Method Article

قياس التدفق الخلوي وتحليل الخلية المفردة لتوصيف تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة في نمو دماغ الفئران المبكر بعد الولادة

DOI:

10.3791/68427

⸱

October 3rd, 2025

 ,  ,  , 
1Azrieli Research Center of CHU Sainte-Justine, 2Pediatric Department, Faculty of Medicine, Université de Montréal

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يجمع هذا البروتوكول بين قياس التدفق الخلوي وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لعزل وتوصيف حالات الخلايا الدبقية الصغيرة في مخيخ أدمغة الفئران المبكرة بعد الولادة. يستخدم التفكك الأنزيمي ، والطرد المركزي Percoll ، والتلوين المناعي للكشف عن عدم تجانس الخلايا الدبقية الصغيرة وتحسين فهم أدوارها في تطور المخيخ والمرض.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تظهر الخلايا الدبقية الصغيرة ، الخلايا المناعية المقيمة في الدماغ ، ملامح نسخ خاصة بالمنطقة والسياق أثناء التطور والمرض. يقدم هذا البروتوكول طريقتين تكميليتين لدراسة مجموعات الخلايا الدبقية الصغيرة في الأنسجة المخيخية للفئران: قياس التدفق الخلوي وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.

كطريقة أولى مستخدمة ، تم تحسين البروتوكول القائم على قياس التدفق الخلوي لأدمغة ما بعد الولادة المبكرة ، مما يضمن عزلة قوية للخلايا واتساقها عبر الظروف التجريبية. يبدأ بتفكك الأنسجة باستخدام الهضم الأنزيمي ، متبوعا بإزالة المايلين عن طريق الطرد المركزي المتدرج بكثافة بيركول لإنتاج تعليق خلية عصبية عالي الجودة ، واستراتيجية بوابات تعتمد على تعبير CD45 و CD11b. يضمن التلوين الحي / الميت بقاء الخلية ، وتستخدم الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروكروم لتحديد تعبير علامات السطح المختارة على الخلايا الدبقية الصغيرة. يتم إجراء الضوابط التعويضية باستخدام حبات اللاتكس مع استراتيجيات بوابات تم التحقق من صحتها باستخدام التألق ناقص واحد (FMO) التحكم.

تتضمن الطريقة الثانية تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية باستخدام 10X Genomics ، باتباع نفس خطوات العزل الأولية ، والتي تتيح التنميط النسخي للدبقية الصغيرة عبر الظروف. يتم تحديد المجموعات الدبقية الصغيرة باستخدام تحليل التعبير الجيني ، ويتم إجراء تحليل التعبير التفاضلي بين المجموعات التجريبية. يتم تطبيق مصنف الغابات العشوائي فقط للتمييز بين عينات الذكور والإناث عند تعدد الإرسال.

توفر هذه البروتوكولات القابلة للتكرار والقابلة للتكيف معا إطارا قويا للتحقيق في تنوع الخلايا الدبقية الصغيرة في المخيخ أثناء نمو الدماغ المبكر وتغييره المحتمل بعد الاضطرابات التجريبية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد فترة ما بعد الولادة المبكرة مرحلة حاسمة لنمو الدماغ ، وتتميز بعمليات خلوية وجزيئات معقدة تضع الأساس للوظائف المعرفية والعاطفية والسلوكية1. ومع ذلك ، تتميز هذه الفترة أيضا بالضعف ، حيث يمكن أن تغير الاضطرابات مسارات النمو العصبي وتؤدي إلى اضطرابات عصبية أو نفسية طويلة الأمد. تلعب الخلايا الدبقية الصغيرة ، الخلايا المناعية المقيمة في الدماغ ، دورا مركزيا في تشكيل الدماغ النامي من خلال التقليم المشبكي ، والبلعمة ، والمراقبة المناعية ، والاستجابات للإهانات البيئية2،3. تظهر هذه الخلايا مرونة ملحوظة ، حيث تتبنى ملامح النسخ التي تختلف وفقا لمنطقة الدماغ ومرحلة التطور والسياق المرضي4،5.

يتطلب التحليل الدقيق لتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ النامي منهجيات قوية وقابلة للتكرار قادرة على تحليل أنماطها الظاهرية الديناميكية في سياق أنسجة المخ غير الناضجة. يوفر قياس التدفق الخلوي حلا موثوقا به ، مما يتيح التوصيف عالي الإنتاجية للمجموعات الخلوية وتعبير العلامات6. ومع ذلك ، فإن تطبيقه في دراسة الخلايا الدبقية الصغيرة من أدمغة ما بعد الولادة المبكرة يمثل تحديا تقنيا بسبب الطبيعة الحساسة للأنسجة والحاجة إلى بروتوكولات عزل وإثراء الخلايا الفعالة7،8.

يجمع البروتوكول المقدم هنا بين قياس التدفق الخلوي وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) لعزل وتوصيف الخلايا الدبقية الصغيرة من أدمغة الفئران المبكرة بعد الولادة ، مع التركيز بشكل خاص على المخيخ من يوم ما بعد الولادة 3 (P3) إلى يوم ما بعد الولادة 30 (P30) 9 ، وهي منطقة ومرحلة نمو تظل المراجع المنهجية التفصيلية محدودة.

يتضمن سير العمل هذا التفكك الأنزيمي ، والطرد المركزي المتدرج للكثافة لإزالة الحطام وإثراء الخلايا ، والتلوين المناعي باستخدام لوحة من العلامات خارج الخلية وداخل الخلايا. لتوصيف تنوع الخلايا الدبقية الصغيرة ، يتم استخدام مجموعة من العلامات السطحية وداخل الخلايا10،11. بدلا من تعيين تسميات ثابتة (التهابية أو تعويضية) ، يحدد البروتوكول المجموعات السكانية الفرعية بناء على ملفات تعريف تعبير العلامات المنفصلة. على سبيل المثال ، يتم تحديد الخلايا الدبقية الصغيرة التي تعبر عن CD80 و CD86 و iNOS و CD206 و Arg1 و CD86 و CD64 أو CD163 و CD206 وتحليلها كمجموعات فرعية متميزة جزيئيا. تعكس هذه العلامات حالات الخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة المختلفة10،11ويتم تقديمها كملفات تعريف للتعبير.

تتيح استراتيجية البوابات متعددة المعلمات هذه التحديد الدقيق للمجموعات الفرعية للدبقية الصغيرة بناء على تعبير العلامات السطحية ، مما يوفر إطارا مبسطا لتحليل عدم التجانس المناعي أثناء نمو الدماغ بعد الولادة. لتوسيع التنميط الظاهري والكشف عن تنوع النسخ ، يتم إجراء تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية بعد عزل الخلية. تؤسس هذه الدراسة سير عمل متسقا وقابلا للتطوير لتعزيز فهم عمليات النمو العصبي والتأثير طويل المدى لتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة. من خلال دمج قياس التدفق الخلوي المحسن و scRNA-seq في إطار مستنير من الناحية التنموية والإقليمية ، يعمل هذا البروتوكول كأداة قوية للتحقيق في علم الأحياء الدبقية الصغيرة في وقت مبكر من الحياة وأهميتها لنتائج النمو العصبي.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات الحيوانية والموافقة عليها من قبل اللجنة الأخلاقية لمركز أبحاث CHU Sainte-Justine وتتوافق مع إرشادات وسياسات مركز أبحاث Ste-Justine وجامعة مونتريال (مونتريال ، كيبيك ، كندا).

