مقالة منهجية

دليل تدريجي لعزل وتحليل سطح الورقة والحمض النووي الريبي الرسولي باستخدام وريدات نبات الأرابيدوبسيس

DOI:

10.3791/68406

⸱

أغسطس 8, 2025

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Indiana University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف طريقة بسيطة ولكنها قابلة للتكرار للغاية لعزل الحمض النووي الريبي خارج الخلية من سطح الورقة والأبوبلاست لنباتات نبات الأرابيدوبسيس.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعمل سطح أوراق النبات والفضاء بين الخلايا داخل الأوراق (الأبوبلاست) كواجهات رئيسية للتبادل الجزيئي بين النباتات وميكروباتها المتفاعلة. في العمل السابق ، أظهرنا وجود مجموعة متنوعة من أنواع الحمض النووي الريبي في أبوبلاست وريدات نبات الأرابيدوبسيس. في الآونة الأخيرة ، كشفت النتائج التي توصلنا إليها أن نباتات نبات الأرابيدوبسيس تفرز أيضا الحمض النووي الريبي بنشاط على أسطح أوراقها. للتحقيق في ذلك ، قمنا بتطوير طريقة قابلة للتكرار بدرجة كبيرة لجمع كل من غسل سطح الأوراق (LSW) وسائل الغسيل الصاخي (AWF) من نفس المجموعة من نباتات نبات الأرابيدوبسيس. بالإضافة إلى ذلك ، اكتشفنا تقنية غير جراحية تتضمن مسحة سطح الأوراق (LSS) ، والتي مكنتنا من جمع الحمض النووي الريبي عن طريق مسح سطح الورقة برفق باستخدام أعواد قطنية معقمة. لتقليل مخاطر التلوث الميكروبي ، قمنا بتصفية كسور LSW و AWF و LSS قبل عزل الحمض النووي الريبي خارج الخلية (exRNA). عند تحليل الحمض النووي الريبي الخارجي المنقى باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام الحمض النووي الريبي المتغير، لاحظنا مجموعة متنوعة من أنواع الحمض النووي الريبي الطويلة والصغيرة في عينات الحمض النووي الريبي LSW و LSS و AWF. تم إجراء مزيد من القياس الكمي والتحليل المقارن بين عينات الحمض النووي الريبي الخارجي والظروف التجريبية باستخدام برنامج ImageJ الذي يمكن الوصول إليه مجانا. يوفر هذا البروتوكول نهجا فعالا وفعالا من حيث التكلفة لعزل وتحليل كميات صغيرة من الحمض النووي الريبي من أوراق النبات. يمكن تمييز مستحضرات الحمض النووي الريبي هذه من خلال التسلسل والتحليلات الجزيئية الأخرى ، مما يوفر رؤى حول الأدوار الديناميكية للحمض النووي الريبي الخارجي في تفاعلات النبات والميكروب.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم استعمار الأوراق من قبل مجموعة متنوعة من الميكروبات ، بما في ذلك البكتيريا والفطريات والفطريات والطلائعيات ، والتي يمكن أن تساعد في حماية النباتات من الضغوطات الحيوية واللاأحيائية ، مما يعزز في النهاية نمو النباتوتطوره 1،2،3،4. تحتوي ورقة النبات على جزأين رئيسيين لاستضافة الميكروبات المتفاعلة: نباتية (سطح الورقة) والنباتات الداخلية (أبوبلاست)2. سطح الورقة محمي بطبقة بشرة كارهة للماء ، والتي تمنع فقدان الماء وتتضمن مكونات مثل الشمع والكوتين. غالبا ما يشتمل سطح الورقة العلوي (الأداكسالي) على خلايا بشرة متخصصة تشبه الشعر تسمى trichomes ، والتي تحمي من الأشعة فوق البنفسجية ، وتنظم درجة الحرارة ، وتعمل كرادع للحيوانات العاشبة. في المقابل ، يسهل الأبوبلاست تبادل الغاز والماء لعملية التمثيل الضوئي ويوفر بيئة رطبة مواتية للاستعمار الميكروبي5. على الرغم من هذه الاختلافات ، تفضل كلتا حجرتي الأوراق بعض الميكروبات ، حيث تكون الشبكات الميكروبية النباتية أكثر تعقيدا من حيث التنوع مقارنة بالشبكات الميكروبية الداخلية5. لا تزال كيفية تنظيم تكوين هذه المجتمعات الميكروبية في كل حجرة خارج الخلية غير مفهومة جيدا. نتوقع أن بنية المجتمع الميكروبي يمكن تحديدها ، جزئيا ، عن طريق الحمض النووي الريبي خارج الخلية (exRNA) الذي يفرزه النبات المضيف.

في دراستنا الأخيرة ، أبلغنا عن وجود أنواع متنوعة من الحمض النووي الريبي على سطح الورقة تختلف عن الحمض النووي الريبي في الأبوبلاست أو محللات الخلية6. في حين أن معظم الأبحاث حول الحمض النووي الريبي الخارجي في النباتات قد ركزت على الحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر ، مثل الحمض النووي الريبي الصغير (miRNAs) والحمض النووي الريبي الصغير المتداخل (siRNAs) ، فقد تم إيلاء اهتمام أقل لأنواع الحمض النووي الريبي الأخرى ، مثل الشظايا المشتقة من الحمض النووي الريبي والحمض النووي الريبي ، والتي يمكن أن تنظم العمليات الخلوية بشكل مستقل عن تكامل التسلسل ، لا سيما في الأنواع التي تفتقر إلى آليات تداخل الحمض النوويالريبي 7،8 ، 9.

