Method Article

التصوير الحي وتوصيف ديناميكيات الخلايا الدبقية الصغيرة والتفاعلات مع المشابك في شبكية الفأر المريضة

DOI:

10.3791/68420

⸱

January 16th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University of California, San Francisco, 2Jules Stein Eye Institute, University of California, Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه الورقة طريقة لتصوير وقياس حركة الخلايا الدبقية الصغيرة وتلامسها مع النقاط بعد المشبكية في الشبكية باستخدام المجهر الكونفوكالي الدوار للقرص الدواري.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الدبقية الصغيرة هي البلعم المقيمة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) التي تستجيب لعدوى الأنسجة والإصابات. بالإضافة إلى دورها في الالتهاب، تلعب الخلايا الدبقية الصغيرة دورا تطويا في تحسين الدوائر من خلال تقليم المشبك. ومع ذلك، لا تزال آليات التقليم المشبكي في التهاب الأعصاب والتنكس العصبي غير معروفة. في هذا البروتوكول، نستخدم نموذج إزالة شبكية الفئران لدراسة ديناميكيات الخلايا الدبقية الدقيقة خارج الجسم الحي. لفحص حركة الخلايا الدبقية الصغيرة وتفاعلاتها مع البروتينات بعد المشبكية، نقوم بتصنيف المشابك العصبية ب AAV-PSD95-RFP ونسجل فيديوهات الزمنية لميكروغليا متحركة متزامنة مع بروتينات ما بعد المشبك باستخدام المجهر الكونفوكالي الدوار للقرص. بعد ذلك نقوم بإنشاء إعادة بناء سطحية وبقعية للميكروغليا وPSD95 باستخدام برامج تحليل الصور. يمكن بعد ذلك استخراج بيانات مثل طول إزاحة الخلايا الدبقية الدقيقة، وسرعة العملية، والاتصال مع النقاط بعد المشبكية من هذه الأسطح لفهم سلوك الخلايا الدبقية الصغيرة سواء في الحالات التوازن الداخلي أو بعد إصابة الخلايا العصبية. يمكن أن يكون هذا البروتوكول مفيدا في دراسة دور الخلايا الدبقية الصغيرة في تقليم التشابك العصبي في أمراض تنكس الشبكية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتمد وظيفة الدائرة والتوازن الداخلي على إطلاق المشابك العصبية المنظم بشكل عال وتفاعلات فريدة أخرى بين أنواع الخلايا المختلفة1. تعمل الخلايا الدبقية الصغيرة كبلعم مقيمة في الجهاز العصبي المركزي (CNS)، وهي مجموعة غير عصبية في الشبكية تلعب دورا فريدا في التقليم المشبكي. خلال تطور الجهاز العصبي المركزي، تقوم الخلايا الدبقية الصغيرة بتقليم المشابك العصبية غير الوظيفية أو الضعيفة لصقل الدوائر العصبية2. تفحص الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ النامي بيئتها وتكون مهيأة لدور وقائي عصبي خلال الفترات الحرجة3. في تطور الجهاز البصري، تعد الخلايا الدبقية الصغيرة منظمات رئيسية في تطور الخلايا العصبية القشرية والخلايا الداخلية، بالإضافة إلى إظهار تغيرات شكلية خلال الفترات الحرجة من إعادة تشكيل التشابك العصبي. وبالمثل، في الشبكية النامية، تقوم الخلايا الدبقية الصغيرة بتنظيف الخلايا المايتية لإفساح المجال لاتصالات مشبكية جديدة، وقد تم تأكيده من خلال زيادة تنظيم المؤشر التجانسي P2Ry12 خلال هذه الأحداث التطهيرية5. ومع ذلك، تبرز النتائج الأخيرة أن الخلايا الدبقية الصغيرة قد لا تلعب دورا حسما في تحسين الدوائر العصبيةفي نظام الرؤية المتطور، مما يؤكد وجود جدل حول دور الخلايا الدبقية الصغيرة في تطور الدوائر البصرية.

في سياقات الإصابات، تتغير الخلايا الدبقية الصغيرة إلى الحالة النشطة ويمكن أن تلعب دورا تنكسيا عصبيا. على سبيل المثال، أظهرت الخلايا الدبقية الصغيرة في نماذج مرض الزهايمر زيادة في ابتلاع لويحات الأميلويد-بيتا7 والمؤشرات المشبكية مثل SPH وPSD958. في التنكس العصبي الشبكية، وجدت العديد من المجموعات البحثية وجود دبقية صغيرة تحتوي على مواد مشبكية مبتلعة، لكن لا يوجد دليل واضح على ابتلاع نشط للمشابك العصبيةالسليمة 9,10,11,12,13. على سبيل المثال، وجد هي وآخرون أن عدد الخلايا الدبقية الصغيرة تزداد وتزيد من حجم المادة المشبكية المبتلعة في نموذج التهاب الشبكيةالصباغي 9، لكن ليس من الواضح ما إذا كان هناك بلعمة للمشابك العصبية السليمة مقابل إزالة الحطام. بالإضافة إلى ذلك، فإن التصنيفات التقليدية للميكروغليالي - مثل "مستريحا مقابل مفعل" أو "M1 مقابل M2" - مبسطة بشكل مفرط وغير دقيقة بشكل متزايد بناء على الرؤى الحديثة. توجد الخلايا الدبقية الصغيرة في تدرج من الحالات، وليس في فئات منفصلة12. لذا، دعا باوليتشيلي وآخرون إلى التحول من التصنيفات الثنائية القديمة إلى تسمية أكثر دقة وتحديدا بدقة للحالات الدقيقة الدبقية لفهم وتعريف شكل ونشاط الخلايا الدبقية بشكل أفضل12. لذلك، فإن استراتيجيات تقييم وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة خارج الجسم الحي وفي الجسم الحي ستعزز قدرة المجال على تمييز حالات ونشاط الخلايا الدبقية الصغيرة في كل من التطور وسياقات الأمراض.