1. عزل الخلايا من الدماغ

  1. بعد إجراءات التخدير / القتل الرحيم ، قم بإزالة الدماغ بالكامل بسرعة من تجويف الجمجمة وضعه في أنبوب سعة 15 مل يحتوي على وسط زراعة الخلايا الدبقية الصغيرة (انظر جدول المواد). احتفظ بالأنبوب على الجليد. كرر نفس الإجراء للفئران الإضافية إذا لزم الأمر.
    تم اشتقاق جميع الفئران المستخدمة في هذه الدراسة من مستعمرات التكاثر الداخلية في مختبر الدكتور تريمبلاي. تم إنشاء الفئران التجريبية عن طريق عبور الفئران B6.129-Cx3Cr1CreERT2-EYFP / WT مع فئران B6-Rosa26iDTR / WT ، وكلاهما مصدره في الأصل من مختبرات جاكسون. أنتجت استراتيجية التكاثر هذه ذرية متغايرة الزيجوت لأليل IDTR ، مما يتيح النضوب المشروط للخلايا المعبرة عن Cx3Cr1 (الخلايا الدبقية الصغيرة في المقام الأول) من خلال نظام Cre-loxP المحفز للتاموكسيفين. قبل جمع الأنسجة ، تم تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق للكيتامين (150 ميكروغرام / جم) والإزيلازين (10 ميكروغرام / جم). تم إجراء القتل الرحيم عن طريق قطع الرأس تحت التخدير العميق ، وفقا لإرشادات رعاية واستخدامها المؤسسية.
  2. إما الحفاظ على الدماغ كله أو المضي قدما في تشريح مناطق معينة إذا رغبت في ذلك. قم بإجراء التشريح في طبق بتري صغير يحتوي على وسط زراعة الخلايا الدبقية الصغيرة (انظر جدول المواد) على الجليد للحفاظ على بقاء الخلية.
    ملاحظة: تم التحقق من صحة هذا البروتوكول للدماغ بأكمله والمخيخ من P1 إلى P30.
  3. قم بإزالة وسط زراعة الخلايا الدبقية الصغيرة وقطع أنسجة المخ جيدا باستخدام مشرط في طبق بتري.
  4. للهضم الأنزيمي ، انقل الأنسجة المتجانسة إلى أنابيب 5 مل. أضف 2 مل من HBSS (1x) مكملا ب 2 مجم / مل من الكولاجيناز D و 14 ميكروغرام / مل DNase I (انظر الجدول 1). أغلق أغطية الأنبوب بالبارافيلم. احتضن الأنابيب في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، مع رج الأنبوب كل 5 دقائق. لإيقاف الهضم ، ضع الأنابيب على الثلج.
  5. قم بتمرير التجانس من خلال مرشح شبكي معدني 140 ميكرومتر (انظر جدول المواد) لإزالة الحطام الكبير. استخدم مدقة زجاجية لفصل الخلايا.
  6. اغسل الفلتر عدة مرات باستخدام وسط زراعة الخلايا الدبقية الصغيرة (3 مل لكل غسلة).
  7. اجمع المرشح باستخدام ماصة سعة 10 مل وانقله إلى أنبوب سعة 15 مل. قم بالطرد المركزي للمحلول عند 500 جم لمدة 7 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  8. تخلص من المادة الطافية عن طريق قلب الأنبوب بعناية. أعد تعليق الحبيبات عن طريق كشطها برفق على الرف.
  9. أضف 10 مل من محلول غروي متوسط قائم على السيليكا بنسبة 37٪ (انظر الجدول 1) لإزالة المايلين والحطام. قم بالطرد المركزي للمحلول عند 500 جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية بأقل قوة فرامل.
  10. استنشق طبقة المايلين في الجزء العلوي من المحلول باستخدام ماصة سعة 10 مل.
    ملاحظة: يمنع الشفط المستمر المايلين من الاختلاط مرة أخرى في المحلول.
  11. اغسل الخلايا بإضافة 10 مل من HBSS (1x) وجهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 7 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  12. تخلص من الطواقي. أعد تعليق الحبيبات عن طريق الكشط برفق باستخدام رف ، ثم أضف 10 مل من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشط بالفلورسنت (FACS) (انظر الجدول 1). قم بالطرد المركزي للمحلول عند 500 جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  13. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات النهائية ، واحتفظ بالخلايا. الخلايا المعزولة جاهزة الآن لتلوين قياس التدفق الخلوي أو تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.
  14. لعزل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، قم بعد الخلايا تحت المجهر باستخدام كواشف الفلورسنت المستقرة على الطاولة (انظر جدول المواد) للتمييز بين الخلايا الحية والميتة ، جنبا إلى جنب مع Trypan Blue (انظر جدول المواد). تأكد من أن الخلايا في حالة ممتازة ، مع قابلية حياة تصل إلى 90٪ ، وتصل إلى تركيز 1000 خلية / ميكرولتر). الخطوات التالية موصوفة في القسم 9.1.
    ملاحظة: احتفظ بالأنابيب على الجليد طوال البروتوكول. يجب تنفيذ جميع خطوات الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية مع الحد الأقصى للفرامل ، باستثناء خطوة Percoll ، حيث يتم تحديد حد أدنى للفرامل. للحصول على أفضل النتائج ، قم بتنفيذ البروتوكول بأكمله في نفس اليوم. بالنسبة لمرشح بروتوكول تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، فإن جميع المحاليل المستخدمة للعزل ، في الخطوة 1.11 ، استخدم HBSS (1x) للغسيل الثاني ، وفي الخطوة 1.12 ، احتفظ ب 70-100 ميكرولتر من محلول الخلية.

2. بروتوكول تلطيخ قياس التدفق الخلوي خارج الخلية

  1. انقل جميع الخلايا إلى صفيحة ذات 96 بئرا ذات قاع مخروطي (انظر جدول المواد). قم بالطرد المركزي للطبق عند 500 جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  2. اقلب اللوحة بسرعة لإزالة المادة الطافية بحركة واحدة.
  3. أعد تعليق حبيبات الخلية في 25 ميكرولتر من محلول الحجب (انظر الجدول 1). احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
  4. لتحضير مزيج تلطيخ الأجسام المضادة خارج الخلية (انظر الجدول 2) ، تخزن الأجسام المضادة للطرد المركزي عند 10,000 × جم لإزالة الركام المحتمل. دون إزعاج الحبيبات ، استنشق الحجم المطلوب بعناية من المادة الطافية لتحضير مزيج التلوين وضبط الحجم على 25 ميكرولتر باستخدام FACS Buffer.
  5. أضف 25 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة خارج الخلية إلى كل بئر. احتضان لمدة 20 دقيقة في RT.
    ملاحظة: قبل الاستخدام التجريبي ، تم معايرة جميع الأجسام المضادة على المعلقات المخيخية (أو الدماغ) أحادية الخلية لتحديد تركيز العمل الأمثل. تم إجراء المعايرة بالتحليل الحجمي عن طريق التخفيفات التسلسلية لتوليد منحنى تشبع ، وتم اختيار التخفيف المقابل لهضبة الإشارة ذات الخلفية الدنيا لتنظيم الإشارة.
  6. بدون خلط ، أضف 150 ميكرولتر من مخزن FACS إلى الآبار. قم بالطرد المركزي للصفيحة عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. اقلب اللوحة لإزالة المادة الطافية بحركة واحدة.
  7. أعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. قم بالطرد المركزي للطبق على حرارة 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. اقلب اللوحة لإزالة المادة الطافية بحركة واحدة. كرر الغسيل مرة أخرى باستخدام 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS في نفس الظروف.

