يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

استخراج حمض النيوكسي ريبونوكلييك من الجينوم الكامل من أنواع البكتيريا المتفطرة عبر تقنية بروميد سيتيل تريميثيل أمونيوم

1.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68409

⸱

ديسمبر 12, 2025

 , 
1DST/NRF Centre of Excellence for Biomedical Tuberculosis Research, South African Medical Research Council (SAMRC), Centre for Tuberculosis Research, Division of Molecular Biology and Human Genetics, Faculty of Medicine and Health Sciences, Stellenbosch University

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول طريقة CTAB لاستخراج الحمض النووي عالي الجودة من البكتيريا الفطرية، متغلبا على التحديات التي تفرضها جدران خلاياها الصلبة والغنية بحمض الفطر. تتضمن العملية الهضم الإنزيمي، وتحلل الخلايا باستخدام CTAB، وتنقية الحمض النووي من خلال الاستخراج العضوي وترسيب الإيثانول. تنتج هذه الطريقة حمضيا نوويا مناسبا للدراسات الجزيئية وموثوقة في أبحاث الفطريات.

الملخص

يعد استخراج الحمض النووي بكفاءة وموثوقية خطوة أساسية في علم الأحياء الجزيئي، حيث يوفر مادة وراثية عالية الجودة للتطبيقات اللاحقة مثل PCR، والتسلسل، والتحليلات الجينومية. ومع ذلك، فإن تركيبة جدار الخلية الفريدة للبكتيريا الفطرية، الغنية بالدهون وأحماض الفطر، تطرح تحديات كبيرة أمام عزل الحمض النووي الفعال. تستخدم طريقة بروميد سيتيل تري ميثيل أمونيوم (CTAB) على نطاق واسع بسبب فعاليتها في استخراج الحمض النووي عالي النقاء من أنواع البكتيريا الفطرية، بما في ذلك السلالات سريعة النمو والبطيئة النمو. تتضمن التقنية تعطيل إنزيمي لخلايا البكتيريا باستخدام الليسوزيم والبروتيناز K، تليها تحلل مكونات الخلايا باستخدام CTAB، الذي يرتبط بشكل انتقائي ويشكل مركبا من عدادات السكريات والبروتينات. يتم تحقيق تنقية وتركيز الحمض النووي من خلال استخراج المذيب العضوي وترسيب الإيثانول. وفقا لبياناتنا، يوفر بروتوكول CTAB كميات عالية من الحمض النووي (200 - 1000 نانوغرام/ميكرولتر) مع جودة عالية وتلوث طفيف كما أثبتت الرحلان الكهربائي الهلامي وتحليل النانودروب. الحمض النووي المستخرج من أنواع الفطرية المختلفة يتميز بنقاء عالي ومناسب لدراسات جزيئية مختلفة. توضح هذه الدراسة الخطوات الإجرائية لطريقة CTAB، مع تسليط الضوء على فائدتها في التغلب على التحديات الفريدة المرتبطة باستخراج الحمض النووي بالميكوبكتيريا.

المقدمة

يعد استخراج الحمض النووي عالي الجودة خطوة أساسية في علم الأحياء الجزيئي، وهو ضروري للتطبيقات اللاحقة مثل PCR، وتسلسل الجينوم الكامل، وغيرها من الدراسات الجينومية. بالنسبة للمتفطرات، وهو جنس يضم أنواعا ممرضة مثل متفطرة السل (M. tuberculosis)، والأنواع البيئية غير الممرضة مثل Mycobacterium smegmatis (M. smegmatis)، يمكن أن يكون استخراج الحمض النووي تحديا بسبب جدرانها الخلوية السميكة والغنية بالدهون والكارهة للماء 1,2,3. يتطلب هذا الجدار الخلوي الصلب استخدام طرق تحليل متخصصة لتعطيل الخلايا وإطلاق الحمض النووي الجينومي بشكل فعال.

