يصف هذا البروتوكول طريقة CTAB لاستخراج الحمض النووي عالي الجودة من البكتيريا الفطرية، متغلبا على التحديات التي تفرضها جدران خلاياها الصلبة والغنية بحمض الفطر. تتضمن العملية الهضم الإنزيمي، وتحلل الخلايا باستخدام CTAB، وتنقية الحمض النووي من خلال الاستخراج العضوي وترسيب الإيثانول. تنتج هذه الطريقة حمضيا نوويا مناسبا للدراسات الجزيئية وموثوقة في أبحاث الفطريات.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
استخراج حمض النيوكسي ريبونوكلييك من الجينوم الكامل من أنواع البكتيريا المتفطرة عبر تقنية بروميد سيتيل تريميثيل أمونيوم
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يعد استخراج الحمض النووي بكفاءة وموثوقية خطوة أساسية في علم الأحياء الجزيئي، حيث يوفر مادة وراثية عالية الجودة للتطبيقات اللاحقة مثل PCR، والتسلسل، والتحليلات الجينومية. ومع ذلك، فإن تركيبة جدار الخلية الفريدة للبكتيريا الفطرية، الغنية بالدهون وأحماض الفطر، تطرح تحديات كبيرة أمام عزل الحمض النووي الفعال. تستخدم طريقة بروميد سيتيل تري ميثيل أمونيوم (CTAB) على نطاق واسع بسبب فعاليتها في استخراج الحمض النووي عالي النقاء من أنواع البكتيريا الفطرية، بما في ذلك السلالات سريعة النمو والبطيئة النمو. تتضمن التقنية تعطيل إنزيمي لخلايا البكتيريا باستخدام الليسوزيم والبروتيناز K، تليها تحلل مكونات الخلايا باستخدام CTAB، الذي يرتبط بشكل انتقائي ويشكل مركبا من عدادات السكريات والبروتينات. يتم تحقيق تنقية وتركيز الحمض النووي من خلال استخراج المذيب العضوي وترسيب الإيثانول. وفقا لبياناتنا، يوفر بروتوكول CTAB كميات عالية من الحمض النووي (200 - 1000 نانوغرام/ميكرولتر) مع جودة عالية وتلوث طفيف كما أثبتت الرحلان الكهربائي الهلامي وتحليل النانودروب. الحمض النووي المستخرج من أنواع الفطرية المختلفة يتميز بنقاء عالي ومناسب لدراسات جزيئية مختلفة. توضح هذه الدراسة الخطوات الإجرائية لطريقة CTAB، مع تسليط الضوء على فائدتها في التغلب على التحديات الفريدة المرتبطة باستخراج الحمض النووي بالميكوبكتيريا.
المقدمة
يعد استخراج الحمض النووي عالي الجودة خطوة أساسية في علم الأحياء الجزيئي، وهو ضروري للتطبيقات اللاحقة مثل PCR، وتسلسل الجينوم الكامل، وغيرها من الدراسات الجينومية. بالنسبة للمتفطرات، وهو جنس يضم أنواعا ممرضة مثل متفطرة السل (M. tuberculosis)، والأنواع البيئية غير الممرضة مثل Mycobacterium smegmatis (M. smegmatis)، يمكن أن يكون استخراج الحمض النووي تحديا بسبب جدرانها الخلوية السميكة والغنية بالدهون والكارهة للماء 1,2,3. يتطلب هذا الجدار الخلوي الصلب استخدام طرق تحليل متخصصة لتعطيل الخلايا وإطلاق الحم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم توليد النتائج التمثيلية بموافقة لجنة أخلاقيات BES في REC: جامعة ستيلينبوش (BES-2024-22504). المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.
1. تحضير تعليق زراعة الفطريات
ملاحظة: اعتمادا على النوع الذي يتم فحصه، يجب إجراء هذه الخطوة إما في مختبر مستوى السلامة البيولوجية 2 (BSL-2) أو مختبر السلامة البيولوجية المستوى 3 (BSL-3). تعتمد مدة الحضانة وظروف الزراعة أيضا على متطلبات نمو النوع الفطري بسبب معدلات النمو المميزة وخصائصها الفسيولوجية.
- جهز 5 أو 8 مل من الزراعة البكتيرية في وسط سائل من ميدلبروك 7H9 أو وسط MGIT على التوالي،....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم تقييم بروتوكول استخراج الحمض النووي باستخدام طريقة CTAB (الشكل 1) عبر أنواع مختلفة من الفطريات مثل M. tuberculosis، M. abscessus، وM. chelonea. تم استخراج الحمض النووي ومقارنته من حيث الإنتاجية والنقاوة وسلامة الحمض النووي المستخرج عبر العينات.
اختلفت تركيز الحمض النووي عبر أنواع الفطريات البكتيرية وتراوح بين 190-600 نانوغرام/ميكرولتر و>1000 نانوغرام/ميكرولتر في بعض الحالات، مما يشير إلى أن CTAB يستخر.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تظهر النتائج التمثيلية فائدة طريقة CTAB في استخراج الحمض النووي من أنواع البكتيريا الفطرية ومعالجة التحديات المرتبطة باستخراج الحمض النووي من هذه الكائنات. البكتيريا الفطرية معروفة بجدرانها الخلوية المعقدة والغنية بالدهون2. تسلط النتائج الحالية الضوء على عدة جوانب حاسمة تساهم في نجاح هذه التقنية، حيث توفر حمضا نوويا سليما عالي التركيز وعالي الجودة، والذي ينبغي أن يكون مناسبا للتطبيقات اللاحقة مثل PCR، والتسلسل، والدراسات الجينومية الأخرى.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لا يوجد لدى المؤلفين تضارب مصالح للكشف عنها.