تتيح الطريقة التي نصفها هنا العزل المتسلسل للحمض النووي الريبي عن كل من غسل سطح الأوراق (LSW) وسائل الغسيل الصاغي (AWF) باستخدام نفس المجموعة من نباتات نبات الأرابيدوبسيس. بالإضافة إلى ذلك ، نصف تقنية متعامدة غير جراحية تتضمن مسحة سطح الأوراق (LSS) ، والتي تتيح جمع الحمض النووي الريبي عن طريق مسح سطح الورقة المرشوشة برفق بأعواد معقمة ذات رؤوس قطنية6. لتقليل مخاطر التلوث الميكروبي ، نقوم بتصفية كل من كسور LSW و AWF قبل عزل الحمض النووي الريبي خارج الخلية. لتقييم توزيع كمية وحجم عينات الحمض النووي الريبي exRNA ، نصف بروتوكولا يستخدم الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد التغيير إلى الطبيعة جنبا إلى جنب مع تحليل الصور باستخدام برنامج ImageJ الذي يمكن الوصول إليه مجانا. يوفر هذا البروتوكول نهجا فعالا وفعالا من حيث التكلفة لعزل وتحليل كميات صغيرة من الحمض النووي الريبي الخارجي. يمكن تمييز مستحضرات الحمض النووي الريبي هذه من خلال التسلسل والتحليلات الجزيئية ، مما يوفر رؤى حول الأدوار الديناميكية للحمض النووي الريبي خارج الخلية في تفاعلات النبات والميكروب.

يختلف البروتوكول الموضح أدناه عن بروتوكولنا الموصوف سابقا لعزل الحمض النووي الريبي من حويصلات النبات خارجالخلية 10. لا يتطلب البروتوكول الحالي أي خطوات طرد مركزي فائق ويتيح عزل الحمض النووي الريبي عن سائل الغسيل الكلي خارج الخلية ، وليس فقط من الحويصلات خارج الخلية. الأهم من ذلك ، أنه يوفر طريقتين متعامدين لعزل الحمض النووي الريبي عن سطح الورقة. على حد علمنا ، لم يتم وصف عزل الحمض النووي الريبي عن أسطح الأوراق قبل منشورنا الأخير6.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد العازلة والتعقيم

  1. تحضير عازلة عزل الحويصلة (VIB) التي تتكون من 20 ملي مولار 2- (N-morpholino) حمض الإيثانسلفونيك (MES) ، ودرجة الحموضة 6.0 ، و 2 ملي مولار كالسيمن2 ، و 0.01 م كلوريد الصوديوم في 1 لتر من الماء المقطر.
    ملاحظة: تم إجراء تعديلات طفيفة على تركيز كلوريد الصوديوم في VIB من 0.1 م إلى 0.01 م لتقليد التركيز الأيوني لأبوبلاست الورقة.
  2. قم بالتعقيم في VIB لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية ، دورة سائلة. بدلا من ذلك ، قم بتعقيم VIB باستخدام مرشح فراغ 0.45 ميكرومتر.
    ملاحظة: هذه الخطوة هي التأكد من أن المخزن المؤقت معقم ، حيث يمكن أن يؤدي أي تلوث ميكروبي إلى استنباط النباتات وبالتالي التباين في النتائج. يمكن تخزين هذا المخزن المؤقت في درجة حرارة الغرفة (دون فتح الغطاء بعد التعقيم) للتخزين قصير الأجل أو عند 4 درجات مئوية للتخزين طويل الأجل.

2. المواد النباتية وحالة النمو

  1. زرع بذور نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا كول-0 من النوع البري (WT) في أواني بلاستيكية مستديرة مقاس 4 بوصات تحتوي على مزيج تأصيص قياسي. بعد البذر ، انقع البذور بمبيد فطري بيولوجي (600 مجم / لتر) ، وقم بتغطيتها بقبة بلاستيكية شفافة ، واحتفظ بها عند 4 درجات مئوية في الظلام لمدة 3 أيام للحث على الإنبات المتزامن.
  2. انقل الأواني التي تحتوي على البذور إلى غرفة نمو قصيرة اليوم يتم التحكم في درجة حرارتها عند 24 درجة مئوية تحت فترة ضوئية مظلمة تبلغ 9 ساعات / 15 ساعة مع كثافة تدفق فوتون ضوئي 150 ميكرولتر م − 2 · ثانية − 1 على مستوى النبات (مزيج 50:50 من 3,500 و 5,000 كلفن طيف 32 واط لمبات فلورية).
  3. بعد حوالي 10 أيام ، انقل الشتلات الفردية إلى إدخالات صينية مكونة من 36 خلية تحتوي على مزيج تأصيص وقم بتغطيتها بقبة بلاستيكية شفافة لمدة 1-2 أسابيع.
    ملاحظة: تتطلب التجربة النموذجية ~ 12-24 نباتا صحيا لكل نمط وراثي / معالجة. وقد لوحظ أن النباتات التي يبلغ عمرها 6-7 أسابيع تنتج الكمية المثلى من LSW و AWF RNA مع أقل خطر للتلوث الخلوي.
  4. اعتمادا على مزيج التأصيص المستخدم ، سقي النباتات كل 10-15 يوما لتجنب الجفاف أو إجهاد الفيضانات.