أثبتت طريقة بروميد سيتيل تريميثيل أمونيوم (CTAB) موثوقية في عزل الحمض النووي عالي الجودة من أنواع مختلفة من البكتيريا الفطرية 4,5. CTAB، وهو مادة خافضة للتوتر السطحي الكاتيوني، يرتبط بعدادات السكريات ومكونات الخلايا الأخرى، مما يسهل إزالتها أثناء عملية الاستخلاص6. حتى مع العينات الصعبة، يضمن بروتوكول CTAB العزل الفعال للحمض النووي السليم والنقي، خاصة عند دمجه مع التحلل الإنزيمي، والمعالجة الحرارية، واستخراج المذيبات العضوية 7,8. لعبت طريقة CTAB دورا حيويا في استخراج الحمض النووي بكفاءة من أنواع الفطريات، خاصة في الأبحاث المتعلقة بتسلسل الجينوم الكامل، وعلم الميتاجينوميات، والتشخيص الجزيئي، والتي تتطلب مواد مدخلات DNA نقية وعالية الجودة 9,10. مقارنة بتقنيات استخراج الحمض النووي الأخرى مثل ضرب الخرز أو مجموعات التجارة، يقدم بروتوكول CTAB المعروض هنا ميزة واضحة في الحفاظ على سلامة الحمض النووي، وهو عامل أساسي للتسلسل طويل القراءة والتطبيقات اللاجينية. بينما أبلغت الدراسات السابقة عن انخفاض إنتاجية الحمض النووي مع CTAB مقارنة بطرق التعطيل الميكانيكي، إلا أنها تؤكد أيضا على قدرته على تقليل قص الحمض النووي والحفاظ على سلامة الحمض النووي11,12. ولمعالجة القيود في النقاء والإنتاجية، تم تحسين البروتوكول الحالي بتقليل أوقات الحضانة وتحسين الاتساق عبر أنواع العينات المتنوعة. وقد دعمت هذه التحسين نتائج أوبرمان وآخرون، الذين أثبتوا أن الحمض النووي المستخرج من CTAB من مزارع المتفطرة الطيور كان ذا تركيز وجودة كافية للتطبيقات اللاحقة مثل تسلسل 16S rRNA واختبارات المسبار الخطي، مما يدعم أيضا تطبيق بروتوكول CTAB كأداة متعددة الاستخدامات وقابلة للتوسع لأبحاث الفطريات، خاصة في الدراسات التي تتطلب DNA جينومي سليم للتحليلات الجزيئيةالمتقدمة 13. بالإضافة إلى ذلك، يتطلب تسلسل الجيل القادم (NGS) عادة ما 100-1000 نانوغرام من الحمض النووي الجيني عالي الجودة14، وفي حالة التسلسل طويل القراءة مثل تسلسل PacBio، يتطلب ≥5 ميكروغرام من الحمض النووي عالي الجودة15، لذا عندما تكون هناك حاجة لكميات كبيرة من الحمض النووي عالي الجودة وسليم، يظل CTAB طريقة فعالة16.

من الضروري إنشاء منهجيات فعالة ومتسقة وفعالة لاستخراج الحمض النووي من الميكروبات الصعبة التحليل لضمان قابلية التكرار والموثوقية عبر المختبرات، خاصة في تحديد السلالات والدراسات الوبائية 5,7. يوفر هذا البروتوكول تفاصيل لاستخراج الحمض النووي الكامل للجينوم من البكتيريا المتفطرة باستخدام طريقة CTAB. يهدف البروتوكول الحالي إلى تمكين الباحثين من تحقيق نتائج متسقة وموثوقة في سير عمل علم الأحياء الجزيئي لديهم من خلال معالجة المخاطر والتغلب على التحديات التي يفرضها جدار الخلية الفطرية المميز17.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم توليد النتائج التمثيلية بموافقة لجنة أخلاقيات BES في REC: جامعة ستيلينبوش (BES-2024-22504). المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير تعليق زراعة الفطريات

ملاحظة: اعتمادا على النوع الذي يتم فحصه، يجب إجراء هذه الخطوة إما في مختبر مستوى السلامة البيولوجية 2 (BSL-2) أو مختبر السلامة البيولوجية المستوى 3 (BSL-3). تعتمد مدة الحضانة وظروف الزراعة أيضا على متطلبات نمو النوع الفطري بسبب معدلات النمو المميزة وخصائصها الفسيولوجية.

