مقالة منهجية

تصور عضوي الشبكية بالكامل مع الدقة الخلوية

DOI:

10.3791/68384

⸱

يونيو 20, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1ICFO-Institut de Ciències Fotòniques, The Barcelona Institute of Science and Technology, 2Ophthalmology Group, Hospital Universitari Vall d'Hebron, Vall d'Hebron Institut de Recerca (VHIR)

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يجمع هذا البروتوكول بين المقاصة البصرية ووضع العلامات المناعية للتصوير متحد البؤر بالحجم الكامل لحضيات الشبكية المثبتة بالكامل. إنه يحافظ على الهيكل ثلاثي الأبعاد ، مما يتيح التصور التفصيلي للمسارات العصبية الرئيسية ، ويحسن دراسة نضوج الشبكية ، والتنظيم المكاني ، وتطبيقاته المحتملة في نمذجة الأمراض والطب الشخصي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عضيات الشبكية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان هي هياكل ثلاثية الأبعاد معقدة تحاكي شبكية العين البشرية ، مما يوفر منصة قوية لدراسة تطور الشبكية وآليات المرض والاستراتيجيات العلاجية المحتملة. علاوة على ذلك ، نظرا لأنها مشتقة من المرضى ، فإنها أصبحت شائعة بشكل متزايد لأنها تحمل وعدا كبيرا كأداة للطب الشخصي. على عكس ثقافات الخلايا ثنائية الأبعاد التقليدية ، تحافظ عضيات الشبكية على البنية ثلاثية الأبعاد الأصلية لشبكية العين ، مما يسمح بتمثيل أكثر واقعية وتمكين دراسات أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية. ومع ذلك ، فإن تعقيدها الهيكلي وكثافتها الخلوية العالية وتكوينها المتنوع تمثل تحديات كبيرة للتوصيف.

لمواجهة هذه التحديات وتعزيز فهمنا للنضوج العضوي في الشبكية مع الحفاظ على السياق ثلاثي الأبعاد ، قمنا بدمج طرق المقاصة البصرية مع وضع العلامات المناعية لتصور الهيكل الكامل للعضيات المثبتة بالكامل مع الفحص المجهري متحد البؤر. لهذا ، استخدمنا طريقة مقاصة متوافقة مع أهداف الفتحة العددية المنخفضة والعالية ، مما يسهل التصوير بالحجم الكامل والتقاط مناطق معينة ذات أهمية بدقة خلوية. باستخدام هذا النهج ، حددنا مورفولوجيا وتوزيع مسارات الخلايا العصبية الرئيسية الثلاثة المسؤولة عن نقل المعلومات المرئية في 3D: المستقبلات الضوئية المخروطية والقضيبية ، والخلايا ثنائية القطب والعقدة. تلقي النتائج التي توصلنا إليها مزيدا من الضوء على تقنيات التصور لمعالجة التنظيم المكاني لخلايا الشبكية داخل العضوية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عضيات الشبكية

عضيات الشبكية هي هياكل ثلاثية الأبعاد معقدة تحاكي شبكية العين البشرية ، مما يوفر منصة قيمة لدراسة تطور الشبكية وآليات المرض والاستراتيجيات العلاجيةالمحتملة 1. إنهم يحافظون على الهندسة المعمارية ثلاثية الأبعاد الطبيعية لشبكية العين ، ويظهرون الدقة النسخية والكفاءة الوظيفية ، وإعادة إنتاج النقل الضوئي والاتصال المشبكي2. بالإضافة إلى ذلك ، فهي تحاكي عن كثب في الجسم الحي التطور3،4 ، مما يسمح بتمثيل أكثر واقعية مقارنة بمزارع الخلايا المسطحة. في الدراسات السابقة ، Isla-Magrané et al. أنشأ بروتوكولا من خطوتين للحصول على عضيات متعددة العين المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من الإنسان (hiPSC) لنمذجة السمات الخلوية للعين البشرية في التطور5،6. نظرا لندرة أنسجة الجنين ، اقتصرت أبحاث تنمية العين البشرية على الدراسات التشريحية.

أظهرت عضيات الشبكية التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول طبقات مناسبة واحتوت على جميع الأنواع الفرعية الرئيسية لخلايا الشبكية ، مثل المستقبلات الضوئية ، والخلايا ثنائية القطب ، والخلايا العقدية ، والخلايا الأفقية ، والخلايا الدبقية الكبيرة ، جنبا إلى جنب مع السمات المورفولوجية الرئيسية والتنظيم المكاني الصحيح والاتصالات. تظهر النماذج العضوية ، على الرغم من كونها حلا محتملا ، تباينا كبيرا ، مما يجعل من الصعب تحقيق نتائج متسقة. لذلك ، هناك حاجة ملحة لاستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات المتقدمة في نماذج بشرية أكثر موثوقية. حتى الآن ، تمت دراسة هذه العضيات فقط باستخدام الأقسام النسيجية ، حيث أن تكوينها الخلوي المعقد وكثافتها وحجمها يعيق اختراق الضوء ، مما يؤدي إلى ضعف أداء التصوير البصري في الطبقات العميقة ، مما يحد من التحليل الشامل.

تصوير كامل

يمكن أن توفر التقنيات النسيجية التقليدية ، التي تتضمن تقسيم وتلوين الأنسجة الثابتة ، معلومات مفصلة حول مناطق معينة ولكنها تفشل في التقاط البنية العامة والعلاقات المكانية داخل العضوية بأكملها. للتغلب على هذا القيد ، يظهر التصوير الكامل كأداة قيمة لدراسة عضيات الشبكية. يسمح التصوير الكامل بتصور العضوية بأكملها في شكلها ثلاثي الأبعاد السليم ، مما يحافظ على التوزيع المكاني لأنواع الخلايا ومكونات المصفوفة خارج الخلية. هذا النهج مفيد بشكل خاص للتحقيق في التركيب الخلوي داخل العضيات وفيما بينها ، مما يوفر فهما أكثر اكتمالا لعملياتها التنموية وتنظيمها الوظيفي. ومع ذلك ، نظرا لكثافتها الخلوية وضغطها ، تكون عضيات الشبكية غير شفافة (الشكل 1 ، غير واضح). يتسبب التعتيم المتأصل في العينات في تشتت الضوء ، مما يعيق التصور التفصيلي للهياكل الداخلية باستخدام الفحص المجهري. هنا ، تظهر تقنيات المقاصة البصرية كأداة قوية.

تقنيات المقاصة البصرية

يشير المقاصة البصرية إلى المعالجات الفيزيائية والكيميائية التي تجعل العينات البيولوجية السميكة شفافة عن طريق تجانس تدرجات معامل الانكسار (RI) للأنسجة لتتناسب مع تدرجات عامل المقاصة وإزالة المواد الممتصةللضوء 7. تقلل هذه الطرق بشكل كبير من تشتت الضوء وتزيد من الشفافية. يسمح لنا هذا التحول برؤية القطعة العضوية للشبكية بأكملها ، مما يتيح تحليلا شاملا لتنظيمها الخلوي المعقد ومورفولوجيتها من خلال تقنيات التصوير الكاملة. من الناحية العملية ، يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريب العينة بمادة عالية من RI وإزالة الدهون والأصباغ.

تتوفر طرق مختلفة للمقاصة ، تختلف في جوانب مختلفة (على سبيل المثال ، درجة الشفافية ، والتوافق مع التقنيات المجهرية ، والعينات ، وجزيئات الفلورسنت ، والجدوى ، والمدة) ، ولكن لا يبرز أي منها كأفضل بروتوكول مشترك8. يتم تصنيفها إلى أربع مجموعات رئيسية: (1) الغمر البسيط ، (2) الكارهة للماء من المذيبات العضوية ، (3) القائم على فرط الجفاف ، و (4) تحويل الأنسجة - أو التضمين الهيدروجيل ، كما تم تلخيصه بشكل جيد بواسطة Avilov et al7. تتضمن جميع الطرق خطوة لمطابقة RI ، عادة عن طريق غمس العينة في محلول يطابق متوسط RI للأنسجة. في الطرق الكارهة للماء ، تتم إزالة الدهون والماء عن طريق غمس العينة في تركيز مذيب عضوي متزايد (مثل الميثانول أو البروبانول).

