Method Article

الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال كتقنية تصور لتحليل اللدونة المشبكية اليومية في قشرة برميل الفأر

DOI:

10.3791/68385

⸱

August 19th, 2025

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Imaging, Institute of Zoology and Biomedical Research, Faculty of Biology, Jagiellonian University, 2Department of Histology, Jagiellonian University Medical College

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف البروتوكول المقدم استخدام المجهر الإلكتروني للإرسال (TEM) لتحديد التغيرات اليومية في قشرة برميل الفأر ، مع التركيز بشكل أساسي على عدد المشبك ومورفولوجيا العمود الفقري المتغصن.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتطلب فحص اللدونة المشبكية اليومية إيواء الفئران في ظروف إضاءة مختلفة (دورة الضوء / الظلام ، LD 12:12 ، والظلام المستمر ، DD) ، وتوفير الوصول إلى عجلات الجري ، والتضحية بها في أربع نقاط زمنية محددة في غضون 24 ساعة - في بداية ومنتصف النهار / اليوم الذاتي وفي بداية ومنتصف الليل / الليل الذاتي. ثم يتم إصلاح الأدمغة بشكل صحيح للفحص المجهري الإلكتروني (TEM). توفر قشرة البرميل ، بتنظيمها الجسدي الدقيق ، نموذجا مثاليا لمثل هذا التحليل. للحصول على منطقة الدماغ المطلوبة ، يتم قطع الأدمغة بشكل عرضي باستخدام اهتزاز ، وبعد ذلك ، يتم اختيار الأقسام التي تحتوي على قشرة البرميل وتضمينها في راتنج Polybed. من الكتل المحضرة التي تحتوي على البراميل المحددة ، يتم قطع أقسام متتالية فائقة النحافة. يتم تحليل الكثافة المشبكية ، المثيرة والمثبطة ، من الصور المجهرية الإلكترونية باستخدام طريقة التشريح التجسيمي. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام صور TEM لإعادة بناء العمود الفقري ثلاثي الأبعاد. تشير التغييرات في شكل العمود الفقري المتغصني إلى إعادة تشكيل الخلايا العصبية خلال النهار. يبلغ عدد المشابك المثيرة ذروته أثناء النوم (النهار) في الفئران ، بينما تبلغ نقاط الاشتباك العصبي المثبطة ذروتها خلال مرحلة نشاطها (في منتصف الليل).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم إنشاء إيقاعات الساعة البيولوجية بواسطة الساعات اليومية في جميع العمليات تقريبا في الكائن الحي. في والبشر ، تم اكتشافها على المستويات الجزيئية والخلوية والكائنات الحية بأكملها ، وكذلك في سلوكهم. يتكون نظام الساعة البيولوجية للكائن الحي من الساعة البيولوجية الرئيسية (جهاز تنظيم ضربات القلب) والساعات الطرفية. تولد جميع الساعات اليومية تذبذبات يومية من خلال التعبير الدوري لجينات الساعة ، والتي تتحكم فيها بروتيناتها. تولد الآلية الجزيئية للساعة إيقاعات الساعة البيولوجية بفترة ~ 1 يوم (أطول أو أقصر من 24 ساعة) ، ولكن في ظل ظروف النهار / الليل ، تتم مزامنة فترة الإيقاعات الداخلية مع 24 ساعة. تم الكشف عن العديد من إيقاعات الساعة البيولوجية في فسيولوجيا الجهاز العصبي للافقاريات والفقاريات. ومع ذلك ، فقد أظهرت بعض الدراسات أنها موجودة أيضا في اللدونة المشبكية والعصبية ، أي التغيرات في عدد وهيكل نقاط الاشتباك العصبي والتشعبات1،2،3،4.

توفر القشرة الحسية الجسدية للفأر موقعا ممتازا لدراسة اللدونة المشبكية على مدار اليوم نظرا لتنظيمها المحدد جيدا وارتباطها المباشر بالنشاط الحركي للحيوانات5،6،7،8،9. في الطبقة الرابعة من القشرة الحسية الجسدية ، توجد هياكل عصبية مميزة (براميل) ملحوظة للغاية حتى في الدماغ غير الملوثة10،11. يعكس ترتيبها مورفولوجيا وتنظيم الشعيرات على خطم ، مما يسمح برسم خرائط دقيقة للمنبهات الحسية. يتم تنظيم البراميل الكبيرة في خمسة صفوف منتظمة ، يحتوي كل منها على ما بين أربعة وسبعة براميل. يتم تمييز صفوف البراميل التي تتوافق مع الشعيرات الكبيرة بأحرف كبيرة من A إلى E وتمثل الشعيرات المرتبة من منطقة العين إلى أسفل على طول الخطم. يتكون كل برميل من منطقتين رئيسيتين: المجوف ، والجزء المركزي المليء بالأعصاب ، والجدار المسمى الجانب ، والذي تهيمن عليه أجسام الخلايا النجومية. يتم فصل البراميل عن بعضها البعض بواسطة مناطق ذات كثافة خلوية أقل ، تسمى الحاجز. يتلقى كل برميل نبضات من شعيرات معينة تقع على الجانب المقابل من خطم10،12.

يسمح التقسيم إلى براميل محددة ، مرتبة في صفوف منتظمة ، بتحديد سريع وسهل للمنطقة المحددة10،13. يعتمد اختيار البراميل من الصف B لتحليل التغيرات اليومية على دراسات اللدونة المعتمدة علىالنشاط 14،15،16،17. يتميز الصف B بحدود جسدية محددة جيدا ويحتوي فقط على أربعة براميل كبيرة مميزة ، مما يبسط موقعه في العينات. نظرا لموقعه المركزي ، يرتبط النشاط العصبي في الصف B بسلوكيات الفئران الطبيعية مثل الاستكشاف البيئي والنشاط الحركي. لعد نقاط الاشتباك العصبي على العمود الفقري والأعمدة المتغصنة ، من المهم تحديد الأجزاء المركزية من البراميل ، حيث تكون أجسام الخلايا متناثرة12،15،18.