3. تلطيخ داخل الخلايا

  1. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للصابونين بارافورمالديهايد (PFA) (انظر الجدول 1) لإصلاح الخلايا ونفاذتها. احتضان لمدة 10 دقائق في RT ، محمي من الضوء.
  2. بدون خلط ، أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للصابونين (انظر الجدول 1). قم بالطرد المركزي للوحة عند 500 × جم لمدة 6 دقائق عند 4 درجات مئوية. اقلب اللوحة لإزالة المادة الطافية بحركة واحدة.
  3. أعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للصابونين. قم بإعداد ضوابط التعويض عن طريق إضافة 20 ميكرولتر من الخرز (انظر جدول المواد) إلى 11 بئرا فارغة. قم بالطرد المركزي للطبق عند 500 × جم لمدة 6 دقائق عند 4 درجات مئوية. اقلب اللوحة لإزالة المادة الطافية بحركة واحدة.
  4. لتحضير مزيج تلطيخ الأجسام المضادة داخل الخلايا (انظر الجدول 3) ، تقوم أجهزة الطرد المركزي بتخزين الأجسام المضادة عند 10,000 × جم لإزالة المجاميع المحتملة. دون إزعاج الحبيبات ، قم بشفط الحجم المطلوب بعناية من المادة الطافية لتحضير مزيج التلوين وضبط الحجم على 50 ميكرولتر باستخدام مخزن الصابونين.
  5. أعد تعليق الحبيبات في 50 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة داخل الخلايا (انظر في الجدول 3). أضف 1 ميكرولتر من كل جسم مضاد إلى آبار الخرز. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT.
  6. بدون خلط ، أضف 150 ميكرولتر من الصابونين المؤقت إلى كل عينة خلية جيدا ، وأضف 100 ميكرولتر من مخزن FACS المؤقت إلى كل بئر يحتوي على عناصر التحكم في التعويض لغسل الخرز. قم بالطرد المركزي للطبق عند 500 × جم لمدة 6 دقائق عند 4 درجات مئوية. اقلب اللوحة لإزالة المادة الطافية بحركة واحدة.
  7. أعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للصابونين وأعد تعليق الضوابط التعويضية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. قم بالطرد المركزي للطبق عند 500 × جم لمدة 6 دقائق عند 4 درجات مئوية. اقلب اللوحة لإزالة المادة الطافية بحركة واحدة. كرر الغسيل مرة أخرى باستخدام 200 ميكرولتر من عازلة الصابونين في نفس الظروف.
  8. أعد تعليق الخلايا وأدوات التحكم التعويضية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. انقل المعلق إلى أنبوب FACS وقم بتخزينه عند 4 درجات مئوية حتى الحصول على قياس التدفق الخلوي.
    ملاحظة: تأكد من إجراء جميع الخطوات التي تتضمن الكواشف الحساسة للضوء في الحد الأدنى من ظروف الإضاءة. لا يحتوي بئر حبة واحدة على أي جسم مضاد ، وهو ما يتوافق مع أنبوب الخرزة غير الملوث.

4. اكتساب قياس التدفق الخلوي

  1. قم بتشغيل مقياس التدفق الخلوي ثم الكمبيوتر.
  2. افتح برنامج مقياس التدفق الخلوي، وابدأ بدء تشغيل الموائع عن طريق تحديد تشغيل ضمن علامة التبويب مقياس الخلوية.
  3. قم بإنشاء مجلد تجربة جديد بالنقر فوق مجلد جديد وتعيين اسم. ثم انقر فوق تجربة جديدة لتسمية التجربة وحدد أنبوب جديد لإضافة عينة وأنبوب عينة.

5. إعداد عناصر التحكم في التعويض

  1. قم بإعداد حبات تعويض ملطخة واحدة لكل فلوروكروم مستخدم في اللوحة ، جنبا إلى جنب مع عنصر تحكم غير ملوطخ.
  2. قم بتحميل أنابيب التعويض على مقياس الخلوة. اضبط جهد التشتت الأمامي (FSC) والتشتت الجانبي (SSC) على 250 تقريبا.
  3. اضبط الفولتية لكل قناة فلورية بحيث يكون عدد السكان السالب في العقد الأول من المحور.
  4. احصل على ما لا يقل عن 5,000 حدث لكل أنبوب.
  5. استخدم مصفوفة التعويض لضبط التداخل الطيفي حتى يتم فصل جميع القمم الموجبة بوضوح عن السكان السالبين وتتركز فوق 104 على المحور المعني.
    ملاحظة: يجب إجراء عناصر التحكم في التعويض لكل تجربة ، حيث يمكن أن تؤثر إعدادات مقياس الخلايا أو أداء الفلوروكروم بشكل كبير على التداخل الطيفي. على الرغم من أن ضوابط التعويض القائمة على الخلايا موصى بها في بعض تطبيقات أنسجة المخ ، فقد تم استخدام حبات التقاط الأجسام المضادة في هذا البروتوكول بسبب انخفاض عدد الخلايا الدبقية الصغيرة التي يمكن الحصول عليها من مخيخ الفأر P3 ، مما يحد من جدوى التعويض القائم على الخلية. تم التحقق من صحة مضان الأجسام المضادة في البداية على الخلايا المشتقة من الدماغ ووجد أنه يمكن مقارنته بالإشارات القائمة على الخرز. قم بتضمين تعليق خلوي غير ملون مشتق من الدماغ أثناء تحسين اللوحة الأولية لتقييم التألق الذاتي للأنسجة وتحديد مستويات إشارة خط الأساس. هذا التحكم ضروري لتعيين المجموعات السالبة بشكل صحيح في كل قناة فلورسنت.

6. إعداد والحصول على ضوابط FMO

  1. لكل علامة رئيسية، قم بإعداد عنصر تحكم مضان ناقص واحد (FMO) يتضمن جميع الأجسام المضادة باستثناء الأجسام التي يتم اختبارها.
  2. قم بتشغيل عناصر تحكم FMO باستخدام نفس إعدادات الاستحواذ مثل العينات الملطخة بالكامل.
  3. استخدم مخططات FMO لتحديد عتبات البوابات للمجموعات السكانية المنخفضة أو المتداخلة والتمييز بين الإيجابيات الحقيقية وضوضاء الخلفية.
    ملاحظة: يجب إجراء ضوابط FMO أثناء التحسين الأولي للوحة لتحديد حدود بوابات دقيقة وموثوقة ، خاصة في الأنسجة ذات التألق الذاتي العالي ، مثل الدماغ. إذا تم تعديل لوحة التلوين أو إعدادات الجهاز أو الظروف التجريبية ، فيجب تكرار عناصر تحكم FMO. بالنسبة للتجارب اللاحقة التي تستخدم نفس إعدادات اللوحة ومقياس الخلايا التي تم التحقق من صحتها ، يمكن إعادة استخدام عتبات البوابات المحددة مسبقا لضمان الاتساق عبر النسخ المتماثلة البيولوجية.

7. إعداد والحصول على ضوابط النمط المتماثل

  1. تلطيخ عينة التحكم بأجسام مضادة للتحكم من النمط المتماثل متطابقة في الفلوروكروم والتركيز مع الأجسام المضادة للاختبار.
  2. احصل على البيانات باستخدام نفس إعدادات مقياس الخلية.
  3. استخدم ضوابط النمط المتماثل فقط لتقييم الارتباط غير المحدد المحتمل ، خاصة في حالة العلامات داخل الخلايا أو الأجسام المضادة ذات الخصائص الضعيفة. لا تستخدم عناصر تحكم النمط المتماثل للبوابات ، لأنها لا تعكس نفس حركية الربط مثل الأجسام المضادة المحددة.
    ملاحظة: عناصر التحكم في النمط المتماثل ليست مناسبة للبوابات ولا ينبغي استخدامها لتحديد السكان. استخدامها اختياري ويجب حجزه للتحقق من خصوصية الأجسام المضادة في حالات مختارة.

