Ex Vivo تحليل الجزيء الفردي لمجموعة مستقبلات الريانودين 2 في أنسجة القلب والخلايا العصبية

Qianye Yin; Christopher I. Richards

doi:10.3791/68408

مقالة منهجية

Ex Vivo تحليل الجزيء الفردي لمجموعة مستقبلات الريانودين 2 في أنسجة القلب والخلايا العصبية

DOI:

10.3791/68408

⸱

يوليو 15, 2025

Qianye Yin¹ , Christopher I. Richards¹

¹Department of Chemistry, University of Kentucky

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه الدراسة طريقة تصوير أحادية الجزيء قائمة على الحويصلة تحافظ على تنظيم المستقبلات الأصلية ، مما يتيح القياس الكمي الدقيق للقياس المتكافئ والتطبيقات الواسعة في تجميع المستقبلات والوظيفة وأبحاث الأمراض.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد فهم تجميع المستقبلات أمرا بالغ الأهمية لتوضيح الآليات الكامنة وراء وظيفتها وتنظيمها في العمليات الفسيولوجية. في حين أن الدراسات التقليدية في المختبر أحادية الجزيء تعتمد على عزل البروتينات عن أنظمة التعبير غير المتجانسة ، إلا أنها غالبا ما تفشل في التقاط التعقيد الفسيولوجي في الجسم الحي الذي ينطوي عليه تنظيم وتجميع بروتينات سطح الخلية. يستخدم هذا البروتوكول الفحص المجهري الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي (TIRFM) لدراسة جزيئات مستقبلات الريانودين 2 (RyR2) الموسومة بعلامة GFP المغلفة داخل حويصلات نانوية. توفر هذه الحويصلات ، التي يتم إنشاؤها من الأعضاء المستخرجة بسرعة من ، لمحة سريعة عن حالة تجميع المستقبل في وقت الاستخراج ، مما يتيح تحليلا مفصلا لقياس متكافئ الوحدة الفرعية وتنظيم المستقبلات استجابة للتغيرات في البيئة الفسيولوجية للحيوان. يستخدم هذا النهج TIRFM وتحليل التبييض الضوئي التدريجي لتوفير قراءة لقياس متكافئ المستقبلات. تسهل مستقبلات التصوير على مستوى الجزيء الفردي اكتشاف عدم التجانس داخل مجموعات المستقبلات المجمعة في حي وتمكن من مراقبة تغيرات التجميع المرتبطة بحالات المرض. نتيجة لذلك ، توفر هذه الطريقة أداة قوية لتحديد توزيع مجموعات المستقبلات وارتباطها بالتغيرات في بيئتها الفسيولوجية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلعب مستقبلات الغشاء أدوارا حاسمة في العمليات الفسيولوجية في جميع أنحاء جسم الإنسان¹. تتمثل الوظيفة الأساسية في التوسط في الاتصال بين الخلايا من خلال نقل المحفزات خارج الخلية لبدء أحداث الإشارات داخل الخلايا. نظرا لدورها الأساسي في الإشارات ، فإن ما يقرب من 70٪ من العلاجات الحالية تستهدف مستقبلات الغشاء². غالبا ما تكون هياكل قليلة القلة تتكون من وحدات فرعية متعددة مجمعة في أشكال غير متجانسة مع قياسات متكافئة^{متعددة 3}^،⁴. يعد فهم كيفية تنظيم المستقبلات في مجمعات وظيفية أمرا بالغ الأهمية لتوضيح أدوارها في الصحة والمرض⁵^،⁶. توفر الطرق الكيميائية الحيوية التقليدية ، مثل الترسيب المناعي والنشاف الغربي ، قياسات متوسطة للمجموعة ، والتي تحجب عدم التجانس في المجموعات السكانية الفرعية^{للمستقبلات 7}. في المقابل ، تسمح تقنيات الجزيء الفردي بالملاحظة المباشرة للمستقبلات الفردية ، مما يتيح القياس الكمي لعدم التجانس داخل مجموعات المستقبلات⁸^،⁹^،¹⁰. أصبحت تقنيات الجزيء الفردي هي المعيار لتحديد تجميع مستقبلات الغشاء ، وقياس متكافئ ، وقلة القلة¹¹^،¹². تم تطبيق هذا النهج على نطاق واسع على العديد من مستقبلات الأغشية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية باستخدام ظروف البروتين المعزول أو زراعة الخلايا. تعتمد دراسات الجزيء الفردي بشكل أساسي على أنظمة التعبير في المختبر ، حيث يمكن عزل البروتينات عن البيئة الخلوية. ومع ذلك ، فإن التعقيد داخل النظام الحي لا ينعكس بشكل كامل في هذه الأنواع من أنظمة التعبير غير المتجانسة.