الكيمياء المناعية جنبا إلى جنب مع التصوير المجهري متحد البؤر هي تقنية لعبت دورا مهما في توضيح الآليات الرئيسية للدونة المشبكية في الفئران. بينما يوفر استخدام الفحص المجهري متحد البؤر صورا عالية الدقة مع تقليل تألق الخلفية ووضوح محسن للبنية الخلوية ، فإنه يعاني من التبييض الضوئي ويتطلب تحضير عينة معقدة ، مما قد يغير حالة الأنسجة البيولوجية. يمكن أن يؤدي اعتماده على علامات الفلورسنت إلى الحد من أنواع البروتينات التي يمكن دراستها في وقت واحد بسبب تداخلها. يوفر الفحص المجهري المناعي الفلوري متحد البؤر وسيلة لتسمية بروتينات معينة ومستويات تعبيرها وتوطينها المرتبط بالنشاط المشبكي باستخدام الأجسام المضادة للكشف عن المستضدات المستهدفة في أقسام الأنسجة الثابتة. على الرغم من أن هذه الطريقة توفر الخصوصية والمرونة لدراسة البروتينات المختلفة المشاركة في النقل العصبي ، إلا أنها محدودة بسبب عدم قدرتها على توفير بيانات في الوقت الفعلي حول العمليات الديناميكية بسبب خطوة التثبيت المعنية. يمكن أن يؤدي التناقض في ارتباط الجسم المضاد أيضا إلى نتائج غير موثوقة19،20،21.

يسمح استخدام المجهر الإلكتروني بدلا من طرق التألق المناعي مع الفحص المجهري الضوئي بدقة أعلى بكثير ودقة أكبر في كل من اختيار التوطين وتمييز الهياكل العصبية. تساعد أقسام المجهر الإلكتروني للإرسال التسلسلي (TEM) على تصور البنية المشبكية على مستوى البنية التحتية وتتمتع بميزة استخدامها لدراسة تكوين المشبك أو القضاء عليه. يمكن TEM الباحثين من تحليل الخصائص الفيزيائية للمشابك والتغيرات في الكثافة والبنية التي تسمى مرونة نقاط الاشتباك العصبي. على الرغم من أن إعداد العينات والتصوير يستهلكان عمالة مكثفة ، إلا أن TEM يوفر فهما أكثر تفصيلا للتغييرات التي تحدث أثناء التعلم وتكوين الذاكرة ومعالجة المعلومات الحسية ، وخلال النهار والسنة وعمر.

تهدف طريقتنا إلى التحقيق في ديناميكيات الساعة البيولوجية للكثافة المشبكية والتشكل باستخدام نهج قائم على أربع نقاط زمنية على الأقل جنبا إلى جنب مع طريقة التشريح التجسيمي القائمة على صور TEM التسلسلية. تسمح طريقة التشريح التجسيمي بتقدير موثوق لأرقام نقاط الاشتباك العصبي حتى عند استخدام عدد قليل من الأقسام التسلسلية فائقة النحافة22،23،24،25،26. يضمن التنظيم الجسدي المحدد جيدا لقشرة البرميل الاختيار التشريحي الدقيق لمواقع الدراسة ، بينما يسمح TEM التسلسلي بالتمايز بين أنواع المشبك (المثير والمثبط) ومواقعها (على العمود الفقري المتغصني والأعمدة). توفر هذه الطريقة أداة قيمة للباحثين الذين يحققون في المرونة العصبية النهارية واليومية ، مما يتيح استكشاف كيفية تأثير العوامل البيئية والداخلية على الديناميكيات المشبكية. تتيح المكونات الفردية لطريقتنا تطبيقها لتحليل تغيرات المرونة العصبية في مجموعة أوسع بكثير من الدراسات ، ولا تقتصر بالضرورة على التغييرات المتعلقة بالساعة البيولوجية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية التي تشمل من قبل لجنة الأخلاقيات المؤسسية المناسبة وتم إجراؤها وفقا للتوجيه 2010/63 / EU الصادر عن البرلمان الأوروبي والمجلس بشأن حماية المستخدمة للأغراض العلمية ، وكذلك مع اللوائح الوطنية. تم بذل كل الجهود لتقليل معاناة وتقليل عدد المستخدمة.

1. تحضير أنسجة المخ

  1. ضحي بالفئران في أربع نقاط زمنية مختلفة كل 6 ساعات على مدار دورة مدتها 24 ساعة ، في كل من ظروف الضوء / الظلام (LD 12:12) والظلام المستمر (DD) (الشكل 1). في ظروف LD 12:12 ، راجع وقت Zeitgeber (ZT) ، حيث يتوافق ZT0 مع بداية الطور الضوئي و ZT12 مع بداية المرحلة المظلمة. في الظلام المستمر ، ارجع إلى التوقيت اليومي (CT) ، حيث يمثل CT0 بداية اليوم الذاتي ، و CT12 يشير إلى بداية الليل الذاتي.
    ملاحظة: النقاط الزمنية هي ZT0 / CT0 (بداية اليوم ، اليوم الذاتي) ، ZT6 / CT6 (منتصف النهار ، اليوم الذاتي) ، ZT12 / CT12 (بداية الليل ، الليل الذاتي) ، و ZT18 / CT18 (منتصف الليل ، الليل الذاتي).
  2. قم بتصفيح أدمغة الفئران وإصلاحها باستخدام 2.5٪ جلوتارالديهايد و 2٪ بارافورمالدهيد في محلول فوسفات 0.1 مولار (درجة الحموضة 7.4).
  3. قم بإزالة كل دماغ من الجمجمة واتركه في محلول مثبت (2.5٪ جلوتارالديهايد و 2٪ بارافورمالدهيد في محلول فوسفات 0.1 M ، درجة الحموضة 7.4) لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية.
  4. لتحضير الدماغ للتقسيم ، قم بقطع المخيخ وتقسيم الدماغ إلى نصفي الكرة الأرضية (الشكل 2 أ ، ب).
  5. اختر نصف كرة واحدة (يمين أو يسار) وقم بتوجيهه بحيث يتم قطع الأقسام بشكل عرضي إلى قشرة البرميل. قم بتركيب نصف الكرة المحدد على ظرف الاهتزاز وألصقه بإحكام (الشكل 2 ج).
  6. قطع المقاطع بسمك 60 ميكرومتر (سرعة قسم الاهتزاز: 7.10 والتردد: 5.00) (الشكل 2 د) ثم نقل الأقسام إلى مزيج من محلول الفوسفات 0.1 M والمحلول المثبت (نسبة 1: 5).
  7. افحص الأقسام تحت المجهر الضوئي بتكبير 4x واجمع فقط تلك التي تحتوي على قشرة مجال البرميل المرئية للخطوة التالية (الشكل 2E). استخدم الشريحة المقعرة للتأكد من بقاء القسم في حالة سائل باستمرار.

