مقالة منهجية

الطباعة الحيوية لشرائح ورم الهيدروجيل كنموذج ثلاثي الأبعاد لسرطان الغدد الليمفاوية لخلايا الوشاح

1.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68417

⸱

سبتمبر 12, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Dr. Margarete Fischer-Bosch Institute of Clinical Pharmacology and University of Tuebingen, 2Department of Physiology and Pharmacology, Karolinska Institute, 3Department of Clinical Pathology, Robert Bosch Hospital, 4Robert Bosch Hospital, 5Departments of Clinical Pharmacology, Pharmacy and Biochemistry, University of Tuebingen, 6iFIT Cluster of Excellence (EXC 2180), Image-guided and Functionally Instructed Tumor Therapies, University of Tuebingen, 7German Cancer Consortium (DKTK) and German Cancer Research Center (DKFZ), Partner Site Tuebingen, 8National Center for Tumor Diseases (NCT), NCT South-West, a partnership between DKFZ, University Hospital Tuebingen, University of Tuebingen, Tuebingen, Bosch Health Campus, Stuttgart, Robert Bosch Hospital, Stuttgart, University Hospital Ulm, and Ulm University

في هذه المقالة

ملخص

يوفر هذا البروتوكول وصفا تفصيليا لتوليد وثقافة وتحليل سرطان الغدد الليمفاوية لخلايا الوشاح في شرائح ورم هيدروجيل مطبوعة ثلاثية الأبعاد.

الملخص

سرطان الغدد الليمفاوية لخلايا الوشاح (MCL) هو ورم نادر وعدواني للخلايا البائية ينتكس بشكل متكرر ويظهر استجابة محدودة فقط للعلاج الكيميائي التقليدي. يتمثل التحدي الرئيسي في أبحاث MCL في زراعة خلايا MCL الأولية خارج الجسم الحي ، حيث تميل الخلايا إلى الخضوع لموت الخلايا المبرمج التلقائي عند زراعتها في ثقافة معلقة ثنائية الأبعاد. على الرغم من أنه من المعروف أن النماذج ثلاثية الأبعاد تلخص بشكل أفضل الحالة في الجسم الحي للأورام الصلبة ، إلا أن تطبيقها لا يزال ضعيفا في الأورام اللمفاوية. يمكن أن يؤدي تطوير نماذج ثلاثية الأبعاد تكرر الظروف في الجسم الحي ل MCL داخل العقدة الليمفاوية إلى تعزيز بقائها على قيد الحياة ، وتسهيل دراسة الحديث المتبادل للبيئة المكروية للورم MCL ، وتقليد استجابة الأدوية في الجسم الحي . هنا ، تم إنشاء نموذج مطبوع ثلاثي الأبعاد ل MCL على شكل شرائح ورم هيدروجيل ، جنبا إلى جنب مع طريقة زراعة محسنة. تم تطوير عملية موحدة باستخدام خطوط خلايا MCL أو خلايا MCL الأولية ، حيث يتم غمر الخلايا في هيدروجيل يحتوي على ألجينات ، والكولاجين من النوع الأول ، ومصفوفة الغشاء القاعدي عن طريق الطباعة الحيوية في حمام دعم الجيلاتين. يتم زراعة شرائح ورم الهيدروجيل MCL الناتجة على دعامة مرشح للحفاظ على ثباتها طوال فترة الاستزراع. يمكن تطبيق العلاجات الدوائية على النظام. يمكن تتبع استجابة الخلايا المفردة داخل شريحة ورم الهيدروجيل عن طريق التصوير الفلوري ثلاثي الأبعاد الحي بأربعة ألوان. أظهرت خلايا MCL الأولية قابلية استقرار للحياة عند زراعتها في شرائح ورم الهيدروجيل. يوفر هذا البروتوكول وصفا مفصلا لتوليد خلايا MCL وزراعتها وتحليلها في شرائح ورم هيدروجيل. من خلال محاكاة البيئة المكروية للورم عن كثب واستخدام ثقافة واجهة الهواء والسائل ، يعزز النموذج المقدم الأهمية الفسيولوجية مقارنة بالثقافة ثنائية الأبعاد التقليدية. إنه يوفر إمكانات كبيرة للنهوض بكل من الدراسات البيولوجية والعلاجية ل MCL.

المقدمة

سرطان الغدد الليمفاوية لخلايا الوشاح (MCL) هو سرطان الغدد الليمفاوية غير هودجكين نادر وعدواني للخلايا البائية ينشأ من منطقة الوشاح في الغدد الليمفاوية1. تتكون منطقة الوشاح من حلقة من الخلايا الليمفاوية الصغيرة المحيطة بالمركز الجرثومي لجريب الخلية البائية. عادة ما يظهر MCL مسارا سريريا عدوانيا ، مع انتكاسات متكررة بعد العلاج الكيميائي الأولي. نظرا لفهم أفضل لتكوين المرض1 وتطوير علاجات جديدة ، بما في ذلك العلاج الكيميائي المناعي2 ، أو مثبطات التيروزين كيناز بروتون3 أو الأجسام المضادة والأدوية المقترنة4 ، أدت خيارات العلاج لمرضى MCL إلى تحسين معدلات الاستجابة والبقاء على قيد الحياة لفترة طويلة بدون تقدم. ومع ذلك ، فإن مقاومة الأدوية والانتكاسات لا تزال تجعل المرض غير قابل للشفاء5. جزئيا ، هذا نتيجة لعدم تجانسها وتأثير البيئة المكروية للورم على تطور الورم ومقاومة الأدوية6. يتمثل التحدي في دراسة MCL في صعوبة زراعة خلايا MCL الأولية في ثقافة التعليق7 ، حيث تخضع الخلايا لموت الخلايا المبرمج التلقائي خارج الجسم الحي4،5. هذا يسلط الضوء على الحاجة إلى مناهج بديلة لنمذجة MCL بشكل أفضل في النماذج قبل السريرية.

في الجسم الحي ، الأورام عبارة عن هياكل ثلاثية الأبعاد (3D) تتكون من مكونات خلوية مختلفة ، بما في ذلك الخلايا السرطانية والخلايا المناعية والخلايا اللحمية ، بالإضافة إلى المكونات غير الخلوية مثل المصفوفة خارج الخلية (ECM). تشكل ECM ، التي تتكون من جزيئات كبيرة مثل الكولاجين واللامينين ، شبكة ليفية معقدة من ألياف مرنة شديدة الحرارة ، مما يخلق بيئة تشبه الهلام2،8،9،10. لتكرار هذه الظروف في الجسم الحي للأورام خارج الجسم الحي بشكل أفضل ، تم تطوير مجموعة متنوعة من النماذج ثلاثية الأبعاد. في السنوات الأخيرة ، أصبحت هذه النماذج حاسمة لدراسة علم الأدوية وعلم الأحياء السرطاني ، مع التركيز بشكل أساسي على الأورام الصلبة11.

حتى الآن ، لا يزال هذا المجال غير مستكشف بشكل جيد في الأورام اللمفاوية ، نظرا لأن الخلايا السرطانية الدموية لديها القدرة على النمو في كل من التعليق وفي محيط اللحمة مثل الغدد الليمفاوية أو نخاع العظام أو الأنسجة اللمفاوية الثانوية12. في الجسم الحي ، تنتشر خلايا MCL من منطقة عباءة الغدد الليمفاوية في الدم أو نخاع العظام ، على الرغم من أنها تتكاثر بشكل أساسي داخل الغدد الليمفاوية التي نشأت منها13،14. داخل الغدد الليمفاوية ، تحيط خلايا MCL بالخلايا التائية والضامة والخلايا اللحمية الوسيطة ، والتي ثبت أنها تتحكم في البقاء على قيد الحياة أو الاستجابة الدوائية لخلايا MCL14،15،16،17،18. علاوة على ذلك ، فإن الحديث المتبادل للبيئة المكروية للورم MCL ، بالإضافة إلى المسامية والخصائص الميكانيكية ، هي عوامل مهمة يمكن أن تؤثر على استجابات الأدوية والمقاومة6،14. وبالتالي ، فإن نماذج الورم ثلاثية الأبعاد الموحدة والقابلة للتكرار من MCL التي تحاكي البيئة المكروية الأصلية مطلوبة لدراسة MCL الأولية. حتى الآن ، تم إنشاء نماذج قائمة على الخلايا بشكل أساسي مثل الكرويات أو العضيات لخلايا MCL الأولية6،19. إنها تعزز بنجاح جدوى الخلايا MCL الأولية وزراعتها على المدى الطويل. ومع ذلك ، فإن المصفوفة خارج الخلية ممثلة تمثيلا ناقصا في هذه النماذج. في هذا السياق ، تقدم الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد المتقدمة نهجا واعدا. من خلال التجميع المباشر للخلايا الحية والهلاميات المائية ، تتيح هذه التقنية إنشاء نماذج العقدة الليمفاوية ثلاثية الأبعاد القائمة على الهيدروجيل ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية.

