يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

أخذ عينات بيئية من ميكروبات التمثيل الضوئي وفيروساتها: من الحقل إلى المختبر

1.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68379

⸱

يوليو 3, 2025

 , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Merced, 2Quantitative Systems Biology Program, University of California, Merced

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نصف طرق أخذ العينات من المناطق الإيجابية للنظم البيئية البحرية والمياه العذبة لعزل العاث الزرقاء (ومضيفيها) وعمليات ما بعد أخذ العينات التي تثري الأنماط الجينية الفردية وتميز ديناميكيات تفاعل الفيروس والمضيف.

الملخص

يلعب أخذ العينات البيئية من الكائنات الحية الدقيقة الضوئية وفيروساتها دورا حاسما في فهم التنوع البيولوجي البحري والمياه العذبة المعاصر وديناميكيات النظام البيئي بالإضافة إلى تأثيرات العوامل المرتبطة بتغير المناخ (مثل ارتفاع درجات الحرارة والتحمض) على المسارات التطورية للأنواع وتكوين المجتمع. لسوء الحظ ، لا يدعم تنوع الغلاف الفيروسي أخذ عينات عالمية واحدة وسير عمل تجريبي. في الواقع ، يتمتع كل نظام فيروسي بميزات فريدة تتطلب تعديلات على البروتوكولات القياسية في علم الفيروسات لتحقيق أهداف البحث. على الرغم من أن اكتشاف الفيروسات وتوصيفها يتطلبان مناهج خاصة بالنظام المستهدف ، إلا أن أهداف البحث متشابهة بالنسبة لجميع الفيروسات: عزل الفيروس. تحديد نطاق المضيف تأكيد العدوى المنتجة ؛ وتميز ديناميكيات الفيروس والمضيف ومضيف الفيروسات. تتكون الأوصاف القوية للأنظمة المضيفة للفيروسات إلى الحد الأدنى من توضيح التشكل وعلم وظائف الأعضاء والكيمياء الحيوية وملامح omics. يمكن الحصول على مزيد من المعلومات عن طريق التلاعب بالنظام عن طريق تغيير عوامل مثل تعدد العدوى ، أو درجة الحرارة ، أو الأس الهيدروجيني ، أو مفتاح المضيف ، أو التطور الموجه ، أو استخدام الأدوية لمراقبة استجابة النظام المضيف للفيروس. يدرس مختبرنا الفيروسات عبر مجالات الحياة (العتائق والبكتيريا وحقيقيات النوى). في هذا التقرير ، نقوم بتفصيل طرق أخذ عينات من ميكروبات التمثيل الضوئي من المنطقة الإيجابية للمياه العذبة والبيئات البحرية مع التركيز على عزل العاثيات (أي العاثية الزرقاء) من البكتيريا الزرقاء. البكتيريا الزرقاء هي أنواع أساسية حاسمة للإنتاج الأولي ودورة المغذيات في هذه النظم البيئية المائية. يمتد سير العمل الموصوف من أخذ عينات من المياه على أعماق مختلفة إلى توصيف ميزات النظام المضيف للفيروسات باستخدام ثقافة الوسائط السائلة والصلبة ، والأساليب الجزيئية / الجينية المتقدمة ، والأساليب التحليلية. الطرق الموصوفة قابلة للتكيف مع العاثيات واكتشاف الفيروسات في الأنظمة المضيفة للفيروسات عبر مجالات الحياة.

المقدمة

يعد توصيف ديناميكيات العدوى والعلاقات التطورية للعاثيات الزرقاء ومضيفيها أمرا أساسيا لفهم الحالات الحالية والمستقبلية للنظم البيئية البحرية والمياه العذبة. تسمح تقنيات التسلسل المتقدمة عالية الإنتاجية والأساليب التحليلية الحديثة بالتسلسل السريع لجينومات العاثة الزرقاء (والمضيف) لدراسة العلاقات بين الفيروس والمضيف1،2. ومع ذلك ، تبدأ مهام سير العمل بأخذ العينات البيئية لعزل وتحديد الفيروسات ومضيفيها3 ، 4 ، 5. نظرا لتنوع الغلاف الفيروسي ، لا يوجد بروتوكول واحد لأخذ عينات وتوصيف جميع الفيروسات والعاثيات. في الواقع ، لكل نظام مضيف للفيروسات خصائصه الفريدة. ومع ذلك، فإن أهداف خط الأساس متشابهة بغض النظر عن نظام الفيروس الذي يجري استكشافه: عزل الفيروس؛ وإعادة النظر في المنظمة. تحديد نطاق المضيف إظهار العدوى المنتجة في واحد أو أكثر من المضيفين ؛ توصيف ديناميكيات عدوى الفيروس والمضيف والمضيف باستخدام الأساليب النوعية والكمية. يمكن فحص الفهم المتقدم لنظام الفيروس عن طريق إزعاج النظام. يوفر تغيير المعلمات مثل تعدد العدوى (MOI) 6 ، ودرجة الحرارة ، ودرجة الحموضة ، وسلالة المضيف ، أو عن طريق استخدام الأدوية لتحديد كيفية استجابة النظام ، نظرة ثاقبة إضافية لطبيعة ديناميكيات مضيف الفيروس. يمكن أن يوفر التلاعب الأكثر تقدما ، مثل التطور الموجه ، معلومات إضافية حول المسار التطوري المحتمل للنظام وكيف يمكن أن تؤثر نقاط النهاية التطورية المشتركة على المجتمع الميكروبي الأكبر والنظام البيئي.

في هذه الدراسة ، نقدم بروتوكولا نموذجيا (ولكن قابلا للتكيف بسهولة) لأخذ العينات البيئية لميكروبات التمثيل الضوئي مثل البكتيريا الزرقاء والطحالب الدقيقة ، والتي تلعب دورا مهما في دورة المغذيات والإنتاج الأولي في النظم البيئية البحرية والمياه العذبة وغيرها من النظم البيئيةالمائية 7،8،9،10،11. يركز سير العمل على عزل المضيفين عن المناطق المليئة بالحيوية في البيئات البحرية والمياه العذبة وفيروساتها وعاثياتها ، والتي تعد محركات رئيسية في هذه النظم البيئية12. تؤثر كل من الفيروسات والعاثيات على كل من الهياكل السكانية حقيقية النواة وبدائية النواة وتؤثر بشكل كبير على تنوع النظام البيئيوإنتاجيته 13. وبالتالي ، فإن الهدف هنا هو توفير بروتوكول أخذ العينات وسير عمل ما بعد أخذ العينات الذي يسهل إثراء المضيفين والفيروسات للتحقيق: ديناميكيات فيروس واحد / مضيف واحد ، فيروسات متعددة / مضيف واحد ، فيروس واحد / مضيف متعدد ، وديناميكيات فيروسات متعددة / مضيفين متعددين. -ركائز omics الكامنة وراء ديناميكيات عدوى الفيروس المضيف ؛ والمسارات التطورية المشتركة المحتملة ونقاط النهاية التطورية التي تؤثر على نظام مضيف الفيروس قيد الدراسة والنظام البيئي الأكبر الذي تم استخراج الفيروسات والمضيف منه.