البروتوكول المقدم هو طريقة محسنة تدمج المقاصة البصرية مع وضع العلامات المناعية لتسهيل التصور ثلاثي الأبعاد الكامل للعضيات الشبكية باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر ، مما يتيح التصوير بالحجم الكامل مع الحفاظ على السلامة الهيكلية. يسمح هذا النهج بتحديد أنواع خلايا الشبكية الرئيسية داخل العضوية ، مما يوفر للباحثين أداة قوية للتحقيق في نضوج الشبكية العضوية والتنظيم المكاني في سياق ذي صلة من الناحية الفسيولوجية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير الأجسام المضادة الفلورية الثانوية حسب الطلب

ملاحظة: يعمل هذا النهج كبديل لاستخدام الأجسام المضادة الفلورية التجارية (انظر المناقشة لمعرفة مزايا تحضير الأجسام المضادة الثانوية الفلورية). علاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لاقتران الفلوروفورات بالأجسام المضادة الأولية في حالة إجراء التألق المناعي المباشر وعدم توفر الجسم المضاد الأولي الفلوري تجاريا. يؤدي التحكم في نسبة الفلوروفور إلى الجسم المضاد عن طريق ضبط كمية الفلوروفور في تفاعل الملصقات إلى إنتاج أجسام مضادة مترافقة أكثر إشراقا. ومع ذلك ، فإن الأجسام المضادة الثانوية المصنوعة حسب الطلب أقل استقرارا ، وتركيز المترافق الناتج أقل بمقدار 10 مرات من تركيز الأجسام المضادة الفلورية التجارية. هذا البروتوكول مقتبس من العمل الذي وصفه Bálint et al9.

  1. قم بإذابة 1 مجم من الفلوروفور في DMSO اللامائي وتناوله في أنابيب للحصول على 0.02 مجم نهائي من الفلوروفور لكل أنبوب. قم بإزالة كل DMSO باستخدام مكثف فراغ السرعة ، يعمل لمدة 1 ساعة و 30 دقيقة. قم بتخزين الحصص عند -20 درجة مئوية محمية من الضوء. بالنسبة إلى Alexa Fluor 405 ، فإن H2O عالي النقاء هو المذيب المناسب لعمل الحصص الصغيرة.
  2. لإجراء تفاعل وضع العلامات ، قم بإذابة حصة واحدة من الفلوروفور في 1-10 ميكرولتر من DMSO (أو H2O فائق النقاء ل Alexa Fluor 405).
    ملاحظة: يتم تحديد الكمية الدقيقة ل DMSO من خلال اختبارات اقتران التحكم السابقة. يتم إجراء هذه الاختبارات عند استخدام دفعة جديدة من الفلوروفور (أو عند نفاد دفعة الفلوروفور السابقة) ، أو عند استخدام فلوروفور جديد لأول مرة في الاقتران. يتضمن اختبار اقتران التحكم إجراء تفاعلات وضع العلامات بكميات متفاوتة من الفلوروفور لتحديد النسبة المثلى من الفلوروفور إلى الجسم المضاد في المترافق. في حالتنا ، تتراوح النسبة المثلى عادة بين 3 ميكرولتر و 5 ميكرولتر.
  3. احتضان 50 ميكرولتر من IgG الثانوي (أو الأساسي) ، و 6 ميكرولتر من 1 M NaHCO3 ، و 1-5 ميكرولتر من الفلوروفور لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) على منصة هزازة ، محمية من الضوء.
  4. أثناء تقدم التفاعل ، قم بإعداد أعمدة استبعاد حجم التنقية عن طريق إزالة أغطية المحلول والسماح للمخزن المؤقت بالمرور. قم بموازنة العمود (واحد لكل تفاعل تسمية) عن طريق تشغيل 3 × 2-3 مل من PBS عبر العمود. في حالة انتهاء خطوة التوازن الأخيرة قبل انتهاء الحضانة ، ضع الأغطية مرة أخرى لتجنب جفافها وانتظر حتى ينتهي تفاعل وضع العلامات.
    ملاحظة: تعمل أعمدة استبعاد حجم التنقية عن طريق الجاذبية. تأكد من أن العمود لا يجف في أي لحظة ، وإلا فلن يعمل تفاعل التنقية بشكل صحيح.
  5. عند انتهاء التفاعل (الخطوة 1.3) ، أضف 140 ميكرولتر من PBS إلى تفاعل الملصقات لجعل الحجم حوالي 200 ميكرولتر ودوامة. أضف هذا الحل إلى وسط العمود ، واسمح للعينة بالدخول إلى العمود ، وبعد أن يتم التخلص من القطرة الأخيرة ، ادفع بإضافة 550 ميكرولتر من PBS. عندما يتوقف السائل عن السقوط ، قم بإزالته بإضافة 300 ميكرولتر من PBS وجمعها في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
  6. احسب تركيز الجسم المضاد ونسب الملصقات عن طريق قياس امتصاص العينة عند 280 نانومتر وامتصاص الفلوروفورات المستخدمة. قم بتطبيق قانون Beer-Lambert لتحديد التركيز (في المولارية) على النحو التالي:
    figure-protocol-1
    حيث يرمز A إلى الامتصاص ، ε معامل الانقراض المولي ، و CF280 هو مقياس للامتصاص الذي يتمتع به الفلوروفور المحدد عند 280 نانومتر والذي يعمل كعامل تصحيح. ثم يكون تركيز الجسم المضاد:
    figure-protocol-2
    ونسبة الملصقات هي:
    figure-protocol-3
  7. قم بتخزين الأجسام المضادة الموسومة في درجة حرارة 4 درجات مئوية ، محمية من الضوء ، لمدة تصل إلى 6 أشهر.

2. وضع العلامات المناعية

  1. قم بإصلاح العضيات بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في RT لمدة 45 دقيقة.
    ملاحظة: اختياري: احتضان العضيات بمحلول استرجاع المستضد (الخطوتان 2.2 و 2.3) لتعزيز التفاعل المناعي للمستضدات.
  2. قم بإعداد 40 مل من محلول استرجاع المستضد عن طريق خلط 0.117 مجم من سترات الصوديوم ثلاثي القاعدة ثنائي الهيدرات في H2O فائق النقاء وضبطه على الرقم الهيدروجيني 9.
  3. احتضان العضيات بمحلول استرجاع المستضد مع اهتزاز خفيف (30 دورة في الدقيقة) عند 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  4. تخلل العضيات باستخدام PBST (PBS مع 1٪ Triton X-100) مع اهتزاز خفيف عند RT لمدة 4 ساعات.
  5. منع العضيات بمحلول مانع (2٪ ألبومين مصل بقري (BSA) مع 0.1٪ Triton X-100) في RT طوال الليل (أو أكثر من يوم واحد).
    ملاحظة: تعتمد تركيزات الأجسام المضادة الأولية والثانوية على الجسم المضاد المعين. بالنسبة للتألق المناعي للعينات الكاملة ، نستخدم تركيزا أعلى مقارنة بالعينات المقطعة. نحتضن الجسم المضاد الأساسي عند 10 ميكروغرام / مل والذي يتوافق في معظم الحالات مع 1: 100 من المخزون (الجدول 1). نحتضن أجسامنا المضادة الثانوية المصنوعة خصيصا عند 20-50 ميكروغرام / مل.
  6. احتضان العضيات بالأجسام المضادة الأولية المخففة في محلول الغسيل (0.1٪ BSA مع 0.1٪ Triton X-100) عند 4 درجات مئوية لمدة يومين مع اهتزاز خفيف.
  7. اغسل العضيات لمدة 3 × 15 دقيقة في محلول الغسيل مع رج خفيف عند RT.
  8. احتضان العضيات مع الأجسام المضادة الثانوية المخففة في محلول الغسيل عند 4 درجات مئوية لمدة يومين مع اهتزاز خفيف.
  9. اغسل العضيات لمدة 3 × 15 دقيقة في محلول الغسيل مع رج خفيف عند RT.
    ملاحظة: بعد وضع العلامات المناعية ، يمكن احتضان الأصباغ الفلورية المفضلة. عادة ما نستخدم علامات نوى الفلورسنت ، مثل DAPI (1: 1,000) و DRAQ5 (1: 500) ، أو الفالودين (1: 100) لتصور شبكة خيوط الأكتين.
  10. احتضان العضيات مع الأصباغ الفلورية المخففة في محلول الغسيل في RT لمدة 1 ساعة مع اهتزاز خفيف.
  11. اغسل العضيات لمدة 3 × 15 دقيقة في محلول الغسيل مع رج خفيف عند RT.