هنا ، تم إنشاء نموذج مطبوع بيولوجيا ثلاثي الأبعاد ل MCL في شكل شرائح ورم هيدروجيل ، جنبا إلى جنب مع طريقة زراعة محسنة. يتم تضمين الخلايا في شرائح هيدروجيل من النوع الأول والألجينات والماتريجيل عن طريق التضمين الحر القابل للانعكاس للطباعة الحيوية للهلاميات المائية المعلقة (FRESH)20. يتم زراعة شرائح ورم الهيدروجيل على دعامة مرشح ، مما يسمح لخلايا MCL بالنمو في بيئة تلخص عن كثب الظروف في الجسم الحي للعقدة الليمفاوية.

يوفر هذا البروتوكول وصفا مفصلا لتوليد خلايا MCL وزراعتها وتحليلها في شرائح ورم هيدروجيل. من خلال استخدام التصوير الفلوري ثلاثي الأبعاد الحي بأربعة ألوان ، يمكن تتبع الجدوى أو الاستجابة الدوائية للخلايا المفردة داخل شريحة ورم الهيدروجيل. أظهرت خلايا MCL الأولية تحسنا في البقاء على قيد الحياة عند زراعتها في شرائح ورم الهيدروجيل. يوفر هذا النموذج أداة لدراسة بيولوجيا MCL والاستجابة للعلاج ، مما يمهد الطريق نحو فهم التأثيرات البيئية الدقيقة وتقلب مرضى MCL.

البروتوكول

يجب أن تتم الموافقة على العمل مع خلايا MCL الأولية من قبل لجنة الأخلاقيات المحلية. في هذه الدراسة ، وافقت لجنة الأخلاقيات في كلية الطب وجامعة إبرهارد كارلز ومستشفى جامعة توبينجن على جمع وعمل عينات المرضى والمتبرعين الأصحاء (رقم المشروع 159/2011BO2) ، وتم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من المرضى وفقا لإعلان هلسنكي. تم عزل خلايا MCL الأولية المستخدمة هنا من الغدد الليمفاوية الكاملة لمريض MCL ، وبالتالي لم تشمل خلايا MCL فحسب ، بل شملت أيضا خلايا أخرى مثل الخلايا المناعية والخلايا الليفية.

1. تحضير ملاط الجيلاتين لحمام الدعم

ملاحظة: سيكون ملاط الجيلاتين بمثابة حمام دعم أثناء عملية الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد. إنه يحفز التشابك بين الحبر الحيوي ، مما يسمح بتكوين بنية ثلاثية الأبعاد. يجب أن يتم تحضير ملاط الجيلاتين في ظروف معقمة داخل غطاء مزرعة الخلية.

  1. قم بإعداد محلول جيلاتين بنسبة 4.5٪ (وزن / حجم) في 10 ملي مولار HEPES و 11 ملي مولار CaCl2 عن طريق إذابة 6.75 جم من مسحوق الجيلاتين في 1.5 مل من 1 M HEPES و 15 مل من 110 ملي من CaCl2 و 133.5 مل من H2O المعقم في برطمان ميسون معقم بغطاء. تأكد من أن جرة ميسون مناسبة للخلط في خلاط عالي الأداء.
  2. احتضن المحلول عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات أو حتى لا تلاحظ أي مسحات عند تقليب المحلول ، مما يشير إلى أن الجيلاتين يذوب تماما. قم بتبريد الجيلاتين على حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل أو لمدة 12 ساعة على الأقل.
  3. قم بإعداد مخزن مؤقت معقم للغسيل يتكون من 10 ملي مولار HEPES و 14.4 ملي مولار CaCl2. قم بتبريد مخزن الغسيل مسبقا إلى 4 درجات مئوية.
  4. قسم الجيلاتين المتصلب بنسبة 4.5٪ إلى عدة قطع باستخدام ملعقة معقمة.
  5. املأ برطمان ميسون الذي يحتوي على الجيلاتين بنسبة 4.5٪ بالكامل بمخزن الغسيل المبرد مسبقا ، مما يضمن بقاء المخزن المؤقت باردا طوال عملية تحضير ملاط الجيلاتين.
  6. قم بتجميد برطمان ميسون المحتوي على الجيلاتين عند -20 درجة مئوية لمدة 45-60 دقيقة ، حتى يصل معلق الجيلاتين إلى 0 درجة مئوية ، لكنه لم يبدأ بعد في تكوين بلورات الثلج. استخدم مقياس حرارة لمراقبة درجة الحرارة.
  7. قم بتوصيل غطاء الخلاط والشفرة بجرة ميسون ، ثم قم بتركيب برطمان ميسون على الخلاط. امزج معلق الجيلاتين لمدة 120 ثانية باستخدام إعداد النبض.
    ملاحظة: قد يلزم ضبط إعدادات الخلاط عند استخدام نوع مختلف من الخلاط.
  8. انقل التعليق المخلوط إلى أنابيب مبردة مسبقا سعة 50 مل. جهاز طرد مركزي عند 3,800 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. تأكد من فصل المعلق إلى ملاط جيلاتين صلب في الأسفل ومخزن الغسيل السائل في الأعلى.
  9. قم بتنفيذ الخطوة التالية على الثلج: اغسل ملاط الجيلاتين. استنشق الطبقة السائلة العلوية ، محاولا إزالة الفقاعات المرئية أعلى المخزن المؤقت للغسيل. أضف 20 مل من مخزن الغسيل الطازج 4 درجات مئوية إلى الأنبوب. قم بدوامة الأنبوب لخلط ملاط الجيلاتين مع مخزن الغسيل.
  10. كرر عملية الطرد المركزي والغسيل 3 مرات على الأقل ، أو حتى لا تظهر فقاعات في الجزء العلوي من المخزن المؤقت للغسيل. بعد الغسيل النهائي ، قم بإزالة أي مخزن مؤقت غسيل متبقي عن طريق الشفط. يمكن تخزين ملاط الجيلاتين عند 4 درجات مئوية لعدة أسابيع.