على وجه التحديد ، نصف سير عمل لأخذ العينات البيئية ، والمعالجة المسبقة الميدانية للعينات (أي قبل الوصول إلى المختبر) ، والمعالجة اللاحقة لعزل العاثيات (والفيروسات) ، وإثراء ثقافات الأنواع المختلطة من الكائنات الحية الدقيقة من أجل تحديد المضيفين المتساهلين ، وتطوير عزلات مستعمرة واحدة للمضيفين المفترض ، وتأكيد حسن النية العلاقة بين الفيروس والمضيف (أي العدوى المنتجة) ، وتوصيف خصائص العدوى الأساسية (مثل الفوعة). لا تسمح فحوصات العدوى بحساب الفوعة النسبية (VR) 14 ومرونة المضيف (RR) 15 فحسب ، بل تتضمن أيضا خطوات لاستخراج عينات الثقافة في النقاط الزمنية الرئيسية للتحقيق في ركائز omics التي تكمن وراء علم وظائف الأعضاء المرصود (أي ديناميكيات تفاعل الفيروس والمضيف). أخيرا ، نناقش المزالق المحتملة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها والحلول ، بالإضافة إلى طرق تعديل الخطوات المحددة لاستهداف أصناف معينة. ينطبق سير العمل على البكتيريا الزرقاء ، والفيروسات النباتية - الطحالب الدقيقة ، والأنظمة البدائية لفيروس fusello-proselo المحبة للحرارة16،17 ، مما يدل على فائدته في توصيف الفيروسات عبر جميع مجالات الحياة الثلاثة: البكتيريا ، حقيقيات النوى ، والعتائق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. أخذ العينات البيئية

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول أخذ العينات البحرية لميكروبات التمثيل الضوئي من منطقة euphotic على بعد 5 أميال من الخط الساحلي قبالة ساحل جنوب كاليفورنيا. ومع ذلك ، فقد تم تكييف البروتوكول لأخذ عينات من البحيرات أو البحيرات المتجمدة أو الينابيع الساخنة الحرارية الأرضية (الشكل 1).

  1. أخذ العينات البيئية في الخارج على طول ساحل جنوب كاليفورنيا
    ملاحظة: تم تحميل سفينة الكونسول الوسطي بعمق 6 أمتار (أي قارب) بمحركات خارجية مزدوجة بقوة 150 حصانا بمعدات البحث (جدول المواد). واختيرت ثلاثة مواقع لأخذ عينات من منطقة الاحتياط: (أ) الموقع 1: شمالا 30 درجة 15.436 ، غرب 117 درجة 31.551 ؛ (ب) الموقع 1: شمالا 30 درجة 15.436 ، غرب 117 درجة 31.551 ؛ (117 درجة 31.551) ؛ (ب) الموقع 1: N 30 ° 15.436 ، W 117 ° 31.551 ؛ (ب (ب) الموقع 2: N 33° 12.521, W 117° 25.275; و (ج) الموقع 3: N 32 ° 59.914 ، W 117 ° 17.058. في كل موقع ، تم استخراج 20 لترا من عينات المياه في منتصف النهار من ثلاثة أعماق مختلفة في كل موقع: < 3 أمتار (عينة سطحية) و 6 أمتار و 14 مترا.
    1. مجموعة مضخة النقل: عند الوصول إلى كل موقع عينة ، انشر مرساة القارب وسجل إحداثيات GPS من نظام الملاحة. قم بتجميع نظام أخذ العينات.
      1. باختصار ، قم بتركيب أحد طرفي أنبوب PVC الأزرق المرن بحجم 2.54 سم (50 قدما) على مصفاة شفط مقاس 2.54 سم لمنع الحطام الكبير من دخول نظام المضخة. قم بتأمين تقاطع أنبوب المصفاة بشريط لاصق. قم بتركيب الطرف المقابل للأنبوب على مشعب السحب لمضخة نقل الفولاذ المقاوم للصدأ 1 حصان.
      2. قم بتوصيل قسم 10 أقدام من 2.54 سم خرطوم مطاطي مرن مقاوم للانهيار بمخرج المضخة. قم بتوصيل السلك الكهربائي لمضخة النقل بمولد العاكس بقدرة 3800 واط الذي يعمل بالغاز بمجرد التجميع ، قم بتجهيز مضخة النقل واختبارها للتأكد من تشغيل نظام المضخة (الشكل 1 ، الصف العلوي).
    2. وزن أنبوب النقل: قم بتأمين أحد طرفي حبل بحري من النايلون بطول 25 مترا وقطره 1.25 سم بثقب مرساة فطر 14 كجم. استخدم شريطا لاصقا لتثبيت الحبل على الأنبوب PVC الأزرق كل 3 أمتار مع ضبط مصفاة الشفط على ارتفاع 1 متر تقريبا فوق المرساة لمنع المصفاة من الثبات في الرمال أو الاصطدام بالصخور تحت الماء. استخدم المرساة لغمر أنبوب النقل (أنبوب PVC الأزرق) ولتجنب أي تيارات خفية قوية من إنشاء زاوية كبيرة بين القارب والأنبوب ، مما قد يعطي أعماق عينة غير دقيقة. اخفض المرساة / الحبل ومجموعة الأنبوب إلى العمق.
    3. استخراج عينات مياه البحر: بمجرد أن يصل طرف الأنبوب مع المصفاة إلى العمق المطلوب ، قم بتشغيل المولد والمضخة. أعد تجهيز المضخة أو رج أنبوب النقل للحصول على الماء لبدء الضخ من العمق. بمجرد نقل تدفق ثابت للمياه من العمق ، قم بتصريف 1-2 أحجام أنبوب مرة أخرى إلى المحيط لضمان تدفق المياه من العمق المطلوب عبر المضخة. اجمع عينات المياه في أباريق ماء سعة 20 لترا (الشكل 1 ، الصف العلوي ، أقصى اليمين).
    4. نقل العينات إلى المحطة الميدانية: املأ أباريق ماء سعة 20 لترا إلى حوالي 18 لترا للسماح بتبادل الغاز (على سبيل المثال ، O2 / CO2) بين عينات المياه ومساحة الرأس أثناء النقل. قبل تغطية أباريق الماء ، سجل درجة الحرارة ودرجة الحموضة والملوحة من عينات المياه الخام. بعد ذلك ، قم بتغطية أباريق الماء وضعها على سرير جليدي في مخزن على سطح السفينة الفرعي وقم بتغطيتها بغطاء خفيف لتجنب التعرض المفرط لأشعة الشمس ودرجات الحرارة المرتفعة.
  2. المعالجة المسبقة الميدانية لعينات المياه
    ملاحظة: عند الوصول إلى مرفق بري (مثل غرفة الفندق / قاعة المؤتمرات / المحطة الميدانية) ، تم اتخاذ سلسلة من خطوات المعالجة المسبقة لحماية المحتوى الميكروبي داخل عينات المياه وفصل أجزاء مختلفة من عينات مياه البحر بناء على حجم الجسيمات.
    1. تجميع نظام الترشيح: قم بتأمين أحد طرفي قطعة بطول 1 متر من أنابيب الفينيل الشفافة مقاس 9.525 مم في مدخل الخرطوم الشوكة على منفذ التفريغ لمضخة تفريغ الحجاب الحاجز الهوائية المحمولة. قم بتأمين الطرف المقابل لنفس الخرطوم بمجموعة كوب تفريغ فلتر سعة 1.0 لتر ، 0.45 ميكرومتر. استخدم كلا من مجموعات أكواب الترشيح 0.45 ميكرومتر و 0.22 ميكرومتر بالتسلسل لفصل أجزاء مختلفة من عينة مياه البحر كما هو موضح أدناه.
    2. لاختبار النظام بحثا عن التسريبات أو المرشحات المعيبة / الممزقة ، قم بتصفية 0.25 لتر من مياه البحر من خلال كوب الترشيح الغشائي البولي إيثر سلفون (PES) 0.45 ميكرومتر. سيظهر النظام غير المتسرب الشفط بين المرشح والشبكة بمجرد ترشيح عينة مياه البحر بالكامل.
    3. الترشيح من خلال تجميع كوب الترشيح الغشائي PES 0.45 ميكرومتر: لعزل الكائنات الحية الدقيقة الضوئية (مثل الطحالب الدقيقة والبكتيريا الزرقاء) ، الهدف هو تصفية 2 لتر من عينة مياه البحر من خلال كوب مرشح غشاء PES 0.45 ميكرومتر باستخدام كوبين مرشحين سعة 1 لتر (أو أربعة أكواب ترشيح سعة 500 مل). قم بتسمية جميع زجاجات الترشيح بشكل مناسب بحجم الفلتر والعمق الذي أخذت منه العينة والتاريخ ومحدد موقع أخذ العينات. أخيرا ، قم بترشيح الغطاء اللولبي والزجاجات التي تحتوي على 0.45 ميكرومتر بقطعة قماش أو غلاف شبه شفاف لمنع أشعة الشمس المفرطة.
      ملاحظة: لا تدع الفلتر الموجود في كوب الفلتر يجف. احتفظ دائما بطبقة رقيقة من السائل على الفلتر. سوف يتراكم المرشح الحطام البيولوجي (على سبيل المثال ، الخلايا). إذا أصبح الفلتر مسدودا بالحطام ، فقم بفك مجموعة الكوب بعناية واترك كوب الفلتر المستخدم جانبا ، لكن لا تتخلص من الكوب المسدود. قم بتوصيل مرشح جديد 0.45 ميكرومتر واستمر.
    4. الترشيح من خلال تجميع كوب مرشح غشاء PES 0.22 ميكرومتر: لعزل الفيروسات حقيقية النواة الكبيرة ، استخدم 1 لتر من مرشح 0.45 ميكرومتر من الخطوة السابقة (الخطوة 1.2.3) وقم بالتصفية من خلال كوب مرشح 0.22 ميكرومتر. قم بتسمية زجاجة الترشيح الفائق بشكل مناسب بحجم الفلتر والعمق الذي أخذت منه العينة والتاريخ ومحدد موقع أخذ العينات. أخيرا ، قم بلف الغطاء وقم بتغطية الزجاجة التي تحتوي على 0.22 ميكرومتر من الترشيح الفائق (من تصفية الترشيح 0.45 ميكرومتر).
      ملاحظة: لا تدع الفلتر الموجود في كوب الفلتر يجف. احتفظ دائما بطبقة رقيقة من السائل على الفلتر. سوف يتراكم المرشح الحطام البيولوجي الذي يحتوي على عينات بيولوجية. إذا أصبح الفلتر مسدودا ، فقم بفك مجموعة الكوب واترك كوب الفلتر المستخدم جانبا. لا تتخلص من الكوب المسدود. قم بتوصيل مرشح جديد 0.22 ميكرومتر واستمر.
    5. تركيز الكتلة الحيوية من مرشح 0.45 ميكرومتر: صب 48 مل من المرشح (من 0.22 ميكرومتر الترشيح) في كل من أنبوبي الطرد المركزي المخروطي المعقمة سعة 50 مل. استخدم مشرطا معقما للقطع بشكل موحد على طول الحافة الخارجية للمرشح المستهلك 0.45 ميكرومتر داخل مجموعة الكوب. استخدم ملقطا معقما لإزالة الفلتر الرطب المحمل بالكتلة الحيوية. اقطعها إلى نصفين. قم بلف نصف ورق الترشيح في أنبوب مخروطي واحد سعة 50 مل. كرر مع النصف الثاني من غشاء المرشح والأنبوب الثاني. برغي على أغطية الأنبوب وآمن بفيلم شفاف. قم بتسمية الأنبوب.
    6. تركيز الكتلة الحيوية الكبيرة للفيروس من مرشح 0.22 ميكرومتر: صب 14 مل من الترشيح الفائق في كل من أنبوبي الطرد المركزي المخروطي المعقمة سعة 15 مل من البولي بروبيلين. استخدم مشرطا معقما للقطع على طول الحافة الخارجية لمرشح 0.22 ميكرومتر المستخدم داخل مجموعة الكوب. استخدم ملقطا معقما لإزالة الفلتر الرطب المحمل بالكتلة الحيوية. اقطعها إلى نصفين. قم بلف وإدخال نصف ورق الترشيح في أحد الأنابيب المخروطية سعة 15 مل. كرر النصف الثاني من غشاء المرشح والأنبوب المخروطي الثاني سعة 15 مل. قم بربط أغطية الأنبوب وتثبيتها بغشاء شفاف (على سبيل المثال ، بارافيلم). قم بتسمية كل أنبوب بحجم المرشح (أي 0.22 ميكرومتر) والموقع والعمق والتاريخ.
    7. احتفظ بالمرشح المتبقي 0.45 ميكرومتر بالإضافة إلى المرشح المتبقي 0.22 ميكرومتر لشحنها مرة أخرى إلى المختبر. كرر عملية الترشيح بأكملها (الخطوات من 1.2.2 إلى 1.2.6) لكل موقع عمق وأخذ عينات.
      ملاحظة: يستخدم Ultrafiltrate في المختبر كقاعدة وسائط (مع المعادن الأصلية والعناصر الغذائية الأخرى).
      الفحص المجهري للعينة الخام (اختياري): خذ أنبوبا مخروطيا سعة 50 مل مع مرشح 0.45 ميكرومتر بهز برفق. استخدم قطارة بلاستيكية (أو ماصة) لأخذ 30-50 مل من مياه البحر من الأنبوب المخروطي سعة 50 مل وإعداد شريحة مجهر زجاجي مع العينة وزلة الغطاء. باستخدام مجهر ميداني وجهاز كمبيوتر ، اعرض محتوى شريحة المجهر لاكتشاف وتسجيل خصائص الكائنات الحية الدقيقة المرصودة (الشكل 2 د).