للتغلب على هذه القيود ، قمنا بتطوير نهج يعزل ويصور مستقبلات الغشاء في حالة ذات صلة من الناحية الفسيولوجية من خلال التقاطها داخل الحويصلات النانوية المشتقة مباشرة من أنسجة القلب والعصبية. تحافظ هذه الطريقة بشكل فعال على حالة تجميع المستقبلات في وقت تكوين الحويصلة ، مما يسمح بالتصور المباشر لقياس متكافئ الوحدة الفرعية للمستقبل ، وهو مؤشر محوري لاستجابة المستقبل في بيئات فسيولوجية مختلفة. يسمح لنا هذا النهج بفحص التجميع المتكافئ لمستقبلات الغشاء التي تحدث مع البيئة البيولوجية المعقدة داخل الحية دون الحاجة إلى تعبير غير متجانس أو إعادة تشكيل. من خلال استخدام المجهر الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي (TIRFM) ، نحقق تصويرا بدقة جزيء واحد للمستقبلات المغلفة بالحويصلات واستخراج آثار التبييض الضوئي لتحديد تكوين الوحدة الفرعية.

يعتبر TIRFM مناسبا تماما لتصوير البروتين الغشائي أحادي الجزيء لأنه يثير الفلوروفورات بشكل انتقائي في حدود ~ 150 نانومتر من سطح الزجاج ، مما يقلل من تألق الخلفية من الجزيئات في المحلول³^،¹⁰. يعزز هذا الحبس بشكل كبير نسبة الإشارة إلى الضوضاء ، مما يتيح الكشف الدقيق عن مجمعات مستقبلات الغشاء الفردية. من خلال تحليل التبييض الضوئي التدريجي للمستقبلات الموسومة بالفلورسنت ، يمكننا تحديد القياس المتكافئ للوحدة الفرعية مباشرة وتقييم عدم التجانس المحتمل داخل مجموعات المستقبلات¹². هذا مهم بشكل خاص لمستقبلات الريانودين 2 (RyR2) ، وهي قناة إطلاق كبيرة داخل الخلايا Ca²⁺ تلعب دورا مهما في اقتران الإثارة والتقلص في القلب ، حيث يتجمع فقط كمتجاني رباعي ، وفي وظيفة متشابكة في الدماغ ، حيث لم يتم إنشاء تجميعها¹^،¹³^،¹⁴. نظرا لوجود العديد من الأشكال الإسوية ل RyR في الأنسجة العصبية ، لا يزال من غير الواضح ما إذا كان RyR2 يشكل مجمعات رباعية متجانسة بحتة في الدماغ ، تتكون من أربع وحدات فرعية متطابقة كما هو الحال في القلب ، أو ما إذا كانت التجمعات غير المتجانسة مع RyR1 أو RyR3 تحدث في الجسم الحي¹⁵^،¹⁶^،¹⁷^،¹⁸.

من خلال عزل الحويصلات من مناطق معينة من القلب والدماغ ، تتيح هذه الطريقة التحقيق في الاختلافات المحتملة الخاصة بالأنسجة في تنظيم RyR2. نحن نستفيد من خصائص RyR2 في أنسجة القلب حيث يمكن أن تشكل فقط homotetramers لتوفير أساس قوي إحصائيا لقياس متكافئ الوحدة الفرعية أحادية الجزيء خارج الجسم الحي ، وتعمل مجموعة رباعي الرباعيات المعروفة كعنصر تحكم للتحقيق في التجميعات غير المعروفة في الأعضاء الأخرى. توفر القدرة على تصوير المستقبلات في حالتها الأصلية مع الحفاظ على تفاعلاتها الفسيولوجية إطارا قويا لدراسة تجميع المستقبلات في أعضاء مختلفة وفي ظل ظروف فسيولوجية مختلفة. يصف هذا البروتوكول سير عمل عزل الحويصلة ، والتثبيت ، والتصوير أحادي الجزيء ل RyR2 الذي يحمل علامة GFP ، مما يسمح بالتوصيف الدقيق لقياس متكافئ المستقبلات. لا تعمل هذه التقنية على تعزيز فهمنا لتنظيم RyR2 في أنسجة القلب والخلايا العصبية فحسب ، بل تقدم أيضا تطبيقات أوسع لدراسة تجميع المستقبلات وتنظيمها في مختلف السياقات الفسيولوجية والمرضية¹⁹^،²⁰^،²¹.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير العينة