2. تثبيت الدماغ وتقسيمها

  1. استخدم فرشاة الرسم وانقل المناديل برفق إلى طبق بتري زجاجي صغير. بعد ذلك ، اشطف أقسام الدماغ في المخزن المؤقت 0.1 M cacodylate (BC ، درجة الحموضة 7.4) لمدة 3 × 5 دقائق.
  2. قم بإصلاح الأقسام في 1٪ من رابع أكسيد الأوزميوم (OsO4) في 0.1 مليون قبل الميلاد مع 1.5٪ فيريسيانيد البوتاسيوم واتركه عند +4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    ملاحظة: قم بإعداد محلول OsO4 مباشرة قبل الاستخدام لأن OsO4 غير مستقر ويقل نشاطه بمرور الوقت.
  3. أقسام ما بعد الإصلاح في 1٪ OsO4 في محلول 0.1 مليون قبل الميلاد لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: قم بتنفيذ كل هذه الخطوات أثناء ارتداء القفازات الواقية وتحت غطاء الدخان مع تهوية تعمل بشكل جيد لأن OsO4 شديد السمية.
    يجب حفظ النفايات في زجاجة منفصلة بغطاء محكم. لا تسمح للمنتج بالدخول إلى المصارف.
  4. بعد التثبيت ، اشطف الأقسام بالماء المقطر لمدة 2 × 5 دقائق.
  5. في الخطوة التالية ، احتضان أقسام الدماغ لمدة 40 دقيقة في محلول 70٪ من الإيثانول الذي يحتوي على 1٪ أسيتات اليورانيل. بعد الخلط ، استخدم حقنة مع مرشح (25 مم) واسكب ببطء 2 مل من المحلول في كل طبق بتري مع الأنسجة.
  6. تجفيف الأنسجة بتركيزات تصاعدية من الكحول: 70٪ و 80٪ و 90٪ إيثانول لمدة 5 دقائق لكل منها و 100٪ إيثانول ، 3 × 5 دقائق لكل منهما.
    ملاحظة: من الممكن ترك الأنسجة في 70٪ من الإيثانول طوال الليل عند +4 درجة مئوية.
  7. اغسل المناديل بأكسيد البروبيلين 2 × 10 دقائق.
    ملاحظة: أكسيد البروبيلين مادة كيميائية شديدة التآكل. استخدمه بحذر أثناء ارتداء القفازات الواقية والعمل تحت غطاء الدخان. يعد استخدام وعاء زجاجي (طبق بتري زجاجي) أمرا بالغ الأهمية لهذه الخطوة.
    أكسيد البروبيلين هو سائل وبخار شديد الاشتعال. يجب حفظ النفايات في وعاء زجاجي منفصل مغلق بإحكام. لا تدع المنتج يدخل المصارف ؛ هناك خطر الانفجار.
  8. استبدل أكسيد البروبيلين بمزيج من راتنج Polybed وأكسيد البروبيلين (نسبة 1: 1). صب ما لا يقل عن 2 مل من المحلول في كل طبق بتري مع الأقسام ، وقم بتغطيتها بغطاء ، واحتضانها لمدة 40 دقيقة.
  9. أخيرا ، قم بتضمين أقسام الدماغ في خليط الراتنج متعدد الطبقات وأكسيد البروبيلين (نسبة 3: 1). استخدم ما لا يقل عن 2 مل من الخليط لكل طبق بتري ، وقم بتغطيته واتركه لمدة 1.5 ساعة.
    ملاحظة: تأكد من غمر الأنسجة بالكامل وتأكد من أنها لا تطفو فوق السائل.
  10. قطع فيلم أكلار إلى قطع مطابقة لحجم الشريحة الزجاجية. باستخدام ماصة بلاستيكية ، ضع كمية صغيرة من الراتنج على فيلم أكلار وانقل أقسام الدماغ من طبق بتري إلى الراتنج باستخدام فرشاة الرسم. قم بتضمين كل قسم بين فيلمين من أكلار واحتضانه لمدة 48 ساعة في فرن 65 درجة مئوية للبلمرة.