3. جمع الحمض النووي الريبي لسطح الورقة

  1. الطريقة القائمة على الطرد المركزي (غسل سطح الأوراق ؛ LSW)
    1. لكل تكرار ، استخدم نباتات نبات نبات الأرابيدوبسيس التي يبلغ عمرها 6-7 أسابيع.
    2. أضف Silwet-L77 (يشار إليه من الآن فصاعدا باسم عامل الترطيب) إلى VIB المعقم بتركيز نهائي قدره 0.001٪ (1 ميكرولتر في 100 مل من VIB) قبل البدء في عزل LSW.
      ملاحظة: Silwet-L77 هو عامل ترطيب يقلل من التوتر السطحي ويمكن المخزن المؤقت من تغطية أسطح الأوراق.
    3. انقل 100 مل من VIB إلى زجاجة رذاذ سعة 500 مل.
    4. افصل وريدات الأرابيدوبسيس بعناية عن جذورها باستخدام مقص ناعم.
    5. قم بإزالة التربة الزائدة من السويقة باستخدام فرشاة ناعمة.
    6. ضع الوريدات على صينية مسطحة بحيث يكون السطح المحوري متجها لأعلى.
    7. رش السطح المحوري بعامل ترطيب VIB + باستخدام خمس مضخات من زجاجة الرش.
    8. اقلب الوريدات بعناية ورش السطح المحوري بعامل ترطيب VIB + خمس مرات.
    9. لاستعادة LSW ، ضع الوريدات المرشوشة بعناية داخل محاقن خالية من الإبر سعة 60 مل مع وجود ثقوب في الأسفل (يمكن أن تتسع وريدتان عمرهما 6 أسابيع كحد أقصى لكل حقنة) موضوعة داخل زجاجات طرد مركزي سعة 250 مل. لف المحقنة بطبقة من البارافيلم حول الرقبة لتعليق طرف المحقنة فوق قاع الزجاجة (انظر الشكل 1 للرجوع إليها).
      ملاحظة: للحصول على تفاصيل حول تحضير المحاقن سعة 60 مل ذات الثقوب ، راجع البروتوكول11 المنشور سابقا.
    10. قم بالطرد المركزي للزجاجات المحملة عند 100 جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية (دوار JA-14).
    11. قم بتصفية LSW من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر واجمع المرشح في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل يوضع على الجليد.
      ملاحظة: عادة ما ينتج 12 مصنعا حوالي 30 مل من LSW في النهاية باستخدام هذا البروتوكول. ومع ذلك ، هذا مجرد تقدير يعتمد على عدد البخاخات التي يتم إجراؤها في كل خطوة. عادة ما يكون هذا الحجم أقل من الحجم الذي تم رشه ، حيث يتم فقد جزء من المخزن المؤقت المرشوش أثناء المناولة.
  2. طريقة مسحة سطح الأوراق (LSS)
    1. رش الوريدات المنفصلة بعامل ترطيب VIB + كما هو موضح في القسم السابق (الخطوات 3.1.1-3.1.7).
    2. لاستعادة LSS ، امسح الأسطح المحورية والعاكسية باستخدام أعواد معقمة ذات رؤوس قطنية واضغط على الأطراف المنقوعة على الجدار الداخلي لأنبوب الطرد المركزي سعة 15 مل للضغط على السائل.
      ملاحظة: يمكن جمع عينات LSS المحورية والعكسية في أنابيب منفصلة بناء على الإعداد التجريبي والنتيجة المتوقعة.
    3. قم بتصفية عينات LSS من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل يوضع على الجليد.
      ملاحظة: اعتمادا على عدد النباتات التي تم مسحها ، يمكن جمع كميات متفاوتة من LSS لكل تجربة.

figure-protocol-1
الشكل 1: الأدوات المستخدمة لغسل سطح الأوراق وعزل سائل الغسيل الرسولي. (أ) لجمع LSW و AWF ، يتم وضع وريدتين كاملتين من نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا في حقنة سعة 60 مل مع ثمانية ثقوب إضافية يتم صهرها في نهاية المحقنة باستخدام ملقط ساخن لإنشاء قنوات لتدفق الغسيل. (ب) ثم يتم لف هذه المحقنة الخالية من الإبر بالبارافيلم في منطقة الرقبة كما هو موضح. (ج) تسمح هذه الخطوة للحقنة بوضعها في زجاجة طرد مركزي سعة 250 مل دون لمس قاع الزجاجة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. جمع سائل الغسيل الصاخي (AWF)

  1. ضع نفس مجموعة النباتات المستخدمة لعزل LSW أو LSS في دورق واشطفها برفق مرتين بالماء المقطر.
  2. تسلل الفراغ إلى الوريدات مع VIB لمدة 20 ثانية على النحو التالي:
    ملاحظة: على الرغم من أن عملية التسلل الفراغي موصوفة جيدا في بروتوكول11 منشور سابقا ، فقد تم استنساخها هنا لتوضيح البروتوكول الحالي.
    1. ضع الوريدات بحذر في ماكينة صنع القهوة الفرنسية مع 300-500 مل من VIB. ضع الغطاء على المكبس الفرنسي وقم بخفض المكبس برفق حتى تغمر النباتات بالكامل.
    2. ضع المكبس الفرنسي بالنباتات والعازلة في غرفة مفرغة. ضع مكنسة كهربائية لمدة 20 ثانية باستخدام مضخة تفريغ. يجب أن يبدأ المخزن المؤقت في الغليان.
    3. حرر المكنسة الكهربائية وقم بإزالة المكبس الفرنسي من غرفة التفريغ ، وانزع الغطاء ، واسكب VIB في دورق بلاستيكي منفصل سعة 500 مل. قم بإزالة الوريدات من الصحافة الفرنسية.
      ملاحظة: يمكن إعادة استخدام VIB عدة مرات في نفس اليوم لنمط جيني واحد ، ولكن بمجرد استخدامه للتسلل الفراغي ، لا ينبغي تخزين VIB للاستخدام في يوم آخر.
    4. قم بإزالة VIB الزائد من النباتات عن طريق رج الأوراق برفق ثم تنظيفها بمنشفة ورقية.
  3. قم بإزالة المخزن المؤقت الزائد من أسطح الأوراق عن طريق النشاف اللطيف بورق النشاف.
  4. لتجميع سائل الغسيل الصاغي (AWF) ، ضع الوريدات داخل 60 مل من المحاقن الخالية من الإبر الموضوعة داخل زجاجات أجهزة الطرد المركزي سعة 250 مل كما هو موضح لجمع LSW وأجهزة الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة عند 600 × جم مع تسارع بطيء.
  5. قم بتصفية AWF المجمع من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر وجمع المرشح في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل يوضع على الجليد.
    ملاحظة: عادة ما ينتج 12 مصنعا حوالي 6 مل من AWF في النهاية باستخدام هذا البروتوكول. يمكن استخدام LSW و AWF و LSS المفلترة على الفور أو تخزينها عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام الآخر.
  6. سجل الوزن الطازج (FW) للنباتات المستخدمة لكل تكرار بعد عزل AWF. بعد ذلك ، استخدم هذه القراءة لتطبيع كمية الحمض النووي الريبي في كل عينة (الشكل 2).

figure-protocol-2
الشكل 2: الرسوم التوضيحية التخطيطية للبروتوكول وطريقة مسحة سطح الورقة. (أ) رسم تخطيطي للبروتوكول التدريجي لعزل غسل سطح الأوراق وسائل الغسيل الصاخبة باستخدام وريدات نبات الأرابيدوبسيس. (ب) توضيح تخطيطي لطريقة مسحة سطح الورقة (LSS) لعزل الحمض النووي الريبي لسطح الورقة. الأرقام المقتبسة من الشكل S1 والشكل S4 من Borniego et al. ، 20256. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

5. ترسيب الحمض النووي الريبي

  1. قم بترسيب الحمض النووي الريبي عن طريق خلط الحجم المطلوب من AWF أو LSW أو LSS مع حجم 0.1 من أسيتات الصوديوم 3 M (درجة الحموضة 5.2) و 1.0 حجم من الأيزوبروبانول البارد في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
  2. أضف الجليكوجين (20 مجم / مل من المرقة) إلى التركيز النهائي البالغ 20 ميكروغرام / مل.
    ملاحظة: تأكد من إمكانية الطرد المركزي لأنابيب الطرد المركزي المستخدمة في ترسيب الحمض النووي الريبي بسرعة عالية تبلغ 000 13 × جم. يمكن أن يؤدي كسر الأنابيب في هذه الخطوة إلى فقدان عينات الحمض النووي الريبي.
  3. يحتضن الخليط عند -20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 1 ساعة أو طوال الليل.
  4. الطرد المركزي الأنابيب عند 13,000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية (دوار JA-25.50).
  5. اغسل الحبيبات مرتين بمثلج 70٪ EtOH واتركها تجف في الهواء لمدة لا تزيد عن 10 دقائق.
  6. أعد تعليق الكريات في 100 ميكرولتر من الماء الخالي من DNase / RNase فائق النقاء أو VIB ، وانقل الحمض النووي الريبي إلى أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مل.
    ملاحظة: بعد هذه الخطوة ، يمكن تخزين الحمض النووي الريبي المترسب عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.

6. عزل الحمض النووي الريبي القائم على TRIzol

  1. أضف 1 مل من كاشف TRIzol إلى كل أنبوب واخلطه عن طريق رج المدور.
    تنبيه: للتعامل مع TRIzol ، استخدمه في غطاء الدخان ، وارتد قفازات ، وواقيا للعين.
  2. ضع الأنابيب على دوار منضدية لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
  3. أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى كل أنبوب ، متبوعا بخطوة دوامة قصيرة ولكنها قوية.
    تنبيه: للتعامل مع الكلوروفورم ، استخدمه في غطاء الدخان ، وارتد القفازات ، وحماية العين.
  4. اسمح للأنابيب بالوقوف عند RT لمدة 3 دقائق تقريبا ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 13,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  5. انقل المرحلة المائية إلى أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل وأضف 10 ميكروغرام من الجليكوجين الخالي من RNase وحجم واحد من الأيزوبروبانول البارد.
    تنبيه: بالنسبة للنفايات الخطرة بيولوجيا المتولدة (مثل نفايات الفينول)، اجمع المذيبات العضوية في حاويات النفايات المخصصة وفقا للإرشادات المؤسسية.
  6. احتضان الأنابيب لمدة لا تزيد عن 1 ساعة عند -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: يؤدي ترسيب الحمض النووي الريبي لأكثر من ساعة واحدة في هذه الخطوة إلى تقليل كفاءة عزل الحمض النووي الريبي ويؤدي إلى تركيز منخفض جدا من الحمض النووي الريبي.
  7. لتكسير الحمض النووي الريبي ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 13,000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  8. اغسل كريات الحمض النووي الريبي مرتين باستخدام 70٪ EtOH المثلج واتركها تجف في الهواء قبل إعادة تعليقها في 10-20 ميكرولتر من الماء الخالي من DNase / RNase فائق النقاء.
  9. قم بتخزين الحمض النووي الريبي المعلق عند -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية للتخزين قصير أو طويل الأجل ، على التوالي.

7. إزالة تلوث الفينول أو الجوانيدين

  1. لإزالة تلوث الفينول أو الجوانيدين من عينات الحمض النووي الريبي ، قم بإجراء ترسيب تسلسلي واحد أو اثنين من الترسيب التسلسلي بنسبة 96٪ EtOH وخلات الأمونيوم.
  2. أضف 1 ميكروغرام من الجليكوجين إلى 10 ميكرولتر من عينات الحمض النووي الريبي واخلطها مع حجم 0.5 من أسيتات الأمونيوم 7.5 M قبل إضافة 2.5 حجم من 96-100٪ EtOH.
    ملاحظة: يجب أن يكون التركيز النهائي ل EtOH 70-75٪ في الحجم بأكمله في هذه الخطوة.
  3. احتضان الخليط عند -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وجهاز الطرد المركزي عند 13,000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  4. اغسل حبيبات الحمض النووي الريبي مرتين باستخدام 70٪ EtOH وأعد تعليقها في 10 ميكرولتر من الماء الخالي من DNase / RNase فائق النقاء.

8. الرحلان الكهربائي لهلام الحمض النووي الريبي للقياس الكمي والمقارنة

  1. تحضير جل صغير (7.2 سم × 8.6 سم × 0.75 مم) يحتوي على 10٪ أو 15٪ بولي أكريلاميد و 7 م يوريا في 1x حمض البوريك EDTA (TBE ، درجة الحموضة 8.4) باستخدام محلول 40٪ أكريلاميد / مكرر ، 37.5: 1. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام جل صغير تجاري لتغيير طبيعة الشمس (15٪ TBE-Urea Gel) لتشغيل عينات الحمض النووي الريبي.
  2. امزج عينات الحمض النووي الريبي (1: 1) مع 2x مخزن مؤقت لتحميل تغيير الطبيعة (95٪ فورماميد ، 10 ملي مولار EDTA ، 0.02٪ SDS ، 0.02٪ بروموفينول أزرق ، و 0.01٪ زيلين سيانول) ، يشوه الطبيعة عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ويوضع على الفور على الجليد.
  3. قم بحل عينات الحمض النووي الريبي في مخزن مؤقت يعمل بمعدل 0.5x TBE عند RT عند 220 فولت لمدة ساعة و 15 دقيقة تقريبا.
  4. بالنسبة لمعايير الحجم ، استخدم مزيجا 1: 1 من علامات سلم ssRNA منخفضة المدى و 14-30 nt ssRNA.
  5. قم بتلطيخ الجل بصبغة هلام الحمض النووي الذهبي 1x SYBR في 0.5x TBE لمدة 10 دقائق ، واغسلها مرتين بالماء المقطر ، وقم بتصويرها باستخدام نظام التصوير (الشكل 3).
  6. لتحديد كمية الحمض النووي الريبي الذي تم حله في كل حارة ، استخدم طريقة تحليل الهلام الموضحة في وثائق ImageJ تحت العنوان الفرعي "تحليل الجل": https://imagej.net/ij/docs/menus/analyze.html
  7. نظرا لأنه يتم تحميل 100 نانوغرام / ميكرولتر من CL RNA في كل مرة لمقارنة نمط النطاقات بين عينات CL و exRNA ، قم بتقدير تركيز عينات الحمض النووي الريبي exRNA بالنسبة إلى CL RNA (الشكل 4).