بينما توجد استراتيجيات لدراسة وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة خارج الجسم الحي وداخل الجسم الحي، فإن التصوير الحي خارج الجسم الحي له عدة فوائد. أولا، صفاء القرنية أو تطور الساد لن يعيق تصوير الشبكية، مما يخلق تصورا واضحا للعمليات الدقيقة والنقاط المشبكية. علاوة على ذلك، يتطلب التصوير في الجسم الحي مهارة تقنية أكبر للإعداد، مما يجعل تحضيرات خارج الجسم الحي ذات قدرة إنتاجية أعلى، مما يؤدي إلى تصوير المزيد من في كل تجربة. على الرغم من الفوائد النظرية التي قد تسمح بها التصوير الحي، إلا أن قوة الليزر العالية مطلوبة (100-230 ميكروواط) لالتقاط حركة عملية الميكروغليا للتصوير الطولي14,15. ومع ذلك، يمكن للتصوير خارج الجسم للميكروبريا بقوة ليزر أقل ووسائط تصوير كافية أن يوفر نفس جودة التصوير كما في الجسم مع التحضير المناسب، رغم أن النسيج لم يعد في مكانه.

لقد أظهرنا أن الميكروبرجيا تزداد في العدد والتعقيد وحركة العملية بعد ارتفاع الضغط داخل العين العابر(IOP) 10. في الأنسجة الثابتة، يؤدي هذا الدبق الدقيق إلى زيادة التزامن مع البروتينات المشبكية10. أظهرت أبحاث سابقة أيضا فقدان التشابك العصبي المبكر وتنكس التغصنات في خلايا عقدة الشبكية (RGCs) في نموذج ارتفاع ضغط الدم العين الناجم عن ليزر الفأر (LIOH) ونماذج تنكسية عصبيةأخرى 10،16،17،18،19،20. ومع ذلك، لا يزال من غير المعروف ما إذا كانت تلعب دورا نشطا في تقليم المشابك العصبية أم دورا أكثر سلبية في إزالة الحطام الخلوي، بما في ذلك المشابك العصبية المفككة. نظرا لأن تفكيك المشابك العصبية هو علامة مبكرة للتنكس العصبي، فإن فهم ديناميكيات الخلايا الدبقية الصغيرة ودورها في تفكيك المشابكالعصبية أمر بالغ الأهمية. هنا، نستخدم التصوير الحي لفهم ديناميكيات الخلايا الدبقية الصغيرة وتفاعلها مع بروتين الكثافة النشطة بعد المشبكية-95 (PSD95) على التغصنات في الخلايا العصبية المغلقة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كانت تؤوي في جامعة كاليفورنيا، سان فرانسيسكو، تحت دورات ضوء 12 ساعة ضوء و12 ساعة مظلمة، وتعطى الماء والنظام الغذائي القياسي حسب المرض، ما لم يتم تحديده. تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجان رعاية واستخدام المؤسسية في جامعة كاليفورنيا، سان فرانسيسكو. راجع جدول المواد والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول. يظهر الشكل 1 نظرة عامة على الإجراء التجريبي، من الحقن داخل الجسم الزجاجي إلى التصوير والتحليل.

1. إنتاج وكفاءة الفيروسات AAV-PSD95-TagRFP

  1. قم ببناء AAV-PSD95-tagRFP بأخذ تسلسل PSD-95pTagRFP (بلازميد Addgene #52671؛ RRID:Addgene_52671) وإدخاله أسفل منشط CMV في AAV-CMV-GFP بعد إزالة GFP (بلازميد Addgene #67634؛ ريد: Addgene_67634).
  2. تحضير الفيروس باستخدام HEK293T ثلاثي النقل، ونقيه باستخدام PEG/الكلوروفورم، وتركيزه إلى عيار 1012 بوصة/مل (كما هو موصوف في Negrini وآخرون).21.
    ملاحظة: عادة ما تنتج هذه الطريقة إنتاجا أقل من الطرد المركزي فوق السطحي، ولكن في هذه التجارب، من المرغوب فيها وجود خلايا مصابة بشكل متناثر21. كانت نسخة الكبسيد/المصل المستخدمة في هذه التجارب 7m8، (بلازميد Addgene # 64839؛ RRID: Addgene_64839).
    1. اختبر كفاءة جهاز AAV قبل المضي قدما في بروتوكول التصوير الكامل.
      ملاحظة: يجب على القراء الذين يطبقون هذا البروتوكول السعي إلى وضع علامات متفرقة على التغصنات الريجندرية الصغيرة، حيث أن الهدف هو تحديد وعزل التغصنات الفردية لل RGC.
  3. تحقق من نجاح النقل ثم ثبت الشبكية في PFA بنسبة 2٪ في 1x ACSF. بالنسبة للبروتينات المشبكية، تحقق من الإشارة تحت المجهر الكونفوكلي عند 63x للتحقق من وضوح وضوح وسم الفلورية.
    ملاحظة: التركيز الأخف للتثبيت يساعد في الحفاظ على وضع العلامات الخاصة بالبروتينات المشبكية. إذا لم يكن ال AAV المستخدم مخصصا للمكونات المشبكية، يمكن للقراء اختيار استخدام 4٪ PFA بدلا من ذلك.