3. تصوير قشرة البرميل والتقطيع

  1. تصوير أقسام الدماغ بتكبير موضوعي 2x باستخدام مجهر ضوئي (الشكل 2F).
  2. اجمع جميع الصور واستيرادها إلى برامج الرسومات.
    1. لفتح الصور، انقر على رمز ملف |افتح الصور وحددها باستخدام Shift |مفتوح. سيتم فتح الصور في نوافذ منفصلة.
    2. ابدأ في تكديس الصور من القشرة (أصغر قطعة) واستمر حتى تتم محاذاة جميع الأقسام بشكل صحيح.
    3. انقر بزر الماوس الأيمن فوق الطبقة 1 |طبقة مكررة على كل صورة. في مربع الحوار، أدخل رقم الصورة كاسم، واختر صورة واحدة كملف وجهة، ثم انقر فوق موافق. كرر هذه الخطوات لجميع الصور ، وقم بتكرارها في نفس ملف الوجهة.
    4. قم بمحاذاة الصور لإعادة بناء حقل البرميل ، مما يضمن الترتيب التشريحي المناسب. استخدم أداة Move لوضع كل طبقة يدويا، ثم انقر على Edit |التحويل |أداة Rotate or Flip لضبط الاتجاه إذا لزم الأمر. لضبط المحاذاة بدقة ، استخدم تحرير | التحويل | قم بتشويه زوايا الصورة وحركها لتتناسب مع الهياكل التشريحية بشكل مستقل. لتسهيل المحاذاة، اضبط وضع المزج للطبقة العليا على تراكب في لوحة الطبقات .
    5. قارن المعالم التشريحية مثل الخطوط العريضة للبرميل والأوعية الدموية لضمان الوضع الصحيح. لحفظ المكدس ، انقر فوق ملف |حفظ باسم ، قم بتسمية الملف ، واختر تنسيقه (PSD أو TIFF) ؛ ثم انقر فوق موافق.
  3. مراجعة الأقسام المتعددة التي تحتوي على حقل البرميل بالتتابع ، وتحديد البراميل المرئية في كل قسم.
  4. حدد كل برميل مرئي يدويا على طبقة مشتركة إضافية ، مما يضمن إعادة بناء حقل البرميل بأكمله. لإنشاء طبقة إضافية، انقر فوق الطبقة |جديد |طبقة، قم بتسمية الطبقة، وانقر فوق موافق. حدد أداة الفرشاة من شريط الأدوات وفي الطبقة الجديدة ، ارسم كل أسطوانة مرئية يدويا.
    1. لمزيد من الدقة، استخدم التكبير/التصغير واضبط حجم الفرشاة حسب الحاجة. لتكبير الصورة وتصغيرها ، استخدم أداة التكبير / التصغير أو اضغط على Ctrl + "+" / Ctrl + "-". لتغيير حجم الفرشاة، انقر بزر الماوس الأيمن على اللوحة القماشية أثناء تنشيط أداة الفرشاة وحرك شريط تمرير Size .
  5. حدد البرميل المحدد بناء على إعادة البناء هذه.
  6. ابحث عن البرميل المحدد تحت المجهر الضوئي بناء على نمط حقل البرميل (خمسة صفوف ، لكل منها أربعة إلى سبعة براميل) وترتيب الأوعية الدموية التي تشير إلى موقعه داخل حقل البرميل.
  7. في كل قسم به قشرة برميل مرئية ، حدد البرميل المحدد تحت مجهر مجسم واقطعه مع البرميل المجاور باستخدام شفرة حلاقة.
  8. قم بإزالة القطعة الصغيرة من القسم ، وألصقها على كتلة من الراتنج ، وضعها بعيدا حتى تجف. في وقت لاحق ، قم بقص الراتنج الزائد المحيط بالأنسجة.
    ملاحظة: تأكد من وضع قطعة الأنسجة بشكل مسطح على سطح الراتنج.
  9. استخدم سكينا فائق الصغر وسكين ماسي لقطع مقاطع متتالية رفيعة جدا (3-6 أقسام ، بسمك 65 نانومتر) (الشكل 3 أ) ، وجمعها على شبكات نيكل مطلية بفورمفار وفتحة واحدة (2 × 0.75 مم).
  10. بمجرد أن تجف ، قارن العينات مع أسيتات اليورانيل 2٪ لمدة 3 دقائق و 0.03٪ سترات الرصاص لمدة 1.5 دقيقة.
    ملاحظة: على النقيض من ذلك ، من المهم غسل الشبكات عدة مرات وتركها لتجف تماما بعد كل خطوة. استخدم المحاقن المزودة بمرشحات لخلات اليورانيل وسيترات الرصاص.
  11. التقط صورا متتالية من تجويف البرميل المحدد (على سبيل المثال، B2) تحت جهد تسارع TEM (جهد متسارع 80 كيلو فولت عند تكبير 4K أو 8K، اعتمادا على المساحة والحجم المطلوبين للتحليل.
    ملاحظة: عادة ، يتم تحليل الحجم الإجمالي على الأقل 100 ميكرومتر3 لكل.

4. تحليل الصور

ملاحظة: يمكن إنشاء ومحاذاة مجموعات من صور TEM بنفس الطريقة باستخدام كل من البرامج الحرة (مثل GIMP) والبرامج التجارية (مثل Photoshop). يمكن إجراء عمليات إعادة البناء أيضا بنفس الطريقة باستخدام كل من البرامج التجارية (على سبيل المثال ، 3D Studio Max) والبرامج المجانية تماما ، مثل Blender.