شكر وتقدير
يعبر المؤلفون عن امتنانهم الصادق لفريق جينوميات السل: نبلة إسماعيل، ميلاني جروبيلار، إميلين كوستا، وروب إم وارن، على مساهماتهم في تطوير وتحسين هذا البروتوكول، بالإضافة إلى دعمهم الثمين طوال هذه الدراسة. وقد تم دعم هذا العمل والأشخاص المشاركين من خلال منح وتمويل من مجلس البحوث الطبية الجنوب أفريقي (SAMRC)، والمؤسسة الوطنية للبحوث (NRF)، وجامعة ستيلينبوش (SU). لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات أو التحليل أو إعداد المخطوطات.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أطراف الماصة بحجم 1 مل | أي مورد | ||
| 10 وميكرو؛ أطراف ماصة L | أي مورد | ||
| 10٪ كبريتات الصوديوم الدودسيل (SDS) | ميرك (سيغما-ألدريتش) | 71736-100 ML | |
| أنابيب البولي بروبيلين بحجم 15 مل | أي مورد | ||
| أنابيب بحجم 2 مل وأنابيب بحجم 1.5 مل | أي مورد | ||
| 200 وميكرو؛ أطراف الماصة | أي مورد | ||
| 2-بروبانول، كاشف حيوي، للجزيئات B& | ميرك (سيغما-ألدريتش) | I9516-1L | التخزين في -20 ودرجة مئوية؛ C |
| 37&00; حاضنة C | أي مورد | ||
| 5 ميلاتار NaCl | ميرك (سيغما-ألدريتش) | S6546 - 100 ML | |
| 65° حاضنة C | أي مورد | ||
| جل الأجاروز | ميرك (سيغما-ألدريتش) | ||
| نظام توثيق جل الأشعة فوق البنفسجية Bio-Rad, | بيوراد | ||
| الطرد المركزي (لأنابيب 15 مل بحجم 50 مل) وميكروفوج (لأنابيب 2 مل) | أي مورد | ||
| الكلوروفورم للتحليل إمبارتا وREG؛ ACS | ميرك (سيغما-ألدريتش) | 1070242500 | |
| الكحول الكلوروفورم/الأيزوأميلي (24:1) | في غطاء أبخرة، اخلط 384 مل من الكلوروفورم و16 مل من كحول الأيزوأميل | ||
| حل CTAB/NaCl | ميرك (سيغما-ألدريتش) | 52370-100 G | قم بإذابة 4.1 جرام من NaCl في 80 مل من الماء المقطر. أثناء التحريك، أضف 10 جرام من CTAB. محلول حراري بدرجة 65 درجة؛ حاضنة C. اضبط الحجم إلى 100 مل باستخدام الماء المقطر. خزنها في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 6 أشهر. |
| سلم DNA بحجم 1 كيلو باكت | ثيرمو فيشر العلمي | ||
| كحول إيثيل، نقي، 200 proof، ل MOLL & | ميرك (سيغما-ألدريتش) | E7023-500ML | اخلط 75 مل من الإيثانول المطلق و25 مل ماء مقطر |
| ليزوزيم (10 ملغ/مل) | ميرك (سيغما-ألدريتش) | 10837059001 | إعادة تكوين الليزوزيم المحمر بالليوفيل (يرفع إلى درجة حرارة الغرفة) بالماء المقطر حتى 10 ملغ/مل |
| وسائط ميدلبروك 7H9 | ميرك (سيغما-ألدريتش) | M0178 | اتبع إرشادات الشركة المصنعة لتحضير الوسائط السائلة |
| ميدلبروك OADC إنثريمنت 6 × 100 مل F  | BD | 212240 | |
| وسائط أنبوب مؤشر نمو البكتيريا الفطرية (MGIT) | BD | 245122 | |
| نظام نانو دروب | ثيرمو فيشر العلمي | ||
| ماصة P10 | أي مورد | ||
| ماصة P1000 | أي مورد | ||
| ماصة P200 | أي مورد | ||
| بروتيناز K، مشمش، PCR grd 2x250mg | ميرك (سيغما-ألدريتش) | 3115801001 | أعد تشكيل قارورة من إنزيم البروتيناز K المحمول بالماء المقطر إلى 10 ملغ/مل. جمد الأليكوات في أنابيب 2 مل عند -20 ودرجة مئوية؛ C |
| SYBR-safe | ثيرمو فيشر العلمي | ||
| رقم الهيدروجينيوم المؤقت Tris/EDTA (TE) 8.0 | ميرك (سيغما-ألدريتش) | 8890-OP أو 382499997 | |
| الدوامة | أي مورد |
المراجع
- FBouso, J. M., Planet, P. J. Complete non-tuberculous mycobacteria whole genomes using an optimized DNA extraction protocol for long-read sequencing. BMC Genomics. 20 (1), 793(2019).
- Daffé, M., Marrakchi, H. Unraveling the structure of the ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