figure-protocol-3
الشكل 3: أوراق النبات مطلية بالحمض النووي الريبي المتنوع. تم فصل 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي من محللة خلايا الأوراق (CL) ، و 2 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي المعزول من AWF و LSW على هلام بولي أكريلاميد متغير الطبيعة بنسبة 15٪ وتلطيخها بصبغة الحمض النووي SYBR Gold لتصور ومقارنة أنماط نطاقات الحمض النووي الريبي. يتم عرض معايير حجم الحمض النووي الريبي في أقصى اليسار. يشار إلى قياسات قياس الكثافة التي تم الحصول عليها باستخدام تحليل هلام ImageJ في الجزء السفلي من كل حارة وتشير إلى كمية الحمض النووي الريبي بالنسبة إلى الحمض النووي الريبي في ممر محللة خلية الأوراق الكلي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-protocol-4
الشكل 4: الاستخراج المتكرر للحمض النووي الريبي LSW. تم عزل LSW لأول مرة باستخدام VIB بدون Silwet L-77 أو تركيزات متفاوتة من Silwet L-77 (0.001٪ أو 0.01٪). يمكن استخدام العزل المتكرر ل LSW باستخدام نفس المجموعة من نباتات نبات نبات الأرابيدوبسيس لإثراء الحمض النووي الريبي LSW باستخدام VIB + Silwet L-77 (0.001٪). تشير L1 و L2 و L3 إلى عينات الحمض النووي الريبي المعزولة باستخدام LSW التي تم جمعها من خلال ثلاث جولات متتالية من الطرد المركزي بعد رش نفس المجموعة من النباتات. زيادة تركيز عامل الترطيب من 0.001٪ إلى 0.01٪ لم تعزز عزل LSW RNA. يشار إلى قياسات قياس الكثافة التي تم الحصول عليها باستخدام تحليل هلام ImageJ في الجزء السفلي من كل حارة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

9. طريقة بديلة لتحديد كمية الحمض النووي الريبي باستخدام طريقة قائمة على لوحة الميكروتيتر

  1. قم بإعداد محاليل الحمض النووي الريبي القياسية باستخدام الحمض النووي الريبي المزمن في مياه خالية من RNase / DNase فائقة النقاء. تحديد نطاق التركيز المناسب للمعايير بناء على التركيز المتوقع للعينات. استخدم تركيزات الحمض النووي الريبي التالية: 0 ، 6.75 ، 12.5 ، 25 ، 50 ، 100 ، 200 نانوغرام / ميكرولتر ، وقم بإعداد حجم كاف من كل معيار للسماح بتكرارين تقنيين.
  2. قم بإعداد صبغة هلام الحمض النووي SYBR Gold 1.5x في 500 ملي مولار Tris HCl درجة الحموضة = 8.
    ملاحظة: يعتمد SYBR Gold على الأس الهيدروجيني ولديه حساسية تلطيخ مثالية بين الرقم الهيدروجيني = 7.0 و 8.0.
  3. إعداد Microplate:
    1. أضف 99 ميكرولتر من dH2O إلى كل بئر.
    2. أضف 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي إلى كل بئر. استخدم 1 ميكرولتر لكل من عينات الحمض النووي الريبي ومعايير الحمض النووي الريبي.
    3. أضف 50 ميكرولتر من 1.5x SYBR Gold إلى كل بئر.
  4. قم بتعيين المعلمات على قارئ اللوحة الدقيقة على النحو التالي:
    اهتزاز - خطي أو مداري: 0:03 (مم: SS)
    قراءة - نقطة نهاية مضان مع ضبط الطول الموجي للإثارة عند 496 نانومتر ، وضبط الطول الموجي للانبعاث عند 540 نانومتر.
  5. قم بإنشاء خط معايرة باستخدام قيم المعايير. باستخدام معادلة خط المعايرة ، احسب تركيزات الحمض النووي الريبي في العينات.
    ملاحظة: يمكن استخدام الأصباغ البديلة لتحديد الحمض النووي الريبي في عينات TRIzol المعزولة. تم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام كاشف القياس الكمي Ribo488 RNA. يتم توفير دليل مفصل من قبل الشركة لهذه الصبغة. باختصار ، قم بتخفيف الصبغة 1000x (1 إلى 1000) باستخدام 200 ملي مولار Tris pH = 8. ثم لإجراء القياسات ، أضف 99 ميكرولتر من dH2O المعقم إلى كل بئر + 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي (عينة أو قياسية) + 100 ميكرولتر من تخفيف Ribo488 ، واحتضان 5 دقائق ، وحدد كمية التألق باستخدام قارئ لوحة باستخدام إثارة 480 نانومتر وانبعاث 520 نانومتر. يتم عرض المنحنيات القياسية التي تم الحصول عليها باستخدام أصباغ الحمض النووي الريبي في الشكل 5.

figure-protocol-5
الشكل 5: المنحنيات القياسية التي تم الحصول عليها باستخدام طريقة القياس الكمي للحمض النووي الريبي المستندة إلى لوحة الميكروتيتر. ينتج عن أصباغ مختلفة من الحمض النووي الريبي ، SYBR Gold (يسار) و Ribo488 (يمين) نتائج متسقة مع تكرارين تقنيين لكل عينة. يمكن استخدام أي من الطريقتين لإجراء القياس الكمي للحمض النووي الريبي. ومع ذلك ، يجب الحصول على منحنى قياسي في كل مرة يحتاج فيها الحمض النووي الريبي إلى القياس الكمي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تظهر نظرة عامة تخطيطية على البروتوكول التدريجي الموصوف أعلاه لعزل غسل سطح الأوراق (LSW) وكسور الغسيل الشاذة (AWF) من نباتات نبات الأرابيدوبسيس في الشكل 2 أ. تسمح هذه الطريقة باستخراج كل من LSW و AWF من ما لا يقل عن ثلاثة إلى ستة نباتات لكل تكرار ، مع إنتاج كميات مكافئة من الحمض النووي الريبي باستمرار من كلا الكسرين. لقياس تركيز الحمض النووي الريبي في محللات الخلايا ، نستخدم القياس الطيفي الضوئي NanoDrop. ومع ذلك ، بالنسبة لعينات الحمض النووي الريبي المشتقة من LSW و LSS و AWF ، فإننا نعتمد على القياس الكمي لقياس الكثافة للمواد الهلامية بولي أكريلاميد الملطخة بالذهب. تعد خطوة القياس الكمي هذه ضرورية لأن الكسور خارج الخلية تحتوي على سكريات غير معروفة من المحتمل أن تكون ملوثة - والتي يمكن أن تنقية في بعض الأحيان وتتداخل مع طرق القياس الكمي للحمض النووي الريبي القائمة على الامتصاص ، مما يؤدي إلى المبالغة في تقدير تركيز الحمض النووي الريبي. للتغلب على هذا القيد ، نخطط لاستخدام طرق تنقية الحمض النووي الريبي غير القائمة على الفينول في عملنا المستقبلي.