  1. لتقدير كثافة نقاط الاشتباك العصبي ، قم بتكديس ما لا يقل عن ثلاث صور TEM في برنامج الرسومات (الشكل 6). كلما زاد عدد الصور التسلسلية ، زادت دقة الحسابات.
    1. لفتح الصور، انقر على رمز ملف |افتح الصور وحددها باستخدام Shift |مفتوح؛ سيتم فتح الصور في نوافذ منفصلة.
    2. لكل صورة ، انقر بزر الماوس الأيمن فوق الطبقة 1 |طبقة مكررة. في مربع الحوار، أدخل رقم الصورة كاسم، واختر صورة واحدة كوجهة، ثم انقر فوق موافق. كرر نفس الخطوات لجميع الصور وقم بتكرارها في نفس الوجهة.
    3. لحفظ المكدس، انقر فوق ملف |حفظ باسم، وقم بتسمية الملف، واختر تنسيقه (PSD أو TIFF)، وانقر فوق موافق.
  2. لمحاذاة صور TEM، حدد طبقة الصورة العلوية، واضبط وضع المزج على Overlay في لوحة Layers . استخدم التحرير |التحويل |قم بالتدوير أو الوجه أداة لضبط اتجاه الصورة. استخدم أداة Move لمحاذاة الهياكل.
    1. لمزيد من التعديلات الدقة، استخدم Edit |التحويل | تشويه لتحريك زوايا الصورة بشكل مستقل. لزيادة الدقة، اضغط مع الاستمرار على Ctrl واسحب نقاط الزاوية الفردية. استخدم التغييرات في حجم وشكل الميتوكوندريا وأغلفة المايلين المحورية بين صور TEM المتتالية للتحقق من التسلسل الصحيح للصور.
  3. استخدم طريقة التشريح لحساب نقاط الاشتباك العصبي.
    1. أضف طبقة إلى مكدس الصور EM بالنقر فوق طبقة |جديد |طبقة |حسنا. تأكد من أن الطبقة الجديدة شفافة (بدون تعبئة الخلفية).
    2. لتحديد منطقة التحليل، انقر فوق الطبقة |جديد |طبقة |حسنا. ثم حدد أداة المستطيل ، وانتقل إلى الطبقة |نمط الطبقة |الحد، وتعيين لون الحد والسمك (الحجم) والموضع (يوصى بالداخل)، وانقر فوق موافق، وارسم مستطيلا. حدد تعبئة: 0٪. ضع علامة على جميع نقاط الاشتباك العصبي الموجودة في صور TEM التي لا تعبر حافتين متجاورتين محددتين للمستطيل (على سبيل المثال ، اليمين والسفلي أو الأعلى واليسار).
    3. أضف طبقة جديدة للتعليقات التوضيحية بالنقر فوق طبقة |جديد |طبقة |حسنا. استخدم أداة Brush لتمييز نقاط الاشتباك العصبي على الطبقة الجديدة. استخدم أداة التكبير/التصغير وأداة اليد لوضع علامات بدقة.
    4. اختر لونا واحدا لتمييز المشابك المثيرة ولونا مختلفا للمشابك المثبطة. لتغيير اللون ، انقر فوق مربع اللون الأمامي في شريط الأدوات ، وحدد لونا في نافذة منتقي الألوان ، وانقر فوق موافق.
  4. إذا كانت صور TEM تحتوي على هياكل كبيرة (على سبيل المثال ، الألياف العصبية النخاعية أو التشعبات الكبيرة أو أجزاء من جسم الخلية) ، فاستخدم شبكة ذات مربعات متعددة. هذا يسمح باستبعاد أي مربعات تشغلها بالكامل الهياكل الكبيرة.
    1. أضف طبقة شفافة جديدة بالنقر فوق طبقة |جديد |طبقة |حسنا. قم بتمكين عرض الشبكة بالنقر فوق عرض |عرض |الشبكة ، وتمكين المحاذاة إلى الشبكة بالنقر فوق عرض |المحاذاة إلى |شبكة.
    2. قم بتعيين تباعد الشبكة بالنقر فوق تحرير |التفضيلات |أدلة ، شبكة وشرائح. حدد أداة الخط، واضبط الوضع على الشكل أو البكسل، واضبط وزن الخط (على سبيل المثال، 1 بكسل)، وارسم خطوطا رأسية وأفقية على طول الشبكة المرئية لتغطية منطقة الصورة بأكملها.
  5. حدد القسمين "العلوي" و "السفلي" لكل مجموعة صور. احسب فقط نقاط الاشتباك العصبي الغائبة في الصورة الأخيرة ولكنها موجودة في الصور السابقة. هذا يسمح بتحديد نقاط الاشتباك العصبي بدقة دون المبالغة في تقدير عددها.
  6. استخدم المقياس على الصورة واحسب حجم العينة (كومة صور TEM). قم بقياس المنطقة التي يتم فيها حساب نقاط الاشتباك العصبي واضربها في عدد صور TEM في المكدس وسمك المقاطع فائقة النحافة.
  7. اقسم عدد نقاط الاشتباك العصبي على الحجم لتحديد كثافة المشبك لكل وحدة حجم.
  8. استخدم جميع صور TEM التي تحتوي على عمود فقري شجيري (عادة ما يكون 10-12 صورة مجهرية إلكترونية متتالية) لإعادة بناء العمود الفقري الشجيري والمشابك التي يشكلها.
    1. افتح مكدس الصور في برنامج الرسومات. حدد أداة الاقتصاص ، وحدد المنطقة التي تحتوي على العمود الفقري المتغصني في المكدس ، واضغط على Enter. سيتم اقتصاص المنطقة المحددة في جميع الطبقات المرئية. اجعل طبقة واحدة فقط مرئية في كل مرة، وقم بإخفاء الطبقات الأخرى باستخدام أيقونة العين في لوحة الطبقات .
    2. احفظ كل صورة تم اقتصاصها على حدة بالنقر فوق ملف |حفظ باسم، وقم بتسمية الملف، واختر تنسيقا (يوصى بتنسيق JPG)، وانقر فوق موافق. كرر لكل طبقة في المكدس.
      ملاحظة: قبل نقل الصور إلى برنامج إعادة بناء ثلاثي الأبعاد ، من الأفضل أولا تحديد العناصر التي يتم إعادة بنائها بالألوان.
    3. أضف طبقة جديدة للتعليق التوضيحي بالنقر فوق الطبقة | جديد |طبقة | حسنا.
    4. اضبط عتامة الطبقة على 30-50٪ في لوحة الطبقات .
