نظام التعبير المزدوج القائم على تكميل GFP لتقييم ملامسة الخلية الخلوية بوساطة السيتونيمات في الأقراص الخيالية لجناح ذبابة الفاكهة الحية

Mathieu Joseph; David  R. Hipfner

doi:10.3791/68411

Method Article

نظام التعبير المزدوج القائم على تكميل GFP لتقييم ملامسة الخلية الخلوية بوساطة السيتونيمات في الأقراص الخيالية لجناح ذبابة الفاكهة الحية

DOI:

10.3791/68411

⸱

August 22nd, 2025

Mathieu Joseph¹^,² , David R. Hipfner¹^,²^,³

¹Institut de recherches cliniques de Montréal (IRCM), ²Programmes de biologie moléculaire, Université de Montréal, ³Département de Médecine, Université de Montréal

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف بروتوكولا لقياس التلامسات بين الخلايا في الطبقات الظهارية المجاورة في الأقراص الخيالية لجناح ذبابة الفاكهة الحية باستخدام نهج قائم على إعادة تكوين GFP.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم التحكم في نمو الأنسجة الجنينية ونمذجها إلى حد كبير عن طريق الإشارات المتبادلة محليا بين مجموعات الخلايا داخل الأنسجة نفسها. Cytonemes هي نوع من filopodia الإشارات التي تم تحديدها لأول مرة في ذبابة الفاكهة والتي تربط وتتوسط التبادل بين الخلايا المنتجة للإشارات والخلايا المستقبلة للإشارة. في القرص الخيالي لجناح ذبابة الفاكهة النامي ، تشارك السيتونيمات في تبادل الإشارات بين مجموعات متميزة من الخلايا داخل ظهارة القرص المناسب (DP) ، والتي ستشكل الجناح البالغ ، وكذلك بين خلايا DP والخلايا في الأنسجة المجاورة المرتبطة بالقرص. تتشابك Cytonemes مع الخلايا المستهدفة لتشكيل اتصالات غشائية حميمة.

هنا ، نقدم بروتوكولا لقياس الاتصال بوساطة السيتونيم بين خلايا DP وخلايا ظهارة الغشاء المحيط بالقبل المجاورة (PerM) ، والتي يتم فصلها عن خلايا DP بواسطة تجويف القرص ، باستخدام نهج إعادة تكوين GFP في أقراص الجناح الحي. باستخدام أنظمة GAL4-UAS و LexA-LexAop ، يتم التعبير عن الأجزاء التكميلية من انقسام GFP (spGFP1-10 ، spGFP11) ، كل منها مدمج في مجال الغشاء ل CD4 ، على جانبي تجويف القرص. ثم يتم استخدام تصوير مضان GFP المعاد تشكيله في مستحضرات قرص الجناح الحي بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر لإنشاء أكوام صور يمكن من خلالها توطين مضان GFP المعاد تشكيله وقياسه كميا. باستخدام هذا النظام ، من الممكن التعبير المشترك عن الجينات المعدلة وراثيا لترميز البروتين أو تداخل الحمض النووي الريبي في الخلايا المنتجة للسيتونيم أو الخلايا المستهدفة لقياس تأثيرها على ملامسات خلايا DP-PerM. هذا النظام ، القابل للتكيف بسهولة مع الأنسجة الأخرى ، وبالتالي يمكن من تحديد العوامل المهمة لتكوين السيتونيم أو وظيفته.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم التحكم في تطور الأنسجة الجنينية بواسطة الخلايا الموجودة في "مراكز التنظيم" التي تشير إلى الخلايا البعيدة داخل الأنسجة ، وتتحكم في قراراتها بالتكاثر (أي النمو والانقسام) أو تبني مصائر^{معينة 1}. يتم التوسط في هذه الإشارات غير المستقلة للخلية بواسطة الروابط التي تنتجها تنظيم الخلايا المركزية التي تشكل تدرجات تركيز عبر الأنسجة وتثير استجابات تعتمد على التركيز. في كثير من الحالات ، يتم تسليم هذه الروابط أو التقاطها من خلال خيطة إشارات طويلة قائمة على الأكتين تسمى cytonemes التي تربط الخلايا المرسلة والمستقبلة للإشارات في الأنسجة²^،³. تم اكتشاف السيتونيمات ل....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم استخدام برنامج تشغيل nubbin-GAL4 للتعبير عن CD4-spGFP1-10 على وجه التحديد في منطقة كيس الجناح في DP (الشكل 1 أ). يتم استخدام برنامج تشغيل PerM-LexA²¹ للتعبير عن CD4-spGFP11 على وجه التحديد في PerM (الشكل 1 أ). هذان النظامان للتعبير مستقلان عن بعضهما البعض ، مما يسمح بالتعبير المتزامن والمحدد للجينات المعدلة وراثيا المختلفة في DP و PerM (الشكل 1 ب ، ج).