2. معالجة العينات لتركيز الفيروسات / العاثيات وإثراء المضيفين

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول خطوات المعالجة الأولى المطلوبة بمجرد وصول العينات إلى المختبر من الموقع الميداني. قد يتطلب النقل بالطائرة مقابل المركبات البرية اعتبارات مختلفة. ستنخفض صلاحية العينة البيئية مع التغيرات المفاجئة في درجة الحرارة ودرجة الحموضة والملوحة والتعرض أو عدم التعرض للضوء وتركيز الغاز المذاب (مثل ثاني أكسيد الكربون2 وO 2) والوقت بين الاستخراج البيئي والمعالجة المختبرية.

  1. تدور تركيز وتخزين الفيروسات والعاثيات
    ملاحظة: بمجرد وصول العينات إلى المختبر ، قد تؤدي المعالجة في غضون 8 ساعات بعد وصولها إلى تقليل فقدان الميكروبات القابلة للحياة بسبب الفاصل الزمني بين استخراج موقع العينة ووصولها إلى المختبر. ستوفر الخطوات الواردة أدناه حصصا من تعليق العاثيات المركزة (أو الفيروس) (أي مخزون العمل) للتخزين والاستخدام على المدى الطويل.
    1. تركيز الترشيح الفائق: لكل عمق أخذ عينات حسب الموقع ، قم بشحن ~ 800 مل المتبقية من الترشيح الفائق إلى المختبر. استخدم مرشح دوران طرد مركزي 3K NMWL 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 6000 × جم لمدة 10-20 دقيقة لتركيز 50-100 مل من الترشيح الفائق وصولا إلى 1.0-1.5 مل. قم بإعداد شبكات لتصوير TEM كما هو موضح سابقا16 لتقييم ما إذا كانت هناك أي جزيئات شبيهة بالفيروسات (VLPs) في الترشيح الفائق المركز الناتج. إذا تم اكتشاف VLPs ، قسم التركيز إلى 100 مل من الحصص الصغيرة. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية (أو -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل).
    2. تركيز الجسيمات من مرشح 0.22 ميكرومتر: استخدم مشرطا معقما لكشط الحطام برفق من المرشحات 0.22 ميكرومتر إلى الترشيح الفائق داخل أنابيب 50 مل التي تم نقل المرشحات فيها. استخدم مجموعة أكواب مكثفة الدوران 10K NMWL لتركيز 50-200 مل من التعليق وصولا إلى حجم ~ 3 مل من العينة المحتجزة. قم بإعداد شبكات لتصوير TEM كما هو موضح سابقا16 لتحديد ما إذا كانت هناك VLPs من مرشح 0.45 ميكرومتر ربما تم التقاطها على سطح مرشح 0.22 ميكرومتر. إذا تم اكتشاف VLPs ، قسم التركيز إلى 100 مل من الحصص وقم بتخزينها عند 4 درجات مئوية (أو -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل).
  2. تدور التركيز والتخصيب من مرشحات 0.45 ميكرومتر.
    ملاحظة: قد تحتوي المزارع المختلطة للكائنات الحية الدقيقة على مضيفين للفيروسات والعاثيات المعزولة أعلاه (الخطوتان 2.1.1 و 2.1.2). يوفر تركيز الدوران وإثراء الثقافات المختلطة مخزونا عاملا يمكن من خلاله تطوير ثقافات نقية للمضيفين المفترض (انظر الخطوة 3).
    1. تركيز المعلقات المختلطة: لكل عمق أخذ العينات حسب الموقع ، قم بإعادة ~ 100 مل من الترشيح الفائق باستخدام مرشح 0.45 ميكرومتر محمل بالحطام الخلوي إلى المختبر. استخدم مشرطا معقما لكشط الحطام من مرشح 0.45 ميكرومتر إلى الترشيح الفائق في الأنابيب سعة 50 مل التي تم نقلها فيها. الطرد المركزي العينة عند 2000 × جم لمدة 10 دقائق ، 4 درجات مئوية لحبيبات الكتلة الحيوية. أعد تعليق الحبيبات في 5 مل من وسائط BG-11 المخففة1: 8 عن طريق التخلي اللطيف باستخدام ماصة.
    2. التخصيب المحتجزة من مرشح 0.45 ميكرومتر: قم بإعداد ست مزارع متوازية في قوارير Erlenmeyer محيرة سعة 250 مل تحتوي على: 50 مل من وسائط BG-11 (3 قوارير) ومزيج من الترشيح الفائق من موقع العينة (40 مل) بالإضافة إلى BG-11 (10 مل). تلقيح كل قارورة ب 0.5 مل من تركيز الخلية (من الخطوة 2.2.1). احتضان مع اهتزاز خفيف في مفاعل ضوئي حيوي لمدة لا تقل عن 7-10 أيام عند 25 درجة مئوية مع ضبط شدة الضوء عند 20-40 مليمول فوتونات / م2 / ثانية .19 بمجرد أن يصبح النمو قويا (على سبيل المثال ، OD730nm = 0.8) ، جهاز الطرد المركزي عند 2000 × جم ، 10 دقائق ، 4 درجات مئوية إلى الحبيبات. أعد تعليق الحبيبات في 10 مل من وسائط BG-11 المخففة 1: 8 عن طريق التخلي اللطيف باستخدام ماصة. قم بإعداد 10-20 حصة من 0.5 مل من تعليق الخلية في أنابيب التبريد ذات الغطاء اللولبي للتخزين -80 درجة مئوية.

3. تطوير الثقافات النقية أحادية النمط الجيني للمضيفين الميكروبيين

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول إجراءات عزل وتنقية المضيفين الميكروبيين المفترض للفيروسات والعاثيات من المزارع المختلطة المعالجة من العينات البيئية المجمعة. يمكن عزل وتنقية أنماط ظاهرية متعددة للمضيف ، مما يزيد من احتمال اكتشاف المضيفين المتساهلين للفيروسات والعاثيات الموجودة في عينات المياه المخزنة (الخطوات 2.1.1-2.1.2).

  1. خطوط الألواح واختيار عزلات مستعمرة واحدة
    ملاحظة: تم تطوير العديد من الثقافات النقية أحادية النمط الجيني من الثقافات المختلطة لزيادة احتمالية عزل مضيف حساس ومتساهل من الفيروسات أو العاثيات التي تم التقاطها أثناء أخذ العينات البيئية وللتحقيق في النطاق المضيف للفيروسات والعاثيات.
    1. تطوير عزلات مستعمرة واحدة (SCI) كما هو موضح أدناه.
      1. تحضير لوحات أجار BG-1120. قم بإذابة الجليد ، حصة واحدة من المعلق المختلط الذي تم تخزينه عند -80 درجة مئوية (من الخطوة 2.2.2). استخدم حلقة معقمة لتركيز الخلايا على ألواح أجار BG-11 باستخدام التقنيات القياسية20. احتضان الصفائح المخططة في مفاعل ضوئي حيوي لمدة ~ 10 أيام عند 25 درجة مئوية مع شدة الضوء عند 20-40 مليمول فوتون / م2 / ثانية أو حتى تظهر المستعمرات على الألواح.
      2. قم بإعداد ~ 10 مزارع بذور في أنابيب استزراع سعة 20 مل مع 5 مل من وسائط BG-11 و / أو 5 مل من مزيج من الترشيح الفائق من موقع العينة و BG-11. اختر SCI من اللوحة باستخدام عود أسنان معقم وقم بتلقيح كل أنبوب على حدة عن طريق إسقاط عود أسنان واحد في كل أنبوب. احتضان مع اهتزاز خفيف في مفاعل ضوئي حيوي لمدة لا تقل عن 10-15 يوما عند 25 درجة مئوية مع ضبط شدة الضوء عند 20-40 مليمول فوتون / م2 / ثانية أو حتى يتم اكتشاف النمو (على سبيل المثال ، OD730nm = 0.4-0.8).
        ملاحظة: إذا كانت هناك أنماط ظاهرية متعددة للمستعمرات (على سبيل المثال ، التشكل ، والشفافية ، واللون) على لوحة الخط الأولى ، فحدد مستعمرات فردية للتلقيح من مجموعة من الأنماط الظاهرية للمستعمرة.
    2. تطوير الثقافات النقية للمخزونات العاملة: بمجرد اكتشاف نمو إيجابي لزراعة البذور ، كرر إجراءات الخطوط حتى يظهر نمط ظاهري واحد فقط للمستعمرة على الألواح (الشكل 3 ب والشكل 4 ب). مزارع البذور الراقية إلى 50 مل في قوارير محيرة سعة 250 مل (الشكلان 3C والشكل 4C) كما هو موضح أعلاه (الخطوة 2.2.2). قم بإعداد ~ 20 حصة من 0.5 مل من تعليق خلية SCI والماصة في أنابيب التبريد ذات الغطاء اللولبي سعة 1.0 مل للتخزين -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: لتطوير ثقافات نقية من البكتيريا الزرقاء ، قد تكون هناك حاجة إلى المضادات الحيوية أو مضادات الفطريات (على سبيل المثال ، إيميبينيم ، سيكلوهكسيميد) لتقليل تلوث الثقافة21. إجراء الطلاء هو نقطة محورية حيث يمكن استهداف عزل البكتيريا الزرقاء أو الطحالب الدقيقة. قد تختلف معلمات الضوء أثناء الحضانة من حيث شدة الضوء أو دورات التشغيل والإيقاف.
  2. توصيف النمط الجيني الفردي وتخزين مخزون العمل
    ملاحظة: لتأكيد عزل وإثراء الأنماط الجينية المضيفة المفترضة الفردية ، تتميز الثقافات النقية شكليا ووراثيا.
    1. التوصيف المورفولوجي: بمجرد أن تؤدي دورات الاستزراع السائل وعمل لوحة الوسائط الصلبة إلى نمط ظاهري أحادي الخلية ، قم بتمييز الأشكال الميكروبية عن طريق كل من الفحص المجهري الضوئي (الشكل 2A-C) ، وإذا كان ذلك متاحا ، المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) و / أو المجهر الإلكتروني الماسح (SEM; الشكل 3 أ والشكل 4 أ). تحت الفحص المجهري الضوئي (على سبيل المثال ، تكبير 60x-100x) يمكن ملاحظة التنظيم الخلوي أحادي الخلية أو الاستعماري أو الخيطي أو الحلزوني أو المتفرع أو ثلاثي الخلية. سيشير هذا إلى تعيين تصنيفي محتمل.
    2. التوصيف الجيني: التحقق من صحة عزل نمط وراثي واحد للكائنات الحية الدقيقة عن طريق استخراج الحمض النووي من الثقافات النقية المفترضة ، متبوعا بتسلسل الجينوم الجزئي. في البكتيريا الزرقاء ، غالبا ما يكون جين 16S rRNA هدفا (الشكل 5 أ) 22. يمكن لتحليل النشوء والتطور 16S تحديد التجميع التصنيفي22. في الطحالب الدقيقة ، غالبا ما يتم استهداف 18S rRNA23. بالنسبة للعزلات ذات الأهمية أو العزلات الجديدة ، يمكن متابعة تسلسل الجينوم الكامل.