    5. حدد أداة الفرشاة ، واختر لونا مختلفا لكل بنية (على سبيل المثال ، العمود الفقري الشجيري ، المشبذب) ، وحدد العناصر. اعمل فقط على الطبقة الجديدة للحفاظ على الصورة الأصلية. عند الانتهاء ، ادمج طبقة التعليقات التوضيحية مع الصورة ، وانقر بزر الماوس الأيمن على الطبقة العليا ، وادمج لأسفل. كرر هذه الخطوات لكل صورة TEM تحتوي على مقطع عرضي للعمود الفقري المتغصن.
  9. انقل صور TEM ذات المقاطع العرضية المرئية للعمود الفقري المتغصني إلى برنامج إعادة بناء ثلاثي الأبعاد. لحذف كائن المكعب الافتراضي ، انقر بزر الماوس الأيمن فوق الكائن ، ثم احذفه. لمحاذاة منظور إطار العرض قبل تحميل الصور، انقر فوق Z على أداة التنقل أو اضغط على اللوحة الرقمية 7. لتحميل الصور، انقر على إضافة |صورة |مرجع ، حدد الصورة الأولى ، وانقر فوقها نقرا مزدوجا للتأكيد. كرر ذلك مع كل صورة، مع التأكد من بقاء منظور إطار العرض متناسقا طوال الوقت.1
    ملاحظة: لتدوير طريقة العرض، اضغط مع الاستمرار على زر الماوس الأوسط، وحرك الماوس أو استخدم أداة التنقل. لتحريك طريقة العرض، اضغط مع الاستمرار على زر Shift + الماوس الأوسط، أو حرك الماوس، أو استخدم تحريك طريقة العرض.
  10. رتب صور TEM على المسافة المناسبة ، مع مراعاة سمك المقاطع فائقة النحافة (الشكل 4 أ). لوضع آخر صورة TEM على طول المحور Z ، انقر فوق الصورة ، وانقر فوق خصائص الكائن (الشريط الجانبي الأيمن) ، وأدخل القيمة في الموقع Z. يمكن الآن توزيع الصور بين الصورة الأولى والأخيرة. لتوزيعها ، حدد جميع الصور ، واضغط على N لفتح اللوحة N ، وانقر فوق علامة التبويب تحرير (في اللوحة N) | حي Z.
    ملاحظة: قبل إجراء أي تعديلات، قم بمحاذاة منظور إطار العرض، وانقر فوق Z على أداة التنقل أو اضغط على اللوحة الرقمية 7.
    يجب تمكين أداة التوزيع لتوزيع الصور. لتنشيطه ، انتقل إلى تحرير | التفضيلات | احصل على الإضافات ، وابحث عن "توزيع" ، وانقر فوق تثبيت. بمجرد التمكين، تظل أداة التوزيع نشطة عبر الجلسات ولا تحتاج إلى إعادة تنشيطها، طالما يتم استخدام نفس الإصدار من البرنامج.
  11. حدد شكل العمود الفقري الشجيري يدويا على كل صورة باستخدام منحنى واحد لكل صورة TEM (الشكل 4B ، C).
    1. تأكد من ظهور صورة TEM الأولى فقط. في مجموعة المشاهد، قم بإخفاء جميع الكائنات الأخرى باستخدام أيقونة العين . لإنشاء منحنى أساسي للمخطط التفصيلي، انقر فوق إضافة |منحنى |دائرة. حرك كائن BézierCircle مع الاستمرار G وحرك الماوس وانقر لقبول التغييرات.
    2. لمطابقة حجم ملف تعريف العمود الفقري المتغصن، قم بتغيير حجم الكائن، واضغط مع الاستمرار على S، وحرك الماوس، ثم انقر. أدخل علامة التبويب Modeling مع تحديد كائن BézierCircle. قم بمحاذاة منظور إطار العرض مرة أخرى وانقر فوق Z على أداة التنقل أو اضغط على اللوحة الرقمية 7.
    3. لضبط شكل المنحنى، حدد نقطة تحكم، واضغط مع الاستمرار على G، وحرك الماوس، ثم انقر.
    4. لضبط اتجاه المقابض وقوتها، حدد نقطة مقبض، واضغط على G للتحرك أو S للتحجيم، وانقر للتأكيد. كرر لكل نقطة.
    5. لإضافة نقطة تحكم جديدة، حدد نقطتي تحكم موجودتين، واضغط مع الاستمرار على Shift وانقر فوق كل نقطة، وانقر بزر الماوس الأيمن، وحدد تقسيم فرعي. عندما يتوافق المنحنى مع حدود ملف تعريف العمود الفقري الشجيري بشكل كاف ، أدخل علامة التبويب Layout ، وانقر بزر الماوس الأيمن على كائن BézierCircle و Duplicate Object ، وانقر دون تحريك الماوس. قم بإنشاء نفس عدد نسخ BézierCircle مثل صور TEM المستخدمة لإعادة البناء. قم بمحاذاتها مع صور TEM المرتبة باستخدام أداة Distribution كما في الخطوة 4.10.
    6. اضبط كل منحنى BézierCircle في علامة التبويب Modeling لمطابقة ملف تعريف العمود الفقري الشجيري في كل صورة. تأكد من أن كائن BézierCircle الذي تم تحريره حاليا وصورة TEM المقابلة فقط هي المرئية في كل مرة.
      ملاحظة: يجب تنفيذ جميع إجراءات النقر بزر الماوس الأيمن المطلوبة لخطوات معينة داخل حدود المشهد. يجب أن تتوافق المنحنيات المتتالية مع حدود أقسام العمود الفقري المتعاقبة وتحتوي على نفس العدد من نقاط التحكم.
  12. قم بتوصيل الخطوط المجاورة باستخدام وظيفة إعادة البناء ثلاثية الأبعاد لتشكيل سطح مستمر وإنشاء الشكل ثلاثي الأبعاد النهائي (الشكل 4D).
    1. تأكد من أن كائنات BézierCircle فقط هي المرئية. في مجموعة المشاهد، قم بإخفاء جميع الكائنات الأخرى باستخدام أيقونة العين في الشريط الجانبي.
    2. لإنشاء كائن العمود الفقري المتغصن، انتقل إلى علامة التبويب Layout ، وحدد جميع كائنات BézierCircle، وانقر بزر الماوس الأيمن، ثم انقر فوق Join. قم بتحويل الكائن المرتبط إلى شبكة بالنقر بزر الماوس الأيمن وتحديد تحويل إلى |شبكة.
    3. لتوصيل حواف الكائن المرتبط ، أدخل علامة التبويب النمذجة ، واضغط 2 للدخول إلى وضع تحديد الحافة |اختر |الكل |انقر بزر الماوس الأيمن |حلقات حافة الجسر.