يتضمن المخطط الجيني الأساسي عبور الذباب لتوليد يرقات من النمط الجيني nub-GAL4 / UAS-CD4-spGFP1-10. PerM-LexA / LexAop-CD4-spGFP11. كعنصر تحك....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لاختبار فائدة إجراء GRASP لقياس التلامس بين خلايا DP و PerM ، قمنا بفحص أقراص الجناح لأربعة أنماط وراثية مختلفة: أقراص التحكم السلبي من النوع البري (النمط الجيني: w¹¹¹⁸) والتي ستعرض فقط مستويات الخلفية من التألق الذاتي في قناة GFP. الأقراص التي تعبر عن CD4-spGFP1-10 في طبقة DP ، ولكنها تفتقر إلى الجين المعدل CD4-spGFP11 ، والذي سيظهر مستوى التألق الناتج عن GFP1-10 وحده (والذي توقعنا أن يكون ضئيلا ، حيث لا ينبغي أن يتألق GFP1-10²⁶) ؛ الأقراص التي يتم فيها التعبير عن CD4-spGFP1-1.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلعب السيتونيمات دورا مهما في توزيع الروابط ، والتحكم في نمو وتنظيم الأنسجة النامية. يحدث تبادل الإشارة حيث تقوم أطراف cytoneme بإجراء اتصالات غشائية حميمة مع أهدافها. في هذا البروتوكول ، نصف طريقة بسيطة لتحليل التلامسات بوساطة السيتونيم بين الطبقات الظهارية في قرص الجناح باستخدام تقنية GRASP.

تتطلب التقنية المعروضة هنا ، كحد أدنى ، أربعة مكونات - سائق GAL4 ، وسائق LexA ، والجينات المعدلة وراثيا تشفران اندماج CD4 لشظايا spGFP التكميلية تحت تحكم UAS و .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ مصالح متنافسة يعلنون عنها.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال منحة CIHR (PJT-162109) إلى D.H. M.J. حصل على منحة دكتوراه من مؤسسة معهد أبحاث عيادة مونتريال ومن برنامج البيولوجيا الجزيئية بجامعة مونتريال. يقر المؤلفون بشدة بمساعدة منصة IRCM للفحص المجهري والتصوير.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
مجهر تشريح Discovery V12	زييس		مجهر تشريح
دومون # 55 ملقط ، نصائح علم الأحياء	أدوات العلوم الجميلة	11255-20	تشريح الملقط
EP-Slik (slik²⁰³⁵⁸)	BDSC	Panneton et al. 2015	سلالة ذبابة للتعبير عن سليك
فيجي		Schindelin J. et al. (2012)	برنامج تحليل الصور
Hoechst 33342	ثيرموفيشر العلمية	[ه3570 ];	التصوير المباشر للبقع النووية
LexAop-CD4-spGFP11 < / م>	BDSC	93018	سلالة الذبابة
مجهر متحد البؤر LSM 700 ؛	زييس		مجهر متحد البؤر
nub-GAL4< / em>	مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة (BDSC)	86108	سلالة الذبابة
PerM-LexA		رامبو ، جوزيف وآخرون ، 2025	سلالة الذبابة
PYREX 9-منخفض زجاج بقعة لوحة	كورنينج لايف ساينسز	7220-85	لجمع وغسل اليرقات
ذبابة الفاكهة المتوسطة من شنايدر	ثيرموفيشر العلمية	21720024	وسيط التصوير الحي
فواصل التصوير SecureSeal ، 8 آبار ، سمك 0.12 مم ؛	جريس بيو لابز	654008	فاصل
طقم مطاط صناعي من السيليكون SYLGARD 184	سيلجارد	3097358-1004	لصنع لوحات التشريح
UAS-CD4-spGFP1-10 < / م>	BDSC	93017	سلالة الذبابة
زن بلاك	زييس		برنامج الاستحواذ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ng, J. K., Tamura, K., Buscher, D., Izpisua-Belmonte, J. C. Molecular and cellular basis of pattern formation during vertebrate limb development. Curr Top Dev Biol. 41, 37-66 (1999).
Kornberg, T. B. Cytonemes and the dispersion of morphogens. Wiley Interdiscip....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

نظام التعبير المزدوج القائم على تكميل GFP لتقييم ملامسة الخلية الخلوية بوساطة السيتونيمات في الأقراص الخيالية لجناح ذبابة الفاكهة الحية

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles