Method Article

بناء المصفوفات الدقيقة للأنسجة القائمة على الغراء لأبحاث الأورام والأمراض

DOI:

10.3791/68424

⸱

August 1st, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Laboratory, The Affiliated Huai'an No.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 2Department of Anesthesiology, The Affiliated Huai'an No.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 3Department of Pathology, The Affiliated Huai'an No.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 4Department of Pediatrics, The Affiliated Huai'an No.1 People's Hospital of Nanjing Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول إنتاجا منخفض التكلفة وطريقة تحقق فعالة لبناء TMA القائم على الغراء ، مما يوفر منصة تشخيص مرضية ملائمة لأبحاث الأورام والأمراض.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقنية المصفوفات الدقيقة للأنسجة (TMA) هي منصة عالية الإنتاجية للكشف والتحليل المتزامن لعينات الأنسجة المتعددة ، مما يسهل البحث الفعال عن المؤشرات الحيوية للأورام والأمراض. ومع ذلك ، غالبا ما تواجه طرق بناء TMA التقليدية قيودا مثل التعقيد التشغيلي والإجراءات التي تستغرق وقتا طويلا والدقة المتغيرة. تم تطوير طريقة بناء TMA القائمة على الغراء للتغلب على هذه التحديات ، مما يوفر تثبيتا محسنا للب الأنسجة وثباتا هيكليا محسنا. وشمل التحقق المنهجي التقييم النسيجي (تلطيخ HE) ، والتنميط الكيميائي المناعي للبروتينات المستهدفة ، وتحليل التهجين الموضعي (FISH). أظهرت النتائج أن الطريقة القائمة على الغراء حافظت على سلامة ممتازة للشرائح ، وتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء ، وضمان قابلية التكرار المتسقة من دفعة إلى دفعة. على الرغم من أن هذا النهج يقتصر على التشغيل اليدوي ، إلا أنه يقدم خيارا موثوقا وفعالا من حيث التكلفة لإنتاج TMA متوسط الإنتاجية. هذه الطريقة مناسبة بشكل خاص لبيئات البحث التي تقدر المرونة وتنوع العينات على الأتمتة على نطاق واسع ، مما يوسع من فائدة TMA في الإعدادات الأكاديمية والتشخيصية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصفوفة الدقيقة للأنسجة (TMA) هي تقنية عالية الإنتاجية لتحليل عينات الأنسجة1،2،3. يتم الحصول على نوى أنسجة مانحة متعددة ، ويتم نقل كتل البارافين المانحة إلى كتل الأنسجة المتلقية للتحليل الجزيئي التفاضلي والمقارن المتزامن في ظل نفس ظروف الأداءنظريا 2،4. الطريقة الكلاسيكية لبناء مصفوفة دقيقة للأنسجة (TMA) هي استخدام ثقب لاستخراج نوى الأنسجة من عينة أنسجة متبرع وترتيبها بالتتابع في كتلة البارافين المتلقية. هذه الطريقة مناسبة لكتل البارافين المانحة ذات العمق المماثل وتسمح بالتحليل الفعال لعينات متعددة على شريحة واحدة ، مما يحسن بشكل كبير من كفاءة الدراسة واتساق البيانات5،6،7. ومع ذلك ، لا تزال هذه الطريقة تمتلك قيودا معينة ، بما في ذلك التعامل غير الكافي مع قلب الأنسجة أثناء عملية التضمين ، مما قد يؤدي إلى تلطيخ غير متسق للعينات في التحليلاتاللاحقة 8.

الطريقة الثانية لبناء TMA هي طريقة الشريط9،10. تعمل هذه الطريقة على عكس عملية البناء عن طريق صب الكتلة حول النوى المستقيمة المقلوبة التي ، عند الانتهاء ، تتدفق مع الجزء العلوي من TMA ، بغض النظر عن طول النواة11،12. ومع ذلك ، تتطلب هذه الطريقة ضمان الوضع المناسب للب الأنسجة وفعالية الشريط ، كما تحد من عدد العينات التي يمكن معالجتها مقارنة بالتقنيات التقليدية.