8. استراتيجية بوابات قياس التدفق الخلوي

  1. قم بإنشاء المخططات النقطية التالية للبوابة المتسلسلة:
    FSC-A مقابل SSC-A لاستبعاد الحطام
    FSC-A مقابل FSC-H لتحديد الفرديات.
    FSC-A مقابل Amcyan (صبغة الجدوى) لبوابة الخلايا الحية.
  2. حدد الخلايا الدبقية الصغيرة على أنها CD11b + CD45 + باستخدام CD11b (FITC) مقابل CD45 (AF700).
    ملاحظة: نظرا لمرحلة النمو (P3-P15) ، والسياق الالتهابي ، والهضم الأنزيمي ، لم يكن TMEM119 و P2RY12 موثوقين لفصل الخلايا الدبقية الصغيرة بوضوح عن مجموعات النخاع الأخرى عن طريق قياس التدفق الخلوي. لذلك تم استخدام استراتيجية بوابات CD11b + CD45 + ، التي تم التحقق من صحتها مسبقا في دماغ ما بعد الولادة ، لتحديد مجموعات الخلايا الدبقية الصغيرة مع تقليل التلوث. في ظروف التحكم ، يتراوح العائد النموذجي من 30,000 إلى 200,000 خلية صغيرة لكل دماغ كامل من P3 إلى P15. بالنسبة للتجارب التي تركز بشكل خاص على المخيخ ، يبلغ متوسط العائد حوالي 5,000 خلية دبقية دقيقة لكل دماغ.
  3. استخدم عناصر تحكم FMO لتحديد عتبات البوابات لعلامات التنشيط.
  4. تحديد المجموعات السكانية الفرعية للدبقية الصغيرة بناء على التعبير عن العلامات المرتبطة بالمناعة:
    CD80+ (فائق السطوع 436)
    CD86+ (PE)
    iNOS + (PE-eFluor 610)
  5. قم بتوصيف المجموعات الفرعية للدبقية الصغيرة بمجموعات من تعبير العلامة:
    CD206 + (APC) ثم Arg1 + (PE-Cy7)
    CD86 + (PE) ثم CD64 + (PerCP-eFluor 710)
    CD163+ (سوبر برايت 600)ثم CD206+ (APC)
    ملاحظة: تستخدم مجموعات العلامات لوصف عدم التجانس الجزيئي داخل مجموعة الخلايا الدبقية الدقيقة. يتم الإبلاغ عن هذه المجموعات الفرعية بناء على تعبير العلامة وحده ولا يتم تعيين أدوار وظيفية محددة لها ، وفقا للمعايير الحالية التي تعترف باللدونة الدبقية الصغيرة والأنماط الظاهرية المعتمدة على السياق.
  6. تحميل عينة تجريبية. اضبط FSC على 300 وSSC على 200. استخدم معدل تدفق منخفض وسجل العدد المطلوب من الأحداث.
  7. بعد الاستحواذ ، اغسل مقياس الخلايا وقم بتصدير البيانات على النحو التالي. ملفات FSC للتحليل.
  8. تحليل البيانات باستخدام برنامج مقياس التدفق الخلوي.

9. عينة تسلسل الحمض النووي الريبي أحادية الخلية

  1. باستخدام نفس بروتوكول عزل الخلايا الموضح لقياس التدفق الخلوي (انظر الخطوة 1.14) ، أعد تعليق الخلايا المنفصلة في المخزن المؤقت FACS. استخدم المخزن المؤقت FACS في أنابيب التجميع وجميع خطوات المناولة اللاحقة للحفاظ على استقرار الخلية.
  2. لا تقم بإجراء فرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت (FACS) إذا كان الهدف هو التقاط جميع أنواع الخلايا من منطقة الدماغ. ومع ذلك ، إذا كانت التجربة تتطلب إثراء الخلايا الدبقية الصغيرة ، فقم بتضمين خطوة فرز FACS قبل التسلسل.
  3. قم بتقييم قابلية الخلية على الفور باستخدام أصباغ الفلورسنت المستقرة على الطاولة و Trypan Blue (انظر جدول المواد). عد الخلايا تحت المجهر باستخدام مقياس الخلايا الدموية (انظر جدول المواد).
  4. تحقق من أن تعليق الخلية يظهر قابلية للحياة بنسبة 90٪ على الأقل وقم بالتكيف مع تركيز نهائي يبلغ حوالي 1,000 خلية / ميكرولتر قبل الشروع في تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.
  5. احتفظ بجميع العينات على الجليد وقم بمعالجتها مباشرة بعد التفكك لتقليل الإجهاد الخلوي وتغيرات النسخ.
  6. تعدد العينات في أزواج باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: تم تجميع ذكر وأنثى من نفس المجموعة التجريبية لتقليل التكاليف التجريبية.
  7. قم بإعداد مكتبات scRNAseq (راجع جدول المواد) واتبع إرشادات الشركة المصنعة الموصى بها.
    ملاحظة: تم إعداد المكتبة من قبل منصة علم الجينوم التابعة لمعهد أبحاث علم المناعة والسرطان (IRIC) في جامعة مونتريال.
  8. تسلسل مكتبات scRNA-seq باستخدام نظام تسلسل إلى متوسط عمق 3200 متر لكل حارة.
    ملاحظة: تم إجراء التسلسل في جينوم كيبيك في مونتريال.

10. تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية

  1. قم بإجراء تحليل عدد المعرف الجزيئي الفريد (UMI) باستخدام برنامج Cell Ranger 10X Genomics (v8.0.0) باستخدام الجينوم المرجعي Mouse GRCm39 2024-A. استخدم حزمة Seurat R (الإصدار 5.1) لتحليل المصب.
  2. قم بإجراء مراقبة الجودة عن طريق استبعاد الخلايا التي تحتوي على الحمض النووي الريبي للميتوكوندريا يتجاوز ، على سبيل المثال ، 30٪ من إجمالي الحمض النووي الريبي (الشكل 1 أ) ، أو عتبة أكثر صرامة تم اختيارها لإزالة الخلايا ذات الإجهاد المحتمل. قم بتصفية الخلايا منخفضة الجودة مع log10GenesPerUMI أكبر من 0.75 (الشكل 1 ب) ، وعدد الميزات الفريدة ("nUMI") أقل من 500 ، وعدد الجينات المكتشفة لكل خلية ("nGene") أكبر من 300 (الشكل 1 ج). بعد ذلك ، قم بإزالة القطرات باستخدام حزمة "scDblFinder" في R. مع مخطط ارتباط nUMI و nGene الذي يظهر العتبات ، يجب أن يكون تأثير التصفية مرئيا الآن (الشكل 1 د).
  3. قم بالتخفيف من تأثيرات الدفعات من خلال تحديد 2,000 جين شديد التباين لكل عينة باستخدام وظيفة SelectIntegrationFeatures من Seurat.
  4. دمج مجموعات البيانات باستخدام تحليل الارتباط الأساسي (CCA) وإجراء تحليل المكونات الرئيسية (PCA) لتقليل الأبعاد. استخدم وظيفة RunPCA مع 50 مكونا رئيسيا (أجهزة كمبيوتر) ، وتوسيع نطاق البيانات ، والتراجع عن مصادر التباين غير المرغوب فيها (على سبيل المثال ، محتوى الميتوكوندريا). قم بتقييم عدد أجهزة الكمبيوتر المحتجزة بناء على مخطط الكوع وتحليل JackStraw.
  5. تصور المجموعات باستخدام خوارزمية التقريب والإسقاط المشعب الموحد (UMAP) عبر وظيفة Seurat RunUMAP . تحديد ملفات تعريف التعبير الجيني الخاصة بالمجموعة باستخدام وظيفة FindAllMarkers . قم بالتعليق على المجموعات بناء على توقيعات النسخ عن طريق الرجوع إلى جينات العلامات المحددة مع موارد أحادية الخلية المنسقة مثل PanglaoDB و CellMarker (الشكل 2). يتم استنتاج أنواع الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الدبقية الصغيرة ، من هذه الملامح النسخية بدلا من علامة السطح المحددة مسبقا.

11. فصل الخلايا على أساس الجنس

  1. حدد الخلايا الذكرية والأنثوية بناء على التعبير عن الجينات الخاصة بالجنس: أربعة خلايا خاصة بالإناث (Xist و Tsix و Usp9x و Eif2s3x) وثلاثة خاصة بالذكور (Eif2s3y و Uty و Ddx3y).
  2. صنف السكان من الذكور والإناث عن طريق تصفية الخلايا التي تعبر عن عدد UMI الطبيعي > 1 لأي من هذه الجينات باستخدام وظيفة المجموعة الفرعية ل Seurat.
  3. قم بإنشاء كائنات Seurat عن طريق تقسيم الخلايا الذكرية والأنثوية بشكل منفصل. قم بتخزين هذه الكائنات وتحليلها بشكل مستقل لمقارنات الخادم.
  4. تحقق من صحة التصنيف من خلال تصور التعبير الجيني الخاص بالجنس باستخدام وظائف FeaturePlot و VlnPlot ، مما يضمن فصلا واضحا بين مجموعات الخلايا من الذكور والإناث.
    ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوتين 12.1 و 12.2 فقط عندما يتم تعدد إرسال العينة عن طريق خلط ذكر وأنثى واحدة.