4. تطوير معلقات الفيروس / العاثيات أحادية النمط الجيني

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول إجراءات عزل وتنقية المعلقات الفيروسية والعاثية المتعددة أحادية النمط الجيني من العينات البيئية.

  1. التخفيف و TEM لمركزات VLP
    ملاحظة: باستخدام فحوصات TEM والبلاك القائمةعلى اللوحة 24 ، يتم تحقيق تأكيد أن VLPs هي عاثية حسنة النية (أو فيروسات) تصيب الخلايا المضيفة.
    1. الفحص المجهري الإلكتروني للمرشحات (0.45 ميكرومتر و 0.22 ميكرومتر): استخدم مركزات من ترشيح 0.45 ميكرومتر و 0.22 ميكرومتر لعينات المياه الخام (انظر الخطوة 2.1) لإعداد شبكات TEM16 والصورة لفحص عدم تجانس جسيمات الفيروس (أي تنوع الأنماط الشكلية). قم بتخفيف العينات التي تؤدي إلى شبكات ذات التقاء مرتفع (على سبيل المثال ، 90٪) قبل إكمال الخطوات اللاحقة لتحقيق التقاء 30٪ -50٪. يمكن استخدام عد الجسيمات اليدوي أو استخدام برامج التصوير لتقدير التقاء الخلايا على الشبكات.
      ملاحظة: يمكن أن يؤدي التقاء الشبكات المرتفع إلى تطهير المروج المضيفة على ألواح الوسائط الصلبة بدلا من ظهور اللوحات الفردية التي يمكن اختيارها. وبالتالي ، فإن تخفيف العينات قبل فحوصات البلاك قد يوفر الوقت. بدلا من ذلك ، يمكن اختبار ألواح العشب المضيفة المتعددة لتفاعلات الفيروسات المضيفة باستخدام التخفيفات التسلسلية لمركزات VLP.
    2. الكشف عن نشاط العاثيات (أو الفيروسات) في المروج المضيفة: على ألواح أجار BG-11 ، قم بزراعة المروج المضيفة المفترضة للبكتيريا الزرقاء (أو الطحالب الدقيقة) من المخزونات العاملة (الخطوة 3.1.2). ماصة 0.5 مل من تعليق VLP في 4.5 مل من الوسائط على المروج (الشكل 6 أ ، على اليسار) وقم بالتدوير برفق حتى يتم طلاء سطح العشب بالكامل بتعليق. احتضن في مفاعل ضوئي حيوي لمدة 3-10 أيام عند 25 درجة مئوية مع شدة الضوء عند 20-40 مليمول فوتونات / م2 / ثانية أو حتى تظهر اللويحات على الألواح (الشكل 6 أ ، يمين).
  2. كشط اللويحات وتطوير معلقات فيروس أو عاثية من النمط الجيني الفردي
    ملاحظة: من خلال كشط الأنماط الظاهرية للويحات الفردية ونشر العاثيات في الثقافات السائلة للمضيف ، يتم تأكيد تفاعلات العاثيات المضيفة (أو الفيروس المضيف) حسن النية ، مما يسمح بتطوير مخزونات عمل العاثيات (أو الفيروسات) لمقايسات العدوى. يجب معايرة المخزونات العاملة من العاثيات (أو الفيروس) بإحدى الطرق العديدة (على سبيل المثال ، qPCR ، فحوصات اللويحات) للمضي قدما في فحوصات العدوى في تعدد محدد من العدوى (MOI).
    1. عزل ونشر نمط وراثي واحد للعاثية (أو فيروس): بمجرد رؤية اللويحات الفردية على الألواح (بسبب التخفيف الكافي لتركيز VLP) ، استخدم حلقة معقمة لكشط لوحة واحدة. قم بتدوير الحلقة في ثقافة بذور 10 مل للمضيف (الشكل 6 ب ، على اليسار). احتضان مع اهتزاز خفيف (على سبيل المثال ، 70-120 دورة في الدقيقة) في مفاعل ضوئي حيوي لمدة 3-10 أيام عند 25 درجة مئوية مع ضبط شدة الضوء على 20-40 مليمول فوتون / م2 / ثانية أو حتى قطراتOD 730 نانومتر أو يتم اكتشاف حطام الخلية في قاع الأنبوب ، مما يشير إلى موت / تحلل الخلية (الشكل 6 ب ، يمين) 25.
      ملاحظة: إذا تشكلت اللويحات على المروج المضيفة ولكن لا توجد علامات على العدوى في المزرعة السائلة ، فقد تكون اللويحات قد تشكلت بواسطة البكتيريا26 بدلا من العاثية (أو الفيروس). يمكن أن يدعم TEM فحوصات اللوحة من خلال الإشارة إلى موت الخلايا عن طريق العاثية (أو الفيروسية) العدوية.
    2. القياس الكمي للعاثيات (أو الفيروسات): يتم عزل العاثيات (أو الفيروسات) باستخدام طرق الترشيح وتركيز الدوران الموضحة أعلاه. تحديد عيارات العاثيات (أو الفيروسات) المعلقات عن طريق فحوصات البلاك التخفيف التسلسلي27. بدلا من ذلك ، قم بإجراء استخراج الحمض النووي وتسلسل جينوم الفيروس الكامل وعلم الوراثة (الشكل 5 ب) لتطوير بادئات لإجراء معايرة العاثية المستندة إلى qPCR لإنشاء مخزونات عاملة لمقايسات العدوى اللاحقة.
      ملاحظة: يمكن ترقية تكاثر الأنماط الجينية للجراثيم المفردة (أو الفيروسات) إلى 50 مل أو 100 مل إذا كانت أحجام العيار أو المخزون العامل منخفضة جدا بالنسبة للاحتياجات التجريبية. ضع في اعتبارك طبيعة النظام المضيف للفيروس (على سبيل المثال ، الفوعة العالية أو الفوعة المنخفضة) ، وتعدد العدوى (MOI) المخطط لفحوصات العدوى ، وعدد فحوصات العدوى التي سيتم إكمالها لمشروع ما عند تطوير مخزونات عاملة من العاثيات (أو الفيروسات). لا ينصح بإذابة مخزون الفيروسات وإعادة تجميده. قم بإذابة واستخدام مخزون فيروسات كامل واحد من التكرارات من نفس المستحضر بنفس العيار لكل تجربة. قد تكمل تقنيات العيار الأخرى الطرق الموصوفة ، بما في ذلك تأين الرش الكهربائي / قياس الطيف الكتلي (ESI / MS) 28.

5. فحوصات العدوى

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول فحوصات الإصابة بالعاثية المضيفة (أو الفيروس المضيف) التي تستخدم من أجل: التوصيف النوعي للضراوة ، ونطاق المضيف ، والنمط الظاهري للعدوى (مؤشر لاستراتيجية النسخ المتماثل) على الوسائط الصلبة ؛ وتقييم حركية النمو كميا ، ضراوة الفيروس14 ، ومرونة المضيف15 في الثقافة السائلة.