3. المقاصة البصرية مع FluoClear BABB

ملاحظة: 1-قد يضر البروبانول بالحاويات البلاستيكية ، خاصة للتعرض طويل الأمد. لتكون آمنا ، استخدم العبوات الزجاجية.

  1. خطوة الجفاف
    1. قم بإعداد محاليل 1-بروبانول في H2O عالي النقاء بالنسب المحددة (15٪ ، 30٪ ، 45٪ ، 60٪ ، 75٪ ، 90٪) ثم اضبطه على درجة الحموضة 9.5 مع ثلاثي ميثيل أمين.
      تنبيه: ثلاثي إيثيل أمين سام إذا تم استنشاقه العمل تحت غطاء الدخان. يمكن إعادة استخدام المحاليل إذا تم تخزينها بشكل صحيح (حاوية محكمة الغلق). اضبط درجة الحموضة قبل الاستخدام.
    2. احتضان العينات مع التدرج المتزايد لمحاليل 1-بروبانول (15٪ ، 30٪ ، 45٪ ، 60٪ ، 75٪ ، 90٪) لمدة ساعتين لكل منهما عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز خفيف.
    3. احتضان العينات بنسبة 100٪ 1-propanol طوال الليل عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز خفيف.
  2. خطوة المقاصة
    تنبيه: BABB هو خليط مذيب قوي معروف بقدرته على إذابة أو إتلاف العديد من المواد البلاستيكية بشكل كبير. لتكون آمنا ، استخدم حاويات زجاجية ذات أغطية متوافقة واعمل داخل غطاء الدخان.
    1. تحضير BABB عن طريق خلط كحول البنزيل (BA) وبنزوات البنزيل (BB) بنسبة 1: 2.
    2. اغمر العينات في BABB في RT طوال الليل.
    3. قبل التصوير ، قم بتحديث BABB.
      ملاحظة: بالنسبة للعضيات التي يبلغ قطرها ~ 1 مم ، يحفز BABB تأثير مقاصة واضح في عشرات الدقائق. اعتمادا على حجم العينة وطبيعتها ، يمكن أن تكون درجة المقاصة مختلفة و / أو تتطلب وقت تعرض أطول لمحلول المقاصة. نوصي بالحصول على الصور قبل وبعد غمر BABB لتحسين بروتوكول المقاصة.
    4. قم بتخزين عينات BABB التي تم تطهيرها باستخدام محلول BABB على المدى الطويل عند 4 درجات مئوية. حماية من الضوء للحفاظ على التألق.

4. الحصول على صورة كاملة

  1. باستخدام ماصة زجاجية ، ضع العضوي في طبق بتري ذو قاع زجاجي مع قطرة من BABB. تأكد من أن العينة تلامس سطح الغطاء.
    تنبيه: احرص على ألا تتلامس قطرة BABB التي تحتوي على العينة مع الحواف البلاستيكية للطبق ، وإلا فإنها ستذوب البلاستيك ، مما يضر بالعينة وجودة التصوير.
  2. باستخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر المقلوب المجهز بأهداف تكبير منخفضة وعالية ، احصل على صور Z-stack للحصول على رؤية ثلاثية الأبعاد كاملة للعينة بتفاصيل خلوية.
    ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استخدام هدف هوائي 10x فتحة عددية (NA) 0.4 وهدف 63x NA 1.4 ، بحجم خطوة 3.5 ميكرومتر و 1 ميكرومتر ، على التوالي.

5. معالجة الصور

  1. أعد معايرة حجم خطوة اكتساب المكدس Z مع الأخذ في الاعتبار عدم تطابق معامل الانكسار (RI) بين محلول المقاصة ووسائط الغمر.
    1. احسب حجم الخطوة المعاد معايرته على النحو التالي:
      figure-protocol-4
      بالنسبة لعينة مضمنة في BABB ، تم تصويرها بهدف جوي بحجم خطوة 3.5 ميكرومتر ، ستكون على النحو التالي:
      figure-protocol-5
    2. باستخدام ImageJ ، قم بتغيير عمق voxel (انقر فوق Image | الخصائص ...) لحجم الخطوة المعاد حسابه.
  2. قم بإنشاء إسقاطات صور لمكدس Z.
    1. باستخدام ImageJ ، افحص مكدس Z بعمق (انقر فوق Image | مكدسات | وجهات نظر متعامدة). ستظهر طرق عرض XY و XZ و YZ للشبكية العضوية.
    2. احفظ مناطق الاهتمام المطلوبة (انقر فوق ملف | حفظ باسم...).
  3. قم بإنشاء رسم متحرك للعرض ثلاثي الأبعاد لمكدس Z باستخدام برنامج المعالجة (انظر جدول المواد).
    1. حدد القنوات المراد تصورها من خلال تمكين مربعات الاختيار الخاصة بها.
    2. اضبط مستويات Z لتصور الجزء الداخلي من العينة (قم بتمكين القطع في خانة الاختيار).
    3. سجل الرسوم المتحركة باستخدام محرر الأفلام (قم بتمكين محرر الأفلام في خانة الاختيار). قم بالسحب والإفلات، والتكبير والتصغير مباشرة باستخدام الماوس. انقر فوق إضافة لتضمين مقطع مختلف للرسوم المتحركة. في حالة ضبط مستويات Z ، قم بتمكين خيار Clip planes (انقر فوق الإعدادات ... | حدد مربع قص الطائرات ).

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
الشكل 1: مقارنة بين ثلاث طرق للمقاصة. إلى اليسار: صور Brightfield لعينات (A) غير مسحة و (B-D) تم مسحها. على اليمين: Z-stack مع مناظر متعامدة xz و yz ل 90 عضوا من عضيات الشبكية DIV ملطخة بالعلامة النووية DRAQ5 (الأصفر) التي تم الحصول عليها باستخدام مجهر مسح ليزر متحد البؤر مزود بهدف 10x من الهواء (RI = 1.00). (أ) عضوية الشبكية غير النظيفة (N = 3). عضيات الشبكية الثابتة PFA ليست شفافة بما يكفي للتصور ثلاثي الأبعاد. (ب) الفركتوز / الجلسرين العضوي (N = 3). (ج) العضية التي تم تطهيرها بواسطة ECi (N = 3). (د) FluoClear BABB العضوي (N = 3). أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: BF = حقل ساطع. CLSM = مجهر المسح بالليزر متحد البؤر ؛ RI = معامل الانكسار. PFA = بارافورمالدهايد. ECi = إيثيل سينامات. BABB = كحول البنزيل / بنزوات البنزيل ؛ DIV = أيام في المختبر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مقارنة طرق المقاصة البصرية لدراسات التألق المناعي في عضيات الشبكية العصبية

هنا ، نقدم نتائج ثلاث طرق مقاصة لإثبات فعالية FluoClear BABB لجعل عضيات الشبكية شفافة. في الشكل 1 ، نلاحظ أن عضيات الشبكية تم تطهيرها باستخدام الفركتوز / الجلسرين (الشكل 1 ب) ، ECi (الشكل 1 ج) ، و FluoClear BABB (الشكل 1 د). تم اختيار طرق المقاصة التي تم اختبارها لأنها أثبتتجميعها 10،11 أنها متوافقة مع تلطيخ التألق المناعي وتحافظ على التألق من البروتينات الداخلية (على سبيل المثال ، GFP الموجود في GCaMPs).

الفركتوز / الجلسرين12 هو بروتوكول إزالة الغمر غير سام وبسيط ولا يتطلب الجفاف ، مما يقلل بشكل كبير من وقت المعالجة مقارنة بالطرق الأخرى. تم الإبلاغ عن أنه فعال في شفافية العضيات المشتقة من أنسجة مختلفة: الشعب الهوائية والكلى والكبد وسرطان الثدي البشري12.