12. تصنيف الخلايا الدبقية الصغيرة المستندة إلى النموذج الإحصائي

  1. قم ببناء خمسة نماذج إحصائية في R (غابة عشوائية ، انحدار لوجستي ، بايز ساذج ، آلة ناقلات الدعم ، شجرة القرار) باستخدام مجموعة تدريب من ~ 1,000 خلية مع تسميات مجموعة معروفة.
  2. قم بتقييم أداء النموذج باستخدام منحنيات التحقق المتبادل وخصائص تشغيل المستقبل (ROC) بمقدار 10 أضعاف (الشكل 3). تحديد الجينات الرئيسية التي تساهم في التصنيف باستخدام وظيفة FindAllMarkers في Seurat.
  3. حدد الطراز الذي يحتوي على أعلى مساحة أسفل منحنى ROC (AUC). تم اختيار نموذج الغابة العشوائية بناء على درجة AUC العليا.
  4. قم بتطبيق النموذج المحدد على الخلايا غير المصنفة باستخدام وظيفة التنبؤ من حزمة RandomForest R. دمج التصنيفات المتوقعة مع مجموعات البيانات المشروحة مسبقا في Seurat باستخدام الدمج.
  5. تحقق من صحة التصنيفات من خلال تصور التعبير الجيني للعلامة باستخدام FeaturePlot و VlnPlot. لضمان اتساق هويات الخلايا المتوقعة ، قم بتقييم تخصيب مجموعة جينات العلامة المتداخلة قبل وبعد إضافة الخلايا المصنفة باختبار إحصائي مناسب (على سبيل المثال ، اختبار فيشر الدقيق).

13. تحليل التعبير الجيني التفاضلي للدبقية الصغيرة

  1. قم بإجراء تحليل التعبير الجيني التفاضلي (DEG) بين مجموعتين محددتين من الاهتمام باستخدام وظيفة Seurat "FindMarkers" ، حيث يمثل ident.1 مجموعة الاهتمام و ident.2 يمثل المجموعة المرجعية.
    ملاحظة: يسرد الإخراج الجينات التي يتم التعبير عنها بشكل تفاضلي في ident.1 بالنسبة إلى ident.2. في هذا السياق ، فإن الجينات التي يتم تنظيمها هي تلك التي تتمتع بتعبير أعلى في ident.1 مقارنة ب ident.2 ، بينما تظهر الجينات التي تم تنظيمها بشكل أقل تعبيرا عن تعبير أقل في المعرفة.1. تستخدم مقارناتهم لإنشاء مخططات بركانية وتفسير تغيير النسخ الخاص بالحالة.
  2. تحديد الجينات المعبر عنها تفاضليا (DEGs) بقيمة P معدلة≤ 0.05. للمقارنات بين مجموعتين محددتين ، استخدم وظيفة FindAllMarkers مع المعايير التالية: الجينات المعبر عنها في 10٪ على الأقل من الخلايا (min.pct = 0.1) وعتبة تغيير log2 fold تبلغ 0.25 (logfc.threshold = 0.25). لمقارنات متعددة المجموعات عبر جميع الخلايا الدبقية الصغيرة ، استخدم الدالة FindAllMarkers بنفس المعلمات. تعتبر الجينات ذات القيمة P المعدلة ≤ 0.05 معبرا عنها بشكل تفاضلي بشكل كبير. لتصور أنماط تعبير DEG ، قم بإنشاء مخطط بركان باستخدام الوظيفة المضمنة في حزمة EnhancedVolcano (الشكل 4).
  3. قارن نتائج قياس التدفق الخلوي من خلال فحص علامات قياس الخلايا المستخدمة للعثور على الخلايا الدبقية الصغيرة ، وتحديدا CD45 + و CD11b + ، والتي تتوافق مع الجينات PtprcوItgam. قم بتأكيد التعبير الجيني باستخدام وظائف FeaturePlot في Seurat.
  4. قم بتقييم العلامات المرتبطة عادة بحالات الخلايا الدبقية الصغيرة المتميزة ، بما في ذلك CD80وNOS2 ، بالإضافة إلى Mrc1 و Arg1 و Fcgr1 و CD163. استخدم وظائف Seurat FeaturePlot و DotPlot لتصور تعبيرها عبر مجموعات الخلايا.
  5. قم بإنشاء مخطط نقطي باستخدام الدالة DotPlot في Seurat لتلخيص تعبيرات العلامات والتحقق من صحة تصنيف السكان.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستخدم هذا البروتوكول بشكل فعال قياس التدفق الخلوي لتوصيف مجموعات الخلايا الدبقية الصغيرة في عينات دماغ الفئران ، بناء على التعبير عن علامات السطح وداخل الخلايا المختارة. توضح الأقسام التالية بالتفصيل النتائج التي تم الحصول عليها من الخطوات الرئيسية لسير العمل ، مع تسليط الضوء على توزيع وعدم تجانس المجموعات الفرعية للدبقية الصغيرة استجابة للظروف التجريبية.

التحقق من صحة استراتيجية التعويض والبوابات
تم استخدام حبات التعويض لمعايرة إشارات التألق وتصحيح التداخل الطيفي بين الفلوروكروم. تم فصل المجموعات السكانية الإيجابية والسلبية لكل فلوروكروم بوضوح ، مما سمح بتوليد مصفوفة تعويض دقيقة. تم التحقق من صحة عتبات البوابات في البداية باستخدام التحكم في التألق ناقص واحد (FMO) أثناء تحسين اللوحة لتمييز الإشارة الحقيقية عن الخلفية ، خاصة بالنسبة للعلامات الضعيفة أو المتداخلة. تمت إعادة استخدام هذه العتبات لاحقا عبر التجارب باستخدام نفس إعدادات لوحة التلوين ومقياس الخلية لضمان الاتساق. تم تضمين عناصر التحكم في النمط المتماثل لمراقبة الارتباط غير المحدد المحتمل ، خاصة بالنسبة للعلامات داخل الخلايا ، ولكن لم يتم استخدامها لقرارات البوابات.

تحديد الخلايا الدبقية الصغيرة
نجحت استراتيجية بوابات الخلايا الحية / الميتة (Amcyan) في استبعاد الخلايا الميتة. عزلت استراتيجية البوابات بشكل فعال مجموعات الخلايا الدبقية الصغيرة بناء على تعبير CD45 (AF700) و CD11b (FITC). تم تحسين معلمات التشتت الأمامي (FSC) والتشتت الجانبي (SSC) (FSC = 300 ، SSC = 200) لتمركز مجموعة الخلايا الدبقية الصغيرة داخل مخطط النقطة (الشكل 5).

التنميط الظاهري للخلايا الدبقية الصغيرة
مكن تحليل مخطط النقطة من تحديد المجموعات السكانية الفرعية للدبقية الصغيرة بناء على التعبير التفاضلي للعلامات السطحية وداخل الخلايا. باستخدام استراتيجيات بوابات محددة في برنامج FlowJo ، تم تحديد مجموعة فرعية من الخلايا الدبقية الصغيرة التي تعبر عن CD80 (Super Bright 436) و CD86 (PE) و iNOS (PE-eFluor 610) (الشكل 6 أ). تم استخدام البوابات المزدوجة أيضا لتحديد مجموعات فرعية تعبر عن CD206 (APC) و Arg1 (PE-Cy7) (انظر الشكل 6 ب). تميزت مجموعات سكانية إضافية بالتعبير المشترك عن CD86 (PE) و CD64 (PerCP-eFluor 710) ، بالإضافة إلى CD163 (Super Bright 600) و CD206 (APC) (الشكل 6C ، D). تعكس ملفات تعريف النمط الظاهري هذه عدم التجانس المحدد بالعلامة داخل مجموعة الخلايا الدبقية الصغيرة وتوضح قدرة هذا البروتوكول على التمييز بين مجموعات فرعية متعددة متميزة من الناحية النسخية والمناعية دون استنتاج الحالات الوظيفية الثابتة.