كشف تحليل هلام الحمض النووي الريبي عن وجود مجموعة واسعة من أنواع الحمض النووي الريبي في LSW و AWF ، بما في ذلك كل من الحمض النووي الريبي الطويل والصغير (الشكل 3). والجدير بالذكر أنه تم عزل كميات الحمض النووي الريبي المكافئة بنجاح من كل من سطح الورقة والكسور النفاذية ، مع تطبيع كميات الحمض النووي الريبي لكل وزن جديد للنبات (FW). والمثير للدهشة أن ملفات تعريف حجم الحمض النووي الريبي لكسور LSW و AWF اختلفت اختلافا كبيرا عن بعضها البعض وعن ملف تعريف الحمض النووي الريبي المحلل الكلي للخلية (CL). تشير هذه الاختلافات إلى أن كسور الحمض النووي الريبي الخارجية ليست ملوثة بالحمض النووي الريبي الخلوي. من بين الكسور الثلاثة ، أظهر الحمض النووي الريبي المستدمد (AWF) أكبر تنوع في توزيع الحجم ، مما يشير إلى أن الحمض النووي الريبي الصاغي أكثر تدهورا من الحمض النووي الريبي لسطح الورقة.

لمزيد من الفحص لوجود الحمض النووي الريبي على سطح أوراق نبات الأرابيدوبسيس ، استخدمنا مسحات قطنية. سمحت لنا هذه الطريقة بجمع الحمض النووي الريبي بشكل منفصل ومتتابع من أسطح الأوراق المحورية (العلوية) والعكسية (السفلية)6. كشفت هذه التحليلات أن كلا سطحي الأوراق يحتويان على كميات متشابهة من الحمض النووي الريبي. علاوة على ذلك ، فإن القدرة على جمع الحمض النووي الريبي ببساطة عن طريق امتصاص المخزن المؤقت من سطح الورقة دون الحاجة إلى الطرد المركزي تدعم الاستنتاج القائل بأن الحمض النووي الريبي يقع بالفعل على سطح الورقة ، بدلا من استخراجه من خلال الثغور أثناء الطرد المركزي.

كان أحد التعديلات الأولية التي سمحت لنا باستخراج كمية وفيرة من الحمض النووي الريبي لسطح الورقة هو إضافة عامل الترطيب. استعدنا ما يقرب من ضعف الحمض النووي الريبي عند إضافة عامل ترطيب (بتركيز منخفض جدا قدره 0.001٪) إلى VIB. يشير هذا الاختلاف في تركيز الحمض النووي الريبي الذي تم الحصول عليه مع Silwet L-77 وبدونه إلى أن استخدام عامل ترطيب يحسن انحلال الحمض النووي الريبي على سطح الورقة. ومع ذلك ، فإن زيادة تركيز عامل الترطيب من 0.001٪ إلى 0.01٪ لم يعزز عزل LSW RNA (الشكل 4). والجدير بالذكر أن تكرار عزل LSW RNA من نفس الأوراق أسفر عن RNA إضافي (حوالي 63٪ من الاسترداد الذي تم الحصول عليه من الغسيل الأول) ، مما يشير إلى أن الأوراق تفرز الحمض النووي الريبي باستمرار على السطح ، مع استبدال ما يقرب من ثلثيها في غضون 30 دقيقة تقريبا اللازمة لمعالجة الأوراق. لزيادة إجمالي غلة الحمض النووي الريبي LSW عندما تكون المواد النباتية محدودة ، فمن الممكن بالتالي غسل نفس الأوراق عدة مرات متتالية. لا نوصي بأكثر من ثلاث غسلات ، لأن المناولة المعنية قد تؤدي إلى تلف تراكمي لمادة الأوراق ، كما تم تقييمها من خلال اللون الأخضر لسائل الغسيل. بالنسبة لهذه التجارب ، تم تقدير تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام تحليل قياس الكثافة القائم على هلام الحمض النووي الريبي. ومع ذلك ، يمكن استخدام طريقة القياس الكمي للحمض النووي الريبي المستندة إلى لوحة الميكروتيتر الموصوفة أعلاه للقياس الكمي الدقيق للحمض النووي الريبي عند تقييم عينات متعددة في وقت واحد (الشكل 5).

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية عزل غسل سطح الأوراق (LSW) ، ومسحة سطح الأوراق (LSS) ، وسائل الغسيل الشاذ (AWF) من وريدات نبات الأرابيدوبسيس الصحية ، متبوعا باستخراج الحمض النووي الريبي. تشمل الخطوات الحاسمة تحضير وتعقيم VIB قبل إجراء التجربة ، وزراعة النباتات في ظل ظروف خاضعة للرقابة ، واستخدام Silwet-L77 لضمان الطلاء المناسب لسطح الورقة بواسطة VIB. يجب أن تنتج هذه الإجراءات كميات متساوية من الحمض النووي الريبي من كل من LSW و AWF تطبيعها بالوزن الطازج للأوراق. يتطلب استعادة الحمض النووي الريبي من هذه الكسور خارج الخلية معالجة دقيقة ، خاصة فيما يتعلق بحبيبات الحمض النووي الريبي باتباع خطوات هطول الأمطار.