تقترح هذه الدراسة طريقة غراء مبتكرة لبناء TMA ، تهدف إلى حل مشاكل مثل عدم كفاية استقرار نوى الأنسجة والتشغيل المعقد الموجود في التقنيات التقليدية13. تستخدم هذه الطريقة الغراء لإصلاح نوى الأنسجة المتعددة معا بدقة ولها مزايا التشغيل البسيط وصلابة العينة القوية. بالمقارنة مع طرق التقسيم أو الشريط التقليدية ، يمكن لطريقة الغراء أن تزيد من معدل الاحتفاظ بنوى الأنسجة وتقليل التكاليف. هذه الطريقة قابلة للتطبيق على الدراسات السريرية ذات حجم العينة المتوسط وهي مناسبة بشكل خاص لتصميمات البحث التي تتطلب تعديلا مرنا للخطة التجريبية. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن قدرة معالجة هذه الطريقة لا تلبي متطلبات الإنتاجية الفائقة9. وفي الوقت نفسه ، في عملية التطبيق الفعلية ، يجب إنشاء مجموعة كاملة من معايير التشغيل الموحدة وأنظمة مراقبة الجودة. يحتاج المشغلون إلى تلقي تدريب منهجي واجتياز تقييمات مهنية لضمان توحيد العمليات الفنية وتكرار النتائج. يشير التحليل الشامل إلى أن هذه التكنولوجيا تحقق توازنا جيدا بين المرونة التشغيلية والفعالية من حيث التكلفة والموثوقية التقنية ، وهي مناسبة بشكل خاص لسيناريوهات البحث حيث تكون الموارد محدودة ولكن لا تزال مراقبة الجودة بحاجة إلى ضمان.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على جميع كتل المتبرعين من العينات المرضية الأرشيفية التي تم جمعها بين عامي 2016 و 2018 في مستشفى هوايان الشعبي رقم 1 التابع لجامعة نانجينغ الطبية. تم إلغاء تحديد العينات قبل استخدامها ومعالجتها وفقا للبروتوكولات المعتمدة (لجنة الأخلاقيات التابعة لمستشفى Huai'an الشعبي رقم 1 التابع لجامعة نانجينغ الطبية ، KY-2024-250-01).

1. تقييم ووضع علامات على أنسجة المتبرع بها

  1. حدد كتل الأنسجة بسمك ≥5 مم ومساحة ≥15 مم × 15 مم. تأكد من هامش أمان 2 مم عند الحواف ، واستبعد المناطق التي تظهر عليها نخر أو نزيف أو تكلس للحفاظ على سلامة الأنسجة.
  2. تحديد المنطقة المستهدفة ووضع علامات عليها
    1. قم بتقييم الأقسام الملطخة ب H & E باستخدام المجهر البصري. حدد موقع المنطقة المستهدفة من خلال المسح الضوئي منخفض الطاقة ، ثم قم بالتبديل إلى الطاقة العالية لتأكيد الخصائص المورفولوجية الخلوية. ضع علامة على حدود المنطقة المستهدفة على الشرائح.
    2. قم بتعيين إحداثيات المنطقة المحددة على سطح كتلة البارافين لإكمال تحويل العلامات.