  1. تحديد ضراوة العاثيات النسبية (أو الفيروس) ونطاق المضيف على الوسائط الصلبة
    ملاحظة: توفر جميع فحوصات الوسائط الصلبة ، بما في ذلك فحوصات البقع الموضعية على العشب ، ومقايسات لوحة التخفيف التسلسلي أحادية اللوحة ، وفحوصات لوحة مقاومة المضيف ، بيانات نوعية حول معلمات عدوى العاثية المضيفة مثل ضراوة الفيروس ونطاق المضيف واستراتيجية النسخ المتماثل. تسمح فحوصات نمو الاستزراع السائل بمزيد من المقاييس الكمية ونمذجة ديناميكيات مضيف الفيروس.
    1. فحوصات بقعة على العشب: لتحديد نطاق المضيف ، قم بإعداد مروج من العديد من العوائل المفترضة المعزولة من العينات البيئية أو من السلالات المكتسبة من مختبرات أخرى أو مجموعات ثقافة. في المروج ، ضع 2 ميكرولتر من تعليق العاثيات (أو الفيروس) على العشب باستخدام ماصة. في منطقة منفصلة من نفس اللوحة ، حدد نفس حجم Triton X-100 والماء النانوي النقي (18 ميجاوات) كعناصر تحكم إيجابية وسالبة ، على التوالي16. قم بإجراء فحوصات متعددة على العشب مع عاثية معينة (أو فيروس) على مضيفين متعددين لتقييم النطاق المضيف للعاثية16. تقدم الأنماط الظاهرية للويحات نظرة ثاقبة على استراتيجية تكرار العاثيات (أو الفيروسات). تشير اللويحات التي لها حدود حادة والتي يتم إزالتها وصولا إلى الأجار إلى النسخ المتماثل ، بينما تشير اللويحات ذات الحدود المنتشرة أو الهالة إلى النسخ المتماثل غير التحللي16،17.
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، تشير فحوصات البلاك التسلسلي للتخفيف أحادي اللوحة إلى ما إذا كانت هناك علاقة خطية بين حجم البلاك وعيار العاثية. استخدم علامة على الجانب الخلفي من اللوحة لتقسيم اللوحة إلى شبكة أو أقسام فطيرة. بعد ذلك ، باستخدام نفس الحجم (أي 2 مل) ولكن مع تخفيفات تعليق العاثيات (على سبيل المثال ، 1: 1 ، 1: 4 ، 1:16 ، 1:64) ، قم بإجراء الفحص الموضعي على العشب على لوحة مضيفة واحدة.
    2. فحوصات مقاومة المضيف: لتحديد ما إذا كانت مجموعة من العاثيات قد تسبب عدوى على مضيف معين ، قم بإعداد العشب المضيف على طبق كما هو موضح أعلاه. باستخدام علامة على الجانب الخلفي من اللوحة ، قسم اللوحة إلى شبكة أو أقسام فطيرة. بعد ذلك ، ضع 2 مل من كل عاثية (أو فيروس) معلقة في قسم واحد من الشبكة (أو الفطيرة) ، باستخدام Triton X-100 والماء النقي النانوي كعناصر تحكم. إذا تمت إضافة جميع معلقات العاثيات (أو الفيروسات) بعيار متساو ، فقم بتقييم الفوعة النسبية بين سلالات العاثيات (أو الفيروسات) على المضيف نوعيا (أي لوحة أكبر = فيروس أكثر ضراوة).
  2. القياس الكمي للضراوة والمرونة والنمو في فحوصات عدوى المزرعة السائلة
    ملاحظة: توفر النتائج النوعية الأولية أساسا لاستهداف أزواج معينة من العاثيات والمضيفة وإجراء المزيد من التحليلات الكمية لديناميكيات تفاعلات الفيروس مع المضيف. في الثقافة السائلة ، يتم إنشاء منحنى نمو المضيف المصاب ومقارنته بنمو المضيف غير المصاب (السيطرة).
    1. إجراء مقايسة عدوى فيروس واحد/مضيف واحد للزراعة السائلة كما هو موضح أدناه.
      1. إنشاء مزارع سائلة متوازية (~ 6-12) للكائن الحي الدقيق (على سبيل المثال ، البكتيريا الزرقاء) التي ثبت أنها حساسة ومتساهلة عن طريق فحوصات لوحة الوسائط الصلبة (الخطوة 5.1) في إما: 1.0 لتر (320 مل من المزرعة) ، 500 مل (160 مل من المزرعة) ، أو 250 مل (80 مل من الثقافة) - قوارير استزراع محيرة ، كما هو موضحسابقا 17. في نقطة زمنية محددة مسبقا (عادة 0.5 أو 1 وقت مضاعفة المضيف) ، قم بتلقيح مجموعة فرعية من المزارع المتوازية بكثافة خلية مكافئة (على سبيل المثال ، OD730nm = 0.08) في ثلاث نسخ مع تعليق العاثيات باستخدام الحجم المناسب المطلوب لإنتاج تعدد محدد مسبقا للعدوى (MOI) مع عيار مخزون العمل المتاح.
      2. اترك الثقافات المتوازية الأخرى (أيضا في ثلاث نسخ) غير ملقحة (أي غير مصابة) كضوابط. اختياريا ، قم بتلقيح مجموعة ثالثة من الثقافات المتوازية بسلالة مختلفة من العاثيات (أو الفيروس) للمقارنات بين أزواج مختارة من العاثيات والمضيفة. اسمح للثقافات بالنمو في مفاعل ضوئي حيوي لمدة 3-10 أيام عند 25 درجة مئوية مع ضبط شدة الضوء عند 20-40 مليمول فوتونات / م2 / ثانية.
      3. قم بإنشاء منحنيات نمو المضيف عن طريق أخذ قراءات OD730nm على فترات زمنية منتظمة (على سبيل المثال ، 8 ساعات) من الثقافات المصابة بالعاثيات وغير المصابة (السيطرة) (الشكل 7 أ). استخدم التحقق من TEM لثقافات المكافحة غير المصابة (الشكل 7 ج) والعدوى المنتجة في مزارع الخلايا المضيفة (الشكل 7 د). يمكن ملاحظة تأثيرات الاعتلال الخلوي29،30 بسهولة في معظم الخلايا المصابة ، بينما لا تظهر على الخلايا غير المصابة علامات التحول المورفولوجي أو الإجهاد.
    2. تحليلات خط الأساس لمقايسات عدوى المزرعة السائلة: من فحوصات عدوى المزرعة السائلة أحادية الفيروس / المضيف الفردي (SVSH) ، يمكن اشتقاق العديد من المقاييس الأساسية ، مثل: الحد الأقصى لمعدل النمو النوعي (μكحد أقصى) 31 ، وضراوة العاثيات النسبية (أو الفيروس)14 ، ومرونة المضيف النسبية15 - للحصول على وصف أكثر كمية لديناميكيات مضيف العاثيات أو مضيف الفيروس (الشكل 7 ب). تشمل المقاييس القياسية التي يمكن الإبلاغ عنها معدل النمو (غالبا ما يتم الإبلاغ عنه كحد أقصى لمعدل النمو النوعي ، أو μكحد أقصى) والضراوة النسبية (VR) 14 مقارنة بعنصر تحكم مضيف غير مصاب و / أو عاثية منفصلة على نفس المضيف. يمكن أيضا الإبلاغ عن مقاييس أخرى مثل القدرة الاستيعابية للنظام (Nasymptote) والمرونة النسبية للمضيف (RR) 15 .