تحليل الخلايا الدبقية الصغيرة أحادية الخلية
تم استخدام التقريب والإسقاط المشعب الموحد (UMAP) لتصور عدم التجانس الخلوي وتحديد مجموعات الخلايا الدبقية الصغيرة بين أنواع خلايا الدماغ الأخرى. تمثل كل نقطة خلية واحدة ، ويتم ترميز الكتلة بالألوان بناء على تشابه النسخ (الشكل 2).

تم إجراء تحليل التعبير التفاضلي داخل مجموعة الخلايا الدبقية الصغيرة لتحديد الجينات المعدلة في ظل الظروف التجريبية. اعتبرت الجينات ذات القيمة المودعة المعدلة ≤ 0.05 معبرة تفاضليا.

تم إنشاء مخطط بركان لتصور هذه الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي للخلايا الدبقية الصغيرة ، مع تسليط الضوء على تلك التي لها تغيير كبير في الطيات والأهمية الإحصائية (الشكل 4).

لمقارنة نتائج الخلايا المفردة هذه مع بيانات قياس التدفق الخلوي ، تم فحص التعبير عن علامات الخلايا الدبقية الصغيرة CD45 و CD11b (Ptprc و Itgam). يظهر UMAP تعبيرها داخل مجموعات الخلايا المختلفة (الشكل 7).

أخيرا ، تم تقييم التعبير عن العلامات المختارة المتعلقة بالمناعة لتوصيف عدم تجانس النسخ بين الخلايا الدبقية الدقيقة. تعرض مخطط الكمان التعبير عن جينات مثل CD80 و NOS- ، وكذلك Mrc1 و Arg1 و Fcgr1 و CD163 على مستوى الخلية المفردة (الشكل 8). تسمح أنماط تعبير العلامات هذه بالمقارنة مع التنميط القائم على قياس التدفق الخلوي وتسليط الضوء على التنوع الجزيئي للمجموعات الفرعية للدبقيات الصغيرة عبر الظروف التجريبية.

figure-results-1
الشكل 1: مراقبة جودة البيانات النسخية أحادية الخلية. (أ) توزيع محتوى الحمض النووي الريبي للميتوكوندريا عبر الخلايا. تم استبعاد الخلايا التي تحتوي على >30٪ من الحمض النووي الريبي للميتوكوندريا لإزالة الخلايا التي يحتمل أن تكون مجهدة أو تحتضر. (ب) تم تصفية الخلايا التي تحتوي على log10GenesPerUMI > 0.75 لضمان نسبة متسقة من الجين إلى UMI وتقليل الضوضاء من المكتبات منخفضة التعقيد. (ج) تم أيضا استبعاد الخلايا التي تحتوي على أقل من 500 نسخة مكتشفة (nUMI) أو أكثر من 300 جين تم اكتشافها (nGENE) للقضاء على الخلايا ذات الجودة الرديئة أو المتعددة. (د) مخطط الارتباط ل NUMI مقابل nGene يوضح تأثير عتبات التصفية. تمت إزالة المضاعفات المكتشفة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تصور UMAP للنسخ أحادية الخلية. مخطط UMAP يوضح توزيع الخلايا المفردة بناء على ملفات تعريف النسخ التي تم الحصول عليها من حيوانين فرديين. تمثل كل نقطة خلية واحدة ، مرمزة بالألوان بواسطة هوية نظام المجموعة. يتم تحديد مجموعة الخلايا الدبقية الصغيرة بين مجموعات الخلايا الأخرى. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: منحنى ROC لمصنف الغابة العشوائية تم تقييمه عن طريق التحقق المتبادل. منحنى خاصية تشغيل جهاز الاستقبال (ROC) يوضح أداء نموذج الغابة العشوائية المستخدم لتمييز الخلايا الدبقية الصغيرة عن أنواع خلايا الدماغ الأخرى بناء على ملفات تعريف التعبير الجيني. تم تدريب النموذج على مجموعة من ~ 1000 خلية ذات ملصقات معروفة وتم تقييمه باستخدام التحقق المتبادل بمقدار 10 أضعاف. من بين النماذج الإحصائية الخمسة التي تم اختبارها (الغابة العشوائية ، والانحدار اللوجستي ، والبايز الساذج ، وآلة ناقلات الدعم ، وشجرة القرار) ، حقق نموذج الغابة العشوائية أعلى أداء تصنيف. تعكس المنطقة الموجودة أسفل المنحنى (AUC) دقة النموذج. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: تحليل التعبير الجيني التفاضلي في الخلايا الدبقية الدقيقة. مخطط بركان يمثل تغيير log2 fold مقابل P-Value المعدلة للجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي في الخلايا الدبقية الصغيرة بين المجموعتين التجريبيتين (التحكم مقابل إصابة الدماغ المخيخية). يتم التعبير عن الجين المنظم بشكل أكبر في مجموعة الاهتمام (ident.1) ، وتظهر الجينات التي تم تنظيمها بشكل أقل تعبيرا أقل مقارنة بالمجموعة المرجعية (ident.2). يتم تصنيف الجينات الرئيسية المعبر عنها بشكل تفاضلي بشكل كبير. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: استراتيجية البوابات لتحديد الخلايا الدبقية الصغيرة عن طريق قياس التدفق الخلوي. (أ) استراتيجية البوابات المطبقة على الخلايا المخيخية من فأر التحكم في اليوم 3 (P3). (ب) تم اختيار الأفراد لاستبعاد المزدوجات. (ج) تم تحديد الخلايا القابلة للحياة باستخدام صبغة قابلة للحياة ؛ تم استبعاد الأحداث ذات FSC-A المنخفض لإزالة الحطام وضمان تحليل الخلايا السليمة. (د) تم تحديد الخلايا الدبقية الصغيرة على أنها CD45 + و CD11b + مع مجموعتين متميزتين: CD45منخفض CD11bint للدبقية الصغيرة الهادئة و CD45int -CD11bعالية للدبقية الصغيرة المنشطة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6. توصيف ملامح تعبير علامة الخلايا الدبقية الصغيرة عن طريق قياس التدفق الخلوي. (أ) بوابات متسلسلة لخلايا CD45 + CD11b + بناء على تعبير CD80 و CD86 و iNOS. (ب) تحديد مجموعة فرعية تعبر عن CD206 ، متبوعا بالبوابة بناء على تعبير Arg1. (ج) تحديد مجموعة فرعية تعبر عن CD86 ، متبوعة بالبوابة بناء على تعبير CD64. (د) تحديد مجموعة فرعية تعبر عن CD163 ، متبوعة بالبوابة بناء على تعبير CD206. توضح استراتيجيات البوابات هذه عدم التجانس الظاهري لمجموعات الخلايا الدبقية الصغيرة بناء على تعبير العلامات السطحية وداخل الخلايا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7
الشكل 7: تأكيد هوية الخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام تعبير Itgam و Ptprc في بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادية الخلية. يعرض UMAP المشهد النسخي للخلايا المخيخية عند P15 ، مع التعبير الجيني ل Itgam و Ptprc متراكبا عبر المجموعات. يدعم التعبير المشترك عن هذه العلامات النخاعية الكنسية تحديد مجموعات الخلايا الدبقية الصغيرة ويتماشى مع العلامات المستخدمة في قياس التدفق الخلوي ، مما يوفر التحقق المتبادل بين التحليلات النسخية ومستوى البروتين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-8
الشكل 8: ملامح التعبير عن الجينات المختارة المرتبطة بالمناعة في الخلايا الدبقية الصغيرة التي تم تحديدها بواسطة تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. تعرض مخططات الكمان توزيع التعبير الجيني ل CD80 و NOS2 و Mrc1 و Arg1 و Fcgr1 و CD163 عبر الخلايا الدبقية الصغيرة الفردية. ترتبط هذه العلامات عادة بالعمليات المتعلقة بالمناعة وتوضح عدم تجانس النسخ الذي لوحظ داخل مجموعة الخلايا الدبقية الدقيقة. يتم عرض البيانات لكل من حالات التحكم وإصابات الدماغ المخيخية (CBI). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: تكوين المحاليل المستخدمة لعزل الخلايا العصبية وتلطيخها. يوفر هذا الجدول تركيبة مفصلة للمحاليل المطلوبة لعزل الخلايا وتلطيخها ، بما في ذلك تركيزاتها ومكوناتها. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: تركيزات مزيج الأجسام المضادة للتلطيخ خارج الخلية. يوضح هذا الجدول بالتفصيل تركيزات الأجسام المضادة والمحلول الحي / الميت المستخدم في التلوين خارج الخلية ، مع تحديد الأحجام والتخفيفات المطلوبة لكل جسم مضاد في مزيج التلوين لعينة واحدة. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 3: تركيزات مزيج الأجسام المضادة للتلطيخ داخل الخلايا. يوضح هذا الجدول بالتفصيل تركيزات الأجسام المضادة المستخدمة في التلوين داخل الخلايا ، مع تحديد الأحجام والتخفيفات المطلوبة لكل جسم مضاد في مزيج التلوين لعينة واحدة. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه الدراسة بروتوكولا مفصلا ومحسنا يجمع بين قياس التدفق الخلوي وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) لعزل وتوصيف الخلايا الدبقية الصغيرة أثناء نمو الدماغ المبكر بعد الولادة. بينما يظل قياس التدفق الخلوي تقنية فعالة من حيث التكلفة ويمكن الوصول إليها ، فإن تكامله مع نسخ الخلية المفردة يوفر رؤى تكميلية من خلال ربط تعبير علامة على مستوى البروتين بملفات تعريف النسخ على مستوى الجينات. يعالج البروتوكول التحديات التقنية الخاصة بأنسجة المخ غير الناضجة ، بما في ذلك التفكك الفعال ، وإزالة الحطام والمايلين ، واستراتيجيات التلوين المناعي المحسنة ، لضمان قابلية التكاثر والموثوقية في تحليل مجموعات الخلايا الدبقية الصغيرة عبر النقاط الزمنية التنموية الرئيسية.