ECi (إيثيل سينامات) 11 هو نكهة غذائية معتمدة من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية ومادة مضافة لمستحضرات التجميل13،14 ، وتعتبر غير ضارة ، وقد أثبتت أنها كاشف مقاصة ممتاز لأنسجة الثدييات. ومن المعروف لقدرته على إزالة الشعر السريع والحد الأدنى من تشويه الأنسجة. يتم تصنيفها على أنها طريقة مقاصة كارهة للماء ، ولكن بالمقارنة مع المذيبات القائمة على BABB ، فهي غير سامة وتحافظ على التألق من بروتينات الفلورسنت لفترة أطول (لمدة تصل إلى 14 يوما). كما هو شائع في معظم بروتوكولات المقاصة ، يتطلب ECi خطوة جفاف مسبقة. للحصول على أفضل النتائج ، يتم تحقيق هذه الخطوة عن طريق غمس العينة في المحاليل مع زيادة تركيزات الكحول بشكل تدريجي. نظرا لأن ECi ليست ضارة ، بمجرد مسح العينة ، يمكن التلاعب بها بأمان وتخزينها في عبوات بلاستيكية. ومع ذلك ، يتم تنفيذ خطوات التجفيف باستخدام 1-بروبانول ، وهو مذيب عضوي يجب التلاعب به تحت غطاء الدخان وتخزينه في عبوات زجاجية.

FluoClear BABB10 هو شكل مختلف من بروتوكول الكارهة للماء يعتمد على كحول البنزيل / بنزوات البنزيل (BABB) كحل مطابقة معامل الانكسار. من المعروف أنها شديدة السمية وأكالة ، لذلك يجب التعامل معها بحذر. تم وصف FluoClear BABB بأنه نسخة محسنة تحافظ على GFP و RFP بشكل أفضل من الإصدارات السابقة وتسمح باستخدام إما 1-بروبانول أو ثلاثي بوتانول كعوامل تجفيف.

لتقييم أداء طرق المقاصة الثلاث ، قمنا بتصوير طائرات Z باستخدام مجهر متحد البؤر مزود بهدف جوي 10x NA0.4 ، مما يوفر مجال رؤية كبيرا (FoV) يبلغ 2.5 × 2.5 × 2.56 مم لالتقاط الحجم الكامل للعضوية الشبكية. استخدمنا عضيات الشبكية في مرحلة متوسطة من النضج (90 يوما في المختبر (DIV)) التي تحتوي على جميع الخلايا العصبية في الشبكية (الخلايا العقدية والخلايا ثنائية القطب والمستقبلات الضوئية) ، مما يحقق الكثافة الخلوية والضغط وبالتالي تكون معتمة. كما هو موضح في المقدمة ، يتم تحقيق المقاصة البصرية عندما تتم مطابقة RI في جميع أنحاء الكائن المراد تصويره. وبالتالي ، فإن وسائط الغمر المستخدمة في التصوير ستؤثر بشكل كبير على الشفافية التي تم تحقيقها. يوضح الجدول 2 تفاصيل RI لوسائط الغمر وحلول المقاصة التي تم اختبارها.

حلمعامل الانكسار
وسائط الغمرهواء1
الماء1.33
الجلسرين1.45
نفط1.51
حلول المقاصةالفركتوز / الجلسرين1.468
إي سي آي1.558
فلوكلير باب1.56

الجدول 2: معامل الانكسار (RI) لوسائط الغمر الأكثر استخداما في المجهر الضوئي ومنهجيات المقاصة البصرية التي تم اختبارها لإزالة عضيات الشبكية. الاختصار: RI = معامل الانكسار.

بمقارنة الصور متحد البؤر الناتجة (الشكل 1 ، اللوحة اليمنى) ، أدى علاج الفركتوز / الجلسرين إلى أقل تحسن في الشفافية ، مما يحد من تصور طبقات الشبكية ويمنع تصور اللب العضوي. حققت ECi شفافية أفضل ، مما سمح بتصور طبقات الشبكية ، ولكن لا يزال التصور محدودا للنواة العضوية للشبكية بسبب تشتت الضوء الذي أعاق اكتشاف التألق من الأجزاء الداخلية للعينة. قدم FluoClear BABB أكبر تحسن في الشفافية ، مما أتاح التصور الواضح لكل من قلب وقشرة الشبكية العضوية بدقة أعلى مع شدة مضان مماثلة.

من الجدير بالذكر أن كلا من بروتوكولات ECi و FluoClear BABB تسببت في انكماش ملحوظ للعينة ، كما يتضح من صور المجال الساطع المقابلة لكل عضوية شبكية تم تطهيرها (الشكل 1 ، اللوحة اليسرى). يرجع انكماش العينة إلى خطوات الجفاف السابقة التي تزيل الماء ، وهذا هو السبب في أن بروتوكول الفركتوز / الجلسرين لا يتقلص العينة. ومع ذلك ، فإن هذا الانكماش يمثل فرصة فريدة لاستكشاف أعمق. على الرغم من أنه يضغط الحجم الكلي للعضوية ويحتمل أن يقلل من المسافات الداخلية ، إلا أنه يزيد أيضا من الاكتناز. يسمح لنا هذا الاكتناز المتناحي ، المنتظم نسبيا في جميع الاتجاهات ، بالاستفادة من أهداف التكبير العالية مع قوة التحليل الفائقة (نظرا لكون NA الأكبر) التي لن تصور سوى طبقة الخلية الخارجية بسبب مسافات العمل الأقصر (WD). على سبيل المثال ، يوفر الهدف الجوي 10x NA 0.4 WD يبلغ 2.53 مم ، في حين أن هدف الزيت 63x NA 1.4 بدقة أفضل بكثير له WD يبلغ 0.14 مم فقط. من خلال استخدام العضيات الأكثر إحكاما التي تم تطهيرها بواسطة BABB ، يمكننا التغلب بشكل فعال على هذا القيد وتحقيق تصوير عالي الدقة للهياكل الأعمق ، مثل طبقة الخلايا العقدية الموجودة داخل الجزء الداخلي من العضوية (الشكل 2).

figure-results-2
الشكل 2: إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لعضوية الشبكية (200 DIV) تم تطهيرها باستخدام FluoClear BABB بمجهر متحد البؤر بالأشعة بالليزر. تم تجهيز المجهر بهدف جوي (A) 10x NA 0.4 و (B) هدف زيت 63x NA 1.5. يسمح المقاصة والتصوير بتصور العضوية بأكملها وفي نفس الوقت ، صورة بتفاصيل دقيقة لبعض مناطق الاهتمام. DRAQ5 (النوى) ، opsin B + GR (المخاريط) ، و TUJ1 (الخلايا العصبية). الاختصارات: DIV = أيام في المختبر ؛ BABB = كحول البنزيل / بنزوات البنزيل ؛ NA = فتحة عددية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

في الختام ، كان خيارنا للمسح هو FluoClear BABB لأنه قدم تصورا فائقا للعضوية الشبكية بأكملها بدقة عالية ونسبة إشارة إلى ضوضاء. الأهم من ذلك ، الانكماش الناجم عن BABBB ، وضغط العضوية بشكل متناحي. سمح لنا هذا الاكتناز بالاستفادة من أهداف التكبير العالية للاستكشاف التفصيلي للهياكل الأعمق. أخيرا ، ضمن توافق BABB مع أهداف الغمر في الزيت الحد الأدنى من تشتت الضوء والتصوير عالي الجودة عبر التكبيرات.

تحديد وتوزيع خلايا الشبكية داخل العضيات والتوزيع الزماني المكاني

باتباع المنهجية المفصلة هنا ، واستخدام التصوير الكامل على العضيات المصنفة مناعية بالأجسام المضادة المحددة المفصلة في الجدول 1 ، درسنا كيف تتشكل الشبكية العصبية من العضيات في نقاط مختلفة من النضج ، من مراحل النمو المبكرة (40 DIV) إلى المراحل الأكثر نضجا (حتى 250 DIV) ، مما يعرض بنية ثلاثية الأبعاد محددة جيدا. سمح لنا هذا النهج بتصور تكوين وتنظيم مكونات الشبكية المختلفة الموضحة في هذا القسم.

