو 2 ملإبندورفEP0030108051-250EA
سلم 1 كيلوبايتثيرمو فيشر العلميSM0311
أنابيب غطاء لولبي بحجم 2 ملشركة ساينتيفش سبيشلتيز إنكP2TUB056C-0001.5ST
خرزات زجاجية معقمة بقطر 2 ممسيغما-ألدرتشZ273627-1EA
AMPure XP Beadبيكمان كولترA63881
ديبلكس Myc-TB جينوسكرين20090205
غرفة الرحلان الكهربائيثيرمو فيشر العلميA25977
كحول الإيثيلي، نقيسيغما-ألدرتشE7023-500ML
FastPrep HomogenizerMP Biomedicals116005500
رؤوس ماصات الفلتر (10 وميكرو؛ ل) بيو-سمارت ساينتيفكFT-10-R
أطراف ماصة التصفية (1000 وميكرو؛ ل) بيو-سمارت ساينتيفكFT-1000-R
رؤوس ماصة الفلتر (20 وميكرو؛ ل) بيو-سمارت ساينتيفكFT-20-R
رؤوس ماصات الفلتر (200 وميكرو؛ ل) بيو-سمارت ساينتيفكFT-200-R
Flow-cell تقنيات أكسفورد نانوبورFLO-MIN114
كتلة التدفئةإبندورف5382000031
مصفوفة إنستا جينبيو-رادBBRD7326030
Magnetic Rack ثيرمو فيشر ساينتفيك 12321D
الطرد المركزي الدقيقإبندورف 5406000046
التابعتقنيات أكسفورد نانوبورMK1B
مجموعة الترميز الشريطي الأصلي V14 تقنيات أكسفورد نانوبورSQK-NBD114.24
NEB Blunt/TA ليغاز ماستر ميكسNEBM0367
وحدة الربط السريع NEBNextNEBE6056
وحدة NEBNext Ultra II End/dA-tailingNEBE7546
مياه خالية من النوكلياز (NFW)ثيرمو فيشر العلميAM9937
الماصات (P10، P20، P200 وP1000)إبندورفEP3123000918-1EA
أنابيب التحليل الكيوبتثيرمو فيشر العلميس32856
مجموعة اختبار HS الكيوبت dsDNAثيرمو فيشر العلميس33231
فلورومتر الكيوبتثيرمو فيشر العلميQ33226
سلالة جل الحمض النووي الآمن SYBRثيرمو فيشر العلميS33102
ألترا بيور أغاروزثيرمو فيشر العلمي17852
جهاز الإضاءة الناقل Universal Hood III (نظام تصوير جزيئي Gel Doc XR)بيو-راد170-8170
خلاط الدوامةلاسيكWMBB0L0E0216

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tuberculosis report. Baltimore Health News. , WHO. (2022).
  2. WHO Malaria Department report. Report 20-23. , WHO. (2023).
  3. The End Strategy TB. 53 (1), WHO. 1689-1699 (2015).
  4. Cabibbe, A. M., et al. Application of targeted nextgeneration sequencing assay on a portable sequencing platform for culturefree detection of drugresistant tuberculosis from clinical samples. J Clin Microbiol. 58 (10), e0063220(2020).
  5. Jouet, A., et al. Deep amplicon sequencing for culturefree prediction of susceptibility or resistance to 13 antituberculous drugs. Eur Respir J. 57 (3), 2002338(2021).
  6. NG, K. C. S., et al. How well do routine molecular diagnostics detect Rifampin. J Clin Microbiol. 57 (1), e0128723(2019).
  7. MacLean, E., Kohli, M., Weber, S. F., Suresh, A. Advances in molecular diagnosis of tuberculosis. J Clin Microbiol. 58 (10), e0158219(2020).
  8. Sibandze, D. B., et al. Rapid molecular diagnostics of tuberculosis resistance by targeted stool sequencing. Genome Med. 14 (1), 42(2022).
  9. Shah, M., Chihota, V., Coetzee, G., Churchyard, G., Dorman, S. E. Comparison of laboratory costs of rapid molecular tests and conventional diagnostics for detection of tuberculosis and drugresistant tuberculosis in South Africa. BMC Infect. Dis. 13 (1), 352(2013).
  10. Hu, T., Chitnis, N., Monos, D., Dinh, A. Nextgeneration sequencing technologies: An overview. Hum Immunol. 82 (10), 801-811 (2021).
  11. Pervez, M. T., et al. A comprehensive review of performance of nextgeneration sequencing platforms. Biomed Res Int. 2022, 3457806(2022).