2. تحضير الحبر الحيوي المحمل بالخلايا

  1. قم بإعداد محلول ألجينات معقم بنسبة 5٪ قبل 1-2 أيام من الطباعة. أضف 1 جم من الجينات إلى 20 مل من PBS المعقم في أنبوب سعة 50 مل. لمنع بقايا مسحوق الألجينات الجافة ، أضف PBS بزيادات صغيرة ، دوامة بين الإضافات. احتضن المحلول إما في حمام مائي 37 درجة مئوية لعدة ساعات أو طوال الليل على أسطوانة أنبوبية في درجة حرارة الغرفة. بمجرد إذابة الجينات تماما ، قم بتخزين المحلول في درجة حرارة 4 درجات مئوية لحين الحاجة.
  2. إذا كنت تعمل مع خط خلية MCL ، فقم بزراعة الخلايا المعلقة في قارورة T75. في يوم الطباعة ، تأكد من توفر 1.4 ×10 7 خلايا لتحضير 1 مل من الحبر الحيوي ، والتي ستنتج 9-10 شرائح ورم هيدروجيل.
  3. إذا كنت تعمل مع خلايا MCL الأولية ، فلا تحتاج الخلايا إلى الاستزراع في ثقافة التعليق قبل الطباعة الحيوية. قم بإذابة خلايا MCL الأولية المحفوظة بالتبريد مباشرة قبل الطباعة الحيوية. انقل خلايا MCL الأولية إلى أنبوب 50 مل مع وسط ثقافة. لإزالة وسط التجميد المتبقي ، قم على الفور بالطرد المركزي للأنبوب عند 340 × جم لمدة 5 دقائق ، ثم قم بإزالة المادة الطافية. أعد تعليق حبيبات الخلية في 20 مل من الوسط الطازج لعد الخلايا.
  4. في يوم الطباعة ، قم بإعداد الحبر الحيوي الملائم للخلايا ذات الأهمية. بالنسبة لخلايا Jeko-1 ، قم بإعداد حبر حيوي يتكون من 0.5٪ (وزن / حجم) ألجينات ، و 20٪ (حجم / حجم) من النوع الأول ، و 1x RPMI ، و 2 ملي مولار HEPES. امزج 100 ميكرولتر من ألجينات 5٪ ، و 200 ميكرولتر من الكولاجين من النوع الأول ، و 100 ميكرولتر من 10x RPMI ، و 200 ميكرولتر من 10 ملي مولار HEPES ، و 350 ميكرولتر من PBS مقابل 1 مل من الحبر الحيوي. ستتم إضافة الخلايا في الخطوة 2.6.
  5. بالنسبة لخلايا MCL الأولية ، قم بإعداد حبر حيوي يتكون من ألجينات 0.5٪ (وزن / حجم) ، و 20٪ (حجم / حجم) من الكولاجين من النوع الأول ، و 1x RPMI ، و 0.5 ملي مولار HEPES. امزج 100 ميكرولتر من ألجينات 5٪ ، و 200 ميكرولتر من الكولاجين من النوع الأول ، و 100 ميكرولتر من 10x RPMI ، و 50 ميكرولتر من 10 ملي مولار HEPES ، و 500 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي ل 1 مل من الحبر الحيوي. ستتم إضافة الخلايا في الخطوة 2.6. إذا كنت تعمل مع خط خلية MCL ، فقم بنقل تعليق الخلية من قارورة المزرعة إلى أنبوب 50 مل.
  6. امزج الخلايا مع 0.4٪ من التريبان الأزرق بنسبة 1: 1. عد الخلايا القابلة للحياة (غير الملوطخة) باستخدام عداد الخلايا أو غرفة نيوباور. احسب حجم تعليق الخلية ل 1 مل من الحبر الحيوي ، وهو ما يساوي 1.4 × 107 خلايا. انقل الحجم المحسوب إلى أنبوب جديد سعة 50 مل. جهاز طرد مركزي عند 340 × جم لمدة 5 دقائق ، ثم قم بإزالة المادة الطافية. أعد تعليق حبيبات الخلية في الحبر الحيوي المحضر لتوليد الحبر الحيوي النهائي المحمل بالخلية.
    ملاحظة: تشير التقديرات إلى أن حجم حبيبات الخلية يبلغ 50 ميكرولتر متوسطة. جنبا إلى جنب مع الحبر الحيوي المحضر في الخطوة 2.4 ، سينتج عنه 1 مل من الحبر الحيوي.

3. الطباعة الحيوية في الحمام

ملاحظة: إذا أمكن ، قم بإجراء عملية الطباعة ثلاثية الأبعاد في بيئة معقمة ، مثل تحت غطاء مزرعة الخلايا. تم تعديل الطابعة ثلاثية الأبعاد المستخدمة للطباعة FRESH عن طريق إضافة موسع مضخة الحقنة ، كما هو موضح في Hinton et al.20.

  1. قم بتشغيل الطابعة الحيوية وتوصيلها ببرنامج الطابعة ثلاثية الأبعاد. افتح ملف .stl الذي يحتوي على مخطط شرائح ورم الهيدروجيل. يمكن طباعة ما يصل إلى 5 شرائح في وقت واحد. تأكد من أن قطر كل شريحة ورم هيدروجيل 8 مم وارتفاعها 1.5 مم. اضبط كثافة التعبئة على 85٪. قم بوضع رأس الطابعة في المنزل.
    ملاحظة: تم تصميم ملف STL باستخدام Fusion 360 ويمكن العثور عليه في ملف الترميز التكميلي 1. للطباعة ثلاثية الأبعاد ، تم استخدام برنامج Cura Version 15.04.5.
  2. انقل ملاط الجيلاتين المعد مسبقا إلى طبق بتري بقطر 35 مم حتى يمتلئ نصفه تأكد من عدم وجود فجوات هوائية في ملاط الجيلاتين. اسحب الماء الزائد من الملاط باستخدام مناديل دقيقة يمكن التخلص منها لتوليد حمام دعم الجيلاتين ، وهو فطيرة ويحافظ على الشكل حتى يتم تطبيق القوة الكافية.
  3. انقل الحبر الحيوي المحمل بالخلايا إلى حقنة زجاجية سعة 2.5 مل وقم بتوصيله بفوهة حادة 0.8 مم. اقلب المحقنة وأخرج فقاعات الهواء والهواء الزائدة بعناية. بمجرد تحضير المحقنة ، أدخلها في الطابعة الحيوية. باستخدام برنامج الطابعة ثلاثية الأبعاد، قم ببثق الحبر الحيوي حتى يبدأ في إخراجه من الفوهة. امسح قطرة الحبر الحيوي المقذوفة باستخدام منديل دقيق علمي يمكن التخلص منه لمنع انسداد الفوهة.
  4. ضع حمام دعم الجيلاتين أسفل فوهة المحقنة مباشرة. اخفض رأس الطابعة حتى يتم وضع الفوهة داخل ملاط الجيلاتين ، على ارتفاع 2 مم فوق الجزء السفلي من حمام الدعم.
  5. ابدأ عملية الطباعة عبر برنامج الطابعة ثلاثية الأبعاد.
  6. بمجرد اكتمال عملية الطباعة ، قم بإزالة أي ملاط جيلاتين زائد من الفوهة لمنع الانسداد. أخرج حمام الدعم الذي يحتوي على شرائح ورم الهيدروجيل وقم بتغطيته بغطاء للحفاظ على العقم.
  7. احتضان حمام الدعم الذي يحتوي على شرائح ورم الهيدروجيل المطبوعة عند 37 درجة مئوية للسماح للجيلاتين بالذوبان. ستؤدي هذه الخطوة إلى تحرير شرائح ورم الهيدروجيل المطبوعة من حمام الدعم.
  8. قم بتسخين المخزن المؤقت للغسيل ووسط زراعة الخلايا مسبقا إلى 37 درجة مئوية. أثناء ذوبان الجيلاتين ، قم بإعداد طبق من 6 آبار لغسل شرائح ورم الهيدروجيل. املأ بئرين ب 10 ملي مولار HEPES ، و 14.4 ملي مولار CaCl2 عازلة غسيل (نفس المخزن المؤقت المستخدم لغسل ملاط الجيلاتين) ، وبئرين بوسط زراعة الخلايا.
  9. بمجرد ذوبان الجيلاتين ، استخدم ملعقة معقمة لنقل شرائح ورم الهيدروجيل إلى المخزن المؤقت للغسيل. اغسل الشرائح لمدة 1 دقيقة لكل منهما ، أولا في بئرين محتجزين للغسيل ، ثم في البئرين متوسطي الاحتواء. شرائح ورم الهيدروجيل المحملة بالخلايا جاهزة الآن للثقافة.
  10. احتفظ بالحبر الحيوي المتبقي لتكرار عملية الطباعة.

4. ثقافة وعلاج شريحة ورم هيدروجيل

  1. لزراعة شرائح الهيدروجيل ، انقلها إلى دعامة مرشح (حجم مسام 0.4 ميكرومتر) موضوعة داخل صفيحة مكونة من 6 آبار. قم بزراعة ما يصل إلى 5 شرائح هيدروجيل على دعامة مرشح واحد. أضف 1.5 مل من وسط زراعة الخلايا أسفل دعامة المرشح. أضف قطرة متوسطة فوق شرائح ورم الهيدروجيل لمنعها من الجفاف.
  2. للعلاج الدوائي لشرائح ورم الهيدروجيل ، أضف الكمية المطلوبة من الدواء إلى وسط زراعة الخلايا. هنا ، تمت معالجة شرائح ورم الهيدروجيل ب 0.33 ميكرومتر -27 ميكرومتر دوكسوروبيسين لمدة 48 ساعة أو 72 ساعة. قم دائما بزراعة مجموعة من الشرائح دون علاج كعنصر تحكم.
  3. ضع اللوحة المكونة من 6 آبار مع شرائح ورم الهيدروجيل في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لفترة الزراعة المطلوبة.