جسمخصوصيهاهدافالموقع في ريتينا[] نهائي (تخفيف)مضيف#RRDI
مكافحة GFPالبرنامج التأسيسيالبرنامج التأسيسيالخلايا الإيجابية ل GCaMP6s10 ميكروغرام / مل (1: 1،000)الفصلAB_300798
القناة 10صندوق الوطاء البطني 2 (Vsx2)عامل النسخالخلايا العصبية والخلايا ثنائية القطب10 ميكروغرام / مل (1: 2)السيدةAB_10842442
أوبسين بأوبسين الأزرقالجزء الخارجي من المخاريط الزرقاءالمخاريط الزرقاء10 ميكروغرام/مل (1:100)ر.بAB_177457
أوبسين RGOpsin الأخضر والأحمرالجزء الخارجي من المخاريط الخضراء والحمراءالمخاريط الخضراء والحمراء10 ميكروغرام/مل (1:100)الفصلAB_11213279
ريكوفريكوريفينبروتين مرتبط بالكالسيومالمستقبلات الضوئية10 ميكروغرام/مل (1:100)ر.بAB_2253622
RHO (RET-P1)رودوبسينالجزء الخارجي من القضبانقضبان63 ميكروغرام / مل (1:100)السيدةAB_260838
TUJ1بيتا توبولين من الفئة الثالثة الخاصة بالخلايا العصبيةبيتا III توبولين الإسويالخلايا العصبيه50 ميكروغرام/مل (1:200)السيدةAB_2315514

الجدول 1: الأجسام المضادة الأولية التي تم اختبارها في عضيات الشبكية من مراحل مختلفة من النضج. الاختصارات: دجاج = Ch ؛ الفأر = السيدة ؛ أرنب = Rb.

سمحت الملصقات المناعية بعلامات مختلفة بتحديد الخلايا المطابقة لهذا الهيكل متعدد الطبقات. TUJ1 ، وهو نوع من بيتا توبولين من الفئة الثالثة (الجدول 1) ، يستخدم عادة في عينات مجزأة لتسمية الخلايا العقدية الشبكية (RGCs) 15 بسبب وفرتها. TUJ1 موجود في جميع الخلايا العصبية في الشبكية16 ومن المراحل المبكرة من التمايز العصبي17. تم العثور على تعبير TUJ1 في جميع مراحل النضج في قشرة العضوية ، مما يسمح بمتابعة تنظيم خلايا الشبكية في طبقات. في الشكل 3 ، يمكننا أن نلاحظ أنه في المراحل المبكرة من التطوير (40 DIV) ، يتم توزيع TUJ1 بشكل موحد في طبقة واحدة رقيقة وموحدة. من 90 DIV ، تصبح المنطقة القمية من العضوية أكثر كثافة وأكثر إحكاما ، حيث تمتلئ بالعديد من الخلايا التي تتراكم في المنطقة القمية. في 170 DIV ، اكتسبت عضوية الشبكية بنية شبكية طبقية ثلاثية الأبعاد مع طبقة قمية منفصلة. في 200 DIV ، يمكننا أن نرى أن هناك أجساما خلوية أخرى تمتد إسقاطات طويلة ، وهي أقل عددا بكثير ، موجودة في عمق داخل العضوية. أخيرا ، في 250 DIV ، يتضح الهيكل المكون من ثلاث طبقات نووية ، يتوافق مع: (1) الطبقة النووية الخارجية (ONL) التي تتوافق مع المستقبلات الضوئية الناضجة ، (2) الطبقة النووية الداخلية (INL) التي تسكنها بشكل أساسي الخلايا ثنائية القطب و (3) طبقة الخلية العقدية (GCL) التي تشكلها RGCs ، كما هو موضح في الشكل 3 (أسفل اليمين).

figure-results-3
الشكل 3: تنظيم الخلايا العصبية عند نضوج عضيات الشبكية في بنية طبقية طبقية. إسقاطات Z-stack للصور متحدة البؤر لعضويات الشبكية التي تم تطهيرها بواسطة FluoClear BABB الملطخة ب TUJ1. في 40 DIV ، لا توجد هياكل متعددة الطبقات. من 170 DIV ، تنقسم الشبكية العصبية إلى طبقات. يشار إلى الطبقات النووية للشبكية: ONL و INL و GCL (رؤوس الأسهم الصفراء). أشرطة المقياس = 25 ميكرومتر (يسار) و 10 ميكرومتر (يمين). الاختصارات: BABB = كحول البنزيل / بنزوات البنزيل ؛ DIV = أيام في المختبر ؛ ONL = الطبقة النووية الخارجية ، INL = الطبقة النووية الداخلية. GCL = طبقة الخلية العقدية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

باستخدام هذه المنهجية ، يمكننا أيضا الإبلاغ عن تجميع حزم المحاور. كما رأينا في المناطق المكبرة (الشكل 4) ، لاحظنا حزم من الألياف تمتد من اللب الداخلي للعضوية باتجاه المحيط ، وتبرز نحو المناطق المتباعدة (حتى 1 مم). ومن المثير للاهتمام أن تكوين هذه الألياف حدث عبر مراحل مختلفة من النضج. مع نمو العضوية ، تتكاثف الألياف وتصبح أكثر تعقيدا وتجمع المزيد من إسقاطات الخلايا (الشكل 4 [250 DIV] والفيديو التكميلي S1). RGCs هي الخلايا الأولى التي تتمايز أثناء تطور الشبكية ، وبالتالي ، يمكنها ترتيب توقعاتها من المراحل المبكرة جدا من التطور. قد تبدأ RGCs في تمديد العصبية حتى قبل تحديد موقعها النهائي داخل العضوية. تتوافق النتائج التي توصلنا إليها مع التقارير السابقة18 التي توضح تكوين بنية شبيهة بالعصب البصري في الثقافات المشتركة للشبكية وعضيات الدماغ.

figure-results-4
الشكل 4: تجميع الإسقاطات العصبية في مراحل مختلفة من النضج. تمتد الألياف من المستويات الداخلية للشبكية العضوية باتجاه المحيط. حدث تكوين هذه الألياف عبر مراحل مختلفة من النضج ، من 40 DIV إلى أقدم نقطة نضج تمت دراستها (250 DIV). أشرطة المقياس = 25 ميكرومتر (الصف العلوي) و 100 ميكرومتر (الصف السفلي). الاختصارات: DIV = أيام في المختبر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

في الموقع القمي للعضيات الشبكية ، تنضج بعض المستقبلات الضوئية إلى قضبان تحتوي على رودوبسين في الأجزاء الخارجية للكشف عن الرؤية أحادية اللون في ظروف الإضاءة الخافتة ، بينما ينضج البعض الآخر إلى مخاريط ، والتي تعبر عن الأوبسينات الزرقاء والخضراء والحمراء وهي مسؤولة عن اللون والرؤية عالية الحدة في ظروف الإضاءة الساطعة. يوضح الشكل 5 (أعلى) عدد المستقبلات الضوئية المخروطية داخل العضوية الشبكية التي عبرت عن الأوبسينات الزرقاء و / أو الخضراء / الحمراء (OPSIN B و GR ، الجدول 1). تظهر هذه الخلايا مورفولوجيا ممدودة مع الأوبسين المختلفة الموزعة في جميع أنحاء جسم الخلية ، باستثناء النواة. والجدير بالذكر أن الطرف الخارجي لهذه الخلايا يبدو أكثر إشراقا ، ومن المحتمل أن يشبه الجزء الخارجي من المستقبل الضوئي الذي يحتوي على الأقراص. لتصور كل من المخاريط الزرقاء والخضراء / الحمراء باستخدام قناة واحدة للكشف عن التألق ، تم تمييز الأجسام المضادة الثانوية ضد الأوبسين الأزرق (OPSIN B ، الأرنب) والأوبسين الأخضر / الأحمر (OPSIN GR ، الدجاج) بنفس الفلوروفور ، مما أدى إلى تحسين استخدام القناة وتبسيط عملية التصوير مع تجنب التداخل الطيفي. عبرت مجموعة فرعية من الخلايا المستقبلة للضوء في الشكل 5 (أسفل) عن رودوبسين (RHO ، الجدول 1 والفيديو التكميلي S2) ، مما يشير بشكل لا لبس فيه إلى هويتها كقضبان. تشترك هذه الخلايا العصبية في التشكل الممدود الموصوف سابقا ، حيث يتم وضع النواة في المنتصف وجسم الخلية الغني بالأوبسين موجه نحو محيط العضوية.