2. استخراج الأنسجة الأساسية

  1. تحضير الثقب والمعالجة المسبقة للعينات
    1. حدد أداة ثقب يدوية بقطر 2 مم وتأكد من نعومة حافة القطع وسهولة التشغيل.
    2. ضع كتلة البارافين المانحة على منصة باردة عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
  2. قم بمحاذاة الإبرة عموديا مع النقطة المحددة ، وقم بتطبيق ضغط دوراني ثابت للوصول إلى العمق المحدد. تجنب الإمالة أو الاهتزاز أثناء العملية7 (الشكل 1 أ).
  3. قم بتدوير الإبرة برفق عكس اتجاه عقارب الساعة (≤2 دورة / ثانية) لسحبها. أخرج قلب الأنسجة بعناية من الإبرة وانقله إلى بئر فردي من صفيحة 96 بئرا مبردة مسبقا. سجل الموقع الأساسي في كل بئر (الشكل 1 ب).
    ملاحظة: إذا كان الجزء السفلي من قلب الأنسجة غير متساو ، فقم بتسويتها بشفرة. بعد التشذيب ، أعد التحقق من السلامة.
  4. قم بالتسجيل المسبق لجميع أرقام المتبرعين ومواضع بئر لوحة ELISA المقابلة (A1-H12) في نموذج التسجيل. أثناء العملية ، أعد التحقق للتأكد من المراسلات الصارمة بين أعداد المتبرعين ومواقع البئر.
  5. افحص النوى على الفور للتأكد من سلامتها. تخلص من النوى المكسورة أو المنحنية أو التي تظهر انحرافات قطرها >0.1 مم.
    ملاحظة: تأكد من تناسق طول اللب (معامل التباين ، السيرة الذاتية ≤5٪) وتجنب الخدوش السطحية أو القطع الأثرية للضغط.

3. تثبيت الأنسجة الأساسية

  1. استخدم علامة مقاومة للماء لرسم شبكة مباشرة على سطح القالب ، مما يضمن خطوطا واضحة ومتباعدة بشكل متساو.
    1. استخدم قالبا قياسيا بمساحة سفلية فعالة تبلغ 3.0 سم × 2.5 سم ، واحتفظ بمساحة حدود فارغة تبلغ 1.5 مم على كل جانب.
    2. استخدم علامة مقاومة للماء بنقطة دقيقة 0.5 مم لرسم تسعة خطوط متوازية متباعدة بشكل متساو أفقيا وعموديا ، لتشكيل شبكة تحديد المواقع 9 × 9 (81 نقطة تقاطع في المجموع).
      ملاحظة: قبل البدء ، قم بتنظيف الجزء الداخلي من القالب باستخدام قطعة قطن مبللة بالزيلين لإزالة البارافين المتبقي ، مما قد يتسبب في تشويه. أثناء عملية الرسم ، استخدم مسطرة فولاذية لضمان سمك خط موحد ونقاط تقاطع يمكن تمييزها بوضوح.
  2. استخدم ماصة لسحب 5 ميكرولتر من الغراء وضعها برفق في وسط الشريحة المسماة مسبقا لتشكيل قطرة واحدة. استخدم الملقط الدقيق على الفور لالتقاط قلب الأنسجة عموديا بزاوية 90 درجة واضغط عليه ببطء عموديا في قطرة الغراء (الشكل 1 ج).
  3. أدخل النوى في تقاطعات الشبكة المقابلة على القالب باستخدام الملقط. ضع ضغطا لطيفا لمدة 5 ثوان لضمان التصاق آمن (الشكل 1 د).
  4. إذا تم إزاحة قلب الأنسجة ، فقم بضبطه وإعادة ضبطه على الفور باستخدام ملاقط دقيقة قبل أن يتجمد الغراء (في غضون 30 ثانية). تخلص من النوى الصلبة المنحرفة للحفاظ على جودة التحضير مع الحفاظ على العينات الثمينة إلى أقصى حد.

4. تركيب الكاسيت وتضمين البارافين

  1. ضع كاسيت المناديل عموديا فوق القالب الفولاذي ، مما يضمن ملامسة الأطراف الأساسية دون الضغط قم بتأمين الكاسيت باستخدام المشابك المغناطيسية في جميع الزوايا الأربع ، وأغلق اللحامات بالبارافين المصهور.
  2. قم بنقع البارافين المنصهر بزاوية 45 درجة في نمط متعرج ، مع الحفاظ على معدل تدفق يبلغ 1 مل / ثانية. تأكد من أن مستوى البارافين يتجاوز الأطراف الأساسية بمقدار 2 مم (الشكل 1E).
  3. قم بتبريد الكتلة بسرعة على لوح بارد 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق لتشكيل طبقة دعم صلبة. انقل الكتلة إلى بيئة 22 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لتقليل الضغط الداخلي. أخيرا ، استخدم مسدسا حراريا 40 درجة مئوية لتنعيم السطح برفق وإزالة علامات الانكماش.
  4. سخني البارافين قليلا لتليينه ، ثم قطعيه بعناية على طول حواف الكاسيت لفك الكتلة. ارفع الكاسيت برفق وقم بإزالة أي بقايا من البارافين لضمان سلامة قلب الأنسجة (الشكل 1F).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة ، تم إنشاء مصفوفات دقيقة عالية الجودة للأنسجة باستخدام طريقة الغراء. للتحقق من فعالية الطريقة ، تم إجراء سلسلة من التجارب ، بما في ذلك تلطيخ H & E ، والكشف الكيميائي المناعي لبروتينات معينة ، وتحليل التهجين الفلوري في الموقع (FISH). يتمثل أحد المكونات الحاسمة في عملية البناء في وجود نقاط أساسية للأنسجة في المواضع والمسافات المتوقعة بعيدا عن بعضها البعض ، والتي يتم تقييمها عن طريق الفحص البصري. يظهر الفحص البصري لكتل TMA أن النوى موجودة ومتباعدة بانتظام في كل TMA (الشكل 2 أ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كطريقة مبتكرة لبناء المصفوفات الدقيقة للأنسجة (TMA) ، أظهرت طريقة الغراء مزايا كبيرة نظرا لسهولة إجراءات البناء والفعالية من حيث التكلفة. بالمقارنة مع طريقة مصفوفة الإبرة التقليدية ، التي تعتمد على الأدوات المتطورة14،15 ، تتيح طريقة الغراء تثبيت العينة عن طريق اللصق ، والذي يمكن القيام به باستخدام الأدوات الأساسية فقط ، مما يقلل بشكل كبير من العتبة الفنية. على عكس طريقة التضمين التقليدية ، يتم إصلاح طريقة اللصق عن طريق الاستغناء ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

شكرا لأعضاء الفريق على دعمهم ومساهمتهم في هذه التجربة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
طقم الكشف عن سرطان الثدي HER2Anbiping2502001طقم الكشف عن سرطان الثدي HER2
الجسم المضاد CDHR4Abcamab166914CDHR4 الجسم المضاد
CDK1 الجسم المضادAbcamab265590CDK1 الجسم المضاد
CRTAC1Abcamab254691CRTAC1 الأجسام المضادة
DNASE1L3 الأجسام المضادةAbcamab203669آلة تضمين الأجسام المضادة DNASE1L3
PSJ MedicalBM450Aآلة التضمين
مجفف الأنسجة الأوتوماتيكي بالكاملLeica BiosystemsASP3005مجفف الأنسجة الأوتوماتيكي بالكامل
شرائح المجهر الزجاجيCitotest250124A1المجهر الزجاجي
الغراءTIZO200الغراء
GPR146 الجسم المضادAbcamab117104GPR146 الجسم المضاد
IGSF10 الجسم المضادAbcamab197671IGSF10 الجسم المضاد
ITIH1 الجسم المضادAbcamab233032ITIH1 الجسم المضاد
المنخفض الأنظار Microtome شفراتThermo Fisher3052835المظهر المنخفض Microtome شفرات
علامة القلمديليSK109قلم تحديد
MicrotomeLeica BiosystemsHistoCore BIOCUTMicrotome
شمع البارافينSolarbioYA0012شمع البارافين
SMAD9 الجسم المضادAbcamab262940SMAD9 الجسم
المضاد TARBP1 الجسم المضادAbcamab115896TARBP1 الجسم المضاد
ZCCHC24 الجسم المضادAbcamab88756ZCCHC24 الأجسام المضادة
شرائح