نضح القلب واستخراج الأعضاء
1. قم بتخدير الماوس باستخدام ثاني أكسيد الكربون حتى يتوقف التنفس.
2. ضع الفأر في وضع ضعيف وقم بتأمين الأطراف.
3. قم بعمل شق خط الوسط على طول البطن وتمتد بشكل جانبي باتجاه القفص الصدري لكشف التجويف الصدري.
4. أدخل إبرة بحذر في البطين الأيسر وقم بتمرير الأذين الأيمن للسماح بتصريف الانحياز.
5. لتحضير الحويصلة ، قم بتسخين 1x PBS البارد حتى يتم تنظيف الدورة الدموية من الدم.
6. للاستئصال بالتبريد ، بعد تروية PBS ، استمر في الترشيح بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) لإصلاح الأنسجة.
7. استخرج القلب بعناية وضعه على الجليد على الفور.
8. باستخدام مقص ناعم ، قم بقص خط الوسط لفروة الرأس بعناية وقشر الجلد لكشف الجمجمة.
9. قم بعمل شق في قاعدة الجمجمة بالقرب من الثقبة العظمى.
10. باستخدام ملقط دقيق ، افتح الجمجمة بعناية على طول الشق الطولي ، وقم بإزالة شظايا العظام لكشف الدماغ.
11. ارفع الدماغ برفق باستخدام ملقط منحني ، وقطع الأعصاب القحفية لاستخراجه سليما بالكامل.
12. إذا تم استخدامه للتشريح بالتبريد ، فقم بإصلاح الدماغ بعد 4٪ PFA عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة.
13. إذا تم استخدامه لتحضير الحويصلة ، ضع الدماغ على الفور على الجليد دون تثبيت لمزيد من المعالجة.
التقطيع بالتبريد
1. قم بإزالة الدماغ أو القلب من 4٪ PFA وجفف.
2. قم بتضمين العضو بأكمله في مركب OCT داخل قالب التبريد.
3. قم بتجميد الأنسجة المضمنة عن طريق وضع القالب في فريزر -80 درجة مئوية حتى يتماسك تماما.
4. قبل التقسيم ، قم بموازنة غرفة ناظم التبريد ورأس العينة إلى -20 درجة مئوية.
5. انقل كتلة OCT المجمدة من الفريزر -80 درجة مئوية إلى غرفة التبريد واتركها تتوازن لمدة 10 دقائق.
6. نظف ظرف العينة بنسبة 70٪ من الإيثانول وجففه وقم بتطبيق طبقة رقيقة من OCT كمادة لاصقة.
7. قم بتثبيت كتلة OCT المجمدة على الظرف ، مما يضمن الاتجاه الصحيح.
8. أدخل ظرف الظرف في حامل عينة ناظم البرد واضبط موضع الشفرة.
9. تقليم OCT الزائد حتى ينكشف سطح الأنسجة.
10. قسم الأنسجة بسمك 10 ميكرومتر ، وجمع الأقسام على شرائح زجاجية.
11. بعد تجفيف الأقسام بالهواء في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة ، ضع وسائط التثبيت على الأقسام وضع غطاء لإغلاق العينة.
12. اسمح لوسائط التثبيت بالضبط قبل تخزين الشرائح عند 4 درجات مئوية للتصوير.
تحضير الحويصلة
1. تحضير الحويصلة القلبية
  1. استخرج القلب بعد نضح القلب باستخدام 1x PBS وضعه على الثلج.
  2. باستخدام مشرط معقم ، قم بتشريح ما يقرب من 30 مجم من عضلة البطين من أسفل القلب.
  3. انقل الأنسجة إلى أنبوب طرد مركزي يحتوي على 4-5 مل من 10 ملي مولار NaHCO₃ مع 5 ملي NaN₃ للحفاظ على سلامة الحويصلة.
  4. قم بتجانس الأنسجة باستخدام الخالط حتى يتحلل بالكامل.
  5. جهاز الطرد المركزي المتجانس عند 10,000 × جم لمدة 20 دقيقة لإزالة الحطام الكبير وجمع المادة الطافية.
  6. قم بإجراء الطرد المركزي الفائق عند 37,000 × جم لمدة 65 دقيقة ، ثم تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 3-4 مل من 20 ملي مولار من المخزن المؤقت Tris-maleate (الرقم الهيدروجيني 6.8) مع 0.6 M KCl.
  7. كرر الطرد المركزي الفائق عند 37,000 × جم لمدة 65 دقيقة أخرى لإزالة أكتوميوسين الذوبان.
  8. أعد تعليق الحبيبات النهائية في 0.5 مل من 20 ملي مولار Tris-maleate buffer (الرقم الهيدروجيني 6.8) مع 50 ملي كلوريد كلوريد للحصول على محلول الحويصلة القلبية وتخزينه عند -80 درجة مئوية.