figure-results-5
الشكل 5: عضيات الشبكية من مراحل لاحقة من التطور. أعلى: المخاريط الناضجة ، أسفل: قضبان. إسقاط Z للصور متحدة البؤر لعضويات الشبكية التي تم تطهيرها بواسطة FluoClear BABB الملطخة ب TUJ1 (الخلايا العصبية) و DRAQ5 (النوى) و opsin-B + GR (المخاريط) و RHO (قضبان). يتم عرض الرسومات التخطيطية كمرجع. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر (يسار) و 10 ميكرومتر (يمين). الاختصارات: DIV = أيام في المختبر ؛ BABB = كحول البنزيل / بنزوات البنزيل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم تحديد الخلايا ثنائية القطب وتوزيعها الزماني المكاني من خلال تتبع تعبير Chx10 (المعروف أيضا باسم Vsx2) على مدى 250 DIV من النضج (الشكل 6). Chx10 (الجدول 1) هو عامل نسخ حاسم لتكاثر الخلايا السلفية وتحديد الخلايا ثنائية القطب في شبكية العين النامية19،20. كجين متماثل ، يتم التعبير عنه في المراحل المبكرة من التطور في الخلايا العصبية ، وفي شبكية العين الناضجة ، يوجد حصريا في الخلايا ثنائية القطب. يوضح الشكل 6 توزيع الخلايا الإيجابية Chx10 داخل العضوية النامية. في البداية ، لوحظ أن العديد من الخلايا الإيجابية Chx10 تمتد من محيط الشبكية العصبية باتجاه المركز. مع نضوج العضوية ، تصبح هذه الخلايا أقل وفرة وتنتقل إلى INL ، حيث توجد الخلايا ثنائية القطب.

figure-results-6
الشكل 6: تعبير Chx10 أكثر من 250 DIV من النضج. صور متحدة البؤر Z-الإسقاط لعضوية شبكية FluoClear BBB ملطخة ب DRAQ5 (النوى) و Chx10 (الخلايا العصبية والخلايا ثنائية القطب الناضجة). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: DIV = أيام في المختبر ؛ BABB = كحول البنزيل / بنزوات البنزيل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

أخيرا ، نوضح أن GFP الداخلي من علامات الكالسيوم GCaMP يتم الحفاظ عليه بعد المقاصة بهذه المنهجية. في الشكل 7 ، يمكننا ملاحظة الشبكية العصبية ل 70 عضوا من عضيات الشبكية DIV المصابة ب Ad5-CMV-GCaMP6s وذات علامة مناعية بمضاد GFP (الجدول 1) لتعزيز التألق بعد التثبيت طويل الأمد.

figure-results-7
الشكل 7: GCaMP الداخلي المحفوظ في طريقة المقاصة FluoClear BABB. عضوية شبكية 70 DIV مصابة ب Ad5-CMV-GCaMP6s المصنفة مناعية بمضادات GFP (الخلايا التي تعبر عن GCaMP) ، و Chx10 (الخلايا العصبية والخلايا ثنائية القطب في المراحل المبكرة) ، و DRAQ5 (النوى). أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر (يسار) و 25 ميكرومتر (يمين). الاختصارات: BABB = كحول البنزيل / بنزوات البنزيل ؛ DIV = أيام في المختبر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو تكميلي S1: إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لعضوية الشبكية تقدم مجموعة من الإسقاطات العصبية. إسقاط Z للصور متحدة البؤر لعضويات الشبكية التي تم تطهيرها بواسطة FluoClear BABB عند 250 DIV ملطخة ب TUJ1 (الخلايا العصبية) الممثلة باللون الأرجواني و DRAQ5 (النوى) باللون الأصفر. الاختصارات: BABB = كحول البنزيل / بنزوات البنزيل ؛ DIV = أيام في المختبر. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

فيديو تكميلي S2: إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للقضبان المحاذاة على سطح عضوية الشبكية في المراحل المتأخرة من التطور (200 DIV). إسقاط Z للصور متحدة البؤر لعضويات الشبكية التي تم تطهيرها بواسطة FluoClear BBB عند 200 DIV ملطخة ب RECOV (المستقبلات الضوئية) الممثلة باللون الأخضر و RHO (قضبان) باللون الأرجواني. الاختصارات: DIV = أيام في المختبر ؛ BABB = كحول البنزيل / بنزوات البنزيل. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسهل البروتوكول الموصوف هنا دراسة التوزيع الزماني المكاني للخلايا التي تشكل العضوية الشبكية في مراحل مختلفة من النضج ، مع الحفاظ على بنيتها الطبيعية ثلاثية الأبعاد ، وهو جانب حاسم لفهم هذه النماذج في سياق الطب الشخصي في المستقبل. يوفر عرضا تفصيليا لبنية الشبكية على مستوى الطبقات المتميزة وأنواع الخلايا الفردية ، مما يتيح تصور الهياكل الخلوية مع الحفاظ على السياق ثلاثي الأبعاد العالمي.

البديل للتصوير الكامل هو المعالجة اللاحقة للعينة لإجراء التصوير على الأقسام التقليدية (البارافين أو المحفوظة بالتبريد). بينما يوفر التقسيم معلومات قيمة حول توطين البروتينات والهياكل ، فإن هذه البيانات تقتصر على مستوى واحد ، مما يحد من فهم الروابط الخلوية المكانية. نتيجة لذلك ، قد لا يتم تمثيل ميزات مثل نسبة المخاريط والقضبان أو تشكيل حزم محورية في مناطق محددة بدقة ، مما يعقد التفسير في ثلاثة أبعاد. عضيات الشبكية غير متجانسة للغاية ، حيث يحتمل أن تحتوي مناطق مختلفة على أنواع مختلفة من الخلايا و / أو تظهر درجات متفاوتة من التعقيد والتمايز. يحل التصوير الكامل هذه المشكلة لأنه يسمح بتحليل تدرجات عدم التجانس على مستوى العالم دون الاعتماد على اختيار مجموعة فرعية من الأقسام التي قد لا تمثل العينة بأكملها.

يمكن استخدام الفحص المجهري الفلوري للصفائح الضوئية (LSFM) 21،22،23 كبديل للفحص المجهري متحد البؤر بالمسح بالليزر. في LSFM ، تضيء العينة بطبقة رقيقة من الضوء يبلغ سمكها بضعة ميكرونات ، ويتم الكشف عن كل التألق الناتج عن القسم البصري المضيء باستخدام الكاميرا. LSFM هي تقنية كشف قائمة على المجال الواسع تمثل استراتيجية عالية الكفاءة للتصور السريع للأحجام الكبيرة (حتى العينات على نطاق السنتيمتر) مع الحد الأدنى من تأثيرات التبييض الضوئي والسمية الضوئية. ومع ذلك ، قد تظهر العضيات انحرافا كرويا كبيرا لأن الضوء الذي يمر عبر الأسطح المنحنية ينكسر بشكل مختلف اعتمادا على زاوية السقوط. في هذه التجارب ، أدى هذا التشويه إلى فقدان التركيز ، مما أدى إلى عدم وضوح الهياكل العميقة والمساس بها. لتصوير عضيات الشبكية (قطرها حوالي 1 مم) ، أثبت الفحص المجهري متحد البؤر بالمسح بالليزر أنه النهج الأكثر فعالية.

تم تصميم هذا البروتوكول وفقا لمتطلباتنا التجريبية. يمكن استخدامه كدليل انطلاق للباحثين الذين يغامرون بالتصوير الكامل لعضيات الشبكية التي تم تطهيرها بصريا ويجب تكييفها إذا اختلفت. في هذا القسم ، يتم وصف الخطوات والتعديلات والقيود الحاسمة للمنهجية بالتفصيل.