5. تحليل جدوى الخلايا عن طريق مقايسة استبعاد التربان الأزرق

  1. لتقييم صلاحية الخلية بعد الزراعة أو العلاج ، قم بإذابة شرائح ورم الهيدروجيل. انقل شريحة ورم هيدروجيل إلى أنبوب 1.5 مل. أضف 500 ميكرولتر لكل شريحة من المخزن المؤقت المذاب الذي يحتوي على 30 ملي مولار EDTA و 55 ملي سترات الصوديوم و 150 ملي مولار من كلوريد الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 6.8). ماصة لأعلى ولأسفل حتى يذوب الهيدروجيل تماما.
  2. قم بالطرد المركزي للمحلول عند 340 × جم لمدة 5 دقائق. استنشاق الطافي أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من الوسط لكل شريحة هيدروجيل مذاب.
  3. امزج تعليق الخلية بنسبة 1: 1 مع 0.4٪ من اللون الأزرق التريباني. عد الخلايا القابلة للحياة (غير الملوطخة) والميتة (الملطخة) باستخدام عداد الخلايا أو غرفة نيوباور. سجل عدد الخلايا الحية والميتة لمزيد من التحليل.

6. أربعة ألوان حية 3D التصوير الفلوري

ملاحظة: يسمح التلوين ذو الألوان الأربعة المستخدم هنا بالتمييز بين الخلايا الحية (إيجابية TMRM) ، والخلايا المبرمج (الركيزة الفلورية Caspase-3 إيجابية) ، والخلايا الميتة (إيجابية PicoGreen) 21،22،23. يتم الكشف عن النوى باستخدام DRAQ5. ومع ذلك ، يمكن تعديل هذا البروتوكول إلى أي صبغة مضانة أخرى مستقرة ضوئيا ومحددة للكشف عن المؤشرات الحيوية أو الهياكل الخلوية أو أنواع الخلايا المختارة. قبل التلوين ، تأكد من أن المجهر قادر على اكتشاف الأطوال الموجية للفلوروفورات المستخدمة في التلوين.

  1. للحصول على تلطيخ بأربعة ألوان لشريحة ورم هيدروجيل ، قم بإعداد محلول تلطيخ عن طريق إضافة TMRM و DRAQ5 وركيزة Caspase-3 الفلورية إلى 1 مل من وسط زراعة الخلايا بتركيز نهائي يبلغ 0.5 ميكرومتر و 5 ميكرومتر و 2 ميكرومتر على التوالي.
  2. باستخدام ملعقة معقمة ، انقل شريحة ورم هيدروجيل إلى غطاء زجاجي بغرفة. أضف محلول التلوين المحضر فوق شريحة الهيدروجيل حتى يتم تغطيتها بالكامل. احتضان العينة لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام.
  3. بعد الحضانة الأولية ، اجمع محلول التلوين الذي يغطي شريحة ورم الهيدروجيل وأضف 0.7 ميكرولتر / مل PicoGreen. قم بإخراج محلول التلوين مرة أخرى إلى شريحة الهيدروجيل واحتضان لمدة 10 دقائق إضافية عند 37 درجة مئوية في الظلام.
  4. بعد الحضانة ، قم بإزالة الوسط الزائد بعناية مع ترك محلول تلطيخ كاف للحفاظ على رطوبة شريحة الهيدروجيل.
  5. قم بتحليل الشريحة على الفور باستخدام مجهر متحد البؤر. لمنع السمية الضوئية والتبييض الضوئي ، قلل من جرعة الفوتون المطبقة عن طريق تقليل شدة الليزر ووقت الإثارة. يمكن العثور على أطياف الإثارة / الانبعاث للبقع الموصوفة أعلاه في الجدول 1.
  6. للحصول على نظرة عامة على التوزيع الخلوي للخلية في الهيدروجيل ، التقط أقسام z. إذا تم أخذ أقسام z أثناء التصوير ، فقم بإنشاء عمليات إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لشرائح ورم الهيدروجيل باستخدام البرنامج المناسب. ستسمح عمليات إعادة البناء هذه بإجراء تحليل شامل للتوزيع المكاني والحالة الخلوية للخلايا في شرائح ورم الهيدروجيل.
  7. اتبع التعليمات والنص المقدم في الملف التكميلي 1 والملف التكميلي 2 لإجراء تجزئة الخلية وإعادة بنائها.

النتائج

تم إنشاء شرائح ورم الهيدروجيل التي تحتوي على خلايا MCL باستخدام البروتوكول الموصوف أعلاه. يتم عرض خطوات سير العمل للطباعة ثلاثية الأبعاد وزراعة شرائح ورم الهيدروجيل في الشكل 1 أ. تم تعديل الطابعة ثلاثية الأبعاد المستخدمة للطباعة FRESH عن طريق إضافة موسع مضخة الحقنة كما هو موضح في Hinton et al.20 (الشكل 1 ب). تمت طباعة ما يصل إلى خمس شرائح في وقت واحد (الشكل 1 ج) وزراعتها على دعامة مرشح واحد (الشكل 1 د). تمت إضافة وسيط أسفل دعامة المرشح لتوفير إمدادات مغذية لشرائح ورم الهيدروجيل. تمت إضافة قطرة من الوسط فوق كل شريحة ورم هيدروجيل لمنعها من الجفاف. يتم عرض نظرة عامة على خمس شرائح ورم هيدروجيل مزروعة على دعامة مرشح واحد في الشكل 1E ، جنبا إلى جنب مع صور مقربة لشريحة هيدروجيل. خلال فترة الاستزراع لمدة 3 أيام ، كانت شرائح ورم الهيدروجيل مستقرة وحافظت على هيكلها (الشكل 2 أ). بعد الطباعة مباشرة ، كانت فقاعات الهواء موجودة في شرائح ورم الهيدروجيل ، لكنها اختفت أثناء الزراعة (الشكل 2 أ).

تم تقييم جدوى خط خلايا MCL Jeko-1 المزروع في شرائح ورم هيدروجيل (3D) مقارنة بخلايا Jeko-1 المزروعة في ثقافة التعليق (2D) عن طريق مقايسة استبعاد التربان الأزرق (الشكل 2 ب). بعد 3 أيام من الثقافة ، كانت 80٪ من الخلايا قابلة للحياة ، مقارنة بقابلية البقاء الأولية ل 88٪ من خلايا Jeko-1 قبل الطباعة. حافظت خلايا Jeko-1 المزروعة في 2D على قابلية البقاء الأولية بنسبة 88٪. لم يكن هناك فرق كبير بين خلايا Jeko-1 المزروعة في 2D و 3D. لتقييم ما إذا كانت خلايا Jeko-1 تتكاثر في شرائح الهيدروجيل ، تم تحديد متوسط عدد خلايا Jeko-1 لكل شريحة هيدروجيل (الشكل 2 ج). بينما تم احتواء خلايا 5 × 105 Jeko-1 في كل شريحة مباشرة بعد الطباعة (d0) ، تضاعف هذا الرقم تقريبا إلى 9.3 × 105 خلايا بعد 3 أيام من الثقافة.

تم تقييم توزيع وحالة خلايا Jeko-1 المزروعة في شرائح هيدروجيل عن طريق التصوير الفلوري الحي بأربعة ألوان (الشكل 2د) مباشرة بعد الطباعة أو بعد 3 أيام من الاستزراع. بعد الطباعة ، أظهرت عمليات إعادة البناء ثلاثية الأبعاد لشرائح Jeko-1 hydrogel توزيعا متجانسا للخلايا. كانت غالبية الخلايا إيجابية ل TMRM ، وهي علامة لإمكانات غشاء الميتوكوندريا22. كانت أقلية من الخلايا إيجابية لنشاط Caspase-3 ، وهو علامة لتحريض موت الخلايا المبرمج23 ، وكذلك لعلامة الخلية الميتة PicoGreen21. بعد 3 أيام من الثقافة ، لوحظت زيادة في عدد الخلايا جنبا إلى جنب مع تكوين مجموعات الخلايا. ظلت معظم الخلايا إيجابية TMRM ، في حين أن عددا قليلا فقط من الخلايا ملطخة إيجابية لنشاط Caspase-3 أو PicoGreen (الشكل 2 ج).

لتحليل ما إذا كانت خلايا MCL في شرائح الهيدروجيل تستجيب للعلاج الكيميائي ، تمت معالجة خلايا Jeko-1 المزروعة إما في ثقافة معلقة (2D) أو في شرائح هيدروجيل (3D) بعقار العلاج الكيميائي Doxorubicin ، وهو جزء من العلاج القياسي لمرضى MCL24. تم الحفاظ على الهيكل العام لشرائح الهيدروجيل أثناء معالجة دوكسوروبيسين (الشكل 3أ). انخفضت صلاحية خلايا Jeko-1 المزروعة في شرائح هيدروجيل اعتمادا على الجرعة استجابة لعلاج دوكسوروبيسين. تمت زيادة IC50 من دوكسوروبيسين في خلايا Jeko-1 عندما تمت زراعة الخلايا في شرائح هيدروجيل (IC50 = 5.8 ميكرومتر) مقارنة بخلايا Jeko-1 المزروعة في ثقافة معلق ثنائية الأبعاد (IC50 = 2.0μM ؛ الشكل 3 ب). أظهر التصوير الفلوري الحي بأربعة ألوان انخفاض TMRM وزيادة إشارة PicoGreen في خلايا Jeko-1 المزروعة في شرائح هيدروجيل استجابة لعلاج Doxorubicin ، مما يؤكد انخفاض الجدوى الناجم عن العلاج. تم إعادة بناء الصور التي تم الحصول عليها من التصوير الفلوري الحي بأربعة ألوان ثلاثية الأبعاد ، وتم تجزئتها بناء على إشارة نوى DRAQ5 ، وتحليلها باستخدام برنامج Python Script الموضح في الملف التكميلي 1. يظهر قناع تجزئة نموذجي في الشكل التكميلي 1. تم استخدام رقم الخلية المحدد من إشارة DRAQ5 لتحديد الرقم الإجمالي للخلية. تم استخدام رقم الخلية الإيجابي لنشاط TMRM و PicoGreen و Caspase-3 لتحديد النسبة المئوية للخلايا القابلة للحياة أو الميتة أو المبردة ، على التوالي. أظهرت التقديرات الكمية للتلوين الفلوري الحي بأربعة ألوان لخلايا Jeko-1 المزروعة في شرائح هيدروجيل لمدة 3 أيام مع أو بدون 9 ميكرومتر دوكسوروبيسين قابلية قابلة للمقارنة مع مقايسة استبعاد التربان الأزرق (الجدول 2).

بالإضافة إلى خطوط خلايا MCL الراسخة ، تمت زراعة خلايا MCL الأولية لثلاثة مرضى مختلفين من MCL إما في مزرعة معلقة ثنائية الأبعاد أو في شرائح هيدروجيل ثلاثية الأبعاد (الشكل 4 ، الشكل التكميلي 2). كما تم التحقق منه من قبل أخصائي علم الأمراض ، كانت جميع MCLs الثلاثة (المريض 1-3) من التشكل الكلاسيكي / المشترك مع مؤشرات Ki67 من 20٪ -50٪. تضمنت خلايا MCL الأولية جميع أنواع الخلايا المعزولة من الغدد الليمفاوية لمريض MCL ، وبالتالي لا تحتوي على خلايا MCL فحسب ، بل تحتوي أيضا على أنواع أخرى من الخلايا المناعية أو الخلايا اللحمية. تم تقييم جدوى شرائح هيدروجيل MCL الأولية من خلال مقايسة استبعاد التريبان الأزرق. بعد 4 أيام من الثقافة ، حافظت خلايا MCL الأولية في شرائح هيدروجيل على قابلية حياة بنسبة 43.6٪ (45.7٪ في اليوم 3) مقارنة بقابلية البقاء الأساسية البالغة 71.0٪ قبل الطباعة (الشكل 4 أ). يمثل هذا زيادة في البقاء مقارنة بالخلايا المزروعة في التعليق (2D) ، والتي كان لها بقاء بنسبة 19.6٪ بعد أربعة أيام من الثقافة (28.4٪ في اليوم 3). تم تصور هذه الجدوى من خلال التصوير الفلوري الحي بأربعة ألوان ، حيث كانت معظم الخلايا إيجابية TMRM وقابلة للحياة ، بينما كانت مجموعة سكانية فرعية إيجابية لنشاط Caspase-3 و PicoGreen ، مما يشير إلى موت الخلايا المبرمج وموت الخلايا ، على التوالي (الشكل 4 ب). وترد بيانات القياس الكمي في الشكل 4 باء في الجدول 2. أظهرت الخلايا الأولية من اثنين آخرين من مرضى MCL زيادة في بقاء الخلايا عند زراعتها في شرائح الهيدروجيل (3D) مقارنة بثقافة التعليق ثنائية الأبعاد المعنية (الشكل التكميلي 1).

figure-results-1
الشكل 1: سير عمل الطباعة ثلاثية الأبعاد لشرائح ورم الهيدروجيل . (أ) سير عمل الطباعة ثلاثية الأبعاد وزراعة الخلايا في شرائح ورم هيدروجيل. (ب) إعداد الطابعة المستخدم للطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد لشرائح الهيدروجيل في حمام دعم الجيلاتين. (ج) طباعة مخطط في برنامج الطابعة ثلاثية الأبعاد. تمت طباعة ما يصل إلى خمس شرائح هيدروجيل في وقت واحد. (د) التمثيل التخطيطي لثقافة شرائح الهيدروجيل. تمت زراعة شرائح الهيدروجيل على دعامة مرشح في صفيحة مكونة من 6 آبار. تمت إضافة قطرة من الوسط فوق كل شريحة هيدروجيل للحفاظ على رطوبتها. يمكن زراعة ما يصل إلى خمس شرائح هيدروجيل على دعامة مرشح واحدة. (ه) شرائح هيدروجيل مطبوعة ثلاثية الأبعاد مزروعة على دعامة مرشح ، كما هو موضح في صورة عامة أو من خلال الصور المقربة. تمثل قضبان المقياس 5 مم أو 1 مم أو 200 ميكرومتر كما هو موضح. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: ثقافة خط خلايا سرطان الغدد الليمفاوية لخلايا الوشاح (MCL) في شرائح هيدروجيل مطبوعة ثلاثية الأبعاد.(أ) لقطة مقربة لشريحة هيدروجيل تمثيلية تحتوي على خط خلايا MCL Jeko-1 بعد الطباعة (d0) أو بعد 3 أيام من الاستزراع (d3). يمثل شريط المقياس 1 مم. (ب) جدوى خلايا Jeko-1 المزروعة في معلق (2D) أو في شرائح هيدروجيل (3D) لمدة يومين كما تم تقييمها بواسطة مقايسة استبعاد التريبان الأزرق. يظهر متوسط ± SD لثلاث تجارب طباعة حيوية مستقلة. (ج) رقم خلية Jeko-1 الموجود في كل شريحة هيدروجيل مباشرة بعد الطباعة (d0) أو بعد ما يصل إلى 3 أيام من الاستزراع (d1-d3). يظهر متوسط ± SD لثلاث تجارب طباعة حيوية مستقلة. لم يلاحظ أي فرق يعتد به إحصائيا (n.s. ، ص > 0.05 ، اختبار مان ويتني). (د) إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لشرائح هيدروجيل جيكو -1 في يوم الطباعة (د0) أو بعد 3 أيام من الاستزراع (د3). تم إنشاء النموذج من أكوام z للتصوير الفلوري ثلاثي الأبعاد الحي بأربعة ألوان. تظهر الخلايا الحية باللون الأحمر (TMRM) ، والخلايا المبرمج باللون الأصفر (النشاط الأنزيمي Caspase-3) ، والخلايا الميتة باللون الأخضر (PicoGreen) ، والنوى باللون الأزرق (DRAQ5). يمثل شريط المقياس 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: العلاج الدوائي لخط خلايا سرطان الغدد الليمفاوية لخلايا الوشاح (MCL) في شرائح هيدروجيل. (أ) لقطة مقربة لشريحة هيدروجيل تمثيلية تحتوي على خط خلايا MCL Jeko-1 المعالج ب 3 ميكرومولار دوكسوروبيسين لمدة 3 أيام (d3). يمثل شريط المقياس 1 مم. (ب) تمت معالجة خلايا Jeko-1 المزروعة في معلق (2D) أو في شرائح هيدروجيل (3D) بتركيزات متزايدة من عامل العلاج الكيميائي Doxorubicin لمدة يومين. تم تقييم صلاحية الخلايا من خلال مقايسة استبعاد التريبان الأزرق. يظهر متوسط ± SD لأربع تجارب طباعة حيوية مستقلة. (ج) إعادة بناء ثلاثي الأبعاد لشرائح هيدروجيل جيكو -1 المعالجة ب 9 ميكرومتر دوكسوروبيسين (دوكسو) لمدة 3 أيام (د 3). تم إنشاء النموذج من أكوام z للتصوير الفلوري ثلاثي الأبعاد الحي بأربعة ألوان. تظهر الخلايا الحية باللون الأحمر (TMRM) ، والخلايا المبرمج باللون الأصفر (النشاط الأنزيمي Caspase-3) ، والخلايا الميتة باللون الأخضر (PicoGreen) ، والنوى باللون الأزرق (DRAQ5). يمثل شريط المقياس 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: ثقافة خلايا MCL الأولية في شرائح هيدروجيل مطبوعة ثلاثية الأبعاد. (أ) جدوى خلايا MCL الأولية المزروعة في تعليق (2D) أو في شرائح هيدروجيل (3D) لمدة تصل إلى 4 أيام ، كما تم تقييمها بواسطة مقايسة استبعاد التربان الأزرق. يظهر متوسط جدوى تجربة واحدة. (ب) إعادة بناء ثلاثي الأبعاد لخلايا MCL الأولية المزروعة في شرائح هيدروجيل (3D) لمدة 3 أيام. تم إنشاء مكدسات Z من شرائح هيدروجيل ملطخة بتلطيخ حي بأربعة ألوان وتم تحليلها باستخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر (CLSM). تظهر الخلايا الحية باللون الأحمر (TMRM) ، والخلايا المبرمج باللون الأصفر (النشاط الأنزيمي Caspase-3) ، والخلايا الميتة باللون الأخضر (PicoGreen) ، والنوى باللون الأزرق (DRAQ5). يمثل شريط المقياس 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