2. تحضير حويصلة الدماغ
  1. استخرج الدماغ بعد نضح عبر القلب مع 1x PBS وضعه على الجليد.
  2. قم بتقسيم الدماغ إلى أقسام بحجم 1 مم باستخدام مصفوفة إكليلية لدماغ الفأر 1 مم.
  3. حدد القسمين الثالث والرابع من البصلة الشمية وقم بتشريحها بعناية: 1) الطبقة القشرية الخارجية من نصفي الكرة الأرضية ؛ 2) الحصين ، ويقع في المنطقة الوسطى من القسم.
  4. من الطرف الخلفي ، اعزل المخيخ عن طريق عمل قطع عرضي في قاعدته.
  5. اجمع نفس مناطق الدماغ من خمسة فئران لضمان إنتاجية الحويصلة الكافية.
  6. قم بتجانس الأنسجة على الفور باستخدام الخالط Dounce في 2 مل من محلول التجانس البارد (0.32 م سكروز ، 10 ملي هيبس ، 2 ملي مولار EDTA ، مثبط للبروتياز ، درجة الحموضة 7.4).
  7. أضف 3 مل من مخزن التجانس الإضافي وجهاز الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 15 دقيقة لإزالة شظايا الأنسجة الكبيرة.
  8. اجمع المادة الطافية وجهاز الطرد المركزي عند 1,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية لإزالة الجزء النووي.
  9. مزيد من الطرد المركزي للطافية عند 10,000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية لإزالة الميتوكوندريا.
  10. الطرد المركزي الفائق الناتج عند 100,000 × جم لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية لحبيبات الحويصلات.
  11. أعد تعليق حبيبات الحويصلة النهائية في 1x PBS للحصول على محلول حوصلة الدماغ وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
توصيف الحويصلة النانوية عن طريق تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA)
1. قم بتجميع خلية الكشف باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
2. قم بتشغيل الجهاز وقم بتشغيل البرنامج المتوافق.
3. قم بتحميل حقنة سعة 1 مل بالماء منزوع الأيونات (DI) وقم بغسل أنبوب النظام يدويا حتى تصبح الخلفية خالية من الملوثات.
4. قم بإعداد عينة الحويصلة النانوية عن طريق تخفيفها في 1x PBS.
5. قم بتحميل ~ 1 مل من عينة الحويصلة النانوية المخففة في حقنة نظيفة سعة 1 مل ، مما يضمن عدم وجود فقاعات هواء.
6. قم بحقن العينة يدويا في خلية الكشف واضبط التركيز البؤري حتى تظهر الحويصلات بوضوح.
7. قم بتثبيت المحقنة على مضخة الحقنة ، واضبط معدل التدفق على 200 ميكرولتر / ثانية في لوحة الأجهزة.
8. في لوحة SOP، اضبط مدة القياس على 60 ثانية، وعدد الدورات على 5، وتأكد من تمكين التحكم في درجة الحرارة وضبطه على 25 درجة مئوية. احفظ الإعدادات كإجراء تشغيلي موحد جديد بالنقر على حفظ الإجراء التشغيلي الموحد وتسمية الملف بشكل مناسب (على سبيل المثال، "nanovesicle_standard.sop").
9. في لوحة الالتقاط، قم بتكوين إعدادات الجهاز عن طريق تحديد مستوى الكاميرا 13 وعتبة الكشف الأولية 3.
10. انقر فوق تشغيل وحدد الإجراء التشغيلي الموحد المحفوظ مسبقا. سيقوم البرنامج تلقائيا بإجراء القياس وفقا للإعدادات.
11. بمجرد الانتهاء، انقر على تحليل لمعالجة كل فيديو. اضبط عتبة الكشف للتأكد من أن جميع الجسيمات مرئية بوضوح، وانقر فوق إنهاء بعد اكتمال تحليل الدفعات. تصدير النتيجة بالنقر على تصدير البيانات | جميع القياسات ، وحفظها كملف CSV لاستخدامها لاحقا.
12. بعد الانتهاء من التجربة ، اغسل النظام ب ~ 2 مل من ماء DI حتى لا تبقى حويصلات متبقية.
13. قم بحقن الهواء من خلال الأنبوب لإزالة أي سائل متبقي ، مما يضمن جفاف النظام للاستخدام التالي.