الخطوة الحاسمة هي القرار بشأن بروتوكول المقاصة. يجب النظر في العديد من المعايير. أولا ، ضع في اعتبارك تصنيف العينة. تطهير العظام ليس مثل تطهير أنسجة المخ ، تماما كما يختلف تطهير عضيات الشبكية عن إزالة عضيات المعدة ، حيث يتطلب كل منها نهجا مميزا. لتصور العضيات التي تم تطهيرها من نوع مختلف ، من الضروري مراجعة الأدبيات لتحديد البروتوكولات التي تم تحسينها خصيصا للعينة ذات الاهتمام. الفركتوز / الجلسرين هي طريقة سريعة وغير سامة للإزالة ثبت أنها مفيدة في تطهير العضيات المشتقة من أنسجة مختلفة (مجرى الهواء البشري ، والقولون ، والكلى ، والكبد ، وأورم الثدي العضيات ، وعضيات الغدد الثديية للفأر) 12 ولكنها لم تكن مناسبة لجعل عضيات الشبكية البشرية شفافة. على حد علمنا ، لا توجد دراسة تشير إلى تطبيق الفركتوز / الجلسرين على الأنسجة العصبية / العضوية. لذلك ، نستنتج أن طريقة المقاصة هذه ليست مناسبة لتوضيح الأنسجة العصبية. هناك ما يبرر إجراء مزيد من التحقيقات لتوضيح الأسباب الكامنة وراء هذا عدم التوافق.

عامل حاسم آخر يجب مراعاته هو FoV المطلوب ، لأنه يؤثر بشكل مباشر على استراتيجية التصوير واختيار المكونات البصرية. عادة ما يتم تحقيق FoVs الكبيرة بأهداف تكبير منخفضة ، والتي غالبا ما تكون مصممة للاستخدام بدون وسائط غمر (على سبيل المثال ، الهواء ، RI = 1.00). تواجه هذه الأهداف عدم تطابق أكبر في RI عند تصوير عينات تم تطهيرها بواسطة BABB (RI = 1.56) ، مما يؤدي إلى تحولات في التركيز العميق الذي يجب تصحيحه أثناء المعالجة اللاحقة. في المقابل ، تقدم أهداف الغمر بالزيت (RI = 1.51) عدم تطابق أقل في RI مع حلول المقاصة مثل BABB (RI = 1.56) ، وبالتالي لا تتطلب إعادة المعايرة.

عادة لا تحقق طرق الغمر البسيطة شفافية عالية وليست مناسبة للحصول على صور عالية الجودة لعينات التثبيت الكاملة. تؤثر بروتوكولات تطهير الأنسجة على الحل الفعال عن طريق تورم العينات أو انكماش العينات. اعتمادا على الهدف من التجربة ، يمكن أن يكون التورم أو الانكماش مفيدا. يمكن للبروتوكولات التي توسع العينة تحسين دقة التفاصيل الدقيقة في نفس النظام البصري غير القادر على إظهار نفس التفاصيل من قبل. يمكن أن يكون الانكماش مرغوبا في تصور العينات الكبيرة التي لن تتناسب مع غرفة العينة أو تتكيف مع مسافات العمل الموضوعية. ومع ذلك ، نظرا لأن الانكماش يضغط على العينة وقد يشوه المسافات الداخلية ، فإن هذه التقنية ليست مناسبة لتقييم الأبعاد أو القياس الدقيق للمسافات بين الخلايا.

عامل مهم آخر يجب مراعاته هو التوافق مع بروتينات الفلورسنت. تعمل البروتوكولات العضوية القائمة على المذيبات في الغالب على إخماد البروتينات الفلورية لأنها تتطلب درجات حرارة عالية أو تحلل البروتينات الفلورية أثناء تضمينها مع حلول مطابقة RI. لحسن الحظ ، فإن معظم الطرق متوافقة مع تقنيات وضع العلامات المناعية. ومع ذلك ، يجب تأكيد توافق كل حاتمة تجريبيا.

علاوة على ذلك ، يمكن إعاقة تغلغل جزيئات IgG الكبيرة عبر الأنسجة ، مما يقلل من كفاءة التلوين ويحد من تصور الهيكل المستهدف على سطح العينة. قد يستغرق تلطيخ العينات الكاملة بالأجسام المضادة عدة أيام (أو حتى أسابيع) ، اعتمادا على حجم العينة وطبيعتها ، مما يزيد بشكل كبير من مدة البروتوكول.

أخيرا ، التوافق مع الأداة البصرية إلزامي. معظم الطرق العضوية القائمة على المذيبات (باستثناء ECi) شديدة التآكل وغير متوافقة كيميائيا مع غرف العينات التجارية وأهداف الغمر. علاوة على ذلك ، تحتوي بعض حلول المقاصة على RI لا يتطابق مع النطاق الذي تتطلبه الأهداف المتاحة (عادة الماء).

هناك بعض الخطوات في البروتوكول التي تحتاج إلى اهتمام خاص. يتطلب FluoClear BABB ، كطريقة مقاصة كارهة للماء ، خطوة جفاف سابقة. يلعب الرقم الهيدروجيني دورا مهما في الحفاظ على مضان البروتينات الداخلية مثل GFP. بعد ذلك ، من الضروري التأكد من ضبط الرقم الهيدروجيني في محاليل الكحول بشكل صحيح. الجفاف هو المفتاح للتخلص الكامل. يتم تحقيق النتائج المثلى من خلال احتضان العينات بتدرج متزايد من محاليل الكحول.

يلعب حجم العينة دورا مهما في السماح للأجسام المضادة بالوصول إلى أهدافها المحددة. قد تفشل الأجسام المضادة في الاختراق بشكل متجانس ويتم الاحتفاظ بها في الجزء الخارجي من العينة. إذا حدث هذا ، ففكر في التبديل إلى نوع آخر من المنظفات (Tween-20 أو Saponin) ، مما يزيد من تركيز ووقت حضانة المنظف والأجسام المضادة. إذا كانت هذه التعديلات غير كافية ، يمكن للاستراتيجيات البديلة تحسين نفاذية الأجسام المضادة. بالنسبة للوضع المناعي الكامل للعينات الكبيرة (على مقياس السنتيمتر) ، وجد الباحثون أن SDS يمكن أن يسهل اختراق الأجسام المضادة الأعمق24. يؤدي SDS إلى فقدان جزئي للبنية الثلاثية للأجسام المضادة ، مما يؤدي إلى خطية البروتين بشكل فعال والسماح له بالتغلغل بشكل أعمق في الأنسجة. بعد ذلك ، يؤدي غسل SDS إلى استعادة خصائص ربط المستضد للأجسام المضادة ، مما يتيح تلطيخا أكثر اتساقا للأنسجة السميكة ويقلل من التدرج الشائع لوضع العلامات الأقوى على سطح العينة.

يوفر تحضير الأجسام المضادة الثانوية الفلورية الخاصة بك العديد من المزايا ، حيث يوفر مرونة أكبر في تصميم الملصقات المناعية ، مما يسمح باختيار تركيبة الأجسام المضادة الثانوية الفلورية المحددة ، مما يزيد من عدد الألوان التي يمكن استخدامها في نفس العينة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن ضبط نسبة الفلوروفور إلى الجسم المضاد ، بحيث تكون أكثر إشراقا بشكل عام. ومع ذلك ، يجب النظر في بعض الجوانب. الأجسام المضادة الثانوية المصنوعة حسب الطلب أقل استقرارا بشكل عام من الأجسام المضادة المتاحة تجاريا ويجب استخدامها طازجة. يحتفظ معظمهم بتقارب الترابط لمدة 3-6 أشهر عند 4 درجات مئوية ، ولكن يجب تحديد الاستقرار تجريبيا ، حيث يمكن أن تتحلل بعض التركيبات بسرعة أكبر. علاوة على ذلك ، يمكن لبعض أزواج الأجسام المضادة والفلوروفور أن تغير تقارب الجسم المضاد للحاتمة ، مما يؤدي إلى وضع علامات جزئية أو كاملة غير محددة. لضمان الموثوقية ، ينصح أولا باختبار الأجسام المضادة الثانوية المصنوعة خصيصا باستخدام عناصر التحكم ، مثل الخلايا في المزرعة ، قبل تطبيقها على العينات التجريبية.