  1. جهز 5 أو 8 مل من الزراعة البكتيرية في وسط سائل من ميدلبروك 7H9 أو وسط MGIT على التوالي، مع إضافة OADC وحضن عند 37 درجة مئوية للفترة المطلوبة للسماح بنمو البكتيريا. تحتاج البكتيريا الفطرية البطيئة النمو إلى 10-14 يوما، بينما تحتاج البكتيريا سريعة النمو إلى حوالي 2-5 أيام.
    ملاحظة: يمكن تحضير تعليق الخلايا البكتيرية الفطرية عن طريق كشط حلقة مليئة بالمستعمرات في ماء معقم مزدوج المقطر إذا كانت الزراعة الابتدائية من صفائح أجار صلبة (مثل أجار ميدلبروك 7H10).
  2. صب الثقافة السائلة في أنابيب بسعة 15 مل.
  3. قم بقتل الثقافة بالحرارة عند 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة في الحاضنة.
  4. في حالة الفطريات السلية أو أنواع أخرى ممرضة تحتاج إلى BSL-3، انقل المزارع الممزوجة بالحرارة إلى مختبر BSL-2.

2. هضم جدار الخلية واستخراج الحمض النووي

ملاحظة: بمجرد تعطيل الزراعة بالحرارة، يمكن تنفيذ الخطوات التالية بأمان في مختبر السلامة البيولوجية المستوى 2 (BSL-2). إذا كان الهدف هو الاستخراج من أجل التسلسل طويل القراءة أو التطبيقات البديلة التي تتطلب DNA عالي الوزن الجزيئي، تأكد من استخدام رؤوس الماصة ذات القطر العريض، وعند خطوات الدوامة، استبدل الدوامة بالعكس أو خلط الماصات.

  1. قم بطرد المركزي بأنبوب 15 مل على 3220 × g لمدة 15-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT). تخلص من المادة الشفافة (تأكد من إزالة جميع الوسائط).
  2. أعد تعليق حبيبة الزراعة بشكل كامل في 300 ميكرولتر من محلول Tris-EDTA (TE).
  3. انقل الحبيبة المعلقة إلى أنبوب بسعة 2 مل.
  4. أضف 100 ميكرولتر من الليزوزيم (10 ملغ/مل) وامزج بالمزج بالضغط على الأنبوب لأعلى وأسفل 5 مرات، ثم اضغط بلطف على الأنبوب لضمان التشتت المتساو.
  5. حضن الخليط عند 37 درجة مئوية على حاضنة دوارة طوال الليل (~16 ساعة؛ قد يقلل وقت الحضانة الأقل من كفاءة التحلل وبالتالي يؤدي إلى انخفاض إنتاج الحمض النووي).
  6. في اليوم التالي، حضر خليطا من 5 ميكرولتر من البروتيناز K (10 ملغ/مل) و70 ميكرولتر من 10٪ SDS. على سبيل المثال، إذا كان هناك خمس عينات، حضر 350 ميكرولتر من 10٪ SDS و25 ميكرولتر من بروتيناز K. اخلط عن طريق قلب الأنبوب لتجنب تكوين الرغوة.
  7. أضف 75 ميكرولتر من الخليط إلى كل عينة.
  8. امزج عن طريق النقر وحضن عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في حاضنة أو كتلة تسخين، مع خلط متقطع عن طريق الانعكاس.
  9. أضف 100 ميكرولتر من 5 M NaCl.
  10. أضف 100 ميكرولتر من محلول CTAB/NaCl المسخن مسبقا عند 65 درجة مئوية.
    ملاحظة: سخن محلول CTAB/NaCl إلى 65 درجة مئوية قبل ضمان دقة التصويب، مع الأخذ في الاعتبار لزوجة المادة عند RT.
  11. اخلط بالنقر حتى يصبح المحلول حليبيا.
  12. الحضانة عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في حاضنة أو كتلة تسخين، مع خلط متقطع عن طريق الانقلاب.
  13. أضف حجما متساويا (~ 675 ميكرولتر) من محلول الكحول الكلوروفورم/الأيزواميل (24:1) إلى كل عينة وامزج بالنقر.
    ملاحظة: قم بهذه الخطوة باستخدام غطاء بخار لأن الكلوروفورم سام إذا تم استنشاقه ويتطلب التعامل بحذر.
  14. قم بعمل طرد مركزي للعينات عند 12000 x جرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  15. قم بسحب 550-600 ميكرولتر من الطور المائي (العلوي) بعناية في أنابيب معقمة بسعة 1.5 مل ووضع علامات عليها بشكل مناسب.
    ملاحظة: كن حذرا من عدم إزعاج الطبقات الأخرى. إذا تعرضت أي طبقات للاضطراب عن غير قصد، قم بعمل الطرد المركزي في الأنبوب مرة أخرى.