2. التصوير

التصوير متحد البؤر لعمليات القطع بالتبريد للأنسجة
1. قم بتشغيل المجهر متحد البؤر للمسح بالليزر وافتح البرنامج المرتبط.
2. حدد الهدف المناسب (20x air أو 60x oil) وقم بتحميل شريحة القطع بالتبريد المحضرة على مرحلة المجهر.
3. قم بتكوين إعدادات الليزر لإثارة GFP باستخدام خط ليزر 488 نانومتر مع مرشح انبعاث 535/70 نانومتر.
4. تحسين معلمات التصوير ، بما في ذلك حجم الثقب (28.9 ميكرومتر) ، وشدة الليزر (17٪) ، وكسب الكاشف (15.3) ، لتعزيز نسبة الإشارة إلى الضوضاء مع تقليل التبييض الضوئي.
5. إذا لزم الأمر ، احصل على مكدس Z عن طريق تعيين المستويين البؤري العلوي والسفلي وتحديد حجم الخطوة المناسب (0.275 ميكرومتر).
6. قم بتمكين خياطة الصور التلقائية مع تداخل الصورة بنسبة 15٪ عند الحصول على صور كبيرة المساحة.
7. اضبط دقة الصورة وقم بتطبيق متوسط الإطار إذا لزم الأمر لتقليل ضوضاء الخلفية.
8. التقط الصور واحفظها بتنسيق ".nd2" لمزيد من التحليل.
تصوير التألق الانعكاس الداخلي الكلي (TIRF)
1. تثبيت الحويصلة عبر مرساة متوافقة حيويا للغشاء (BAM) طريقة²²
  1. تنظيف 35 مم الأطباق الزجاجية القاع عن طريق صوتنة لها في 5 M هيدروكسيد الصوديوم لمدة 1 ساعة عند 45 درجة مئوية ، متبوعة بثلاث شطف شامل بالماء DI.
  2. قم بتقطيع الأطباق في 0.1 M HCl لمدة ساعة أخرى عند 45 درجة مئوية ، تليها ثلاث عمليات شطف إضافية بالماء DI.
  3. عالج السطح الزجاجي النظيف بنسبة 2٪ 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) في الإيثانول لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإدخال مجموعات وظيفية أمين.
  4. اشطف الطبق 3 مرات بماء DI والإيثانول لإزالة APTES الزائدة واتركه حتى يجف.
  5. احتضن الطبق ب 100 ميكرومتر Oleyl-O (CH₂CH₂) nCO-CH₂CH₂-COO-NHS (Sunbright OE-020CS) في 1x PBS لمدة 10 دقائق.
  6. اغسل الطبق باستخدام PBS لإزالة الكاشف غير المتفاعل.
  7. أدخل الحويصلات بالتركيز المطلوب واحتضانها لمدة 15 دقيقة للسماح بربط الحويصلة.
  8. اشطف الطبق برفق باستخدام PBS لإزالة الحويصلات غير المربوطة مع ضمان بقاء الحويصلات الثابتة.
2. إعداد التصوير TIRF والاقتناء
  1. قم بتشغيل المجهر الفلوري المقلوب مصدر ليزر 488 نانومتر وكاميرا EMCCD.
  2. قم بتشغيل برنامج Metamorph و CellSens لتهيئة التحكم في التصوير.
  3. قم بتنظيف هدف غمر الزيت بمقدار 60x (1.49 NA APO) بالميثانول لإزالة الغبار والزيوت المتبقية.
  4. ضع قطرة صغيرة من زيت الغمر المطابق لمعامل الانكسار (RI) على العدسة الشيئية.
  5. ضع طبق الحويصلة المحضر على مرحلة المجهر ، مع التأكد من توسيطه للحصول على المحاذاة المثلى.
  6. اضبط تركيز شعاع الليزر عن طريق توسيط شعاع الإثارة في منتصف الفتحة الخلفية للهدف في وضع التألق العرضي.
  7. استخدم محرك السائر لضبط زاوية سقوط الليزر حتى يتم الوصول إلى الزاوية الحرجة ، مما يضمن الانعكاس الداخلي الكلي على سطح الزجاج.
  8. تحديد المستوى البؤري عن طريق المسح الضوئي من خلال المحور Z ، وتمييز: 1) مستوى التركيز الأول ، المقابل لسطح القاع الزجاجي ؛ 2) مستوى التركيز الثاني ، المقابل للسطح المجمد بالحويصلة.
  9. بمجرد التركيز البؤري على الحويصلات، قم بتطبيق التركيز البؤري التلقائي في CellSens لقفل موضع الهدف في هذا المستوى، مما يمنع الانجراف أثناء التصوير.
  10. قم بإيقاف تشغيل الليزر مؤقتا وانقل مرحلة المجهر إلى مجال رؤية جديد لم يتعرض بعد لضوء الإثارة.
  11. ابدأ التسجيل أثناء تشغيل الليزر في نفس الوقت ، مما يضمن التقاط عملية التبييض الضوئي الكاملة دون تعرض مسبق.
  12. الحصول على صور بالمعلمات التالية: وقت التعريض الضوئي: 100 مللي ثانية لكل إطار، وضع الاستحواذ: 900 إطار مستمر لكل مجال رؤية، إعداد الكسب: 1,400.
  13. كرر العملية لمجالات عرض متعددة لضمان جمع البيانات بشكل كاف.
  14. احفظ مكدسات الصور بتنسيق TIFF لمزيد من المعالجة.