يدمج هذا البروتوكول المحسن المقاصة البصرية مع وضع العلامات المناعية لتسهيل التصوير متحد البؤر للعضيات الشبكية المثبتة بالكامل. يحافظ على السلامة الهيكلية ويتيح تحديد أنواع خلايا الشبكية الرئيسية داخل العضوية. وبالتالي ، يوفر البروتوكول للباحثين أداة قوية للتحقيق في نضوج الشبكية العضوية والتنظيم المكاني.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن ممتنون لأنخيل ساندوفال وإريك كالاتايود وغوستافو كاسترو أولفيرا ومارتا مارتن وألينا هيرشمان (معهد ICFO-Institut de Ciències Fotòniques) على دعمهم الفني. والجهات الممولة التي دعمت هذا العمل هي Fundació CELLEX؛ ومؤسسة الكيانات التمويلية التي دعمت هذا العمل. Fundació Mir-Puig; Ministerio de Economía y Competitividad - برنامج Severo Ochoa لمراكز التميز في البحث والتطوير (CEX2019-000910-S, [MCIN/AEI/10.13039/501100011033])؛ Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades - Agencia Estatal de Investigación (PID2021-122807OB-C31 and PID21-122807OB-C32); معهد Salud Carlos III (PI22/01747); مؤسسة لا مرة واحدة; Generalitat de Catalunya من خلال برنامج CERCA ؛ Laserlab-Europe (EU-H2020 GA رقم 871124) ؛ و Fondo Social Europeo (PRE2020-095721 ، M.C.).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10x NA0.40 هدف جافلايكاHC PL APO CS2-
63x هدف NA1.40 OILلايكاHC PL APO CS2-
الأجسام المضادة المضادة ل GFPأبكامأب13970-
كحول البنزيل (بكالوريوس)سيجما ألدريتش13162-
بنزوات البنزيل (BB)سيجما ألدريتشW213802-
طبق بتري زجاجي سفليماتيكP35G-1.5-14-C-
مصل الألبومين البقري (BSA)سيجما ألدريتشأ7030-
الأجسام المضادة Chx10ستا كروز للتكنولوجيا الحيويةSC-365519-
أعمدة ترشيح جل Cytiva Illustra Nap-5 ، Sephadex G-25سيجما ألدريتش17-0853-02-
دابيسيجما ألدريتشد9542-
DMSOسيجما ألدريتشD8418-
درQ5ترموفيشر62251-
صبغة (حمض الكربوكسيليك ، إستر سكسينيميديل)Invitrogen أو Abberior--
ImageJ / فيجي  المؤسسه  الإصدار 1.50i-
مجهر المسح بالليزر متحد البؤر المقلوبأنظمة لايكا الدقيقةTCS SP8 STED 3X-FALCON-
برنامج معالجة LAS X 3Dأنظمة لايكا الدقيقة--
mQ H2O--مياه فائقة النقاء من نظام تنقية المياه Synergy
NaHCO3أكروس أورجانيكس424270010-
IgG ثانوي غير مصنفجاكسون إيمونوريسيرتش--
الجسم المضاد الأزرق OpsinMillipore   AB5407 -
الجسم المضاد Opsin RGميليبورAB5745 -
بارافورمالديهايد (PFA) 4٪علم الحرارة J199943-K2-
حل PBSجيبكو18912-014-
مجسات وضع العلامات على Phalloidinترموفيشر--
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)جيبكو  10010023-
الجسم المضاد RECOVميليبورAB5585-I -
الجسم المضاد RHO (RET-P1)سيجما ألدريتشO4886 -
سترات الصوديوم ثلاثي الهيدرات القاعدية سيجما ألدريتشسي 8532-
تريتون X-100سيجما ألدريتشتي 8787-
الجسم المضاد TUJ1كوفانس  MMS-435P -

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, Y. J., Jo, D. H. Retinal organoids from induced pluripotent stem cells of patients with inherited retinal diseases: A systematic review. Stem Cell Rev Rep. 21 (1), 167-197 (2025).
  2. Onyak, J. R., Vergara, M. N., Renna, J. M. Retinal organoid light responsivity: Current status and future opportunities. Trans Res. 250, 98-111 (2022).
  3. O’Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: A window into human retinal development. Development. 147 (24), dev189746(2020).
  4. Wahle, P., et al. Multimodal spatiotemporal phenotyping of human retinal organoid development. Nat Biotechnol. 41 (12), 1765-1775 (2023).
  5. Isla-Magrané, H., Veiga, A., García-Arumí, J., Duarri, A. Multiocular organoids from human induced pluripotent stem cells displayed retinal, corneal, and retinal pigment epithelium lineages. Stem Cell Res Ther. 12 (1), 581(2021).
  6. Isla-Magrané, H., Zufiaurre-Seijo, M., García-Arumí, J., Duarri, A. All-trans retinoic acid modulates pigmentation, neuroretinal maturation, and corneal transparency in human multiocular organoids. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 376(2022).
  7. Avilov, S. V. Navigating across multi-dimensional space of tissue clearing parameters. Methods Appl Fluoresc. 9 (2), 022001(2021).
  8. Brenna, C., et al. Optical tissue clearing associated with 3D imaging: application in preclinical and clinical studies. Histochem Cell Biol. 157 (5), 497(2022).
  9. Bálint, Š, Verdeny Vilanova, I., Sandoval Álvarez, Á, Lakadamyali, M. Correlative live-cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (9), 3375-3380 (2013).
  10. Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS One. 10 (5), e0124650(2015).
  11. Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. J Am Soc Nephrol. 28 (2), 452-459 (2017).
  12. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nat Protoc. 14 (6), 1756-1771 (2019).
  13. Wang, Y., Zhang, D. -H., Zhang, J. -Y., Chen, N., Zhi, G. -Y. High-yield synthesis of bioactive ethyl cinnamate by enzymatic esterification of cinnamic acid. Food Chem. 190, 629-633 (2016).
  14. Schellinger, A. P., Carr, P. W. Solubility of buffers in aqueous-organic eluents for reversed-phase liquid chromatography. LCGC North America. 22 (6), 544(2004).
  15. Jiang, S. -M., et al. β-III-Tubulin: A reliable marker for retinal ganglion cell labeling in experimental models of glaucoma. Int J Ophthalmol. 8 (4), 643-652 (2015).
  16. Guo, J., Walss‐Bass, C., Ludueña, R. F. The β isotypes of tubulin in neuronal differentiation. Cytoskeleton. 67 (7), 431-441 (2010).
  17. Lee, S., et al. TuJ1 (class III β-tubulin) expression suggests dynamic redistribution of follicular dendritic cells in lymphoid tissue. Eur J Cell Biol. 84 (2-3), 453-459 (2005).
  18. Fernando, M., et al. Differentiation of brain and retinal organoids from confluent cultures of pluripotent stem cells connected by nerve-like axonal projections of optic origin. Stem Cell Rep. 17 (6), 1476-1492 (2022).
  19. Belecky-Adams, T., et al. Pax-6, Prox 1, and Chx10 homeobox gene expression correlates with phenotypic fate of retinal precursor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 38 (7), 1293-1303 (1997).
  20. Rowan, S., Cepko, C. L. Genetic analysis of the homeodomain transcription factor Chx10 in the retina using a novel multifunctional BAC transgenic mouse reporter. Dev Biol. 271 (2), 388-402 (2004).
  21. Andilla, J., et al. Imaging tissue-mimic with light sheet microscopy: A comparative guideline. Sci Rep. 7, 44939(2017).
  22. Olarte, O. E., Andilla, J., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. Light-sheet microscopy: A tutorial. Adv Opt Photonics. 10, 111(2018).
  23. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
  24. Darche, M., et al. Light sheet fluorescence microscopy of cleared human eyes. Commun Biol. 6 (1), 1025(2023).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

BABB

مقالات ذات صلة