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يعد استخدام مولد كهربائي محمول يعمل بالبنزين ومضخة نقل المياه وأنابيب مقاومة للانهيار بمثابة وسيلة فعالة لاستخراج عينات المياه من المحيط والبحيرات والبحيرات المتجمدة والبيئات المائية الأخرى (مثل البحيرات) في أعماق محددة (الشكل 1 ، الصفوف الثلاثة العلوية). هناك حاجة إلى معدات بديلة للمياه الحمضية ذات درجة الحرارة العالية للينابيع الساخنة وحمامات السباحة والأواني الطينية ، والتي يمكن أن تتميز بدرجة حموضة < 4 ودرجات حرارة أكبر من 90 درجة مئوية. يمكن استخدام عم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الغلاف الفيروسي واسع ومتنوع ، وبالتالي يتطلب مناهج تجريبية مختلفة لدراسة أنظمة الفيروسات المختلفة. يتضمن ذلك استراتيجيات مختلفة لعزل الفيروسات ومضيفيها من بيئات مختلفة وطرق معالجة مختلفة لضمان إمكانية إنتاج الثقافات النقية للمضيفين وفيروساتهم من العينات الأولية. يمكن استخدام هذه المزارع النقية في فحوصات عدوى SVSH ، سواء على الوسائط الصلبة أو في الثقافة السائلة ، بحيث يمكن تحقيق ميزات النظام والتحليلات الكمية لديناميكيات مضيف الفيروس. في هذا التقرير ، نصف سير عمل قياسي ولكنه قابل للتعديل ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم تمويل هذه الدراسة جزئيا من قبل منحة OISE رقم 1856091 (PI-Ceballos) ومنحة NSF DBI رقم 2119968 (PI-Ceballos). يقر المؤلفون بمساهمات الدكتور تشينابونغ وانغناي والدكتور شاكريت تاتشابايكون من جامعة كينج مونغكوت للتكنولوجيا في ثونبوري (تايلاند) ، اللذين قدما التصوير بالفيديو والدعم الميداني لأخذ العينات البيئية ، على التوالي. كما يشكر المؤلفون الدكتور خورخي أرماندو ليفا سانابريا من جامعة كوستاريكا - غواناكاستي على مساعدته في الحصول على تصاريح أخذ العينات من المتنزهات الوطنية في كوستاريكا والمساعدة في جمع العينات من أحواض الطاقة الحرارية الأرضية. ويشكر المؤلفان أيضا السيد إنريكي ماروكين جونيور (جامعة كاليفورنيا ميرسيد) والسيدة أليكسيا ماسيدا (جامعة مين ، أورونو ، الشرق الأوسط ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، اللذين ساعدا في أخذ العينات قبالة سواحل جنوب كاليفورنيا والبحيرات في شمال مينيسوتا ، على التوالي. يشكر المؤلفون ويعتكرون الدعم الفني للسيدة Socheata Hour ، التي قامت بحساب معلمات العدوى لمجموعة بيانات φSBL14-SWII.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 مضخة نقل من الفولاذ المقاوم للصدأ حصان   ؛Utilitech ، شارلوت ، نورث كارولاينا ، الولايات المتحدة الأمريكيةغير متاح
أنابيب 1.5 ملwww.eppendorf.com30123611
10K NMWL Centricon Plus 70 مكثف الدوران www.sigmaaldrich.comUFC701008
250 مل قوارير Erlenmeyer محيرة  ؛www.sigmaaldrich.comCLS4450250
مولد عاكس 3800 واط   ؛منتجات WEN ، ويست دندي ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكيةWEN 56380i
3K NMWL Amicon 15 مل   ؛www.sigmaaldrich.comUFC800308
500 مل قوارير Erlenmeyer محيرة   ؛www.sigmaaldrich.comCLS4450500
أباريق ماء سعة 5 جالون   ؛www.homedepot.comغير متاح
80 قدما طويلا ، 0.5 بوصة القطر ، النايلون   ؛https://facomex.mx/producto/combo/غير متاح
وحدة تحكم مركزية عميقة V بطول 26 قدما Sailfish 2660 مع محركين خارجيين من طراز Yamaha بقوة 150 حصانا   ؛https://yamahaoutboards.com/غير متاح
أسيتات الأمونيوم (CH3CO2NH4)www.sigmaaldrich.com631618
حمض البوريك (H3BO3)www.sigmaaldrich.com10043353
ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم (CaCl2. 2H2O)www.sigmaaldrich.com10035048
جهاز طرد مركزي 5920  Rwww.eppendorf.com5948000107
حامض الستريك (C6H8O7)www.sigmaaldrich.com77929
سداسي هيدرات نترات الكوبالت (II) [Co (NO3) 2.6H2O]www.sigmaaldrich.com10026229
خرطوم مرن مطاطي مقاوم للانهيار   ؛swanhose.comCELTF58050
خماسي هيدرات كبريتات النحاس (II) (CuSO4.5H2O)www.sigmaaldrich.com7758998
أنابيب الطرد المركزي Corning 50 مل   ؛www.sigmaaldrich.comCLS430291
فوسفات ثنائي البوتاسيوم (K2HPO4)www.sigmaaldrich.com7758114
حمض ثنائي الصوديوم إيثيلين ديامين رباعي أسيتيك (Na2EDTA)www.sigmaaldrich.com6381926
DS-11 FX + _Microvolume ومقياس الطيف الضوئي ومقياس الزهرwww.denovix.comغير متاح
شريط لاصق www.homedepot.comغير متاح
أنابيب Eppendorfwww.sigmaaldrich.comEP022364120
ايثانولwww.sigmaaldrich.com64175
حمض الإيثيلين أمينرتال أسيتيك (EDTA)www.sigmaaldrich.com60004
سترات الأمونيوم الحديديك (C6H8O7· xFe3+· yNH3)www.sigmaaldrich.com1185575
أنابيب PVC زرقاء فليكس بالإضافة إلى   ؛www.carlonsales.com12008-750
Innova S44i - شاكر حاضنة قابل للتكديسwww.eppendorf.com2231001081
LVEM5 الفحص المجهري الإلكتروني Microscope_Transmission الإلكترون على الطاولة (TEM)delongamerica.comغير متاح
كبريتات المغنيسيوم سباعي الهيدرات (MgSO4.7 H2O)www.sigmaaldrich.com10034998
رباعي هيدرات كلوريد المنغنيز (II) (MnCl2.4H2O)www.sigmaaldrich.com13446349
مشروم انكور أسود مطلي بالفينيل / 30 رطلwww.homedepot.comغير متاح
أطباق بتري ، بوليسترينwww.sigmaaldrich.comص 5481
كوب مرشح غشائي من البولي إيثر سلفون (PES) بحجم 0.22 ممwww.sigmaaldrich.comZ358193-1CS
كوب مرشح غشائي من البولي إيثر سلفون (PES) بحجم 0.45 ممwww.sigmaaldrich.comZ370622-1CS
إيثيل الزانثوجينات البوتاسيوم (C2H5OCSSK)www.sigmaaldrich.com140896
كربونات الصوديوم (Na2CO3)www.sigmaaldrich.com497198
كبريتات دوديسيل الصوديوم [CH3 (CH2) 11OSO3Na]www.sigmaaldrich.com151213
ثنائي هيدرات موليبدات الصوديوم (Na2MoO4.2H2O)www.sigmaaldrich.com10102406
نترات الصوديوم (NaNO3)www.sigmaaldrich.com7631994
تريس (هيدروكسي ميثيل) ميثيل] -2-أمينوإيثان سلفونيك ACI (TES) (C6H15NO6S)www.sigmaaldrich.com7365448
تريتون X-100   ؛www.sigmaaldrich.comتي 8787
هيدروكلوريد تريزما (Tris-HCl)www.sigmaaldrich.com1185531
مضخة فراغ / ضغط   ؛كول بارمر. فيرنون هيلز ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكيةEW-79204-00
أنابيب الفينيل   ؛www.homedepot.comغير متاح
كبريتات الزنك هيبتاهيدرات (ZnSO4.7H2O)www.sigmaaldrich.com7446200