وصمه عارTMRMدرQ5ركيزة NucView405 Caspase-3بيكو جرين
الإثارة / الانبعاث548 نيوتن متر/574 نيوتن متر647 نيوتن متر / 681 نيوتن متر429 نيوتن متر / 469 نيوتن متر488 نيوتن متر / 520 نيوتن متر

الجدول 1: الحد الأقصى للإثارة / الانبعاث للبقع المستخدمة في التصوير الفلوري ثلاثي الأبعاد الحي بأربعة ألوان.

عينة٪ من الخلايا
TMRM (الخلايا القابلة للحياة)PicoGreen (الخلايا الميتة)Caspase-3 (الخلايا المبرمج)
جيكو -1 Ctrl8323.618.3
جيكو -1 دوكسو 9 ميكرومتر27.681.386.6
مريض MCL الأولي 175.231.133.1

الجدول 2: القياس الكمي لإعادة البناء ثلاثية الأبعاد للتلطيخ الحي بأربعة ألوان لشرائح ورم الهيدروجيل المزروعة. تمت زراعة شرائح ورم الهيدروجيل لمدة 3 أيام واحتوت على خلايا Jeko-1 المزروعة مع أو بدون علاج ب 9 ميكرومولار دوكسوروبيسين أو خلايا MCL الأولية (المريض 1).

الشكل التكميلي 1: تحديد الخلية من إعادة البناء ثلاثية الأبعاد للتلطيخ الحي بأربعة ألوان. إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للصورة متحد البؤر المسماة ب DRAQ5 تم الحصول عليها من (أ) تلطيخ حي بأربعة ألوان و (ب) صورة مجزأة على هذه القناة تم إنشاؤها باستخدام خط أنابيب تحليل التصوير Python. يمثل شريط المقياس 200 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الشكل.

التكميلي Figure 2: ثقافة خلايا MCL الأولية للمرضى 2 و 3 في شرائح ورم هيدروجيل . جدوى خلايا MCL الأولية ل (أ) المريض 2 أو (ب) المريض 3 المزروع في معلق (2D) أو في شرائح هيدروجيل (3D) لمدة تصل إلى 4 أيام كما تم تقييمه بواسطة مقايسة استبعاد التربان الأزرق. يظهر متوسط جدوى تجربة واحدة. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الرقم.

الملف التكميلي 1: تعليمات لتحليل عمليات إعادة البناء ثلاثية الأبعاد التي تم الحصول عليها من تلطيخ حي بأربعة ألوان. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: برنامج نصي بايثون لتحليل عمليات إعادة البناء ثلاثية الأبعاد التي تم الحصول عليها من تلطيخ حي بأربعة ألوان. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الترميز التكميلي File 1: Stl. ملف يحتوي على مخطط شرائح ورم الهيدروجيل. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

تقدم شرائح ورم الهيدروجيل الموضحة في هذا البروتوكول نموذج MCL الذي يحاكي بنية العقدة الليمفاوية ، مما يسمح بدراسة بقاء خلايا MCL والاستجابة للأدوية في بيئة مكروية للورم ثلاثي الأبعاد ناتجة عن الطباعة الحيوية.

تعتمد طرق الطباعة الحيوية الأكثر استخداما على البثق ، حيث يتم إخراج الحبر الحيوي من خلال نظام الاستغناء. في الطباعة النافثة للحبر ، على سبيل المثال ، يتم ربط الأحبار الحيوية بسرعة بعد الترسيب لتشكيل هياكل ثلاثية الأبعاد25. ومع ذلك ، فإن هذا النهج يأتي مع قيود ، لا سيما من حيث لزوجة المواد المستخدمة والقدرة على تكديس الطبقات. في المقابل ، تطبق الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد القائمة على المحقنة ، مثل الطباعة الحيوية FRESH المستخدمة في هذا البروتوكول ، نهج الهلام في الجل. يسمح ذلك بطباعة الأحبار الحيوية منخفضة اللزوجة ، مثل الكولاجين ، في تركيبات مستقرة ، مما يجعل من الممكن تقليد البيئة المكروية المعقدة للورم20،26. في حين أن الطابعات ثلاثية الأبعاد التي تم تطويرها خصيصا للطباعة الحيوية يمكن أن تكون باهظة الثمن ، إلا أن الطريقة المعروضة هنا توفر نقطة دخول يسهل الوصول إليها. يمكن تكييفه مع طابعات البثق القياسية مع تعديلات بسيطة نسبيا. يمكن طباعة هذه التعديلات ثلاثية الأبعاد بخيوط ميسورة التكلفة ، وتتوفر التصميمات كموارد مفتوحة المصدر ، على سبيل المثال ، بواسطة Hinton et al.20. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن تحضير حمام دعم الهيدروجيل للطباعة الحيوية FRESH حساس للغاية لدرجة الحرارة ويتطلب عناية دقيقة أثناء تحضير الملاط.

في كثير من الأحيان ، يتم زراعة نماذج الأورام المطبوعة ثلاثية الأبعاد في أنظمة عائمة ، تفتقر إلى تدرج الأكسجين في الجسم الحي 25 ، أو في مزارع رقائق الموائعالدقيقة 27 ، والتي تلتقط درجة عالية من التعقيد ولكن لها إنتاجية منخفضة وتتطلب صيانة عالية. يمكن التغلب على هذه العقبات بشرائح ورم الهيدروجيل الموضحة هنا. إن إعداد زراعة ما يصل إلى خمس شرائح من ورم الهيدروجيل على واجهة الهواء والسائل مشتق من ثقافة شرائح الورم المقطوعة بدقة للأورام الصلبة28. يتكون غشاء دعامة المرشح المستخدم في هذا البروتوكول من غشاء بولي تترافلورو إيثيلين (PFTE) بحجم مسام 0.4 ميكرومتر ، مما يسمح بتبادل المغذيات ولكنه يمنع الارتباط الخلوي أو هجرة الخلايا29. توفر الثقافة الموجودة على غشاء PTFE الدعم المادي للشرائح للحفاظ على ثباتها ومنعها من التمزق أو التفكك. بالإضافة إلى ذلك ، فإنها توفر واجهة هواء سائل ، توفر الأكسجين بشكل أساسي من الهواء أعلاه والمواد المغذية من الوسط الموجود أسفل المرشح30. وبالتالي ، يشتمل النظام على اختلافات زمانية مكانية في إمدادات المغذيات ، وتكاثر الخلايا ، والأكسجين ، كما قد تحدث في الجسم الحي25. استزرعت خلايا MCL الأولية في شرائح ورم الهيدروجيل على دعامة المرشح ، وحافظت على قابلية البقاء لأكثر من 40٪ لمدة 4 أيام ، والتي كانت متفوقة على الجدوى التي لوحظت في ثقافة التعليق ثنائية الأبعاد (الشكل 3 أ ، الشكل التكميلي 2). يجب أن تتناول المزيد من التحقيقات ما إذا كان يمكن تحقيق قابلية البقاء لفترات طويلة عن طريق إضافة السيتوكينات أو الزراعة المشتركة مع الخلايا الليفية التي تعبر عن CD40L ، كما تم وصفها في الكرويات والعضيات لورم سرطان الغدد الليمفاوية الأولي للخلايا البائية6،19،30 أو المزارع المشتركة لخلايا MCL الأولية مع خلايا الخلايا الليفية L التي تعبر عن CD40L14. يجب مراعاة دمج مثل هذه الأساليب في شرائح ورم الهيدروجيل لتعزيز ثقافة خلايا MCL الأولية بالإضافة إلى التشابه مع البيئة المكروية الأصلية.