3. ترسيط الحمض النووي والاستبعاد

  1. أضف حجما متساويا (550-600 ميكرولتر) من الأيزوبروبانول البارد جدا وامزج عن طريق قلب الأنابيب.
    ملاحظة: إذا كان تركيز الحمض النووي مرتفعا، فقد يتكون ترسيبان أبيض أثناء الخلط.
  2. حضن الأنابيب عند -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة.
    ملاحظة: يمكن أن تعزز فترات الحضانة الأطول ترسيبات الحمض النووي18 ، لكنها قد تؤدي أيضا إلى تلاقي الأملاح. لذا، يمكن إجراء الحضانة الليلا إذا كان من المتوقع انخفاض تركيز الحمض النووي.
  3. الطرد المركزي بأعلى سرعة (~21130 × g) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لدفع الحمض النووي غير القابل للذوبان.
    ملاحظة: تأكد من أن الجانب الأمامي من أنبوب 1.5 مواجها للداخل داخل دوار الطرد المركزي. في هذه الخطوة، يترسب الحمض النووي في أسفل الأنابيب وعلى طول الجزء الخلفي من الأنابيب. هذا مهم لتجنب إزعاج الحبيبات التي قد تكون غير مرئية في الخطوة التالية. قد يكون هناك راسب أو حبيبات بيضاء مرئية إذا كان تركيز الحمض النووي مرتفعا. غياب الحبيبة لا يعني فشل الاستخراج؛ تابع الخطوات المتبقية.
  4. استنشق المادة الفائقة من الجانب الأمامي للأنبوب دون إزعاج حبيبات الحمض النووي أو إخراجها بسرعة مع التأكد من بقاء الحبيبة غير مضطربة.
    ملاحظة: من الأفضل استنشاق الفائق إذا كانت الثقافة الأولية صغيرة ويتوقع تركيز منخفض للحمض النووي.
  5. أضف 1000 ميكرولتر من الإيثانول البارد بنسبة 75٪.
  6. اخلط عن طريق قلب الأنابيب عدة مرات.
  7. الطرد المركزي عند 12000 × جرام لمدة 30 دقيقة (بنفس الاتجاه كما في الخطوة 3).
  8. قم بسحب أو صفير كل الإيثانول دون إزعاج الحبيبات.
    ملاحظة: قد تتكرر الخطوات من 5 إلى 8 إذا كان من المتوقع حدوث تلاقي عالي في الملح.
  9. اترك الأنابيب تجف في الهواء عند RT طوال الليل أو لمدة لا تقل عن 30 دقيقة.
  10. أضف 25-50 ميكرولتر من مخزن TE (pH 8) إلى كل أنبوب لإعادة تعليق الحمض النووي.
    ملاحظة: يمكن إعادة تعليق الحمض النووي في مياه تريس (10 ملميول، درجة حموضة 8) أو مياه خالية من النوكلياز إذا كانت التطبيقات في الأسفل حساسة ل EDTA.
  11. اسمح لحبيبة الحمض النووي بأن تعود للتعليق طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  12. تخزين عند 4 درجات مئوية لمدة 2-3 أيام قبل إجراء تقييم الجودة.
  13. خزن عند -80 درجة مئوية لفترة طويلة.

4. قياس الحمض النووي ومراقبة الجودة

ملاحظة: يتم عادة إجراء مراقبة جودة الحمض النووي باستخدام مطياف ميكرو حجمي ورحلان كهربائي هلامي. يمكن أيضا استخدام نظام قياس الكمية القائم على التألق لقياس الحمض النووي المستخرج من الحمض النووي.