تم استخدام قياس التدفق الخلوي لتحديد المجموعات الفرعية للدبقية الصغيرة بناء على التعبير عن العلامات السطحية وداخل الخلايا المختارة. بدلا من استنتاج الحالات الوظيفية ، تم تمييز المجموعات الفرعية من خلال ملفات تعريف تعبير العلامات الخاصة بها ، مثل CD80 + / CD86 + / iNOS + ; CD206 + / Arg1 + ; الأنماط الظاهرية CD86 + / CD64 + أو CD163 + / CD206 + . تعكس هذه المجموعات المحددة بالعلامة عدم التجانس الجزيئي داخل حجرة الخلايا الدبقية الصغيرة وتوفر نهجا عمليا للتوصيف عالي الإنتاجية. في حين أن هذه التصنيفات القائمة على العلامات السطحية قد لا تلتقط التعقيد الكامل لتنوع الخلايا الدبقية الصغيرة ، إلا أنها تظل مفيدة ، خاصة في السياقات التي قد لا تتوفر فيها الأدوات الجزيئية عالية الأبعاد. تم تجنب التصنيفات الثنائية مثل نموذج M1 / M2 عمدا ، اعترافا بالطبيعة الشبيهة بالطيف والمعتمدة على السياق للأنماط الظاهرية الدبقية الصغيرة ، كما هو موضح في الأدبيات الحديثة12.

تتوافق هذه الملاحظات مع الدراسات السابقة التي تسلط الضوء على دور الخلايا الدبقية الصغيرة في كل من النضج الطبيعي للدماغ واستجابة للمنبهات البيئية أو المرضية13،14. توفر القدرة على التمييز بين عدم تجانس الخلايا الدبقية الصغيرة رؤى قيمة حول كيفية مساهمة استقطاب الخلايا الدبقية الصغيرة في اضطرابات النمو العصبي15،16.

على الرغم من أن تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية يوفر دقة أعلى ويسمح بتحديد المجموعات السكانية الفرعية للخلايا الدبقية الصغيرة المتميزة نسخا ، إلا أن تكلفتها وتعقيدها التحليلي تحدان من إمكانية الوصول إليها. في مجموعة البيانات الحالية التي تم جمعها في اليوم 15 بعد الولادة بعد الإصابة في الفترة المحيطة بالولادة ، تم حل ذروة الاستجابة الالتهابية إلى حد كبير ، مما يؤدي إلى انخفاض عدد الخلايا الدبقية المنشطة. وبالتالي ، فإن تقنيات تقليل الأبعاد مثل UMAP لم تستعيد المجموعات الفرعية الدبقية الصغيرة المنفصلة جيدا ، ولم يتم تضمين تحليل النسخ على مستوى الكتلة في مخطوطة البروتوكول هذه.

يتمثل أحد الابتكارات المهمة لهذا البروتوكول في تحسينه لعزل وتوصيف الخلايا الدبقية الصغيرة من المخيخ خلال مراحل ما بعد الولادة المبكرة (P3 إلى P30). تمثل هذه المنطقة والسياق الخاص بالعمر تحديات مميزة ، بما في ذلك انخفاض إنتاجية الخلايا ومحتوى المايلين وزيادة هشاشة الأنسجة. لمعالجة هذه القيود ، يدمج البروتوكول سير عمل تفكك مكيف ، وإزالة فعالة للحطام والمايلين ، وظروف تلطيخ المناعة المضبوطة بعناية المناسبة للأنسجة المخيخية صغيرة الحجم. على الرغم من الاعتراف المتزايد بالدبقية الصغيرة المخيخية على أنها متميزة وظيفيا ونسخيا عن تلك الموجودة في مناطق الدماغ الأخرى ، إلا أن البروتوكولات التفصيلية لعزلها وتحليلها لا تزال محدودة. توفر الطريقة الحالية سير عمل موثوقا ويمكن الوصول إليه ، مصمم خصيصا للدراسات التنموية للدبقية الصغيرة المخيخية.

الهدف الرئيسي من هذه المخطوطة هو توفير إطار منهجي قابل للتكرار وقابل للتكيف بدلا من الإبلاغ عن اكتشافات بيولوجية محددة. يعد سير العمل مناسبا للتكيف مع مراحل النمو الأخرى أو النماذج التجريبية التي قد تكون فيها حالات الخلايا الدبقية الصغيرة المتميزة نسخا أكثر بروزا. في مثل هذه السياقات ، يظل قياس التدفق الخلوي أداة قيمة ، خاصة عند دمجها مع المقايسات التكميلية.

تتمثل إحدى نقاط القوة الرئيسية لهذا البروتوكول في قدرته على التكيف عبر مراحل النمو المختلفة ، بدءا من اليوم 3 بعد الولادة (P3) إلى يوم ما بعد الولادة 30 (P30). هذا يسمح بالتحليل الطولي للنمط الظاهري للدبقية الصغيرة مع تقدم نضوج الدماغ. يتيح الاستخدام المشترك لقياس التدفق الخلوي و scRNA-seq دراسة ليس فقط علامات السطح ، ولكن أيضا مسارات الإشارات داخل الخلايا وعوامل النسخ المشاركة في الخلايا الدبقية الدقيقة.