تحتوي الغدد الليمفاوية على شبكة متطورة من ألياف المصفوفة خارج الخلية. بسبب نمطها ، تعرف باسم الألياف الشبكية. تتكون هذه الألياف بشكل أساسي من الكولاجين ومكونات خاصة بغشاء الطابق السفلي31،32،33. لإنشاء مصفوفة تشبه الحالة في الجسم الحي في الغدد الليمفاوية ، يتكون الحبر الحيوي المستخدم لتوليد شرائح ورم الهيدروجيل من الكولاجين من النوع الأول و Matrigel ، والذي يتكون من بروتينات ECM الغشائية القاعدية الأربعة لامينين والكولاجين الرابع والإنتاكتين والبيرليكان34. علاوة على ذلك ، يضاف الجينات إلى الحبر الحيوي لتثبيت شرائح ورم الهيدروجيل ، مما يسمح بزراعة طويلة الأمد والنقل من وعاء إلى آخر باستخدام ملعقة. أظهر اختبار الهلاميات المائية المختلفة التي تحتوي على الكولاجين والألجينات أعلى قابلية للحياة الخلوية مع شريحة هيدروجيل مستقرة ومتينة عند استخدام حبر حيوي يحتوي على 0.5٪ ألجينات و 20٪ كولاجين (البيانات غير معروضة). إلى جانب المكونات ، فإن قطر شريحة ورم الهيدروجيل البالغ 0.8 سم يشبه متوسط قطر العقدة الليمفاوية البالغ 1 سم35. أظهر التصوير ثلاثي الأبعاد الحي لشرائح ورم الهيدروجيل أيضا توزيعا متساويا للخلايا (الشكل 2 ج).

هنا ، تم عرض القدرة على معالجة شرائح الهيدروجيل بالأدوية من خلال العلاج بالدوكسوروبيسين ، وهو جزء من علاج R-CHOP (ريتوكسيماب ، سيكلوفوسفاميد ، دوكسوروبيسين ، فينكريستين ، بريدنيزون) ، وهو علاج قياسي للرعاية للمجموعات الفرعية24 لمرضى MCL الأكبر سنا. بالمقارنة مع الثقافات ثنائية الأبعاد ، يمكن دراسة تأثيرات البيئة المكروية للورم على تأثيرات العلاج في شرائح ورم الهيدروجيل. كما هو موضح في الشكل 3 ، كانت خلايا Jeko-1 المزروعة في شرائح هيدروجيل أكثر مقاومة لعلاج دوكسوروبيسين من الخلايا المزروعة ثنائية الأبعاد. يتماشى هذا مع الملاحظات التي تفيد بأن المصفوفة خارج الخلية يمكن أن تؤثر على استجابات الأدوية وتعزز مقاومة الأدوية بشكل متكرر من خلال تعديل تصلب الورم36 ، والاتصال الخلويالخلوي 37 ، وتوصيل الدواء38. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يعطي تحليل التدفق الخلوي ، بالإضافة إلى تلطيخ التألق المناعي المناعي أو متعدد الإرسال ، رؤى أعمق حول استجابة العلاج للخلايا المفردة في شرائح ورم الهيدروجيل.

في الختام ، يصف هذا البروتوكول توليد وزراعة شرائح ورم الهيدروجيل ، والتي تمثل نموذج العقدة الليمفاوية ثلاثية الأبعاد يحاكي بنية العقدة الليمفاوية ثلاثية الأبعاد الأصلية. لديها القدرة على توسيع التطبيق من خلايا MCL إلى مؤشرات سرطان الغدد الليمفاوية الأولية الأخرى.

الإفصاحات

تم دعم هذه الدراسة من قبل مؤسسة روبرت بوش ووزارة العلوم والبحث والفنون في بادن فورتمبيرغ (3R-Network BW).

شكر وتقدير

نشكر كيرستين ويليك على مساعدتها الفنية الممتازة ويانغ تشانغ على مساعدته القيمة في تحليل الصور ثلاثية الأبعاد.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
µ-slide 8 بئر قاع زجاجيibidi GmbH80827شرائح قاع زجاجية تستخدم للتصوير المباشر لشرائح هيدروجيل
10x PBSكارل روث GmbH + Co.KG9150.1مكون الحبر الحيوي
10X RPMI-1640 متوسطسيجما ألدريتشراند 1145مكون الحبر الحيوي
2.5 مل حقنة مانعة للغلق موديل 1002 TLLهاملتون81420حقنة للطباعة الحيوية
طابعة بثق ثلاثية الأبعاد ، PrintrBot بسيطروبوت الطباعةتعديل ذاتي للسماح بطباعة الأحبار الحيوية
لوحة 6 بئرTh. Geyer GmbH & Co.KG7696790ثقافة شرائح الهيدروجيل
أنظمة ترشيح الفراغ العلوي للزجاجة ، غشاء PES ، 500 مل ، 0.22 & م حجم المسام ، 70   ؛ غشاء قطر ممشركة كورنينج513-3355الترشيح المعقم للمخازن المؤقتة
كلوريد الكالسيوم يجفكارل روث GmbH + Co.KGتي 885.2مكون من عازلة الغسيل وملاط الجيلاتين
الكولاجين الأول من الفئرانشركة كورنينجCLS354249مكون الحبر الحيوي
برنامج Cura الإصدار 15.04.5 للطباعة ثلاثية الأبعادألتيميكرالبرامج المستخدمة للطباعة ثلاثية الأبعاد
درQ5بيوستيشن المحدودةDR50050وصمة عار للتصوير الحي لشرائح الهيدروجيل
حمض الإيثيلين أمينرتيتراأسيتيك (EDTA) ثنائي هيدرات الملح ثنائي الصوديومسيجما ألدريتشإ5134مكون من المخزن المؤقت لإذابة الجينات
عداد الخلايا الأوتوماتيكي EVEشركة نانو إنتيك10027-452عداد الخلية
أطباق بتري فالكون بكتريولوجية بغطاء ، قطر 35 ممصقر351008مملوءة بملاط الجيلاتين لتشكيل حمام الدعم للطباعة الحيوية
أنابيب الصقر ، 50 ملسارستيدت إيه جي & Co.KG62.547.254
مصل ربلة الساق الجنينيةسيجما ألدريتشس 0615مكمل متوسط زراعة الخلايا
الجيلاتين من جلد الخنزيرسيجما ألدريتشجي 1890المكون الرئيسي لملاط الجيلاتين
HEPES ، حمض حر ، درجة البيولوجيا الجزيئيةميرك KGaAسجل المستخلصات المحفوظة 7365-45-9مكون من عازلة الغسيل وملاط الجيلاتين
خط خلية Jeko-1 MCLATCCCRL-3006خط خلية MCL
مناديل KIMTECH العلوم الدقيقةشركة كيمبرلي كلارك7551يستخدم لسحب الماء الزائد من ملاط الجيلاتين وإزالة القطرات من فوهة الطابعة ثلاثية الأبعاد
برنامج LAS X الإصدار 3.5.7.23225لايكاالبرامج المستخدمة لإعادة البناء ثلاثية الأبعاد
مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر Leica TCS SP8لايكاTCS SP8مجهر متحد البؤر للتصوير الحي
ميسون جار نصف لتر عادي 16 أونصةشركة الكرةجي 001جرة يتم فيها تحضير ملاط الجيلاتين
مصفوفة غشاء الطابق السفلي لعامل نمو المواد المخفضة (GFR)شركة كورنينج356231مكون الحبر الحيوي
إدراج ثقافة الخلايا مليخلية ، 0.4 µ ؛ م حجم المسامميرك KGaAبيكمورغ 50دعم مرشح شرائح الهيدروجيل
ركيزة NucView 405 Caspase-3 ، 1 ملي مولار في 1x PBSالبيوتيوم10405وصمة عار للتصوير الحي لشرائح الهيدروجيل
خلاط سلسلة أوستر بروفيشنالاوسترBPST02-B00خلاط لتوليد ملاط الجيلاتين
البنسلين / الستربتامايسينجيبكو15140163مكمل غذائي لوسط زراعة الخلايا MCL
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay-Kits und dsDNA-Reagenzienإنفيتروجينص 7589وصمة عار للتصوير الحي لشرائح الهيدروجيل
روتينا 35 صهيتيتش24573الطرد المركزي للخلايا
جهاز طرد مركزي ROTINA 38 / 38RهيتيتشZ720109الطرد المركزي لملاط الجيلاتين
RPMI-1640 + جلوتاماكسجيبكو61870036قاعدة وسط الثقافة لخلايا MCL
ألجينات الصوديومتعاون FMCGQ9109901مكون الحبر الحيوي
كلوريد الصوديومميرك KGaA1.06404مكون من المخزن المؤقت لإذابة الجينات
سترات الصوديومكارل روث GmbH + Co.KG3580.1مكون من المخزن المؤقت لإذابة الجينات
قنيات تطبيق Sterican الحادة 21G 0.8x22 ممب. براون9180109فوهة للطباعة ثلاثية الأبعاد
رباعي ميثيل رودامين-ميثيلستر-بيركلورات (TMRM)سيجما ألدريتشتي 5428وصمة عار للتصوير الحي لشرائح الهيدروجيل
أزرق تريبان ، 0.4٪سيجما ألدريتشتي 8154وصمة عار لتحليل الجدوى
ميزان حرارة مقاوم للماءVWR620-2099ميزان حرارة لمراقبة درجة حرارة ملاط الجيلاتين