  1. طريقة المطيافية الفوتوفوتومائية
    1. قس تركيز الحمض النووي وحدد الجودة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: من المثالي أن تكون نسبة عينة الحمض النووي 260/280 بين 1.7 و2.0. القيمة 1.8 تعتبر عادة نقية للحمض النووي. تشير القيم التي تقل عن هذا النطاق إلى وجود تلوث بواسطة البروتين المتبقي أو الجوانيدين أو مواد الكشف الأخرى التي تمتص بقوة عند أو بالقرب من 280 نانومتر. نسبة 260/230 بين 2.0-2.2 هي المثالية. إذا كانت النسبة أقل من المتوقع، فقد يشير ذلك إلى وجود ملوثات تمتص عند 230 نانومتر، مثل EDTA، والفينول، والكربوهيدرات. تحقق أيضا من مخططات الامتصاص التي تم الحصول عليها للعينة.
  2. الرحلان الكهربائي الهلامي
    1. إجراء الرحلان الكهربائي بجل الأجاروز19 لتقييم سلامة الحمض النووي وتحديد ما إذا كان قد حدث تجزئة أو تحلل.
    2. لرؤية الحمض النووي تحت نظام توثيق جل الأشعة فوق البنفسجية، استخدم جل أغاروز بنسبة 1.0٪ يحتوي على صبغة SYBR Safe. شغل الجل على 80 فولت لمدة 45 دقيقة.
      ملاحظة: الهدف هو وجود أشرطة واضحة ومميزة ذات وزن جزئي عالي فوق أعلى نطاق في سلم الحمض النووي. استخدم مخزن TAE جديد بمقدار 1× في كل مرة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم تقييم بروتوكول استخراج الحمض النووي باستخدام طريقة CTAB (الشكل 1) عبر أنواع مختلفة من الفطريات مثل M. tuberculosis، M. abscessus، وM. chelonea. تم استخراج الحمض النووي ومقارنته من حيث الإنتاجية والنقاوة وسلامة الحمض النووي المستخرج عبر العينات.

اختلفت تركيز الحمض النووي عبر أنواع الفطريات البكتيرية وتراوح بين 190-600 نانوغرام/ميكرولتر و>1000 نانوغرام/ميكرولتر في بعض الحالات، مما يشير إلى أن CTAB يستخر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تظهر النتائج التمثيلية فائدة طريقة CTAB في استخراج الحمض النووي من أنواع البكتيريا الفطرية ومعالجة التحديات المرتبطة باستخراج الحمض النووي من هذه الكائنات. البكتيريا الفطرية معروفة بجدرانها الخلوية المعقدة والغنية بالدهون2. تسلط النتائج الحالية الضوء على عدة جوانب حاسمة تساهم في نجاح هذه التقنية، حيث توفر حمضا نوويا سليما عالي التركيز وعالي الجودة، والذي ينبغي أن يكون مناسبا للتطبيقات اللاحقة مثل PCR، والتسلسل، والدراسات الجينومية الأخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لا يوجد لدى المؤلفين تضارب مصالح للكشف عنها.