على الرغم من أن البروتوكول أعلاه قد تم تحسينه لأوراق نبات الأرابيدوبسيس ، فقد استخدمناه أيضا بنجاح على أنواع نباتية أخرى مع تعديلات طفيفة فقط. يمكن تحسين استخراج الحمض النووي الريبي من سطح الورقة عن طريق تنفيذ تعديلين أساسيين: أولا ، عن طريق إجراء جولات متعددة من عزل LSW ، وثانيا ، عن طريق زيادة تركيز عامل الترطيب. قد تتطلب الأنواع النباتية التي لها أسطح أوراق كارهة للماء ، مثل الأرز12،13 ، تركيزات أعلى من عامل الترطيب.

بالإضافة إلى ذلك ، وصفنا طريقة غير جراحية لجمع الحمض النووي الريبي لسطح الأوراق باستخدام مسحات قطنية. باستخدام طريقة عزل الحمض النووي الريبي لسطح الورقة ، نضمن وضع أنبوب التجميع في دلو ثلج. بالنظر إلى أن الحمض النووي الريبي الموجود على سطح الورقة يفرز ويتراكم في درجة حرارة الغرفة ، فإننا نفترض أنه سيظل مستقرا حتى أثناء عملية التجميع. لقد قارنا أيضا أنماط النطاقات ل LSW و LSS RNA ، ولا تظهر فرقا كبيرا من حيث التدهور.

يستخدم البروتوكول أعلاه كاشف TRIzol لتنقية الحمض النووي الريبي من LSW أو LSS أو AWF. يستخدم هذا الكاشف الفينول لإزالة البروتينات. ومع ذلك ، وجدنا أن التنقية القائمة على TRIzol لا تزيل السكريات مثل البكتين ، والتي توجد بكثرة في LSW و AWF6. يمكن أن تسبب جزيئات التنقية هذه مشكلات في القياس الكمي للحمض النووي الريبي باستخدام قياس الطيف الضوئي أو القياس الفلوري. لذلك نعتمد على تحليل قياس الكثافة القائم على هلام الحمض النووي الريبي لتقييم تركيزات الحمض النووي الريبي exRNA. نحن ندرس حاليا طرق التنقية القائمة على العمود والتي من شأنها أن توفر فصلا أفضل للحمض النووي الريبي عن السكريات. ومع ذلك ، غالبا ما تحد هذه الطرق من استعادة الحمض النووي الريبي الصغير حيث تم تحسين غشاء السيليكا لربط جزيئات الحمض النووي الريبي الأكبر من ~ 200 نيوكليوتيد. قد تمر الحمض النووي الريبي الصغيرة عبر الغشاء أثناء الارتباط أو تضيع في خطوات الغسيل. لذلك ، حتى الآن ، نعتمد فقط على الطريقة المستندة إلى TRIzol لاستعادة أكثر شمولا لجميع أحجام الحمض النووي الريبي ، بما في ذلك الحمض النووي الريبي الصغير ، على الرغم من أنها تتطلب معالجة دقيقة وفصل الطور.

بالإضافة إلى ذلك ، عند إجراء تحليل هلام الحمض النووي الريبي ، لا نرى شظايا أصغر من 80 nt لإجمالي عينات الحمض النووي الريبي الخلوي مقارنة ب AWF و LSW RNAs ، ويرجع ذلك أساسا إلى الوفرة المنخفضة بالنسبة للكميات الكبيرة من rRNA و tRNA. يرجع وجود نطاقات أصغر في AWF و LSW إلى تدهور الحمض النووي الريبي والكثرة rnas ، والذي يحدث بشكل طبيعي بعد إفراز الحمض النووي الريبي في حجرة النباتات خارج الخلية ، وهي ليست قطعة أثرية يتم إدخالها أثناء جمع النباتات والتعامل معها كما أكد التسلسل وتحليل اللطخة الشمالية6.

طريقة عزل غسل سطح الأوراق الخاصة بنا هي أداة متعددة الاستخدامات ذات إمكانات كبيرة لمجموعة واسعة من التطبيقات البحثية. يجب أن يمكن من عزل الجزيئات الحيوية عن سطح الورقة ، مثل الحمض النووي الريبي والبروتينات والمستقلبات الأخرى التي قد تكون أساسية لفهم التفاعلات بين النباتات والميكروبات. إذا كان تحديد الميكروبات الموجودة في AWF و LSW مطلوبا ، فيمكن تحقيق ذلك عن طريق التخلص من الترشيح من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر.

تتفاعل النباتات مع مجموعة واسعة من الميكروبات ، بما في ذلك البكتيريا والفطريات والفيروسات ، والتي تشكل مجتمعات معقدة على أسطحها1. يمكن أن يكون لهذه المجتمعات الميكروبية تأثيرات عميقة على نمو النبات ومقاومة الأمراض واكتساب المغذيات2،3،4. من خلال عزل وتحليل غسل سطح الأوراق باستخدام هذه الطريقة ، يمكن للباحثين عزل الحمض النووي الريبي الخارجي ، والمستقلبات الميكروبية ، وتحديد المجتمعات الميكروبية الموجودة على سطح الورقة ، والتحقيق في كيفية تنظيم هذه المجتمعات على المستوى الجزيئي.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل بمنحتين من مؤسسة العلوم الوطنية الأمريكية ،