المراجع

  1. Jain, P., Wang, M. L. Mantle cell lymphoma in 2022-a comprehensive update on molecular pathogenesis, risk stratification, clinical approach, and current and novel treatments. Am J Hematol. 97 (5), 638-656 (2022).
  2. Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: State of the art. Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 61-86 (2008).
  3. Wen, T., Wang, J., Shi, Y., Qian, H., Liu, P. Inhibitors targeting Bruton's tyrosine kinase in cancers: Drug development advances. Leukemia. 35 (2), 312-332 (2021).
  4. Lee, H. J., et al. Phase 1/2 study of zilovertamab and ibrutinib in mantle cell lymphoma (mcl) or chronic lymphocytic leukemia (cll). J Clin Oncol. 40 (16_suppl), 7520(2022).
  5. Roué, G., Sola, B. Management of drug resistance in mantle cell lymphoma. Cancers. 12 (6), 1565(2020).
  6. Araujo-Ayala, F., et al. A novel patient-derived 3d model recapitulates mantle cell lymphoma lymph node signaling, immune profile, and in vivo ibrutinib responses. Leukemia. 37 (6), 1311-1323 (2023).
  7. Bryant, J., et al. Development of intermediate-grade (mantle cell) and low-grade (small lymphocytic and marginal zone) human non-Hodgkin's lymphomas xenotransplanted in severe combined immunodeficiency mouse models. Lab Invest. 80 (4), 557-573 (2000).
  8. Andersen, T., Auk-Emblem, P., Dornish, M. 3d cell culture in alginate hydrogels. Microarrays. 4 (2), 133-161 (2015).
  9. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  10. Jubelin, C., et al. Three-dimensional in vitro culture models in oncology research. Cell Biosci. 12 (1), 155(2022).
  11. Hickman, J. A., et al. Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo. Biotechnol J. 9 (9), 1115-1128 (2014).
  12. Rossi, M., Alviano, F., Righi, S., Sabattini, E., Agostinelli, C. Three-dimensional models: A novel approach for lymphoma research. J Cancer Res Clin Oncol. 148 (4), 753-765 (2022).
  13. Saba, N. S., et al. Pathogenic role of B-cell receptor signaling and canonical nf-κb activation in mantle cell lymphoma. Blood. 128 (1), 82-92 (2016).
  14. Chiron, D., et al. Rational targeted therapies to overcome microenvironment-dependent expansion of mantle cell lymphoma. Blood. 128 (24), 2808-2818 (2016).
  15. Nylund, P., Nikkarinen, A., Ek, S., Glimelius, I. Empowering macrophages: The cancer fighters within the tumour microenvironment in mantle cell lymphoma. Front Immunol. 15, 1373269(2024).
  16. Nygren, L., et al. T-cell levels are prognostic in mantle cell lymphoma. Clin Cancer Res. 20 (23), 6096-6104 (2014).
  17. Medina, D. J., et al. Mesenchymal stromal cells protect mantle cell lymphoma cells from spontaneous and drug-induced apoptosis through secretion of b-cell activating factor and activation of the canonical and non-canonical nuclear factor κb pathways. Haematologica. 97 (8), 1255-1263 (2012).
  18. Jindal, U., et al. Targeting cers6-as1/fgfr1 axis as synthetic vulnerability to constrain stromal cells supported proliferation in mantle cell lymphoma. Leukemia. 38 (10), 2196-2209 (2024).
  19. Nie, L., et al. Establishment of a patient-derived organoid culture platform for mantle cell lymphoma drug sensitivity and car t cell anti-tumor activity assay. Blood. 140 (Supplement 1), 9219-9220 (2022).
  20. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Sci Adv. 1 (9), e1500758(2015).
  21. Van Der Kuip, H., et al. Short-term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug Taxol in an intact tumor environment. BMC Cancer. 6 (1), 86(2006).
  22. Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J. 76 (1), 469-477 (1999).
  23. Porter, A. G., Jänicke, R. U. Emerging roles of caspase-3 in apoptosis. Cell Death Differentiat. 6 (2), 99-104 (1999).
  24. Huseynov, V. Treatment of mantle cell lymphoma in transplant non-eligible patients. Hematol Transfus Cell Ther. 44, S2-S3 (2022).
  25. Augustine, R., et al. 3d bioprinted cancer models: Revolutionizing personalized cancer therapy. Transl Oncol. 14 (4), 101015(2021).
  26. Budharaju, H., Sundaramurthi, D., Sethuraman, S. Embedded 3d bioprinting – an emerging strategy to fabricate biomimetic & large vascularized tissue constructs. Bioact Mater. 32, 356-384 (2024).
  27. Seaman, K., Sun, Y., You, L. Recent advances in cancer-on-a-chip tissue models to dissect the tumour microenvironment. Med-X. 1 (1), 11(2023).
  28. Davies, E. J., et al. Capturing complex tumour biology in vitro: Histological and molecular characterisation of precision cut slices. Sci Rep. 5 (1), 17187(2015).
  29. Millipore PICM03050: Millicell Standing Cell Culture Inserts Data Sheet. , Merck KGaA. Darmstadt, Germany. (2025).
  30. Lamaison, C., et al. A novel 3d culture model recapitulates primary fl b-cell features and promotes their survival. Blood Adv. 5 (23), 5372-5386 (2021).
  31. Kramer, R. H., Rosen, S. D., McDonald, K. A. Basement-membrane components associated with the extracellular matrix of the lymph node. Cell Tissue Res. 252 (2), 367-375 (1988).
  32. Kaldjian, E. P., Gretz, J. E., Anderson, A. O., Shi, Y., Shaw, S. Spatial and molecular organization of lymph node T cell cortex: A labyrinthine cavity bounded by an epithelium-like monolayer of fibroblastic reticular cells anchored to basement membrane-like extracellular matrix. Int Immunol. 13 (10), 1243-1253 (2001).
  33. German, S. V., et al. Plug-and-play lymph node-on-chip: Secondary tumor modeling by the combination of cell spheroid, collagen sponge, and T-cells. Int J Mol Sci. 24 (4), 3183(2023).
  34. Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: From discovery and ecm mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliver Rev. 79-80, 3-18 (2014).
  35. Ogassavara, B., Tucunduva Neto, R. R., De Souza, R. R., Tucunduva, M. J. Ultrasound evaluation of the morphometric patterns of lymph nodes of the head and neck in young and middle-aged individuals. Radiol Brasileira. 49 (4), 225-228 (2016).
  36. Huang, J., et al. Extracellular matrix and its therapeutic potential for cancer treatment. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 1-24 (2021).
  37. Subrahmanyam, N., Ghandehari, H. Harnessing extracellular matrix biology for tumor drug delivery. J Personalized Med. 11 (2), 88(2021).
  38. Ahmad, V. Prospective of extracellular matrix and drug correlations in disease management. Asian J Pharma Sci. 16 (2), 147-160 (2021).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

MCL
الطباعة الحيوية لشرائح ورم الهيدروجيل كنموذج ثلاثي الأبعاد لسرطان الغدد الليمفاوية لخلايا الوشاح
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.