المراجع

  1. Zhang, D., You, F., He, Y., Te, S. H., Gin, K. Y. H. Isolation and characterization of the first freshwater cyanophage infecting Pseudanabaena. J Virol. 94 (17), 10-1128 (2020).
  2. Dong, Z. Isolation, Characterization and Ecological Dynamics of Tropical Freshwater Cyanophages. , National University of Singapore. Doctoral dissertation (2022).
  3. Sime-Ngando, T. Environmental bacteriophages: viruses of microbes in aquatic ecosystems. Front Microbiol. 5, 355(2014).
  4. Sigee, D. C. Freshwater microbiology: biodiversity and dynamic interactions of microorganisms in the aquatic environment. , John Wiley & Sons. (2005).
  5. Jacquet, S., Miki, T., Noble, R., Peduzzi, P., Wilhelm, S. Viruses in aquatic ecosystems: important advancements of the last 20 years and prospects for the future in the field of microbial oceanography and limnology. Adv Oceanography Limnol. 1 (1), 97-141 (2010).
  6. Tucker, S., Pollard, P. Identification of cyanophage Ma-LBP and infection of the cyanobacterium Microcystis aeruginosa from an Australian subtropical lake by the virus. Appl Environ Microbiol. 71 (2), 629-635 (2005).
  7. Bhardwaj, A., et al. Cyanobacteria: a key player in nutrient cycling. Cyanobacteria. , 579-596 (2024).
  8. Douterelo, I., et al. Methodological approaches for studying the microbial ecology of drinking water distribution systems. Water Res. 65, 134-156 (2014).
  9. Brandt, J. P., Flannigan, M. D., Maynard, D. G., Thompson, I. D., Volney, W. J. A. An introduction to Canada's boreal zone: ecosystem processes, health, sustainability, and environmental issues. Environ Rev. 21 (4), 207-226 (2013).
  10. Ramanan, R., Kim, B. H., Cho, D. H., Oh, H. M., Kim, H. S. Algae-bacteria interactions: evolution, ecology and emerging applications. Biotechnol Adv. 34 (1), 14-29 (2016).
  11. Atkinson, C. L., Capps, K. A., Rugenski, A. T., Vanni, M. J. Consumer-driven nutrient dynamics in freshwater ecosystems: From individuals to ecosystems. Biol Rev. 92 (4), 2003-2023 (2017).
  12. Mojica, K. D., Brussaard, C. P. Factors affecting virus dynamics and microbial host-virus interactions in marine environments. FEMS Microbiol Ecol. 89 (3), 495-515 (2014).
  13. Graham, E. B., et al. Microbes as engines of ecosystem function: when does community structure enhance predictions of ecosystem processes. Front Microbiol. 7, 214(2016).
  14. Ceballos, R. M., Stacy, C. L. Quantifying relative virulence: when µ max fails and AUC alone just is not enough. J General Virol. 102 (1), 001515(2021).
  15. Hour, S., Pierce, A. J., Heng, S. Y., Plymale, R., Ceballos, R. M. Quantifying Resilience in Single-Host/Single-Virus Infections. Appl Microbiol. 5 (1), 18(2025).
  16. Ceballos, R. M., et al. Differential virus host-ranges of the Fuselloviridae of hyperthermophilic Archaea: implications for evolution in extreme environments. Front Microbiol. 3, 295(2012).
  17. Ceballos, R. M., Drummond, C. G., Stacy, C. L., Padilla-Crespo, E., Stedman, K. M. Host-dependent differences in replication strategy of the Sulfolobus spindle-shaped virus strain SSV9 (aka, SSVK1): infection profiles in hosts of the family Sulfolobaceae. Front Microbiol. 11, 1218(2020).
  18. Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria. Microbiology. 111 (1), 1-61 (1979).
  19. Kliphuis, A. M., Janssen, M., van den End, E. J., Martens, D. E., Wijffels, R. H. Light respiration in Chlorella sorokiniana. J Appl Phycol. 23, 935-947 (2011).
  20. Lea-Smith, D. J., Vasudevan, R., Howe, C. J. Generation of marked and markerless mutants in model cyanobacterial species. J Vis Exp. (111), e54001(2016).
  21. Noroozi, M., Amozegar, M. A., Rahimi, R., Shahzadeh Fazeli, S. A., Bakhshi Khaniki, G. The isolation and preliminary characterization of native cyanobacterial and microalgal strains from lagoons contaminated with petroleum oil in Khark Island. Biol J Microorg. 5 (20), 33-41 (2017).
  22. Nübel, U., Garcia-Pichel, F., Muyzer, G. PCR primers to amplify 16S rRNA genes from cyanobacteria. Appl Environ Microbiol. 63 (8), 3327-3332 (1997).
  23. Tragin, M., Lopes dos Santos, A., Christen, R., Vaulot, D. Diversity and ecology of green microalgae in marine systems: an overview based on 18S rRNA gene sequences. Perspect. Phycol. 3 (3), 141-154 (2016).
  24. Uchida, H., et al. A coupled assay system for the lysis of cyanobacteria. Japanese J Water Treatment Biol. 34 (1), 67-75 (1998).
  25. Drummond, C. Characterization of Sulfolobus. Spindle-shaped Virus replication. , Portland State University. (2010).
  26. Flores, E., Wolk, C. P. Production, by filamentous, nitrogen-fixing cyanobacteria, of a bacteriocin and of other antibiotics that kill related strains. Arch Microbiol. 145, 215-219 (1986).
  27. Wick, C., McCubbin, P. Characterization of purified MS2 bacteriophage by the physical counting methodology used in the integrated virus detection system (IVDS). Toxicol Methods. 9 (4), 245-252 (1999).
  28. Marei, E. M., Elbaz, R., Hammad, A. Induction of temperate cyanophages using heavy metal-copper. Int J Microbiol Res Rev. 5 (5), 472(2013).
  29. Bratchkova, A., Kroumov, A. D. Microalgae as producers of biologically active compounds with antibacterial, antiviral, antifungal, antialgal, antiprotozoal, antiparasitic and anticancer activity. Acta Microbiol Bulgarica. 36 (3), 79-89 (2020).
  30. Storms, Z. J., Teel, M. R., Mercurio, K., Sauvageau, D. The virulence index: a metric for quantitative analysis of phage virulence. Phage. 1 (1), 27-36 (2020).
  31. Omata, T., Murata, N. Isolation and characterization of three types of membranes from the cyanobacterium (blue-green alga) Synechocystis PCC 6714. Arch Microbiol. 139, 113-116 (1984).
  32. Wilson, W. H., Joint, I. R., Carr, N. G., Mann, N. H. Isolation and molecular characterization of five marine cyanophages propagated on Synechococcus sp. strain WH7803. Appl Environ Microbiol. 59 (11), 3736-3743 (1993).
  33. Grasso, C. R., et al. A review of cyanophage-host relationships: Highlighting cyanophages as a potential cyanobacteria control strategy. Toxins. 14 (6), 385(2022).
  34. Srivastava, A., Gupta, N., Mishra, A. K. Cyanophages: interacting mechanism and evolutionary significance. Cyanobacteria. , 255-282 (2024).
  35. Cai, L., et al. Abundant and cosmopolitan lineage of cyanopodoviruses lacking a DNA polymerase gene. ISME J. 17 (2), 252-262 (2023).
  36. Komárek, J., Kaštovský, J., Mareš, J., Johansen, J. R. Taxonomic classification of cyanoprokaryotes (cyanobacterial genera) 2014, using a polyphasic approach. Preslia. 86 (4), 295-335 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

أخذ عينات بيئية من ميكروبات التمثيل الضوئي وفيروساتها: من الحقل إلى المختبر
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.