IOS-2243531 و IOS-2141969 إلى RWI.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
14-30 nt ssRNA علامة سلمتاكارا3416
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 ملVWR20170-038
حقنة 10 مل بدون إبردينار بحريني303347
15 مل أنابيب الصقرVWR89039-668
15٪ جل ميني بروتين TBE-يوريا ، 10 بئر / 12 بئر ، 30 µ ؛ L / 20 & Lبيو راد4566053 / 4566055
إدراج درج 36 خليةسوق الأوراق الحقيقية
40٪ محلول أكريلاميد وثنائي أكريلاميد ، 37.5: 1بيو راد1610148
أواني مستديرة مقاس 4 بوصاتسوق الأوراق الحقيقية
50 مل أنابيب الصقرVWR89039-656
حقنة 50 مل بدون إبردينار بحريني309653
96 لوحة بئر قاع أسودجرينير655090
أكروديسك 0.22 μ مرشح حقنة Mسطل4192
أكروديسك 0.45 μ مرشح حقنة Mسطل4454
برسلفات الأمونيوم (APS)   ؛سيجما ألدريتشأ 3678
كلوريد الكالسيوم سيجما ألدريتشج1016
الكلوروفورم (خال من RNase)ماكرون فاين كيماوياتMK444110
قباب بلاستيكية شفافةهامرت الدولية11 3348يمكن استخدام أي قبة بلاستيكية لتغطية النباتات والحفاظ على الرطوبة
عصا قطنية ذات رأس طبي من الدرجة الطبيةيولينإس-21102
الإيثانول (خال من Rnase)مختبرات ديكون ، إنك2716GEA
ماكينة صنع القهوة فرينش برس، 24 أونصة سائلةذروة الثلجسي إس-111
صينية نمو بدون ثقوب 10 × 20سوق الأوراق الحقيقية
دلو الثلج  شويت بيوتك ، سبونجكس3-680 052
إيزوبوبانولثيرمو ساينتفيك149320050
JA-14 دوار الزاوية الثابتةبيكمان كولتر. الموديل: JA-14339247
كيموايتKCWW ، كيمبرلي كلارك34120
سلسلة ssRNA منخفضة المدىنيبرقم 0364 إس
هيدرات MESسيجما ألدريتشإم 8250
قارئ Microplateبيوتيك  التآزر H1
ميراكل جروميراكل جرو24-8-16إنه غذاء نباتي لجميع الأغراض. اعتمادا على مصدر التربة المستخدم لزراعة النباتات ، يمكن تعديل التطبيق.
زجاجة نالجين 250 مل (بدون غطاء خارجي)نالجين3120
مناشف ورقية
بارافيلم   فيلم M مختبربارافيلمإس-25929
دورق بلاستيكي (500 مل)يولينإس-21658
الجليكوجين الخالي من النياز RNase (20 مجم / مل)ثيرمو ساينتفيكر0561
مبيد الفطريات البيولوجي RootShield Plus WPبيووركس68539-9
مقص
سيلويت L-77مختبرات Phytotechط7777يمكن استخدام أي ماركة Silwet L-77. ومع ذلك ، يفقد Silwet فعاليته على مدار الفترة الزمنية. إنه مثالي لاستبداله مرة واحدة في السنة.
كلوريد الصوديومسيجما ألدريتشس7653
فرشاة طلاء الشعر النايلون الناعمةلنا. توريد الفنرقم 6
زجاجة رذاذيولينإس-7272يمكن استخدام أي زجاجة رذاذ ولكن يجب أن تكون إعدادات الرش قيد الاستحمام.
Sungro Professional Growing Mixسونغرو
مزيج التكاثر Sungroسونغرو
صبغة جل الحمض النووي الذهبي SYBR (مركز 10,000x في DMSO)ثيرمو ساينتفيكس 11494
TEMEDثيرمو ساينتفيك17919
كاشف TRIzolإنفيتروجين15596026
ماء عالي النقاء Dnase / Rnaseإنفيتروجين10977015
يورياسيجما ألدريتشيو 5378
غرفة فراغ ، 0.20 متر مكعب قدم.SP Scienceware - منتجات Bel-Art - أداة HBF42031-0000
مضخة فراغ ، 3.5 قدم مكعب في الدقيقةمنتجات الفراغ المثاليةP101532
ميزان الوزنإسكاليWBB480535هذا مجرد مثال. يمكن استخدام أي ميزان وزن.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vorholt, J. A. Microbial life in the phyllosphere. Nat Rev Microbiol. 10 (12), 828-840 (2012).
  2. Ritpitakphong, U., Falquet, L., Vimoltust, A., Berger, A., M'etraux, J., L'Haridon, F. The microbiome of the leaf surface of Arabidopsis protects against a fungal pathogen. New Phytol. 210 (3), 1033-1043 (2016).
  3. Chaudhry, V., Runge, P., Sengupta, P., Doehlemann, G., Parker, J. E., Kemen, E. Shaping the leaf microbiota: plant-microbe-microbe interactions. J Exp Bot. 72 (1), 36-56 (2021).
  4. Vacher, C., Hampe, A., Port'e, A. J., Sauer, U., Compant, S., Morris, C. E. The phyllosphere: microbial jungle at the plant-climate interface. Ann Rev Ecol Evol Syst. 47, 1-24 (2016).
  5. Mahmoudi, M., Almario, J., Lutap, K., Nieselt, K., Kemen, E. Microbial communities living inside plant leaves or on the leaf surface are differently shaped by environmental cues. ISME Commun. 4 (1), ycae103(2024).
  6. Borniego, M. L., et al. Diverse plant RNAs coat Arabidopsis leaves and are distinct from apoplastic RNAs. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (1), e2409090121(2025).
  7. Ren, B., Wang, X., Duan, J., Ma, J. Rhizobial tRNA-derived small RNAs are signal molecules regulating plant nodulation. Science. 365 (6456), 919-922 (2019).
  8. Chery, M., Drouard, L. Plant tRNA functions beyond their major role in translation. J Exp Bot. 74 (7), 2352-2363 (2022).
  9. Panstruga, R., Spanu, P. Transfer RNA and ribosomal RNA fragments-Emerging players in plant-microbe interactions. New Phytol. 241 (2), 567-577 (2024).
  10. Baldrich, P., Rutter, B. D., Karimi, H. Z., Podicheti, R., Meyers, B. C., Innes, R. W. Plant extracellular vesicles contain diverse small RNA species and are enriched in 10- to 17-nucleotide "Tiny" RNAs. Plant Cell. 31 (2), 315-324 (2019).
  11. Rutter, B. D., Rutter, K. L., Innes, R. W. Isolation and quantification of plant extracellular vesicles. Bio Protoc. 7 (17), e2533(2017).
  12. Zhang, Z., et al. OsHSD1, a hydroxysteroid dehydrogenase, is involved in cuticle formation and lipid homeostasis in rice. Plant Sci. 249, 35-45 (2016).
  13. Zhou, L., Ni, E., Yang, J., Zhou, H., Liang, H., Li, J., Jiang, D., Wang, Z., Liu, Z., Zhuang, C. Rice OsGL1-6 is involved in leaf cuticular wax accumulation and drought resistance. PLoS One. 8 (5), e65139(2013).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Leaf Surface RNAApoplastic RNAArabidopsis RosettesExtracellular RNARNA IsolationLeaf Surface WashApoplastic Wash FluidRNA Gel ElectrophoresisImageJ AnalysisPlant Microbe Interactions

مقالات ذات صلة