3. معالجة الصور وتحليل البيانات

معالجة الصور متحد البؤر
1. افتح الصور متحدة البؤر المكتسبة في البرنامج المرتبط.
2. اضبط إعدادات جدول البحث (LUT) لتحسين السطوع والتباين.
3. قم بتطبيق نفس تعديلات جدول البحث بشكل موحد عبر جميع الصور للحفاظ على التناسق البصري.
معالجة الفيديو TIRF وتحليل شدة التألق
1. معالجة الفيديو للتصور
  1. افتح مكدسات صور TIRF المكتسبة (تنسيق TIFF) في ImageJ للتصور.
  2. اضبط السطوع والتباين لتحسين وضوح الإشارة، مما يضمن سهولة تمييز الحويصلات الفلورية عن الخلفية.
  3. تصدير الصور المعدلة للعرض التقديمي أو مزيد من التحليل النوعي.
2. تحليل خطوة التبييض الضوئي
  1. استخراج آثار الوقت
    1. افتح البرنامج النصي MATLAB (انظر الملف التكميلي 1) المسمى "getTimeTraces.m" وقم بتشغيله. في واجهة المستخدم الرسومية (GUI)، انقر فوق تحميل الفيلم وحدد ملف .tiff التصوير TIRF لاستيراد مكدس أفلام الحويصلة.
    2. انقر فوق البحث عن القمم لتحديد إشارات التألق أحادية الجزيء تلقائيا. سيتم تمييز مناطق الإشارة بدوائر في نافذة المعاينة.
    3. انقر على تعبئة البيانات. سيؤدي هذا إلى تصدير تتبع كثافة الوقت لكل بقعة إلى ملف .xlsx لتحليله في اتجاه النهائي.
  2. عد الخطوات اليدوي
    1. قم بتشغيل البرنامج النصي "simpleGraph.m" (راجع الملف التكميلي 1) لتشغيل واجهة المستخدم الرسومية (GUI)، وانقر فوق تحميل ملفات البيانات وحدد الملف .xlsx الذي تم إنشاؤه في الخطوة 3.2.2.1.3.
    2. افحص خطوات التبييض لكل تتبع وقت معروض في اللوحة اليسرى. تأكد من قبول الآثار التي تستوفي المعايير التالية فقط للتحليل: 1) يحتوي تتبع الوقت على خطوة تبييض واحدة مميزة على الأقل. 2) مدة الخطوة الواحدة لا تقل عن 1 ثانية. 3) فرق الشدة بين مستويات الخطوة لا يقل عن 3 أضعاف الانحراف المعياري لشدة ما بعد التبييض.
    3. على اليمين ، حدد موقع حقل الخطوة # واستخدم الأزرار + أو - لإدخال عدد خطوات التبييض الضوئي لكل تتبع.
    4. بعد الانتهاء من كل إدخال ، انقر فوق التالي للانتقال إلى التتبع التالي. بمجرد معالجة جميع التتبعات ، سيقوم البرنامج تلقائيا بإنشاء وحفظ ملف .txt لتسجيل عدد الخطوات لكل تتبع.
  3. ملخص عدد الخطوات
    1. قم بتشغيل البرنامج النصي "CombinedFiles.m" (راجع الملف التكميلي 1) لفتح واجهة المستخدم الرسومية.
    2. اكتب الاسم المطلوب لإخراج الملخص في مربع النص.
    3. انقر فوق دمج نتائج simpleGraph متعددة في ملف واحد. في مستعرض الملفات، حدد ملفا واحدا أو أكثر من ملفات .txt المطلوبة التي تم إنشاؤها من الخطوة 3.2.2.2.3. سيقوم البرنامج النصي تلقائيا بتجميع جميع بيانات عدد الخطوات وإنشاء ملف .xlsx مدمج يلخص تكرار خطوة واحدة وخطوتين,... اثار.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتأكيد قابلية تطبيق هذه الطريقة ، تحققنا أولا من التعبير عن GFP-RyR2 وتوطينه عن طريق التصوير متحد البؤر لعمليات القطع بالتبريد لأنسجة القلب والخلايا العصبية (الشكل 1). أظهرت إشارة التألق في أنسجة القلب نمطا مخططا عرضيا يتوافق مع التوطين المتوقع ل RyR2 في خلايا عضلة القلب ولكنها أظهرت كثافة عالية في مناطق معينة في الدماغ ، وهي القشرة والحصين والمخيخ ، مما يشير إلى تعبير خاص بالمنطقة.