    4. لملء الفجوة في الجزء العلوي من الكائن ، قم بإلغاء تحديد الكل بالنقر بجوار الكائن ، واضغط مع الاستمرار على Alt وانقر فوق قسم حافة واحد من الحافة العلوية ، وانقر بزر الماوس الأيمن ، وحدد Extrude Edges ، واسحب لأعلى على المحور Z ، واضغط على S وحرك الماوس لتقليص حلقة الحافة الجديدة ، انقر لقبول التغيير. أثناء استمرار تحديد حلقة الحافة الجديدة، انقر بزر الماوس الأيمن وحدد واجهة جديدة من الحواف. املأ الفجوة السفلية بنفس الطريقة.
    5. لتنعيم الكائن، أدخل علامة التبويب Layout ، وانقر بزر الماوس الأيمن، وحدد Shade Smooth. لمزيد من تنعيم الشكل، انتقل إلى المعدلات (الشريط الجانبي الأيمن) |إضافة معدل |توليد |سطح التقسيم الفرعي. قم بتعيين كل من Viewport و Render على نفس القيمة (يوصى بها 1).
  13. كرر الخطوات 4.11-4.12 لإعادة بناء المشبك (الشكل 4E ، F).
  14. قم بتعيين لون لكل هيكل واستخدم وظيفة العرض لإعداد الصورة النهائية (الشكل 4G ، H). انتقل إلى قائمة تظليل إطار العرض وحدد Rendered لمعاينة تغييرات المواد. حدد الكائن المراد تلوينه وانقر فوق المادة (الشريط الجانبي الأيمن) |جديد |ضبط اللون الأساسي.
    1. لتحسين مظهر المادة، اضبط أشرطة التمرير الخشونة أو المعدنية حسب الحاجة. استخدم هذه الطريقة لتعيين لون مميز لكل بنية.
    2. لضبط إضاءة المشهد ، انقر فوق كائن Light ، واضغط مع الاستمرار على G ، وحرك الماوس لتغيير موضعه. لتغيير شدة الضوء ، انتقل إلى البيانات (الشريط الجانبي الأيمن) واضبط قيمة الطاقة .
    3. لوضع الكاميرا، قم بتوجيه إطار العرض لمواجهة العمود الفقري المعاد بناؤه كما يجب أن يظهر في الصورة النهائية، اضغط على Ctrl + Alt + Numpad 0. حدد إطار الكاميرا المرئي، واضغط مع الاستمرار على G، وحرك الماوس لتغيير موضعه إذا لزم الأمر.
    4. للتحضير للعرض ، انتقل إلى الإخراج (الشريط الجانبي الأيمن) ، وقم بتغيير قيم الدقة X و Y لمطابقة الصورة المطلوبة. لتحسين جودة الصورة، انتقل إلى العرض (الشريط الجانبي الأيمن) |قم بالعرض واضبط قيمة العينات إلى ما بين 120 و250. للحصول على خلفية شفافة، انتقل إلى Render |فيلم |تحقق من شفاف. لعرض الصورة، اضغط على F12 أو انتقل إلى Render (القائمة العلوية) |عرض الصورة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتطبيق طريقتنا بشكل صحيح على تحليل التغيرات المشبكية اليومية ، من الضروري البدء باختيار أربع نقاط زمنية على الأقل على فترات متساوية ، مع نقطتين لكل مرحلة من مراحل نشاط (كل 6 ساعات). في هذه النقاط الزمنية المحددة ، يتم التضحية بالحيوانات ، ويتم جمع أدمغتها. يسمح هذا النهج بتحديد الأنماط اليومية أو اليومية للدونة المشبكية وربطها بالتغيرات في النشاط الحركي للحيوانات (الشكل 1). يسمح استخدام نقطتين زمنيتين فقط بتحليل الاختلافات في الكثافة المشبكية بين مراحل النشاط ولكنه قد لا يعكس بدقة النمط الحق...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، قدمنا المنهجية المستخدمة لدراسة اللدونة اليومية للمشابك وإعادة بناء العمود الفقري الشجيري في قشرة برميل الفئران. لضمان نتائج موثوقة ، يجب أن تتضمن دراسة اللدونة اليومية أربع نقاط زمنية على الأقل. أظهر بحثنا أن البيانات من نقطتين زمنيتين - واحدة خلال مرحلة الراحة (النهار) والأخرى أثناء مرحلة النشاط (الليل) - قدمت معلومات عن الاختلافات اليومية بين مراحل نشاط في ظل ظروف LD 12:12. كانت كثافة المشبك الكلية (المثيرة والمثبطة) أعلى بنسبة 21٪ خلال مرحلة الراحة (النوم) مقارنة بمرحلة النشاط ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم دعم هذا العمل من خلال منح من المركز الوطني للعلوم في بولندا ، NCN OPUS20 nr UMO-2020/39 / B / NZ7 / 03366 إلى EP وكلية الطب بجامعة Jagiellonian ، nr N41 / DBS / 001129 إلى MJ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
فيلم Aclarأجار العلميAGL4458
برنامج الخلاط   ؛الإصدار: v. 2.91.2
حمض الكاكوديليك ، ثلاثي هيدرات ملح الصوديومعلوم متعددة01131-100
شريحة مقعرةمينزل9.161 151
سكين الماس  دياتوم15-الولايات المتحدةزاوية السكين: الترا 45 درجة ؛  
كاميرا رقمية نيكون  DXM 1200 فهرنهايت
ثنائي الصوديوم فوسفات الهيدروجين دوديكاهيدراتالبقعة799280115
تضمين الراتنجعلوم متعددة08792-1تركيبة Luft 
ايثانولبول أوراالسلطة الفلسطينية - 11-0004
برنامج GIMPالإصدار: الإصدار 3.0.4
سترات الرصاصتابL018
الفحص المجهري الضوئي   ؛نيكون  أوبتيفوت
رابع أكسيد الأوزميوم علوم متعددة0223ج -10بلوري (99.95٪)
الرسام
برنامج فوتوشوبالإصدار: CS5
فيريسيانيد البوتاسيومسيغمالدريتشص 8131
أكسيد البروبيلين   ؛سيغمالدريتش82320نقية. PA ، &GE ؛ 99.5٪ (GC)
شبكات فتحة واحدةأجار العلميAGG25252 × 0.75 مم أو 2 × 1 مم
كلوريد الصوديوم تشيمبور117941206
ثنائي هيدروجين فوسفات الصوديوم ثنائي الهيدراتتشيمبور117991808
مجهر ستيريوبزو
مرشح الحقنة   ؛بيوسينسBS25PES045
TEM يوئيلJEM-2100
فائقة الميكروتوملايكاUC7
أسيتات اليورانيللاكيما
الاهتزازلايكاVT1000 S