ومع ذلك ، قد يؤثر الهضم الأنزيمي على التعبير عن بعض العلامات السطحية ، مما يستلزم تحسينا دقيقا لظروف الهضم لأهداف تجريبية محددة17،18. بالإضافة إلى ذلك ، لا يوفر قياس التدفق الخلوي ولا تسلسل الخلية المفردة بيانات على مستوى السكان ، والتي قد لا تلتقط بشكل كامل الفروق الدقيقة المكانية والوظيفية لتفاعلات الخلايا الدبقية الصغيرة داخل بيئتها الأصلية. يمكن أن يساعد دمج التقنيات المكانية أحادية الخلية في معالجة هذا القيد من خلال الحفاظ على السياق المكاني للخلايا الدبقية الدقيقة. يمكن أن تقدم الدراسات المستقبلية التي تجمع بين هذا البروتوكول وتقنيات التصوير ، مثل الكيمياء المناعية ، أو التصوير في الجسم الحي ، أو اللطخة الغربية ، أو علم النسخ المكاني أحادي الخلية ، رؤى تكميلية في ديناميكيات الخلايا الدبقية الدقيقة.

تفتح هذه الطريقة طرقا جديدة للتحقيق في كيفية تأثير الإهانات في وقت مبكر من الحياة ، مثل الالتهاب أو نقص الأكسجة أو الضغوطات البيئية ، على الأنماط الظاهرية للخلايا الدبقية الصغيرة والمساهمة في نتائج النمو العصبي على المدى الطويل. من خلال تمكين التوصيف الدقيق والموثوق لحالات تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة ، فإنه يسهل تحديد الأهداف العلاجية لتعديل استجابات الخلايا الدبقية الصغيرة في الحياة المبكرة ، بهدف منع أو تخفيف اضطرابات النمو العصبي.

في الختام ، يوفر هذا البروتوكول إطارا قويا ويمكن الوصول إليه لدراسة تنوع الخلايا الدبقية الصغيرة أثناء نمو الدماغ المبكر. يسمح الجمع بين قياس التدفق الخلوي وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية بتطبيق مرن عبر مراحل النمو المختلفة والنماذج التجريبية ، مما يسهل الاستكشاف الأعمق لبيولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة في كل من السياقات الفسيولوجية والمرضية.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأعلن أصحاب البلاغ أنه لا يوجد تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الكندية للبحوث الصحية (487354) ومؤسسة أبحاث كيبيك (333845).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
140 & مرشح شبكة معدنية M   ؛سيجما ألدريتشس 3895
أنبوب 15 ملسارستيدت62.554.205
أنبوب 5 ملسارستيدت55.526.006
96 لوحة بئر مع قاع مخروطي   ؛سارستيدت82.1583.001
أرجيناز 1 - مترافق Pecy7 - استنساخ : A1exF5ثيرمو فيشر العلمي25-3697-82
كواشف الفلورسنت المستقرة على الطاولةإنفيتروجينأ49905
CD11b - Fitc المترافق - الاستنساخ: M1/70بي دي فارمينجن553310
CD163 - الاقتران SB600 -- استنساخ : TNKUPJثيرمو فيشر العلمي63-1631-82
CD206 - APC المترافق - استنساخ : C068C2بيو ليجند141708
CD45 - مترافق A700 - استنساخ : 30-F11بي دي فارمينجن560510
CD64 - مترافق   PerCP-eF710 - استنساخ: X54-5 / 7.1ثيرمو فيشر العلمي46-0641-82
CD80 - مترافق SB436 - استنساخ: 16-10A1ثيرمو فيشر العلمي62-0801-82
CD86 -- مترافق PE -- استنساخ : GL-1بيو ليجند105008
الكولاجيناز دسيجما – الدريتش11088866001
DNase Iسيجما – الدريتش10104159001
مصل الأبقار الجنينية (FBS)سيجما – ألدريتش إف 1051
HBSS (محلول الملح المتوازن من هانك) 10xWisent Bioproducts 311506CL
مقياس الخوضVWR الدولية82030-470
HEPESWisent Bioproducts 330.050.EL
iNOS -- PE المترافق - eF610 -- استنساخ : CXNFTثيرمو فيشر العلمي61-5920-82
KClثيرمو فيشر العلميBP366-500
KH2PO4ثيرمو فيشر العلميبي بي 362-500
أمسيان حية / ميتةثيرمو فيشر العلميL34957
وسائط زراعة الخلايا الدبقية الصغيرةتقنيات الحياةط: A12475-01
Na2HPO4ثيرمو فيشر العلميBP332-500
كلوريد الصوديومثيرمو فيشر العلميBP358-212
بارافورمالدهيدسيجما – ألدريتش ص 6148
الفئران المضادة للماوس CD16 / CD32BD Biosciences 553142
الصابونينسيجما – ألدريتش ط7900
مكتبات scRNAseq10X علم الجينوم1000121
وسط غروي قائم على السيليكاثيرمو فيشر العلمي45001747
أزيد الصوديومثيرمو فيشر العلميBP922I-500
تريبان بلوجيبكو1525006

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berardi, N., Sale, A., Maffei, L. Brain structural and functional development: Genetics and experience. Dev Med Child Neurol. 57 (Suppl 2), 4-9 (2015).
  2. Tremblay, M. E. Microglial functional alteration and increased diversity in the challenged brain: Insights into novel targets for intervention. Brain Behav Immun Health. 16, 100301(2021).
  3. Salter, M. W., Beggs, S. Sublime microglia: Expanding roles for the guardians of the CNS. Cell. 158 (1), 15-24 (2014).
  4. Michell-Robinson, M. A., et al. Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair. Brain. 138 (Pt 5), 1138-1159 (2015).
  5. Nayak, D., Roth, T. L., Mcgavern, D. B. Microglia development and function. Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).
  6. Mehl, L. C., Manjally, A. V., Bouadi, O., Gibson, E. M., Tay, T. L. Microglia in brain development and regeneration. Development. 149 (8), dev200425(2022).
  7. Mastenbroek, L. J. M., Kooistra, S. M., Eggen, B. J. L., Prins, J. R. The role of microglia in early neurodevelopment and the effects of maternal immune activation. Semin Immunopathol. 46 (1-2), 1(2024).
  8. Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. Microglial dynamics during human brain development. Front Immunol. 9, 1014(2018).
  9. Srakocic, S., et al. Proposed practical protocol for flow cytometry analysis of microglia from the healthy adult mouse brain: Systematic review and isolation methods' evaluation. Front Cell Neurosci. 16, 1017976(2022).
  10. Akhmetzyanova, E. R., Rizvanov, A. A., Mukhamedshina, Y. O. Current methods for the microglia isolation: Overview and comparative analysis of approaches. Cell Tissue Res. 395 (2), 147-158 (2024).
  11. Walker, D. G., Lue, L. F. Immune phenotypes of microglia in human neurodegenerative disease: Challenges to detecting microglial polarization in human brains. Alzheimers Res Ther. 7 (1), 56(2015).
  12. Paolicelli, R. C., et al. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
  13. Hammond, T. R., et al. Single-cell RNA sequencing of microglia throughout the mouse lifespan and in the injured brain reveals complex cell-state changes. Immunity. 50 (1), 253-271.e6 (2019).
  14. Bernier, L. P., York, E. M., Macvicar, B. A. Immunometabolism in the brain: How metabolism shapes microglial function. Trends Neurosci. 43 (11), 854-869 (2020).
  15. Butovsky, O., et al. Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia. Nat Neurosci. 17 (1), 131-143 (2014).
  16. Gosselin, D., et al. Environment drives selection and function of enhancers controlling tissue-specific macrophage identities. Cell. 159 (6), 1327-1340 (2014).
  17. Chometon, T. Q., et al. A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells. PLoS One. 15 (4), e0231132(2020).
  18. Skog, M., et al. The effect of enzymatic digestion on cultured epithelial autografts. Cell Transplant. 28 (5), 638-644 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow CytometrySingle Cell AnalysisMicroglia ActivationPostnatal Brain DevelopmentMouse CerebellumCell IsolationRNA SequencingTissue DissociationSurface Marker ProfilingDifferential Expression

Related Articles