شكر وتقدير

يعبر المؤلفون عن امتنانهم الصادق لفريق جينوميات السل: نبلة إسماعيل، ميلاني جروبيلار، إميلين كوستا، وروب إم وارن، على مساهماتهم في تطوير وتحسين هذا البروتوكول، بالإضافة إلى دعمهم الثمين طوال هذه الدراسة. وقد تم دعم هذا العمل والأشخاص المشاركين من خلال منح وتمويل من مجلس البحوث الطبية الجنوب أفريقي (SAMRC)، والمؤسسة الوطنية للبحوث (NRF)، وجامعة ستيلينبوش (SU). لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات أو التحليل أو إعداد المخطوطات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أطراف الماصة بحجم 1 ملأي مورد
10 وميكرو؛ أطراف ماصة Lأي مورد
10٪ كبريتات الصوديوم الدودسيل (SDS)ميرك (سيغما-ألدريتش)71736-100 ML
أنابيب البولي بروبيلين بحجم 15 ملأي مورد
أنابيب بحجم 2 مل وأنابيب بحجم 1.5 ملأي مورد
200 وميكرو؛ أطراف الماصةأي مورد
2-بروبانول، كاشف حيوي، للجزيئات B&ميرك (سيغما-ألدريتش)I9516-1L التخزين في -20 ودرجة مئوية؛ C
37&00; حاضنة Cأي مورد
5 ميلاتار NaClميرك (سيغما-ألدريتش)S6546 - 100 ML
65° حاضنة Cأي مورد
جل الأجاروزميرك (سيغما-ألدريتش)
نظام توثيق جل الأشعة فوق البنفسجية Bio-Rad,بيوراد
الطرد المركزي (لأنابيب 15 مل بحجم 50 مل) وميكروفوج (لأنابيب 2 مل)أي مورد
الكلوروفورم للتحليل إمبارتا وREG؛ ACSميرك (سيغما-ألدريتش)1070242500
الكحول الكلوروفورم/الأيزوأميلي (24:1)في غطاء أبخرة، اخلط 384 مل من الكلوروفورم و16 مل من كحول الأيزوأميل
حل CTAB/NaClميرك (سيغما-ألدريتش)52370-100 Gقم بإذابة 4.1 جرام من NaCl في 80 مل من الماء المقطر. أثناء التحريك، أضف 10 جرام من CTAB. محلول حراري بدرجة 65 درجة؛ حاضنة C. اضبط الحجم إلى 100 مل باستخدام الماء المقطر. خزنها في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 6 أشهر.
سلم DNA بحجم 1 كيلو باكتثيرمو فيشر العلمي
كحول إيثيل، نقي، 200 proof، ل MOLL &ميرك (سيغما-ألدريتش)E7023-500MLاخلط 75 مل من الإيثانول المطلق و25 مل ماء مقطر
ليزوزيم (10 ملغ/مل)ميرك (سيغما-ألدريتش)10837059001إعادة تكوين الليزوزيم المحمر بالليوفيل (يرفع إلى درجة حرارة الغرفة) بالماء المقطر حتى 10 ملغ/مل
وسائط ميدلبروك 7H9ميرك (سيغما-ألدريتش)M0178اتبع إرشادات الشركة المصنعة لتحضير الوسائط السائلة
ميدلبروك OADC إنثريمنت 6 × 100 مل F BD212240
وسائط أنبوب مؤشر نمو البكتيريا الفطرية (MGIT)BD245122
نظام نانو دروبثيرمو فيشر العلمي
ماصة P10أي مورد
ماصة P1000أي مورد
ماصة P200أي مورد
بروتيناز K، مشمش، PCR grd 2x250mg ميرك (سيغما-ألدريتش)3115801001أعد تشكيل قارورة من إنزيم البروتيناز K المحمول بالماء المقطر إلى 10 ملغ/مل. جمد الأليكوات في أنابيب 2 مل عند -20 ودرجة مئوية؛ C
SYBR-safeثيرمو فيشر العلمي
رقم الهيدروجينيوم المؤقت Tris/EDTA (TE) 8.0ميرك (سيغما-ألدريتش)8890-OP أو 382499997
الدوامةأي مورد