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jasinska, M., Pyza, E. Circadian plasticity of mammalian inhibitory interneurons. Neural Plast. 2017, 1-12 (2017).
  2. Krzeptowski, W., Hess, G., Pyza, E. Circadian plasticity in the brain of insects and rodents. Front Neural Circuits. 12, 32(2018).
  3. Mansilla, A., et al. Molecular mechanisms that change synapse number. J Neurogenet. 32 (3), 155-170 (2018).
  4. Frank, M. G. Renormalizing synapses in sleep: the clock is ticking. Biochem Pharmacol. 191, 114533(2021).
  5. Jasinska, M., et al. Daily rhythm of synapse turnover in mouse somatosensory cortex. Acta Neurobiol Exp. 74 (1), 104-110 (2014).
  6. Jasinska, M., et al. Circadian rhythmicity of synapses in mouse somatosensory cortex. Eur J Neurosci. 42 (8), 2585-2594 (2015).
  7. Jasinska, M., et al. Circadian clock regulates the shape and content of dendritic spines in mouse barrel cortex. PLOS ONE. 14 (11), e0225394(2019).
  8. Jasinska, M., et al. Circadian changes of dendritic spine geometry in mouse barrel cortex. Front Neurosci. 14, 578881(2020).
  9. Jasinska, M., et al. Light-modulated circadian synaptic plasticity in the somatosensory cortex: link to locomotor activity. Int J Mol Sci. 25 (23), 12870(2024).
  10. Woolsey, T. A., Vander Loos, H. The structural organization of layer IV in the somatosensory region (SI) of mouse cerebral cortex. Brain Res. 17 (2), 205-242 (1970).
  11. Woolsey, T. A., Welker, C., Schwartz, R. H. Comparative anatomical studies of the Sml-face cortex with special reference to the occurrence of "barrels" in layer IV. J Comp Neurol. 164 (1), 79-94 (1975).
  12. Armstrong-James, M., Fox, K. Spatiotemporal convergence and divergence in the rat SI barrel cortex. J Comp Neurol. 263 (2), 265-281 (1987).
  13. Barrel cortex. Fox, K. , Cambridge University Press. (2008).
  14. Jasinska, M., et al. Rapid, learning-induced inhibitory synaptogenesis in murine barrel field. J Neurosci. 30 (3), 1176-1184 (2010).
  15. Knott, G. W., Quairiaux, C., Genoud, C., Welker, E. Formation of dendritic spines with GABAergic synapses induced by whisker stimulation in adult mice. Neuron. 34 (2), 265-273 (2002).
  16. Jasinska, M., et al. Effect of associative learning on memory spine formation in mouse barrel cortex. Neural Plast. 2016, 1-11 (2015).
  17. Jasinska, M., et al. Fear learning increases the number of polyribosomes associated with excitatory and inhibitory synapses in the barrel cortex. PLOS ONE. 8 (2), e54301(2013).
  18. White, E. L. Ultrastructure and synaptic contacts in barrels of mouse SI cortex. Brain Res. 105 (2), 229-251 (1976).
  19. Keller, P. J., Ahrens, M. B. Visualizing whole-brain activity and development at the single-cell level using light-sheet microscopy. Neuron. 85 (3), 462-483 (2015).
  20. Serrano, M. E., Kim, E., Petrinovic, M. M., Turkheimer, F., Cash, D. Imaging synaptic density: the next holy grail of neuroscience. Front Neurosci. 16, 796129(2022).
  21. Woelfle, S., et al. CLARITY increases sensitivity and specificity of fluorescence immunostaining in long-term archived human brain tissue. BMC Biol. 21 (1), 113(2023).
  22. Weibel, E. R. Stereological methods. Vol. 1: practical methods for biological morphometry. , Academic Press. London. (1979).
  23. Sterio, D. C. The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector. J Microsc. 134 (2), 127-136 (1984).
  24. Gundersen, H. J. G. Stereology of arbitrary particles. J Microsc. 143 (1), 3-45 (1986).
  25. Fiala, J. C., Harris, K. M. Cylindrical diameters method for calibrating section thickness in serial electron microscopy. J Microsc. 202 (3), 468-472 (2001).
  26. Napper, R. M. A. Total number is important: using the disector method in design-based stereology to understand the structure of the rodent brain. Front Neuroanat. 12, 16(2018).
  27. Perez-Cruz, C., Simon, M., Czéh, B., Flügge, G., Fuchs, E. Hemispheric differences in basilar dendrites and spines of pyramidal neurons in the rat prelimbic cortex: activity- and stress-induced changes. Eur J Neurosci. 29 (4), 738-747 (2009).
  28. Kasthuri, N., et al. Saturated reconstruction of a volume of neocortex. Cell. 162 (3), 648-661 (2015).
  29. Mikula, S., Binding, J., Denk, W. Staining and embedding the whole mouse brain for electron microscopy. Nat Methods. 9 (12), 1198-1201 (2012).
  30. Videnovic, A., Zee, P. C. Consequences of circadian disruption on neurologic health. Sleep Med Clin. 10 (4), 469-480 (2015).
  31. Logan, R. W., McClung, C. A. Rhythms of life: circadian disruption and brain disorders across the lifespan. Nat Rev Neurosci. 20 (1), 49-65 (2018).
  32. Nassan, M., Videnovic, A. Circadian rhythms in neurodegenerative disorders. Nat Rev Neurol. 18 (1), 7-24 (2021).
  33. Shen, Y., et al. Circadian disruption and sleep disorders in neurodegeneration. Transl Neurodegener. 12 (1), 8(2023).
  34. Dufort-Gervais, J., Mongrain, V., Brouillette, J. Bidirectional relationships between sleep and amyloid-beta in the hippocampus. Neurobiol Learn Mem. 160, 108-117 (2019).
  35. Adler, P., et al. Aging disrupts the circadian patterns of protein expression in the murine hippocampus. Front Aging Neurosci. 11, 368(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Transmission Electron MicroscopyCircadian Synaptic PlasticityBarrel CortexMouse BrainSynaptic DensityDendritic Spine ReconstructionExcitatory SynapsesInhibitory SynapsesStereological Dissector MethodTangential Brain Sectioning

Related Articles