  12. Tafess, K., et al. Targetedsequencing workflows for comprehensive drug resistance profiling of Mycobacterium tuberculosis cultures using two commercial sequencing platforms: Comparison of analytical and diagnostic performance, turnaround time, and cost. Clin Chem. 66 (6), 809-820 (2020).
  13. Use of targeted nextgeneration sequencing to detect drugresistant tuberculosis. WHO rapid communication. , WHO. https://www.who.int/publications/i/item/9789240076372 (2023).
  14. Hazra, D., et al. Impact of wholegenome sequencing of Mycobacterium tuberculosis on treatment outcomes for MDRTB/XDRTB: A systematic review. Pharmaceutics. 15 (6), 1408(2023).
  15. Shea, J., et al. Comprehensive wholegenome sequencing and reporting of drug resistance profiles on clinical cases of Mycobacterium tuberculosis in New York State. J Clin Microbiol. 55 (6), 1871-1882 (2017).
  16. Meehan, C. J., et al. Whole genome sequencing of Mycobacterium tuberculosis: Current standards and open issues. Nat Rev Microbiol. 17 (10), 533-545 (2019).
  17. Heupink, T. H., Verboven, L., Warren, R. M., Van Rie, A. Comprehensive and accurate genetic variant identification from contaminated and lowcoverage Mycobacterium tuberculosis whole genome sequencing data. Microb Genom. 7 (1), e000555(2021).
  18. Wang, X., et al. Interpretation of the third edition of WHO consolidated guidelines on tuberculosis: Module 3: Diagnosis: Rapid diagnostics for tuberculosis detection. Chin J Antituberc. 46 (2), 120-130 (2024).
  19. Kambli, P., et al. Targeted nextgeneration sequencing directly from sputum for comprehensive genetic information on drugresistant Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis. 127 (1), 102051(2021).
  20. Use of targeted nextgeneration sequencing to detect drugresistant tuberculosis. Rapid Communication. , WHO. 1-8 (2023).
  21. Nandlal, L., Perumal, R., Naidoo, K. Rapid molecular assays for the diagnosis of drugresistant tuberculosis. Infect Drug Resist. 15 (1), 4971-4984 (2022).
  22. Dippenaar, A., et al. Nanopore sequencing for Mycobacterium tuberculosis: A critical review of the literature, new developments, and future opportunities. J Clin Microbiol. 60 (5), e0123422(2022).
  23. Chan, W. S., et al. Rapid and economical drug resistance profiling with nanopore MinION for clinical specimens with low bacillary burden of Mycobacterium tuberculosis. BMC Res Notes. 13 (1), 123(2020).
  24. Feuerriegel, S., et al. Rapid genomic first and secondline drug resistance prediction from clinical Mycobacterium tuberculosis specimens using DeeplexMycTB. Eur Respir J. 57 (4), 2004784(2021).
  25. GenoScreen product brochure. Deeplex MycTB. , GenoScreen. (2023).
  26. Mtafya, B., et al. A practical approach to render tuberculosis samples safe for application of tuberculosis molecular bacterial load assay in clinical settings without a biosafety level 3 laboratory. Tuberculosis. 138 (1), 102194(2023).
  27. Suganthi, P., Usharani, B., Venkateswari, R., Muthuraj, M. Biosafety practices in mycobacteriology laboratory. Research Advances in Microbiology and Biotechnology. 3, B P International (a part of SCIENCEDOMAIN International). Chennai. 1-39 (2023).
  28. consolidated guidelines on tuberculosis. Module 4: Treatment and care. WHO guideline. , WHO. (2022).
  29. Williams, J., et al. Matrixbased DNA extraction for targeted nextgeneration sequencing on decontaminated sputum samples. J Vis Exp. (181), e68147(2025).
  30. Delahaye, C., Nicolas, J. Sequencing DNA with nanopores: Troubles and biases. PLoS One. 16 (2), e0245534(2021).
  31. Zhao, K., et al. Rapid identification of drugresistant tuberculosis genes using direct PCR amplification and Oxford Nanopore Technology sequencing. Can J Infect Dis Med Microbiol. 2022, 8845672(2022).
  32. Tagliani, E., et al. Culture and nextgeneration sequencingbased drug susceptibility testing unveil high levels of drugresistantTB in Djibouti: Results from the first national survey. Sci Rep. 7 (1), 15076(2017).
  33. Smith, C., Halse, T. A., Shea, J., Modestil, H., Fowler, R. C. Assessing nanopore sequencing for clinical diagnostics: For Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 59 (7), e0123421(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Long Read SequencingAmplicon SequencingDrug Resistant TuberculosisTargeted NGSPortable SequencingDNA Library PreparationResistance Variant DetectionFlow Cell PrimingGel ElectrophoresisBioinformatics Pipeline

Related Articles