المراجع

  1. FBouso, J. M., Planet, P. J. Complete non-tuberculous mycobacteria whole genomes using an optimized DNA extraction protocol for long-read sequencing. BMC Genomics. 20 (1), 793(2019).
  2. Daffé, M., Marrakchi, H. Unraveling the structure of the mycobacterial envelope. Microbiol Spectr. 7 (4), 7.4.1(2019).
  3. Wayne, L. G., Sohaskey, C. D. Nonreplicating persistence of Mycobacterium tuberculosis. Annu Rev Microbiol. 55 (1), 139-163 (2001).
  4. Mohammadi, S., et al. Optimal DNA isolation method for detection of non-tuberculous mycobacteria by polymerase chain reaction. Adv Biomed Res. 6 (1), 133(2017).
  5. Van Soolingen, D., et al. Occurrence and stability of insertion sequences in Mycobacterium tuberculosis complex strains: Evaluation of an insertion sequence-dependent DNA polymorphism as a tool in the epidemiology of tuberculosis. J Clin Microbiol. 29 (11), 2578-2586 (1991).
  6. Wilson, K. Preparation of genomic DNA from bacteria. Curr Protoc Mol Biol. 56 (1), 2.4.1-2.4.5 (2001).
  7. Van Embden, J. D., et al. Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: Recommendations for a standardized methodology. J Clin Microbiol. 31 (2), 406-409 (1993).
  8. Wang, W. -F., et al. Genomic analysis of Mycobacterium tuberculosis isolates and construction of a Beijing lineage reference genome. Genome Biol Evol. 12 (2), 3890-3905 (2020).
  9. Epperson, L. E., Strong, M. A scalable, efficient, and safe method to prepare high quality DNA from mycobacteria and other challenging cells. J Clin Tuberc Other Mycobact Dis. 19, 100150(2020).
  10. Warren, R., et al. Safe Mycobacterium tuberculosis DNA extraction method that does not compromise integrity. J Clin Microbiol. 44 (1), 254-256 (2006).
  11. Amaro, A., Duarte, E., Amado, A., Ferronha, H., Botelho, A. Comparison of three DNA extraction methods for Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium subsp. avium. Lett Appl Microbiol. 47 (1), 8-11 (2008).
  12. Arslan, N., Demiray-Gurbuz, E., Ozkutuk, N., Esen, N., Özkütük, A. A. Comparison of four different DNA isolation methods from MGIT culture for long-read whole genome sequencing of Mycobacterium tuberculosis. Jundishapur J Microbiol. 17 (9), e148070(2024).
  13. Opperman, C. J., et al. Mycobacterium avium DNA extraction: Implications for NTM identification and amplicon sequencing. South Afr J Infect Dis. 40 (1), 5(2025).
  14. Froenicke, L. Illumina and Aviti sample and library requirements. DNA Technol Core. , https://dnatech.ucdavis.edu/illumina-aviti-sample-and-library-requirements (2015).
  15. Froenicke, L. PacBio Revio and Sequel II library prep & sequencing. DNA Technol Core. , https://dnatech.ucdavis.edu/pacbio-revio-and-sequel-ii-library-prep-sequencing (2016).
  16. Dippenaar, A., et al. Droplet-based whole genome amplification for sequencing minute amounts of purified Mycobacterium tuberculosis DNA. Sci Rep. 14, 9931(2024).
  17. Doig, C. The efficacy of the heat-killing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Pathol. 55 (10), 778-779 (2002).
  18. Li, Y., et al. A systematic investigation of key factors of nucleic acid precipitation toward optimized DNA/RNA isolation. Biotechniques. 68 (4), 191-199 (2020).
  19. Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. N.Y. (2012).
  20. Van Soolingen, D., Hermans, P. W., De Haas, P. E., Van Embden, J. D. Insertion element IS1081-associated restriction fragment length polymorphisms in Mycobacterium tuberculosis complex species: A reliable tool for recognizing Mycobacterium bovis BCG. J Clin Microbiol. 30 (7), 1772-1777 (1992).
  21. Doig, C., Seagar, A. L., Watt, B., Forbes, K. J. The efficacy of the heat killing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Pathol. 55 (10), 778-779 (2002).
  22. Dippenaar, A., et al. Exploring the potential of Oxford Nanopore Technologies sequencing for Mycobacterium tuberculosis sequencing: An assessment of R10 flowcells and V14 chemistry. PLOS ONE. 19 (6), e0303938(2024).
  23. Chang, A., et al. Metagenomic DNA sequencing to quantify Mycobacterium tuberculosis DNA and diagnose tuberculosis. Sci Rep. 12, 16972(2022).
  24. Forbes, J. D., Knox, N. C., Ronholm, J., Pagotto, F., Reimer, A. Metagenomics: The next culture-independent game changer. Front Microbiol. 8, 1069(2017).
  25. Marshall, J. E., et al. Methods of isolation and identification of non-tuberculous mycobacteria from environmental samples: A scoping review. Tuberculosis. 138, 102291(2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

استخلاص الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجينطريقة CTABالحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين للجينوم الكاملتحلل الجدار الخلويبروتيناز Kالمعالجة بالليزوزيمالاستخلاص بالمذيبات العضويةالرحلان الكهربائي لهلام الأغاروزمحلول Tris-EDTA المنظم
استخراج حمض النيوكسي ريبونوكلييك من الجينوم الكامل من أنواع البكتيريا المتفطرة عبر تقنية بروميد سيتيل تريميثيل أمونيوم
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.