بعد توليد الحويص...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تضع هذه الدراسة بروتوكولا مفصلا وقابلا للتكرار للتغليف خارج الجسم الحي والتصوير أحادي الجزيء لمستقبلات الغشاء باستخدام RyR2 الموسوم ب GFP كنظام نموذجي. يعمل البروتوكول على تطوير الأساليب الحالية بشكل كبير من خلال تمكين التحليل المتكافئ لمجمعات المستقبلات مباشرة من الأنسجة الأصلية ، مع الحفاظ على السياق الفسيولوجي لبروتينات الغشاء. بالمقارنة مع أنظمة التعبير التقليدية في المختبر ، يقلل هذا النهج من القطع الأثرية التي يتم إدخالها عن طريق الإفراط في التعبير أو إذابة المنظفات ، مما ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نعرب عن تقديرنا لنواة الفحص المجهري الخفيف UKY ومركز الإلكترونيات الحيوية والطب النانوي لاستخدام منشآتهم. تم تقديم الدعم لهذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (GM138837 و GM138882). تم إنشاء الشكل 2 (https://BioRender.com/s69w811) والشكل 3 (https://BioRender.com/y54b47) في BioRender.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
طبق 35 مم \| رقم 1.5 غطاء \| قطر الزجاج 14 مم	Mattek	P35G-1.5-14-C
Andwin Scientific قوالب / محولات Tissue-Tek Cryomold	فيشر Scientific	NC9542860
APTES	Millipore Sigma	440140-100ML	(3-Aminopropyl) triethoxysilane
Bio-Gen PRO200 مختبر الخالط	Pro Scientific	1204B59
cellSENS	Olympus Scientific Solutions	n / a
EMCCD Camera	Andor	n / a	iXon Ultra 897
الإيثانول المطلق & ge ؛ 100٪ (v / v) USP للبيولوجيا الجزيئية (200 برهان) VWR		71006-012
Leica CM1860	Leica	N / a	cryostat
MetaMorph Advanced	Molecular	Devices n / a
Nanosight NS300 (مع برنامج Nanosight NTA)	Malvern Panalytical	n / a
Nikon AXR مجهر متحد البؤر المقلوب	نيكون	n / a
أوليمبوس IX83 مجهر مضان مقلوب بضبط تلقائي للصورة بمحركات	أوليمبوس	ن / أ	TIRFM
بارافورمالدهيد 4٪ في PBS جاهز للاستخدام كاشف مثبت	VWR	76221-378
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) 20x ، درجة نقاء	فائقة VWR	97062-950
هيدروكسيد الصوديوم ، حبات ، كاشف الصف	VWR	97064-526
SUNBRIGHT OE-020CS +	NOF شركة أمريكا	n / a	Oleyl-O (CH_{2< / sub>CH_{2< / sub>) _{n< / sub>CO-CH_{2< / sub>CH_{2< / sub>-COO-NHS}}}}}
Tissue-Tek O.C.T. مركب	ساكورا	M71484
VectaMount AQ مختبرات ناقلات متوسطة متصاعدة مائية		H-5501-60