2. تربية الفئران وحقن AAV-PSD95-TagRFP داخل الجسم الزجاجي

  1. تهجين بين ذكر وإناث فئران ألبينو CD-1 (السلالة 022) مع B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J (سلالة 005582) لإنتاج فئران ألبينو CD-1 مع ميكروبرليا معبرة عن EGFP. انتظر على الأقل أربعة أجيال من التهجين العكسي لاستخدام الفئران الذكور والإناثى Cx3cr1 غير المتجانسة في التجارب. حافظ على السلالة وجددها بعد 10 أجيال مرة أخرى إلى خلفية CD-1 لمنع الانحراف الجيني.
  2. تخدير (P30-P60) باستخدام تخدير إيزوفلوران عبر غرفة تحفيز باستخدام تخدير بنسبة 3-5٪ في الأكسجين مع معدل تدفق 1 لتر/دقيقة من الأكسجين. ضع على ميكروسكوب مجسم، مع التأكد من إعطاء الإيزوفلوران باستمرار عبر مخروط أنف. للتأكد من أن مخدر، اضغط على إصبع القدم على الأقل 3 مرات للتأكد.
  3. أضف قطرة بروباراكاين بنسبة 0.5٪ قبل حقن ال AAV. حقن 2 ميكرولتر من AAV-PSD95-RFP ببطء داخل العينين عند الطرف العلوي الصدغي باستخدام حقنة 26s G بسعة 10 ميكرولتر. قم بإزالة الإبرة ببطء لمنع ارتداد تدفق الحمض النووي عبر موقع الحقن. ضع مرهم مضاد حيوي على العينين بعد الحقن.
  4. ملاحظة: يجب ألا تتجاوز الإبرة نصف محيط غرفة الجسم الزجاجي. وبذلك، يمكن أن تتلف الشبكية والعدسة بطرف الإبرة، مما يؤدي إلى تقطع غير متقطعة أو حتى غير ناجحة. تطور الماء الأبيض أو النزيف هو مؤشر على تقنية حقن خاطئة.
  5. بعد الحقن، تأكد من أن في حالة تأهب قبل إعادتها إلى أقفاصها الأصلية وغرف السكن. إذا شعر بألم بعد الحقن، أعط البوبرينورفين عن طريق الحقن داخل الصفاق. انتظر 3 أسابيع حتى تظهر حالة التعابير الجنائية (AAV). إذا تم استخدام نموذج محفز لرفع الضغط داخل العين (أو إجراء تلاعبات أخرى)، انتظر 3 أسابيع قبل تحفيز ضغط داخل العين مرتفع في إحدى العين، باستخدام العين المقابلة أو عيون ساذج كوسيلة تحكم.

3. القتل الرحيم وتثبيت الشبكية بشكل مسطح

  1. حضر محلول طازج 1x من السائل الدماغي الشوكي الصناعي (ACSF، pH 7.4) في 1x PBS يحتوي على المكونات التالية في ملليمتر: 119 NaCl، 2.5 KCl، 1.3 MgCl 2.6H 2O، 2.5 CaCl 2.2H2O، 1 NaHPO4، 11 جلوكوز، و20 HEPES.
  2. قم بأكسجين المحلول لمدة لا تقل عن 15 دقيقة قبل استخدامه للتشريح الحاد. اربط الأنبوب بخزان أكسجين، وضع غطاء به فتحة في المنتصف لمنع تسرب الغاز.
  3. قم بقتل الفأر بتخدير إيزوفلوران على الأقل 1 مل في غرفة تحفيز صغيرة، يليه خلع عنقي. ضع علامة على الجانب الأنفي من القرنية بقلم تحديد قبل إزالة العينات حتى يمكن تتبع موقع الشبكية طوال فترة التجربة.
    1. لإزالة العين التي تحقن بالميكروب أو بالليزر، قم بإجراء عملية بطيئة محيطية محدودة في الملتحمة وضع المقص خلف العين لتشريح العين عند قاعدة العصب البصري. وهذا يسمح للعين الرقيقة بالبقاء سليمة.
  4. باستخدام مجهر تشريح، قم بعمل ثقب صغير بإبرة 23 أو 25 جيلون في القرنية، مما يسمح لأنبوب ACSF المؤكسج بتدفق العين للعين. أدخل مقصا في هذه الفتحة لعمل قطع ائتماني عند نهاية الأنف.
  5. اقطع بقية القرنية وقزحية القرنية عند الليمبوس.
  6. أزل القزحية والعدسة. إذا كانت الشبكية ملتصقة بالعدسة، افصلها باستخدام الملقط.
  7. افصل الشبكية عن الصلبة باستخدام الملقط لتشريح لطيف بين ال RPE والشبكية العصبية.
  8. ضع الشبكية على الجانب غير الشبكي من ورق ترشيح غشائي من إستر السليلوز المختلط (MCE) للرؤية والتصوير بوضوح.
  9. قم بعمل شقوق صغيرة مريحة في الشبكية عند الأرباع الثلاثة الأخرى، مع أطول قطع في شبكية الأنف لتتبع موقع الشبكية.
    ملاحظة: يجب أن تبدو الشبكية كأنها برسيم بأربع أوراق.
  10. انقل الشبكية من ورق المرشح إلى مناديل مختبرية. استخدم قطرة واحدة من ACSF لترطيب الشبكية ثم استخدم المنديل لتجفيف ورق الفلتر. كرر ذلك لمدة لا تقل عن 8-10 قطرات لجعل الشبكية تلتصق بورق الفلتر.
  11. ضع الشبكية في غرفة مؤكسجة أثناء تشريح العين المقابلة للجهة المقابلة من الجانب.
  12. بمجرد الاستعداد للتصوير، جفف ورق الفلتر كما ذكر في الخطوة 3.10 واقلب الشبكية على طبق ماتيك بيتري. ثقل الشبكية إما بخرز معدني أو خاتم. أضف 3-5 قطرات من ACSF.
    ملاحظة: الخرزات المعدنية الصغيرة، مثل تلك الموجودة في حمام خرز معدني أو حلقة، ذات حجم ووزن كافيين لمنع الانجراف دون الإخلال بسلامة الشبكية.
  13. اصنع خاتما بأخذ سلك فولاذي وأوتار نايلون مشدودة، ثم لصقها وإضافة وزن لتكوين حلقة بأوتار متوازية ثابتة ومشدودة.
    1. لف السلك حول أسطوانة بقطر نصف بوصة واسحب بقوة باستخدام كماشة. اقطع كل حلقة من الأسطوانة وقم بتسويتها بين ملزم.
    2. صنفرة الحلقة على وجه واحد ليكون لها جانب خشن ومسطح. قم بتمديد خيوط النايلون فوق فتحة زجاجة بقطر 1-2 بوصة، وثبتها في مكانها بواسطة أربطة مطاطية.
    3. ضع الحلقة فوق أوتار النايلون ولصقها بعناية على أوتار النايلون عن طريق تطبيق كميات صغيرة من الغراء على طول المحيط الداخلي للحلقة. بعد ذلك، ضع وزنا خفيفا فوق الحلقة، مثل عملة معدنية أو سلك معدني رفيع، لتثبيت الخاتم في مكانه.
    4. بعد التجفيف، اقطع خيوط النايلون من الحافة الخارجية للحلقة باستخدام مقص دقيق. والنتيجة هي أوتار متوازية ثابتة تمتد بقوة على قطر الحلقة.
    5. إذا كانت كثافة أوتار النايلون عالية جدا داخل الحلقة، قم بقص خيوط فردية باستخدام مقص زنبركي دقيق لتناسب احتياجات التجربة.
      ملاحظة: يجب أن تستغرق عملية التشريح والتركيب ~5 دقائق فقط. كلما استغرق الأمر بسرعة أكبر لوضع الأنسجة في ظروف فسيولوجية متساوية خارج الجسم الحي، كان النسيج أكثر صحة.

4. اكتساب الكونفوكال على قرص دوار

ملاحظة: شغل غرفة الترطيب عند 5٪ ثاني أكسيد الكربونوتشغيلها لمدة ساعة على الأقل قبل التصوير. السماح للنظام والعينة بالوصول إلى التوازن الحراري سيساعد في تقليل الانحراف.

  1. ابدأ بمسح العدسة العينية بسرعة 10 مرات للتركيز على الميكروغليا. عند مسح الأنسجة بحثا عن مناطق للتصوير، استخدم قناة الدبقية الصغيرة كمرجع، وركز فقط على الخلايا الدبقية الصغيرة التي تحتوي على نقاط مشبكية لامعة متزامنة (ضمن 10-20 ميكرومتر). نظرا لأن تصنيف AAV ليس متجانسا في جميع أنحاء النسيج، افحص المناطق التي تحتوي على الدبق الدبقي والثقل المتزامنة في نفس المستوى. بمجرد تحديد منطقة تستوفي هذه المعايير، قم بالتبديل إلى 60x للتركيز، ثم انتقل إلى وضع الكاميرا بالنقر على زر الكاميرا .
    1. باستخدام برنامج نظام التصوير، انقر بزر الفأرة الأيمن على الشاشة للعثور على التنقل العشوائي. ستظهر شاشة معاينة يمكنها مسح النسيج عن طريق إنشاء إطار 3 × 3، 5 × 5، أو بحجم مخصص للشاشة للحصول على أفضل مناطق. استخدم حجم الإطار 3 × 3 أو 5 × 5 مع قناة مرجعية واحدة لمنع التبييض الضوئي المستمر.
      ملاحظة: لهذا البروتوكول، استخدمنا قناة الميكروغليا.
  2. تخيل الشبكية المثبتة فورا باستخدام مجهر كونفوكال قرصي دوار بزاوية 60x (NA 1.49).
  3. لمعاينة العينة، انقر بزر الفأرة الأيمن على الشاشة، اختر مباشرة، ثم اضغط على زر التعديل التلقائي حتى يتمكن النظام من تعديل العرض بناء على LUTs الحالية. لضبط إعدادات الليزر، اختر كل قناة على حدة أولا واضبط قوة الليزر والتعريض حسب الحاجة. ثم انقر بزر الفأرة الأيمن على الفلوروفور لتعيين الإعدادات إلى المجهر واحفظ الإعدادات المخصصة، لأن البرنامج لن يحفظها عند الانتقال إلى قناة أخرى.
    1. انتقل إلى القناة التالية وقم بالضبط حسب الحاجة. انقر بزر الفأرة الأيمن على الفلوروفور لحفظ الإعدادات. إذا كنت تحصل على عدة قنوات في نفس الإطار، أدخل نفس القيم المستخدمة بعد معاينة كل قناة بشكل منفصل. انقر بزر الفأرة الأيمن على الفلوروفور لحفظ الإعدادات.
    2. للحصول على قنوات متعددة القنوات، اختر القنوات التي تهتم بها تحت تبويب لامبدا . للتصوير الحي، ادمج جميع القنوات في قناة واحدة لالتقاط الحركة الدقيقة بسرعة من الخلية المعنية للسماح بالتقاط كل قناة في نفس الوقت، بدلا من كل قناة بشكل منفصل، مما قد يسبب تأخرا في التايم لابس حسب سرعة الخلية.
  4. تابع عملية الحصول على تايم لابس للوقت المطلوب.
    1. في تبويب الوقت في أسفل اليسار، أدخل فترة زمنية مدتها 5-10 دقائق للوقت بفاصل 20 ثانية.
    2. تحت تبويب إعدادات الاكتساب على اليمين، اضبط دقة الصورة على 608 × 832 مع حجم بكسل 0.12 ميكرومتر.
    3. اجمع الصور في 10 - 20 ميكرومتر باستخدام حجم خطوة 0.3 ميكرومتر لضمان دقة مقبولة لعمليات الخلايا الدبقية الدقيقة والنقاط المشبكية على طول محور z. لضمان نجاح تتبع الخلية، حافظ على الفاصل الزمني بين الإطارات عند 20 - 30 ثانية.
      ملاحظة: نظرا لهشاشة الأنسجة خارج الجسم الحي، ينصح بتصوير الشبكية التجريبية أولا ولمدة لا تزيد عن ساعة. وذلك لتطبيع حالة العين المقابلة، والتي يجب أن تكون في غرفة مؤكسجة أثناء تصوير الشبكية الأولى.
  5. استخدم هذا البروتوكول لتصوير الطبقات السطحية الأكثر في الشبكية. من خلال الحصول على فواصل زمنية أكبر من 20 ميكرومتر، يصبح من الصعب التقاط حركة العملية الدقيقة خلال فترات 20 ثانية. لذلك، فقط صور الميكرو برجيوم التي تناسب داخل كومة 20 ميكرومتر.

5. تتبع التحليل وتصدير البيانات

  1. التصيير السطحي للميكروغليا
    1. حول ملف التايم لابس إلى صيغة IMS باستخدام برنامج محول الملفات. أدخل أحجام الفوكسل التالية بناء على خصائص الصورة المكتسبة من الخطوة 4.2: x = 0.1272423 ميكرون، y = 0.1272423 ميكرون، z = 0.3 ميكرون.
    2. بمجرد الإطلاق، سيبدأ برنامج التحليل في أرينا. انقر على مجلد Observe لفتح الملف الذي تم تحويله سابقا. تأكد من أن الصورة في عرض ثلاثي الأبعاد.
    3. للكشف عن الخلايا الدبقية الصغيرة الفردية بالكامل، انقر على أيقونة السطح الأزرق في شريط أدوات الكائنات . اختر آخر ثلاثة خيارات تحت إعدادات الخوارزمية : تتبع الأسطح (مع مرور الوقت)، تصنيف الأسطح، وإحصائيات الكائن-الكائن. انقر على زر التشغيل الأزرق للانتقال إلى الخطوة التالية.
      1. في حالة وجود عدة ميكروغليا، اختر مقطع فقط منطقة اهتمام (ROI) لضمان وجود الخلايا الدبقية الصغيرة الفردية داخل جسم سطحي واحد. اضبط معلمات x و y و z وفقا لذلك لتكوين سطح من الخلايا الدبقية الصغيرة الفردية محل اهتمام فقط.
    4. اختر القناة التي سيتم إنشاء عرض سطحي لها. إذا رغبت، اختر Smooth لتنعيم إنشاء السطح واستخدم نسبة 1:1 - 1.25 إلى حجم الفوكسل في الصورة. على سبيل المثال، إذا كان حجم فوكسل الصورة 0.12 × 0.12 × 0.3 ميكرومتر، اضبط تفاصيل السطح على 0.15 - 0.16 ميكرومتر. تحت العتبة، اختر تقسيم التعلم الآلي لتدريب البرنامج على اكتشاف الخلايا المعنية.
      ملاحظة: تتضمن الخطوة التالية تغذية بيانات التدريب إلى الذكاء الاصطناعي لجامعة إيماريس من خلال تقسيم التعلم الآلي.
    5. تحت بيانات التدريب، راقب أداتي فرشاة الطلاء: الخلفية (لاكتشاف الخلفية) والمقدمة (لاكتشاف الإشارة الحقيقية للعينة). ارسم ضربات فرشاة الرسم باختيار فرشاة الرسم المطلوبة واستخدام زر Shift + Left click. تأكد من اختيار عرض الاستيفاء تحت الإعدادات. اختر القطار والتنبؤ لإدخال بيانات التدريب من ضربات الفرشاة التي تم تنفيذها.
      ملاحظة: تغذية أكثر من ست ضربات تؤدي إلى وقت معالجة أطول لل الذكاء الاصطناعي والتقاط الخلية بشكل غير دقيق.
      1. استخدم المؤشر الأصفر في المنتصف للتحرك عبر مجموعة z-stack. ارسم عدة ضربات فرشاة عبر مستويي x و y و z، وكذلك في بعض (وليس كل) فترات الزمن. قم بعمل 3-5 ضربات فرشاة قصيرة في كل مدخل، لأن الذكاء الاصطناعي يتعلم بشكل أفضل باستخدام قطع صغيرة من المعلومات في كل مرة. قم بتعديل هذه الخطوة بشكل تكراري مع كل إدخال حتى يتم إنشاء سطح دقيق للخلية.
      2. اختر المستطيل الأصفر للتبديل بين شاشة التدريب والسطح الفعلي الذي تم إنشاؤه كفحص نهائي. تحقق أيضا عبر الفاصل الزمني أن السطح يمثل الخلية بدقة.
    6. بمجرد تحقيق العرض الدقيق للأسطح، انتقل إلى الخطوة التالية. إلغاء تحديد تقسيم الكائنات.
    7. اضبط عدد الفوكسل في المخطط التكراري. حرك العتبة بحيث تزيل الأجسام الصغيرة غير المتصلة بالسطح الرئيسي.
      ملاحظة: تستخدم هذه الخطوة لإزالة أي أسطح صغيرة غير مرغوب فيها تتكون بسبب الضوضاء الخلفية. الهدف هو إزالة أي أسطح غير متصلة بجسم الخلية الرئيسي محل الاهتمام.
    8. بعد ذلك، قم بتعديل السطح حسب الحاجة. قم بإزالة أي أشياء ليست جزءا من السطح الرئيسي أو الحواف المقطوعة يدويا باستخدام أداة المقص حسب الحاجة.
    9. إذا رغبت، حدد عتبة للفجوات المسموح بها يمكن ربطها بالكائن. اختر خوارزمية التتبع للخلية المتحركة.
      ملاحظة: الحركة الذاتية الانحدار هي الأداة الأكثر استخداما لتتبع الخلايا، حيث تتابع الحركة المستمرة طوال فترة التايم لابس.
      1. أقصى مسافة وأكبر حجم فجوة هما أرقام يحددها المستخدم تحدد نقاطا مهمة يمكن أن ينحرف عنها السطح. حدد مسافة فجوة قصوى 0.96 ميكرومتر وحجم فراغ أقصى 3 (الإعدادات الافتراضية).
    10. مماثل لكيفية تصفية الأجسام السطحية في الخطوة 5.1.7، تصفية المسارات غير المرتبطة بالسطح الرئيسي. يتم تعديل ذلك أيضا بواسطة مخطط مدرج بياني. حدد أين يجب ضبط العتبة من خلال البحث عن متى يتم إزالة المسارات الصغيرة التي لا تدوم أكثر من خمسة أطر زمنية من تعديلات الفلتر.
    11. بعد ذلك، قم بإعداد تصنيفات إذا رغبت في ذلك. على سبيل المثال، صنف طول الإزاحة بين 0 - 1 ميكرومتر و1+ ميكرومتر لتحديد حركة عملية صغيرة أو إزاحة كبيرة بشكل ملحوظ للعملية أو الخلية.
    12. وأخيرا، ضع تسميات مناسبة على بعض الأحداث باستخدام التصنيفات من الخطوة السابقة.
      ملاحظة: أفضل استخدام لهذه الخطوة بعد توليد نقاط للإشارة بعد المشبك.
  2. التصنيف الفوري ل PSD95
    1. للكشف عن الخلايا الدبقية الصغيرة الفردية بالكامل، انقر على أيقونة السطح الأزرق في شريط أدوات الكائنات . اختر آخر ثلاثة خيارات تحت إعدادات الخوارزمية : تتبع الأسطح (مع مرور الوقت)، تصنيف الأسطح، وإحصائيات الكائن-الكائن. انقر على زر التشغيل الأزرق للانتقال إلى الخطوة التالية.
    2. اختر القناة المصدرية لعلامة المشبك. قم بإيقاف التقطيع وأي قنوات أخرى لرؤية PSD95 فقط. استخدم زر ctrl وأداة اختيار المؤشر لتقدير قطر النقطة xy.
      1. اختر بعض النقاط اللامعة التي تدوم طوال فترة الزمن (حجمها يتراوح بين 0.6 ميكرومتر و1.2 ميكرومتر).
      2. أوقف الطرح في الخلفية. إذا كانت الصورة تتطلب طرحا في الخلفية، استخدم أداة طرح الخلفية تحت معالجة الصور قبل معالجة التايم لابس.
    3. بعد ذلك، أضف فلتر بناء على جودة البقعة. اسحب مخطط التكرار بحيث يتم التقاط جميع نقاط PSD95 بدقة طوال التايم لابس.
      ملاحظة: الجودة تعتمد على شدة مركز النقطة9. هذا المرشح يلتقط الإشارة الفعلية ل PSD95 بدقة أكبر، مقارنة بعدد مرشحات الفوكسل أو مرشحات القطر.
    4. بعد ذلك، قم بإزالة أي بقع ناتجة عن الضوضاء باستخدام خطوة التحرير. قم بالتبديل بين مؤشر المكعب أو مؤشر الدائرة لإزالة النقاط المفردة أو المتكررة على التوالي، والتي تظهر فقط لمدة 1-2 وقت بسبب الضوضاء.
    5. إذا رغبت، حدد عتبة للفجوات المسموح بها يمكن ربطها بالكائن. اختر خوارزمية التتبع المناسبة لعلامة التشابك.
      1. أقصى مسافة وأكبر حجم فجوة هما أرقام يحددها المستخدم تحدد نقاطا مهمة يمكن أن تنحرف عنها البقع. حدد مسافة فجوة قصوى تبلغ 14.6 ميكرومتر وحجم فجوة أقصى 3 (الإعدادات الافتراضية).
    6. مماثل لكيفية تصفية الأجسام النقطية في الخطوة 5.2.3، تصفية المسارات غير المرتبطة بنقاط نقط مميزة. يتم تعديل ذلك أيضا بواسطة مخطط مدرج بياني. لتحديد مكان ضبط العتبة، ابحث عن متى تزال مسارات الكائنات الصغيرة.
    7. قم بإعداد تصنيفات إذا رغبت. على سبيل المثال، التمييز بين البونكتا المبتلعة أو الملامسة أو غير المتصلة باستخدام تصنيف أقصر مسافة إلى السطح . يتم ابتلاع أي نقطة < 0 ميكرومتر داخل السطح، متصلة بين 0 إلى 0.5 ميكرومتر من السطح، أو غير متصلة ب 0.5+ ميكرومتر من السطح.
    8. وأخيرا، ضع تسميات مناسبة على بعض الأحداث باستخدام التصنيفات من الخطوة السابقة.
  3. بمجرد أن تمثل الأسطح والبقع بدقة الدبقية الصغيرة والنقطة المعنية، قم بتصدير جميع الإحصائيات من كل كائن تحت تبويب الإحصائيات . تأكد من استخراج الإحصائيات التفصيلية، والتي ستشمل طول الإزاحة والسرعة وأحداث التلامس سرية.
    1. العديد من الإحصائيات، مثل المساحة، والحجم، وطول الإزاحة، والسرعة، هي مخرجات من إيماريس. تصدير طول وإزاحة السطح وسرعته لتعريف ديناميكيات الخلايا الدبقية الصغيرة في التجربة.
      1. عرف طول الإزاحة بأنه المسافة بين الموقع الابتدائي للسطح والموضع النهائي، وتقاس بميكرومتر22.
      2. عرف السرعة بأنها السرعة اللحظية للسطح من فترة زمنية إلى أخرى، تقاس بوحدة ميكرومتر/ثانية22.
        ملاحظة: الأحداث التلامسية هي ظاهرة وصفها المؤلفون بأنها نقاط ما بعد المشبكية سليمة تشارك مسافة 0 ميكرومتر بين الخلايا الدبقية الصغيرة الفردية لمدة خمسة أطر زمنية متسقة على الأقل ضمن الفاصل الزمني.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تصوير الخلايا الدبقية الصغيرة من شبكية الفأر CX3CR1-GFP باستخدام البروتوكول المذكور. تراوحت الفئران بين P30 إلى P60 وقت حقن AAV-PSD95-RFP، ومرت على الأقل 21 يوما للسماح بالتعبير عن AAV. تظهر الصور التمثيلية للميكروبراليا وتفاعلاتها مع نقاط PSD95 قبل وبعد التحليل في الشكل 2. لتحفيز تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة، استخدمنا نموذج ارتفاع ضغط العين الناتج عن ليزر الفأر (LIOH)، وهو نموذج يرفع الضغط داخل العين (IOP) بشكل مؤقت 10,1...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتيح هذا البروتوكول تصور وتتبع تفاعل الخلايا الدبقية الصغيرة الفردية مع مواقع ما بعد المشبك على طول التشعبات في RGCs. في الأمراض التنكسية العصبية مثل الزرق، تتزامن الخلايا الدبقية الصغيرة مع المشابك العصبية في الطبقة الداخلية الشبكية (IPL) في الشبكية. دور الخلايا الدبقية الصغيرة في تفكك المشابك غير مفهوم جيدا. ومع ذلك، قد تساهم الخلايا الدبقية الصغيرة من خلال عدة آليات محتملة، بما في ذلك ابتلاع المشابك العصبية بشكل شاذ، أو إزالة الحطام من الخلايا المبنية بشكل سلبي، أو مزيج من هذه الآليات...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PSD-95pTagRFP كان هدية من يوهانس هيل (بلازميد Addgene #52671؛ RRID: Addgene_52671)، بينما النسخة المقبدة 7 متر و8 أشخاص، كانت هدية من جون فلانري وديفيد شافر (بلازميد أدجين # 64839؛ RRID: Addgene_64839). نود أن نشكر أبارنا لاكاراجو على السماح لنا باستخدام مجهر الأقراص الدوار في مختبرهم ونيلسا لا كونزا على الإرشاد في التصوير الحي. نود أيضا أن نشكر فيليس دان، أنيكا بالراج، ولوكا ديلا سانتينا على النقاشات والتعليقات المفيدة حول هذه المخطوطة. نشكر سولينغ وانغ على المساعدة في تحليل البيانات حول إيماريس. تم تمويل هذا العمل من قبل NIH-NEI EY028148 و EY034973 إلى Y.O.، وجائزة ARVO ديفيد إل. إبستين إلى Y.O.، وNIH-NEI EY034973-S1 إلى C.F.. وقد تم دعم هذا البحث جزئيا من خلال الموارد المشتركة لمركز الرؤية في UCSF التابع ل NIH-NEI P30 EY002162/EY037668، ومن خلال منحة غير مقيدة من منظمة أبحاث لمنع العمى في نيويورك، نيويورك. تم إنشاء الشكل 1 في biorender.com.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
إبرة قياس 25ألكون8065420920
26 ثانية بقياس 10 وميكرو؛ إل سرينجهاميلتون701RNWG
7m8أدجين64839http://n2t.net/addgene:64839
سلك الفولاذ المقاوم للصدأ 304 متعدد الأغراض من نوع Bend-and-Stayستانفورد للمواد المتقدمةSS3368أسلاك فولاذية لصنع الحلقات
سداسي هيدريدات كلوريد الكالسيومسيغما-ألدرتشC5080-500G
مجهر التشريحأمسكوبلتشريح وتركيب الشبكية
مقص التشريحFST15024-10
D-(+)-جلوكوزسيغما-ألدرتشG7528-250G
الملقطدومون11252-21
هيبسسيغما-ألدرتشH3375-500G
إيماريس 10.0.2أوكسفورد إنسترومنتسبرامج التحليل
محول ملفات إيماريسأوكسفورد إنسترومنتس
لوكتايت سوبر غلو ألترا جل كونترولرلوكتايت1363589غراء لصنع الحلقات
كلوريد المغنيسيوم سداسي الهيدراتسيغما-ألدرتشM9272-100G
ورق ترشيح غشاء MCE (13 مم)ميليبورHABG013000.45 μ حجم المسام
غرفة البيئة الدقيقةتوكاي هيتمجموعة STXG-TIZBX
مجهر نيكون إكليبس Ti2-E المقلوبنيكون
عناصر NISنيكون
مرهم نيوميسين وبولي ميكسين ب ومحلول الزنك البصري البصري المصنوع من النيوميسين والبوليميكسين B وباستراسين، USPبوش + لومب24208-780-55
حجم فرشاة الرسم 00أمازون
بريزم 8.0جراف باد
محلول بروباراكاين هيدروكلوريد العيون USP، 0.5٪ساندوز61314-0016-01
طبق بتري مغلف ب PDL (35 مم)ماتيكP35GC-1.5-14-Cرقم 1.5 كوفرسليب
PSD95_pTagRFPأدجين52671http://n2t.net/addgene:52671
كلوريد البوتاسيومسيغما-ألدرتشP9333-500G
كلوريد الصوديومسيغما-ألدرتشS7653-1KG
فوسفات الصوديوم أحادي الهيدرات أحادي الأساسسيغما-ألدرتشS9638-25G

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wu, Y. K., Hengen, K. B., Turrigiano, G. G., Gjorgjieva, J. Homeostatic mechanisms regulate distinct aspects of cortical circuit dynamics. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (39), 24514-24525 (2020).
  2. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  3. Rosin, J. M., et al. Embryonic microglia interact with hypothalamic radial glia during development and upregulate the TAM receptors MERTK and AXL following an insult. Cell Rep. 34 (1), 108587(2021).
  4. Wang, X., Li, K., Guo, L., Liu, X., Guo, Y., Zhang, W. The influence of changes in microglia development on the plasticity of the developing visual cortex circuit in juvenile mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (4), 45(2025).
  5. Blume, Z. I., Lambert, J. M., Lovel, A. G., Mitchell, D. M. Microglia in the developing retina couple phagocytosis with the progression of apoptosis via P2RY12 signaling. Dev Dyn. 249 (6), 723-740 (2020).
  6. Brown, T. C., et al. Microglia are dispensable for experience-dependent refinement of mouse visual circuitry. Nat Neurosci. 27 (8), 1462-1467 (2024).
  7. Huang, Y., et al. Microglia use TAM receptors to detect and engulf amyloid β plaques. Nat Immunol. 22 (5), 586-594 (2021).
  8. Ding, X., et al. Loss of microglial SIRPα promotes synaptic pruning in preclinical models of neurodegeneration. Nat Commun. 12 (1), 2030(2021).
  9. He, J., et al. Microglia mediate synaptic material clearance at the early stage of rats with retinitis pigmentosa. Front Immunol. 10, 912(2019).
  10. Yu, A., Fang, C., Tan, L. X., Lakkaraju, A., Della Santina, L., Ou, Y. Microglia target synaptic sites early during excitatory circuit disassembly in neurodegeneration. iScience. 28 (4), 112201(2025).
  11. Xu, S., et al. Synaptic changes and the response of microglia in a light-induced photoreceptor degeneration model. Mol Vis. 27, 206-220 (2021).
  12. Paolicelli, R. C., et al. Microglia states and nomenclature: a field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
  13. Yu, Z., Gutu, A., Kim, N., O'Shea, E. K. Synapse weakening-induced caspase-3 activity confers specificity to microglia-mediated synapse elimination. bioRxiv. , (2024).
  14. Miller, E. B., Zhang, P., Ching, K., Pugh, E. N., Burns, M. E. In vivo imaging reveals transient microglia recruitment and functional recovery of photoreceptor signaling after injury. Proc Natl Acad Sci USA. 116 (33), 16603-16612 (2019).
  15. Wahl, D. J., Ng, R., Ju, M. J., Jian, Y., Sarunic, M. V. Sensorless adaptive optics multimodal en-face small animal retinal imaging. Biomed Opt Express. 10 (1), 252(2019).
  16. Ou, Y., Jo, R. E., Ullian, E. M., Wong, R. O. L., Della Santina, L. Selective vulnerability of specific retinal ganglion cell types and synapses after transient ocular hypertension. J Neurosci. 36 (35), 9240-9252 (2016).
  17. Della Santina, L., et al. Disassembly and rewiring of a mature converging excitatory circuit following injury. Cell Rep. 36 (5), 109463(2021).
  18. Ramírez, A. I., et al. Microglial changes in the early aging stage in a healthy retina and an experimental glaucoma model. Prog Brain Res. 256, 125-149 (2020).
  19. de Hoz, R., et al. Bilateral early activation of retinal microglial cells in a mouse model of unilateral laser-induced experimental ocular hypertension. Exp Eye Res. 171, 12-29 (2018).
  20. Soliño, M., Yu, A., Della Santina, L., Ou, Y. Large-scale survey of excitatory synapses reveals sublamina-specific and asymmetric synapse disassembly in a neurodegenerative circuit. iScience. 26 (8), 107262(2023).
  21. Negrini, M., Wang, G., Heuer, A., Björklund, T., Davidsson, M. AAV production everywhere: a simple, fast, and reliable protocol for in-house AAV vector production based on chloroform extraction. Curr Protoc Neurosci. 93 (1), e103(2020).
  22. Imaris reference manual. , https://lims.gzzoc.com/files/instrument/20240722/2024072212391299299_ImarisManual.pdf (2024).
  23. Joseph, A., Power, D., Schallek, J. Imaging the dynamics of individual processes of microglia in the living retina in vivo. Biomed Opt Express. 12 (10), 6157(2021).
  24. Wu, W., et al. In vivo imaging in mouse spinal cord reveals that microglia prevent degeneration of injured axons. Nat Commun. 15 (1), 8837(2024).
  25. Lee, J. E., Liang, K. J., Fariss, R. N., Wong, W. T. Ex vivo dynamic imaging of retinal microglia using time-lapse confocal microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (9), 4169-4176 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microglia DynamicsSynaptic PruningRetinal ExplantSpinning Disk MicroscopyMicroglia MotilityPSD95 LabelingTime Lapse ImagingSynapse InteractionNeuroinflammationSurface Rendering

Related Articles