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bingle, L., Fonseca, F. P., Farthing, P. M. Constructing tissue microarrays: Protocols and methods considering potential advantages and disadvantages for downstream use. Oral Biol Mol Tech Appl. Seymour, G. J., Cullinan, M. P., Heng, N. C. K. , 429-438 (2017).
  2. Chung, L. K., et al. Tissue microarray analysis for epithelial membrane protein-2 as a novel biomarker for gliomas. Brain Tumor Pathol. 35 (1), 1-9 (2018).
  3. Torata, N., et al. Tissue tablet method: An efficient tissue banking procedure applicable to both molecular analysis and frozen tissue microarray. Hum Pathol. 45 (1), 143-152 (2014).
  4. Koo, M., Squires, J. M., Ying, D., Huang, J. Making a tissue microarray. Biobank Methods Protocols. Yong, W. H. , 313-323 (2019).
  5. Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A., Olsen, D. A., Provost, E. Amplification of tissue by construction of tissue microarrays. Exp Mol Pathol. 70 (3), 255-264 (2001).
  6. Vogel, U. F., Bueltmann, B. D. Simple inexpensive, and precise paraffin tissue microarrays constructed with a conventional microcompound table and a drill grinder. Am J Clin Pathol. 126 (3), 342-348 (2006).
  7. Pires, A. R. C., Andreiuolo, F. M., de Souza, S. R. TMA for all: A new method for the construction of tissue microarrays without recipient paraffin block using custom-built needles. Diagn Pathol. 1 (1), 14(2006).
  8. Zlobec, I., Koelzer, V. H., Dawson, H., Perren, A., Lugli, A. Next-generation tissue microarray (ngTMA) increases the quality of biomarker studies: An example using CD3, CD8, and CD45RO in the tumor microenvironment of six different solid tumor types. J Transl Med. 11 (1), 104(2013).
  9. Glinsmann-Gibson, B., et al. Recommendations for tissue microarray construction and quality assurance. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 28 (4), 325-330 (2020).
  10. Chen, N., Zhou, Q. Constructing tissue microarrays without prefabricating recipient blocks: A novel approach. Am J Clin Pathol. 124 (1), 103-107 (2005).
  11. Pires, A. R. C., de Souza, S. R. Hypodermic needle without recipient paraffin block technique. Methods Mol Biol. 664, 53-61 (2010).
  12. Vogel, U. F., Bültmann, B. Application of a novel and low-cost technique to construct paraffin tissue microarrays out of paraffinised needle biopsy specimens from patients with breast cancer. J Clin Pathol. 63 (7), 640-643 (2010).
  13. Qin, P., Li, L., Zhao, L., Bian, P., Xiong, Z. Constructing high-density tissue microarrays with a novel method and a self-made tissue-arraying instrument. Pathol Res Pract. 245, 154430(2023).
  14. Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A next-generation tissue microarray (ngTMA) protocol for biomarker studies. J Vis Exp. (91), e51893(2014).
  15. Barrette, K., van den Oord, J. J., Garmyn, M. Tissue microarray. J Invest Dermatol. 134 (9), 1-4 (2014).
  16. Sexton, T., Kucera, G. L., Levine, E. A., Watabe, K., O'Neill, S. S. Optimization of tissue microarrays from banked human formalin-fixed paraffin embedded tissues in the cancer research setting. Biopreserv Biobank. 17 (5), 452-457 (2019).
  17. Harfouch, R. M., et al. Optimization of tissue microarray technique for breast cancer patients: A short communication. Ann Med Surg. 85 (10), 5299-5303 (2023).
  18. Choi, C. H., et al. Construction of high-density tissue microarrays at low cost by using self-made manual microarray kits and recipient paraffin blocks. Korean J Pathol. 46 (6), 562-568 (2012).
  19. Kim, K. H., et al. In-house manual construction of high-density and high-quality tissue microarrays by using homemade recipient agarose-paraffin blocks. Korean J Pathol. 47 (3), 238-244 (2013).
  20. Moncada, R., et al. Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas. Nat Biotechnol. 38 (3), 333-342 (2020).
  21. Bingham, V., et al. Topographic analysis of pancreatic cancer by TMA and digital spatial profiling reveals biological complexity with potential therapeutic implications. Sci Rep. 14 (1), 11361(2024).
  22. Casadonte, R., Longuespée, R., Kriegsmann, J., Kriegsmann, M. MALDI IMS and cancer tissue microarrays. Adv Cancer Res. 134, 173-200 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tissue MicroarrayGlue Based TMATumor ResearchDisease BiomarkersCore FixationHistological EvaluationHE StainingImmunohistochemistryFISH AnalysisSlice Integrity
Video Coming Soon

Related Articles