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Taur, Y., Frishman, W. H. The cardiac ryanodine receptor (RyR2) and its role in heart disease. Card Rev. 13 (3), 142-146 (2005).
Lundstrom, K. Structural genomics and drug discovery. J Cell Mol Med. 11 (2), 224-238 (2007).
Levitz, J., et al. Mechanism of assembly and cooperativity of homomeric and heteromeric metabotropic glutamate receptors. Neuron. 92 (1), 143-159 (2016).
Fox-Loe, A. M., Moonschi, F. H., Richards, C. I. Organelle-specific single-molecule imaging of α4β2 nicotinic receptors reveals the effect of nicotine on receptor assembly and cell-surface trafficking. J Bio Chem. 292 (51), 21159-21169 (2017).
Degani-Katzav, N., Gortler, R., Gorodetzki, L., Paas, Y. Subunit stoichiometry and arrangement in a heteromeric glutamate-gated chloride channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E644-E653 (2016).
Aryal, S. P., Fu, X., Masud, A. A., Neupane, K. R., Richards, C. I. Single-molecule studies of membrane receptors from brain region specific nanovesicles. Bio-protocol. 11 (10), e4018(2021).
Schneeweis, L. A., et al. Comparison of ensemble and single molecule methods for particle characterization and binding analysis of a pegylated single-domain antibody. J Pharm Sci. 104 (12), 4015-4024 (2015).
Hines, K. E. Inferring subunit stoichiometry from single molecule photobleaching. J Gen Phys. 141 (6), 737-746 (2013).
Lee, J., Lee, T. H. Single-molecule investigations on histone h2a-h2b dynamics in the nucleosome. Biochem. 56 (7), 977-985 (2017).
Aggarwal, V., Ha, T. Single-molecule pull-down (SiMPull) for new-age biochemistry: methodology and biochemical applications of single-molecule pull-down (SiMPull) for probing biomolecular interactions in crude cell extracts. Bioessays. 36 (11), 1109-1119 (2014).
Sungkaworn, T., et al. Single-molecule imaging reveals receptor-g protein interactions at cell surface hot spots. Nature. 550 (7677), 543-547 (2017).
Fu, X., et al. Brain region specific single-molecule fluorescence imaging. Anal Chem. 91 (15), 10125-10131 (2019).
Anderson, K., et al. Structural and functional characterization of the purified cardiac ryanodine receptor-Ca2+ release channel complex. J Bio Chem. 264 (2), 1329-1335 (1989).
Waddell, H. M. M., Mereacre, V., Alvarado, F. J., Munro, M. L. Clustering properties of the cardiac ryanodine receptor in health and heart failure. J Mol Cell Card. 185, 38-49 (2023).
Peng, W., et al. Structural basis for the gating mechanism of the type 2 ryanodine receptor ryr2. Science. 354 (6310), aah5324(2016).
Xiao, B., et al. Isoform-dependent formation of heteromeric Ca2+ release channels (ryanodine receptors). J Bio Chem. 277 (44), 41778-41785 (2002).
Xu, L., Wang, Y., Yamaguchi, N., Pasek, D. A., Meissner, G. Single channel properties of heterotetrameric mutant ryr1 ion channels linked to core myopathies. J Biol Chem. 283 (10), 6321-6329 (2008).
Chagovetz, A. A., Klatt Shaw, D., Ritchie, E., Hoshijima, K., Grunwald, D. J. Interactions among ryanodine receptor isotypes contribute to muscle fiber type development and function. Dis Model Mech. 13 (2), dmm038844(2019).
Yao, J., et al. Limiting RyR2 open time prevents Alzheimer's disease-related neuronal hyperactivity and memory loss but not β-amyloid accumulation. Cell Rep. 32 (12), 108169(2020).
Hiess, F., et al. Subcellular localization of hippocampal ryanodine receptor 2 and its role in neuronal excitability and memory. Comm Biol. 5 (1), 183(2022).
Clowsley, A. H., et al. Analysis of RyR2 distribution in HEK293 cells and mouse cardiac myocytes using 3D MINIFLUX microscopy. bioRxiv. , (2023).
Kato, K., et al. Immobilized culture of nonadherent cells on an oleyl poly(ethylene glycol) ether-modified surface. Biotech. 35 (5), 1014-1021 (2003).
Yin, Q., Aryal, S. P., Song, Y., Fu, X., Richards, C. I. Quantitative single-molecule analysis of ryanodine receptor 2 subunit assembly in cardiac and neuronal tissues. Anal Chem. 96 (41), 16298-16306 (2024).
Moonschi, F. H., et al. Cell-derived vesicles for single-molecule imaging of membrane proteins. Angew Chem Int Ed. 54 (2), 481-484 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

GFP

Ex Vivo تحليل الجزيء الفردي لمجموعة مستقبلات الريانودين 2 في أنسجة القلب والخلايا العصبية

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة